Summary

Kemisk konjugation av en renad DEC-205-riktad antikropp med fulllängdsprotein för inriktning på mus dendritiska celler in vitro och in vivo

Published: February 05, 2021
doi:

Summary

Vi beskriver ett protokoll för kemisk konjugation av modellen antigen ovalbumin till en endocytosis receptor-specifika antikropp för in vivo dendritic cell inriktning. Protokollet omfattar rening av antikroppen, kemisk konjugation av antigenet samt rening av konjugat och verifiering av effektiv konjugation.

Abstract

Riktad antigen leverans till kors-presentera dendritiska celler (DC) in vivo inducerar effektivt T effector cell svar och visar ett värdefullt tillvägagångssätt i vaccin design. Antigen levereras till DC via antikroppar som är specifika för endocytosreceptorer som DEC-205 som inducerar upptag, bearbetning och MHC klass I- och II-presentation.

Effektiv och tillförlitlig konjugation av önskat antigen till en lämplig antikropp är ett kritiskt steg i DC-inriktning och beror bland annat på antigenets format. Kemisk konjugation av protein i full längd till renade antikroppar är en möjlig strategi. Tidigare har vi framgångsrikt etablerat korslänkning av modellen antigen ovalbumin (OVA) och en DEC-205-specifik IgG2a antikropp (αDEC-205) för in vivo DC inriktning studier på möss. Det första steget i protokollet är rening av antikroppen från supernatanten av NLDC (icke-lymfoida dendritiska celler)-145 hybridom genom affinitetskromatografi. Den renade antikroppen aktiveras för kemisk konjugation av sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidometyl] cyklohexan-1-karboxoxylat) samtidigt som sulfhydrylgrupperna i OVA-proteinet exponeras genom inkubation med TCEP-HCl (tris (2-karboxytyl) fosfinhydroklorid). Överskott av TCEP-HCl och sulfo-SMCC avlägsnas och antigenet blandas med den aktiverade antikroppen för koppling över natten. Den resulterande konjugatet αDEC-205/OVA är koncentrerad och befriad från obundet OVA. Framgångsrik konjugation av OVA till αDEC-205 verifieras av western blot analys och enzym-linked immunosorbent assay (ELISA).

Vi har framgångsrikt använt kemiskt tvärbundna αDEC-205/OVA för att inducera cytotoxiska T-cellssvar i levern och för att jämföra olika adjuvanser för deras potential att inducera humoral och cellulär immunitet efter in vivo-inriktning på DEC-205+ DC. Utöver detta erbjuder sådana kemiskt kopplade antikropps-/antigenkonjugater värdefulla verktyg för effektiv induktion av vaccinsvar på tumörantigener och har visat sig vara överlägsna klassiska immuniseringsmetoder när det gäller förebyