Summary
Descriviamo un protocollo per riprogrammare i fibroblasti derivati dalla pelle umana in cellule progenitrici neuronali indotte (INPC) e la loro successiva differenziazione in Astrociti indotti (iA). Questo metodo porta a una generazione rapida e riproducibile di iNPC e iA in grandi quantità.
Abstract
La ricerca sui disturbi neurologici si concentra principalmente sull'impatto dei neuroni sui meccanismi delle malattie. La disponibilità limitata di modelli animali influisce gravemente sulla studio dei contributi specifici del tipo di cellula alle malattie. Inoltre, i modelli animali di solito non riflettono la variabilità nelle mutazioni e nei corsi di malattia osservati nei pazienti umani. I metodi di riprogrammazione per la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC) hanno rivoluzionato la ricerca specifica del paziente e creato strumenti preziosi per lo studio dei meccanismi delle malattie. Tuttavia, la tecnologia iPSC presenta svantaggi come il tempo, l'impegno del lavoro, la selettività clonale e la perdita di marcatori epigenetici. Recenti modifiche di questi metodi consentono una generazione più diretta di lignaggi cellulari o tipi di cellule specifiche, bypassando l'isolamento clonale o uno stato pluripotente delle cellule staminali. Abbiamo sviluppato un metodo di conversione diretta rapida per generare cellule progenitrici neuronali indotte (iNPC) da fibroblasti cutanei utilizzando vettori retrovirali in combinazione con mezzi nevralizzante. Gli iNPC possono essere differenziati in oligodendrociti (iN) neuroni (iN) e astrociti (iA). IAs la produzione facilita il test rapido dei farmaci e dei sistemi di malattia poiché la differenziazione dagli INPC richiede solo 5 giorni. Inoltre, gli IA sono facili da lavorare e sono generati in popolazioni pure in gran numero. Abbiamo sviluppato un saggio di co-coltura altamente riproducibile utilizzando neuroni GFP+ del topo e iA derivati dal paziente per valutare potenziali strategie terapeutiche per numerosi disturbi neurologici e neurodegenerativi. È importante sottolineare che i test iA sono scalabili in formato 384-well facilitando la valutazione di più piccole molecole in un'unica piastra. Questo approccio consente la valutazione terapeutica simultanea di più linee cellulari del paziente con diversi background genetici. La facile produzione e conservazione degli IA e la capacità di migliorare più composti in un unico test rendono questa metodologia adattabile per la medicina personalizzata.
Introduction
Comprendere i meccanismi di malattia sottostanti è fondamentale per le malattie neurologiche in quanto aiuta nello sviluppo di potenziali strategie terapeutiche. Mentre i modelli animali sono stati storicamente il gold standard per la ricerca di malattie del sistema nervoso, la traduzione diretta di potenziali terapie in un ambiente clinico mostra spesso unsuccesso limitato 1,2,3. Le ragioni della mancanza di traduzione sono la mancanza di variabilità del background genetico e delle mutazioni nei topi, la visualizzazione incompleta dei fenotipi della malattia e la variazione della sensibilità ai farmaci o il dosamento in pazienti umani che non sono ben raffigurati nei ceppi di topo inbred. Inoltre, per molti disturbi neurologici rari, non sono disponibili o pochi modelli animali. Lo studio dei meccanismi delle malattie direttamente nei tipi di cellule umane pertinenti potrebbe facilitare la ricerca e migliorare la traduzione in clinica. Per i disturbi del SNC, le cellule umane primarie sono difficili da recuperare e rappresentano una fonte molto limitata in quanto le biopsie sono invasive o possono essere recuperate solo dopo la mortem nella fase finale della malattia. Negli ultimi 15 anni, lo sviluppo della tecnologia di riprogrammazione cellulare ha rapidamente ampliato la capacità di modellare le malattie neurologiche e neurodegenerative umane in vitro.
I metodi tradizionali di riprogrammazione cellulare comportano la riprogrammazione di fibroblasti o altri tipi di cellule in cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC) in grado di differenziarsi in tipi di cellule da tutti e tre gli stratigerminali 4. Takahashi e Yamanaka sono stati i primi a dimostrare che la re-espressione di quattro fattori di trascrizione delle cellule staminali è sufficiente per reindirizzare le cellule somatiche per diventare iPSC5. Gli iPSC possono quindi essere ulteriormente differenziati in tipi di cellule specifici. Tuttavia, lo svantaggio di questo processo è che è laborioso e dispendioso in termini di tempo generare e isolare cloni di cellule staminali stabili. Mutazioni somatiche o aberranze specifiche della cellula madre sono mantenute anche nel clone delle cellule staminali e possono influire sui risultati dello studio6. Inoltre, l'aumento delle prove suggerisce che il processo di riprogrammazione alle cellule staminali cancella preziosi cambiamenti epigenetici che potrebbero influenzare i meccanismidelle malattie cellulari 4,7,8. Negli ultimi anni, i ricercatori si sono concentrati su metodi di riprogrammazione modificati che consentono una generazione più diretta di diversi tipi di cellule, bypassando allo stesso tempo lo stato pluripotente delle cellule staminali9,10,11,12 (rivisto in 13,14). Le prime scoperte hanno rivelato una riprogrammazione combinatoria in vitro dei fibroblasti ai cardiomiociti15,ai neuroni16 e agli epatociti17 per espressione ectopica di più fattori di trascrizione specifici del lignaggio o microRNA18. Questo è stato seguito da studi che riprogrammano direttamente le cellule per modellare idisturbi neurologici 19,20. Come accennato in precedenza, tali protocolli di riprogrammazione o conversione diretta hanno potenziali vantaggi rispetto ai protocolli iPSC classici, tra cui la velocità e l'ablazione della fase di isolamento clonale. Inoltre, le prove suggeriscono che questi protocolli consentono di mantenere una maggiore quantità di informazioni epigenetiche relative all'età del paziente e probabilmente lo stesso vale per i marcatoririlevanti per la malattia 7,8.
Ad oggi, la maggior parte delle ricerche in vitro sui disturbi neurologici si è concentrata principalmente sui neuroni. Tuttavia, è noto che altri tipi di cellule come astrociti, microglia e oligodendrociti svolgono un ruolo fondamentale nella patologia della malattia e nella progressione di disturbi neurodegenerativi come il morbo di Alzheimer (AD), la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), il morbo di Parkinson (PD), la malattia di Huntington (MH), la sclerosi multipla (SM) e altre patologie neurologiche come la sindrome di Rett (RTT), i disturbi del sonno, dipendenza, epilessia, disturbi dello stoccaggio lisosomiale, depressione, emicrania e dolorepatologico 21,22,23,24,25,26. Gli astrociti sono il tipo di cellula più abbondante nel sistema nervoso centrale (SNC) e fino a poco tempo fa sono stati ampiamente trascurati da un punto di vistapatologico 7. Ora sono noti per avere un ruolo fondamentale nel supportare quasi tutte le funzioni omeostatiche del SNC sano. Inoltre, è evidente che hanno un impatto patologico importante e sono molto preziosi nella comprensione del meccanismo della malattia e nella valutazione delle strategieterapeutiche 19.
Nella descrizione attuale, dettagliamo un protocollo per la conversione diretta dei fibroblasti del paziente umano in cellule progenitrici neuronali indotte (INPC) utilizzando vettori retrovirali che esprimono i fattori di riprogrammazione di Yamanaka (Klf4, Oct3/4, Sox2 e c-Myc) e la successiva esposizione a mezzi nevralizzante. Studi precedenti hanno utilizzato diverse combinazioni di fattori trascrittivi per la riprogrammazione diretta alle cellule neurali (recensito in 14), ma i fattori utilizzati nel protocollo descritto sono ampiamente disponibili sia come plasmidi per la produzione interna di vettori virali, sia come kit di riprogrammazione virale pronti per essere disponibili in commercio. Gli iNPC risultanti possono essere ulteriormente differenziati in neuroni indotti (iN)27, oligodendrociti (iOs)24 e astrociti (iAS)19 per studiare il loro ruolo nelle malattie neurologiche. Il nostro protocollo non prevede una generazione dispendiosa in termini di tempo di iPSC che la maggior parte dei protocolli disponibili utilizza per la derivazione di astrocitiumani 28. Circa il 98-100% degli INPC riprogrammati direttamente può differenziarsi in astrociti positivi alla GFAP29 rispetto al solo 2% utilizzando il metodo di conversione diretta dai fibroblasti agli astrociti30. Recentemente, uno studio trascritomico comparativo utilizzando il nostro metodo di riprogrammazione descritto ha dimostrato che gli INPC riprogrammati dai fibroblasti donatori possono mantenere caratteristiche di invecchiamento a livello trascrizionale e funzionale simili agli astrociti postmortem abbinati all'età e agli astrocitiprimari 29. Pertanto, questo protocollo di conversione è un potente strumento per indagare i meccanismi della malattia e valutare nuovi approcci terapeutici per disturbi neurodegenerativi e neurologici legati all'età.
Qui descriviamo il protocollo utilizzato per generare i NPC e un'ulteriore differenziazione in iA, che sono i più adatti per test di screening molecolare su piccola scala su larga scala. I meccanismi delle malattie e i test farmacologici con iA possono essere eseguiti utilizzando diverse metodologie come co-colture con neuroni o analisi metaboliche e biochimiche. Il vantaggio di questo sistema è la velocità e la facilità di manutenzione di queste linee cellulari rispetto agli iPSC. Inoltre, gli iNPC possono essere congelati in piccole porzioni per la differenziazione degli IA, il che facilita i test farmacologici in condizioni costanti per lunghi periodi di tempo. Nel complesso, il confronto di numeri di campione più grandi diventa possibile in questo modo, il che apre la porta a valutare il potenziale terapeutico dei composti in una popolazione di pazienti più ampia e rappresentativa.
Protocol
| media | Reagente | Importo da mescolare | Concentrazione finale (%) |
| Mezzi fibroblasti | DMEM, alto glucosio, GlutaMAX | 500 mL | 89 |
| Siero bovino fetale | 50 mL | 10 | |
| Antibiotico-Antimicotico | 5 mL | 1 | |
| Supporti di base | DMEM/F12 + Glutamax | 500 mL | 97 |
| N-2 | 5 mL | 1 | |
| B-27 | 5 mL | 1 | |
| Antibiotico-Antimicotico | 5 mL | 1 | |
| Supporti di conversione | Supporti di base | 50 mL | 99.9 |
| FGF | 1 μL | 0,02 (20 ng/mL) | |
| FEG | 1 μL | 0,02 (20 ng/mL) | |
| eparina | 50 μL | 0,1 (5 μg/mL) | |
| Supporti NPC (Neural Progenitor Cell) | DMEM/F12 + Glutamax | 500 mL | 96.9 |
| N-2 | 5 mL | 1 | |
| B-27 | 5 mL | 1 | |
| Antibiotico-Antimicotico | 5 mL | 1 | |
| FGF | 10 uL | 0.002 | |
| Astrociti | DMEM, alto glucosio, GlutaMAX | 500 mL | 89 |
| Siero bovino fetale | 50 mL | 10 | |
| Antibiotico-Antimicotico | 5 mL | 1 | |
| N-2 | 1 mL | 0.2 | |
| I supporti devono essere filtrati dopo aver miscelato tutti i componenti. I supporti di conversione (con fattori) devono essere preparati freschi ogni settimana. | |||
La tabella 1. Ricette multimediali per tutti i tipi di cella inclusi nel protocollo. I supporti devono essere filtrati dopo aver miscelato tutti i componenti con un sistema di filtrazione sterile sottovuoto per grandi volumi o siringhe e filtri per siringhe da 0,2 um. I supporti di conversione (con fattori) devono essere preparati freschi ogni settimana.
1. Conversione diretta dei fibroblasti umani adulti in cellule progenitrici neuronali
NOTA: Una sequenza temporale schematica di questo protocollo può essere rivista in Meyer (2014)19.
- Utilizzare fibroblasti cutanei umani primari che possono essere ottenuti da banche cellulari o biopsiecutanee 31. Cellule di coltura a 37 °C in un incubatore di coltura tissutale di CO2 al 5%. Cellule di passaggio per almeno 1-2 passaggi dopo lo scongelamento prima dell'uso nell'esperimento. Una volta che le cellule sono pronte, rivestire un pozzo di una piastra a 6 pozzetti con fibronectina umana (1:200 diluita in PBS) a temperatura ambiente per 15-20 minuti.
- Quando le cellule sono pronte per essere placcate, rimuovere la fibronectina dal piatto e aggiungere immediatamente la soluzione cellulare o 2 mL di mezzi fibroblasti (Tabella 1) - non lasciare asciugare il piatto prima di aggiungere mezzi. A seconda della velocità di crescita delle cellule, la piastra 150.000 (in rapida crescita) - 200.000 fibroblasti (a crescita lenta) in due pozzi di una piastra di fibronectina umana rivestita a 6 po 'ciascuno.
NOTA: Le cellule devono essere circa il 70% confluenti affinché la trasduzione virale sia in grado di tenerle nella stessa piastra per diversi giorni dopo la trasduzione. Può essere utile seminare a due densità diverse per avere una scelta il giorno successivo per la conversione. - Il giorno dopo la semina, controllare i fibroblasti al microscopio e verificare la densità cellulare (tra il 70 e l'85%) e anche semina in tutto il pozzo per risultati ottimali.
- Trasdurre un pozzo con tutti e quattro i vettori retrovirali (Oct3/4, Klf4, Sox2 e c-Myc) - utilizzare una molteplicità di infezione (MOI) di 10 per la crescita rapida o 15 per i fibroblasti a crescita lenta (l'efficienza di trasduzione dovrebbe superare il 70% o più di cellule positive per ogni vettore). Aggiungere il mix regolare di fibroblasti medio-virale a un volume totale di 1 mL per pozzo e incubare durante la notte a 37 °C in un incubatore dicoltura tissutale di CO 2 al 5%. Lasciare il secondo pozzo non trattato e riportare le cellule all'incubatrice di coltura tissutale.
NOTA: i vettori retrovirali possono essere acquistati da un fornitore o realizzati internamente, i protocolli sono disponibili online32. - Il giorno dopo la trasduzione, lavare le cellule 1x con PBS e aggiungere 1 mL di mezzo fibroblasto fresco.
- Il giorno successivo, cambia medio-medio di conversione. Lavare le celle 1x con PBS per eliminare il mezzo fibroblasto residuo, quindi aggiungere 1 mL di mezzo di conversione. Cambia bene anche i supporti dei media non trattati in supporti di conversione.
NOTA: Alcuni cambiamenti morfologici possono essere osservati anche cambiando il supporto sui fibroblasti che non hanno ricevuto un trattamento vettoriale retrovirale, quindi avere un pozzo non trattato (opzionale) sarà utile quando si determinano gli effetti dei vettori virali. Le cellule devono iniziare a cambiare morfologia 2-4 giorni dopo il passaggio ai supporti di conversione. - Osservare le cellule al microscopio e osservare i cambiamenti nella morfologia (Figura 1). I supporti cellulari devono essere sostituiti giornalmente durante tutto il processo di conversione (1-2 mL di supporti di conversione, tabella 1) e per le successive impostazioni cultura iNPC. Cambiare il mezzo rimuovendo con cura il 70% del mezzo dal pozzo assicurandosi che le cellule rimangano coperte nel restante 30% dei supporti.
NOTA: I media con fattori di crescita in esso devono essere consumati entro 1 settimana dalla preparazione.- Continuare a osservare le cellule e cambiare i supporti ogni giorno (1-2 mL di supporti di conversione).
- Alcune linee cellulari iniziano a formare formazioni rotonde elevate sciolte che crescono in sfere come strutture o sfere neuronali sciolte(Figura supplementare 1 e 19,33). Fare attenzione a non staccare queste cellule. Se le palle si staccano, possono essere raccolte e ri-placcate in un nuovo pozzo rivestito di fibronectina di una piastra a 6 po po '.
NOTA: Se vengono espanse da sole, le cellule avranno una diversità ridotta rispetto alla piastra iniziale e possono rappresentare una linea cellulare distintamente diversa. Si consiglia di combinare queste celle con il resto delle celle convertite al successivo ciclo di divisione.
- Dopo circa 5-6 giorni in mezzi di conversione (fino a 12 giorni per linee cellulari difficili) o quando le cellule diventano molto dense, passare loro 1:2 o massimo 1:3.
NOTA: È molto importante mantenere le cellule ad alta densità durante tutto il processo di conversione.
2. Procedura di conversione e scissione iNPC
- Riscaldare la soluzione di distacco cellulare (ad esempio, Accutasi) e rivestire un numero appropriato di pozzi di un pozzo 6 con fibronectina (1:200 in PBS, 1 mL di volume di rivestimento) per 15-20 minuti a temperatura ambiente. Il rivestimento di fibronectina può essere più lungo senza impatto negativo, ma si deve fare attenzione a non ridurre i tempi di rivestimento.
- Lavare accuratamente le celle con PBS senza staccare le cellule (utilizzare la parete del pozzo per applicare delicatamente PBS alle cellule). Rimuovere con cura pbs con pipette o per aspirazione.
- Aggiungere 0,5 mL di soluzione di distacco cellulare e incubare 2-3 min a 37 °C in un incubatore di coltura tissutale. Controllare al microscopio per verificare che la maggior parte delle cellule si sia staccata. Se tutte le cellule si sono spente, aggiungere 2 mL di nuovi mezzi di conversione e pipettare delicatamente su e giù 2-3 volte per dissociare i grumi (se necessario).
- Raccogliere le celle in un tubo da 15 ml e aggiungere ulteriori 3 ml di mezzi per diluire ulteriormente la soluzione di distacco cellulare. Lavare prima il pozzo con i supporti extra per assicurarsi che tutte le cellule siano state raccolte.
- Centrifuga per 4 min a 200 x g a temperatura ambiente.
NOTA: La conversione di celle o i NPC è estremamente sensibile alla presenza di soluzioni di distacco cellulare nei supporti. È assolutamente necessario rimuovere l'enzima residuo mediante centrifugazione e ritiro del supernatante. - Rimuovere il supernatante dal pellet cellulare e rimescolare le cellule in 1 mL di mezzo fresco. Pipettare delicatamente su e giù 2-3 volte per risolvere i grumi cellulari. Rimuovere la fibronectina dai 6 pozzi rivestiti e aggiungere immediatamente 1 mL di mezzi freschi a ciascun pozzo (non lasciare asciugare la fibronectina). Per un rapporto di divisione di 1:2, aggiungere 0,5 mL della sospensione cellulare in un pozzo e l'altro 0,5 mL in un secondo pozzo.
- Cellule di coltura a 37 °C in un incubatore di coltura tissutale.
- Distribuire le cellule scuotendo delicatamente il pozzo 6 in direzione nord-sud-est-ovest (non circolare) e mettere in incubatrice di coltura tissutale.
- Osservare le cellule al microscopio il giorno successivo e cambiare il supporto (1-2 mL). Cambiare supporto ogni giorno fino a quando le celle non sono pronte per essere divise di nuovo.
NOTA: A questo punto, la proliferazione cellulare dovrebbe iniziare ad accelerare e le cellule dovrebbero essere pronte per una seconda divisione entro 2-3 giorni (4 giorni per linee a crescita molto lenta).- In questa nuova divisione, seminare un pozzo di cellule nei mezzi di conversione e l'altro pozzo in supporti NPC contenenti solo FGF a maggiore concentrazione senza EGF/eparina(tabella 1).
NOTA: alcune linee cellulari raggiungono uno stato stagnante nei supporti di conversione dopo circa 10 giorni e il passaggio ai supporti NPC potrebbe aiutare con la crescita cellulare. Inoltre, i PNG hanno una forma più specifica e più piccola, se coltivati in supporti NPC19. A questo punto, gli iNPC sono pronti per la differenziazione e l'ulteriore utilizzo.
- In questa nuova divisione, seminare un pozzo di cellule nei mezzi di conversione e l'altro pozzo in supporti NPC contenenti solo FGF a maggiore concentrazione senza EGF/eparina(tabella 1).
- Continua a cambiare media (1-2 mL) degli iNPC ogni giorno.
- Espandere i PNG in piatti da 10 cm combinando due o tre pozzi confluenti di un pozzo da 6. Il volume multimediale per piatti da 10 cm è in genere di 12-15 mL.
- Alla successiva divisione, espandere ulteriormente queste cellule a tre o quattro piatti da 10 cm (12-15 mL di media) per generazioni di un gran numero di scorte cellulari. I piatti da 10 cm sono solitamente divisi a 1:3 o 1:4 ogni 3-4 giorni a seconda del tasso di proliferazione.
3. Generare astrociti indotti dai PNG
- Per realizzare astrociti da iNPC freschi, i NPC di semi (in piastre rivestite con fibronectina da 10 cm) direttamente in mezzo astrocito da 10 mL(tabella 1)in modo che siano circa il 10% di confluenza il giorno successivo. Cellule di coltura a 37 °C in un incubatore di coltura tissutale di CO2 al 5%.
NOTA: La densità di semina raccomandata è di solito di 50 μL della risospensione cellulare di un piatto di 10 cm di NPC, a condizione che siano diluiti in un volume finale in base al loro rapporto di divisione (ad esempio, 3 mL per una divisione di 1:3, 4 mL per una divisione 1:4, ecc.). - Cambiare il mezzo (10 mL di supporti astrociti) degli iAs tre giorni dopo la placcatura. Mantenere le celle differenzianti per 5-7 giorni.
NOTA: gli iA non tollerano bene più passaggi, quindi è meglio fare astrociti freschi ogni volta che si dividono i PNG. - Per seminare per la sperimentazione, dividere gli astrociti utilizzando la tripina o la soluzione di distacco cellulare come descritto nei passaggi 2.1-2.7. Le densità di semina raccomandate sono incluse nella tabella 2.
| Tipo di piastra | Astrociti per pozzo |
| 384-beh | 2500 |
| 96-bene | 10000 |
| 24-bene | 40000 |
| 6-bene | 150000 |
La tabella 2. Densità di semina raccomandata di iA per area piastra. Numero tipico di iA seminati per generare un monostrato sulle piastre di coltura tissutale più comuni.
4. Preparazione e sbrinamento delle porzioni per la differenziazione degli astrociti dagli stock di NPC congelati (alternativa alla fase 3)
NOTA: In alternativa al mantenimento degli INPC in coltura, gli astrociti possono anche essere prodotti direttamente da uno stock congelato. Per fare ciò, gli iNPC vengono congelati in porzioni più piccole. La tabella 3 mostra i volumi di congelamento e di scongelamento suggeriti per porzioni da scongelare in un piatto da 10 cm contenente 10 mL di mezzi astrociti.
| Dimensione porzione | Sospensione cellulare (μL) | Mezzi di congelamento (μL) | Volume totale (μL) | Scongela in |
| 4x | 400 | 400 | 800 | Due piatti da 10 cm |
| 2x | 200 | 200 | 400 | Un piatto da 10 cm |
La tabella 3. Istruzioni su come partizionare iNPC per generare iA. Proporzione di supporti di sospensione e congelamento iNPC per generare porzioni. Si noti che la concentrazione finale di DMSO è del 10% quando la sospensione cellulare viene mescolata con mezzi di congelamento.
- Per realizzare astrociti da scorte di iNPC congelate, rimuovere il flaconcino di stock di porzioni dal serbatoio di stoccaggio dell'azoto liquido e scongelare rapidamente a 37 °C. Non appena le cellule vengono scongelate, la soluzione di cella della pipetta in un tubo da 15 ml contenente mezzi astrociti da 5 ml.
- Centrifuga per 4 min a 200 x g e temperatura ambiente. Rimuovere il supernatante e resuspend in 1 mL di mezzo fresco di astrocito.
- Aggiungere 9 mL di mezzo di astrocita fresco a un piatto rivestito di fibronectina di 10 cm e aggiungere 1 mL di soluzione cellulare. Distribuire delicatamente le cellule nel movimento nord-sud-est-ovest. Cellule di coltura a 37 °C in un incubatore di coltura tissutale di CO2 al 5%.
Representative Results
Questo protocollo consente la rapida e facile generazione di iNPC direttamente dai fibroblasti della pelle umana utilizzando retrovirus contenenti i fattori Yamanaka. Questo metodo consente di bypassare lo stato delle cellule staminali e la necessità di selezione clonale, evitando così variazioni clonali. Passi importanti da tenere a mente mentre le cellule sono sottoposte al processo di conversione sono la densità di semina dei fibroblasti, il pH del supporto e il mantenimento delle cellule a una confluenza ottimale. Esempi di confluenza di divisione ottimale e cambiamenti morfologici durante il processo di conversione sono disponibili nella figura 1.
Figura 1. Immagini rappresentative del processo di conversione dopo aver aggiunto il mix retrovirale di fattori Yamanaka. I fibroblasti sono stati seminati e trasdotti ventiquattro ore dopo con fattori Yamanaka. Due giorni dopo il virus (DPV), i supporti sono stati modificati in supporti di conversione. Le celle sono state coltivate in supporti di conversione fino a quando non sono state pronte per il passaggio (13 DPV). Le cellule sono state seminate post passaggio per raggiungere l'80% di confluenza il giorno seguente (14 DPV). Passaggi successivi mantennero questa densità fino a quando le cellule progenitrici neuronali iniziano a dividersi rapidamente. La barra di scala è di 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Al termine del processo di conversione, i PNG mostreranno un'espressione fortemente ridotta o nessuna espressione di marcatori e morfologia dei fibroblasti ed esprimeranno marcatori cellulari specifici NPC (Figura 2). Inoltre, possono anche essere utilizzati per generare diverse linee cellulari, come iN, iOs e iAs.
Figura 2. Le celle che subiscono il processo di conversione esprimono marcatori specifici della cella. I fibroblasti del paziente (A), le cellule progenitrici neuronali indotte (INPC (B) e le cellule astrociti indotte (IAs (C) sono state sedate su coverlips di vetro in una piastra trattata con coltura tissutale di 24 pozzi. Le cellule sono state immunososteniate per: marcatori cellulari specifici per fibroblasti (A), Vimentina (verde) e TE7 (rosso), marcatore cellulare specifico iNPC (B), Nestin (rosso) e marcatore cellulare iAs (C) GFAP (viola) e marcatore iNPC Nestin (verde). La barra di scala è di 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella nostra esperienza, gli IA in particolare sono molto preziosi per i test dei farmaci e dei meccanismo delle malattie in quanto possono essere generati in popolazioni pure (98% o più cellule positive GFAP29)a un numero elevato riproducibile. Gli iA possono essere differenziati dagli iNPC prendendo una piccola aliquota di cellule durante la scissione o una porzione iNPC precedentemente congelata e placcando direttamente nei mezzi astrociti. Considerazioni importanti durante questo processo sono il mantenimento della densità iniziale di semina degli INPC bassa (Figura 3 e Figura 4), poiché è stato dimostrato che un'alta densità ostacola il processo di differenziazione (Figura 4) e presta ulteriore attenzione al pH dei media, poiché l'acidificazione può attivare anche astrociti sani.
Figura 3. Immagini rappresentative del processo di generazione degli IA dagli INPC. Gli iNPC sono seminati in supporti astrociti (tabella 1) a bassa densità di semina. Una buona densità di semina è di circa il 10% il primo giorno dopo la semina (DPS) (a sinistra); tuttavia, questa densità può essere regolata in base al tasso di crescita delle cellule. La morfologia tipica degli iAs può essere osservata dopo 5 DPS (al centro). In alcuni casi, si può osservare una morfologia aberrante degli astrociti, con lunghe estensioni appuntite. Questo cambiamento è indicativo dell'attivazione degli astrociti e può essere secondario allo stato della malattia o a tecniche di lavorazione errate (a destra). La barra di scala è di 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. La densità di semina iNPC influisce sull'efficienza di differenziazione degli iAs. Le linee iNPC di controllo sono state sementi a bassa (A) e alta densità (B) nei mezzi astrociti per dimostrare gli effetti della densità di semina sulla differenziazione. 5 DPS, la linea a bassa densità esprime marcatori specifici per astrociti, mentre la linea ad alta densità mostra una miscela di marcatori iNPC e iAs con una morfologia marcata simile a iNPC. La barra di scala è di 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1. Cifre aggiuntive del processo di conversione dopo aver aggiunto il mix retrovirale di fattori Yamanaka. Immagini del processo di conversione a 12 DPV (1 giorno prima del passaggio) e 19 DPV (6 giorni dopo il passaggio). Si noti la differenza di morfologia tra le cellule prima e dopo il passaggio, a 12 cellule DPV hanno una morfologia della struttura simile a una palla. Dopo un passaggio e diversi giorni sui supporti di conversione (tabella 1) le celle iniziano a visualizzare una morfologia simile a un NPC. La barra di scala è di 200 μm. Fare clic qui per scaricare questo file.
Discussion
In sintesi, la conversione diretta è un metodo facile e veloce per generare cellule progenitrici neuronali indotte dai fibroblasti cutanei del paziente. Questo metodo è vantaggioso per la sua velocità e per il gran numero di celle generate che sono facili da mantenere. Inoltre, l'aumento delle prove suggerisce che i metodi di riprogrammazione diretta rimuovono meno segni epigenetici rispetto alla classica tecnologia di riprogrammazione iPSC,lasciando quindi l'ambiente della malattia più intatto 4,7,8. La differenziazione degli iNPC agli astrociti è molto semplice e altamente riproducibile anche tra più laboratoriindipendenti 19,29,33. Gli iNPC possono essere congelati in piccole porzioni e scongelati direttamente a scopo di differenziazione, il che aiuta a ridurre la variazione tra gli esperimenti poiché i numeri di passaggio possono essere mantenuti simili. Gli astrociti svolgono un ruolo cruciale nella progressione della malattia in molte malattie neurologiche e sono quindi un tipo di cellula interessante con cui lavorare. Gli astrociti possono essere utilizzati per studi meccanicistici, studi metabolici o test farmacologici e di solito vengono coltivati come monostrati. Inoltre, gli astrociti possono essere combinati in sistemi di co-coltura con neuroni del topo o umani per valutare l'impatto degli astrociti sulla sopravvivenza e sulla morfologia neuronale, entrambi buoni readout per il testfarmacologico 34.
Per utilizzare con successo questo protocollo, è necessario tenere a mente alcuni punti e potenziali limitazioni. I fibroblasti della pelle umana, ad esempio, variano notevolmente nel loro tasso di divisione cellulare e nella risposta ai vettori virali. Poiché queste non sono linee cellulari standardizzate, sono variabili come l'umanità stessa, ogni linea è diversa. Per quanto riguarda molti metodi di riprogrammazione, è più facile riprogrammare i fibroblasti che hanno un tasso di divisione cellulare da moderato a veloce rispetto alle cellule che si stanno a malapena replicando. Il tasso di replicazione può essere influenzato dalla qualità della biopsia cutanea e dalla lavorazione stessa, dal numero di passaggio dei fibroblasti e dalla manipolazione. Quando si lavora con i fibroblasti cutanei primari, è importante non lasciare che le cellule disomogenee per evitare l'induzione della senescenza. Se i fibroblasti non crescono bene, è meglio provare un nuovo stock o un passaggio inferiore, anche se in alcuni casi, anche la malattia stessa potrebbe svolgere un ruolo. La divisione cellulare può talvolta essere migliorata utilizzando il 15% o il 20% di FBS nel supporto dei fibroblasti rispetto allo standard 10%.
La qualità dei vettori virali di riprogrammazione è di grande importanza per il successo. Nelle nostre mani, i vettori retrovirali erano più efficienti rispetto ai vettori lentivirali o ad altri virus non integranti; tuttavia, questo potrebbe dipendere dalla qualità e dalla purezza del vettore virale. I kit vettoriali retrovirali commerciali di solito specificano la concentrazione del vettore virale e spesso anche una molteplicità di infezione per una certa linea cellulare. È importante tenere presente che i fibroblasti primari differiscono dalla linea cellulare utilizzata dalle aziende per determinare l'assorbimento del vettore virale. Inoltre, anche quando si ordina lo stesso kit commerciale, la variazione tra i lotti è comune. Inoltre, l'assorbimento dei vettori virali varia anche tra le linee cellulari dei fibroblasti. Alcune linee potrebbero essere più sensibili e quindi le cellule trasdutte potrebbero morire, mentre altre linee cellulari potrebbero essere più resistenti all'assorbimento virale. Pertanto, determinare l'efficienza di trasduzione per una data linea cellulare può essere importante soprattutto se la linea cellulare sta crescendo lentamente o i precedenti tentativi di conversione non sono riusciti. Nelle nostre mani, il modo migliore per valutare quanto di uno specifico vettore retrovirale è necessario per la conversione è eseguire una colorazione immunofluorescente con diverse diluizioni del vettore virale. Il numero di cellule che esprimono il transgene per ogni vettore può quindi essere conteggiato, con l'obiettivo di un'efficienza di trasduzione del 70% o superiore. Nella nostra esperienza, MOI simili possono essere utilizzati per la maggior parte delle linee cellulari, tuttavia il MOI può essere regolato se necessario.
Durante il processo di conversione, è fondamentale non dividere le celle troppo presto. Il tempo fino a quando le cellule sono pronte per essere divise dipende da più fattori tra cui la linea cellulare primaria e le sue caratteristiche, la qualità del vettore virale utilizzato e la qualità dei media. È importante sottolineare che il tasso di successo della conversione è molto più alto quando le cellule sono mantenute ad alta densità. Anche se le cellule iniziano a cambiare morfologia, è meglio lasciare le cellule nel primo pozzo più a lungo che dividerle prematuramente. Se la divisione avviene troppo presto, la conversione può arrestarsi nel suo progresso e portare le cellule a differenziarsi in forma e comportamento simili a fibroblasti. Inoltre, diluirli troppo presto può comportare corpi cellulari più allungati rispetto ai corpi cellulari piccoli e compatti dei PNG osservati in precedenza. Pertanto, le prime divisioni dovrebbero sempre essere conservatrici; è meglio mantenere le cellule troppo dense con una divisione 1:1 o 1:2 rispetto a diluirle troppo. Una morte cellulare è prevista dopo la divisione iniziale. Naturalmente, le cellule sembrano sempre peggiori (piatte) il primo giorno dopo la scissione, il che è normale. I migliori giudizi sulla forma della cella dovrebbero essere fatti 2-3 giorni dopo. È importante sottolineare che anche la qualità dei fattori di crescita e delle componenti dei media è fondamentale. È importante preparare piccole quantità di supporti contenenti fattori di crescita in modo che i supporti completamente preparati siano utilizzati solo per 5-7 giorni al massimo. Non mantenere il supporto a temperatura ambiente o a 37°C per lunghi periodi di tempo. Utilizzare rapidamente e conservare in frigorifero non appena viene eseguita la modifica del supporto. Inoltre, mantenere basso il volume dei supporti a 1 mL anziché a 2 mL può aiutare soprattutto per le linee cellulari più resistenti alla conversione. Se le cellule consumano rapidamente il supporto, che può essere osservato da un cambiamento nel colore del supporto da rosso a giallo (tasso di acidificazione), regolare il volume del supporto fino a 2 mL. Il rapido consumo di media è un segnale positivo e spesso osservato nelle fasi successive della conversione insieme all'aumento della proliferazione.
I PNG sono anche molto sensibili alla presenza di accutasi nei media ed è molto importante mantenere breve il tempo di incubazione dell'accutasi. Si consiglia un periodo di incubazione di 2-4 minuti, controllare frequentemente le cellule al microscopio per vedere quando si sono staccate. È essenziale centrifugare le cellule dopo la scissione per rimuovere il mix enzimatico dal supporto. È anche importante tenere a mente il numero di passaggio in quanto le linee cellulari possono cambiare con una ristrutturazione estesa che porta all'alterazione dei profili di espressione. Pertanto, è importante congelare molti stock cellulari nei primi passaggi. Le cellule devono essere congelate in 10% DMSO e 90% mezzi NPC e conservate a lungo termine in azoto liquido. A causa della mancanza di siero in questo supporto è fondamentale garantire un congelamento lento utilizzando camere di congelamento e una volta congelato durante la notte, trasferire immediatamente all'azoto liquido. Mentre nessuna selezione clonale viene eseguita in questo protocollo, è possibile che la coltivazione e la passaging estese portino alla selezione naturale di una popolazione cellulare iniziale con un tasso di crescita e sopravvivenza favorevole. Pertanto, è importante tenere a mente il numero di passaggio e la manipolazione quando si eseguono esperimenti. Preferiamo usare passaggi più bassi per esperimenti, se possibile, non superiamo il passaging delle linee cellulari per più di 20 volte. Poiché i PNG crescono rapidamente, un gran numero di stock può essere congelato a passaggi più bassi per gli esperimenti. Le linee cellulari con tassi di crescita particolarmente elevati sono a più alto rischio di acidificazione dei media. Pertanto, man mano che le linee cellulari crescono con velocità diverse, potrebbe essere necessario regolare la quantità di supporti in base alla proliferazione. Se le cellule vengono continuamente lasciate in mezzi altamente acidificati, possono influenzare la salute sia delle linee cellulari di controllo che di malattia. Ciò fa sì che anche gli astrociti sani diventino reattivi, influenzando il loro uso in ulteriori differenziazioni ed esperimenti.
Per la differenziazione degli astrociti, è importante mantenere le cellule a bassa densità poiché l'alta densità impedirà alle cellule di differenziarsi e continuerà a prolifere a tassi più elevati. Pertanto, la densità di semina deve essere regolata per ogni linea cellulare in base al loro tasso di proliferazione. Si consiglia di provare diverse densità di semina ed eseguire colorazioni / RT-PCR con marcatori astrociti per garantire una corretta differenziazione. La qualità delle IAs può essere valutata insieme a controlli sani utilizzando saggi di co-coltura con neuroni. A condizione che la patologia della malattia non porti a un fenotipo reattivo, i neuroni dovrebbero rimanere vitali a contatto con gli IA per diversi giorni. La morfologia degli astrociti può variare notevolmente tra le singole linee cellulari e può essere influenzata anche dal fenotipo della malattia. Inoltre, nelle malattie in cui gli astrociti sono fortemente influenzati, potrebbero mostrare un fenotipo reattivo con estensioni grandi e allungate.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo tutti i pazienti e i volontari sani per aver donato campioni critici agli studi di ricerca. Inoltre, ringraziamo Rochelle Rodrigo per la continua assistenza tecnica esperta nella coltura tissutale e Laura Ferraiuolo per aver confermato autonomamente la tecnica nel suo laboratorio come collaboratrice. Questo lavoro ha ricevuto finanziamenti dai National Institutes of Health Grants R01 NS644912-4 e RC2 NS69476-01 (ad A.L.S.) e dal Packard Center for ALS Research Grant P2ALS e dalla Helping Link Foundation. K.M. ha anche ricevuto finanziamenti dalla Fondazione nazionale svizzera per la scienza, nonché dal Premio per lo sviluppo di giovani ricercatori dall'Associazione per la distrofia muscolare, dal Rett Syndrome Research Trust e dalle famiglie delle fondazioni SCN2A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100mm x 2mm Style dish, Cell culture treated, Nonpyrogenic | Corning | 430167 | Tissue culture |
| 15 ml conical screw cap centrifuge tubes, copolymer polypropylene | USA Scientific | 1475-1611 | Used for lifting and centrifuge cells |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1500-1811 | Media preparation |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Antibiotic with antifungal activity for media preparation |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen | 17504044 | For NPC and base media |
| Cryogenic vials 1.2ML | Corning | CLS430658-500EA | For freezing cell stocks |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569010 | For fibroblast and Astrocyte media |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565042 | For NPC and base media |
| DMSO | Sigma | D2438-50ML | For freezing cell stocks |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190136 | Referred in protocol as PBS. For fibronectin dilution and cell wash |
| EZ Retrovirus iPSC Reprogramming Kit | ALSTEM | RF101 | Retrovirus containing the Yamanaka factors. Virus can also be made in-house. |
| Fetal Bovine Serum, certified | Gibco | 16000-036 | Referred in protocol as FBS . For Fibroblast and Astrocyte media |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use | Fisher | 14-955-461 | Filter media (50mL) |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149-10KU | Referred in protocol as Heparin. Used in conversion media. Powder diluted in ultrapure water. Final stock concentration of 5000X |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore Sigma | FC010-10MG | Referred in protocol as Fibronectin, used in 1:200 dilution for coating. |
| Isopropanol (technical grade) | Fisher Scientific | S25372A | For freezing cell stocks |
| Mr. Frosty | Thermo Fisher | 5100-0001 | For freezing cell stocks |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | For Astrocyte, NPC and base media |
| Recombinant Human EGF | Preprotech | AF-100-15 | Referred in protocol as EGF, used in conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
| Recombinant Human FGF-basic | Preprotech | 100-18B | Referred in protocol as FGF, used in NPC and conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | Referred in protocol as Accutase. Used for lifting during the conversion process and NPCs. |
| Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System | Millipore Sigma | S2GPU05RE | Media filtration |
| Tissue culture plate, 6 well, Flat bottom with Low evaporation lid | Fisher | 08-772-1B | Tissue culture |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Invitrogen | 25300062 | Lifting of Fibroblasts and Astrocytes |
| Whatman Puradisc 25 syringe filters, 0.2 μm, PES sterile | Millipore Sigma | 80-2502 | Filter media (50mL) |
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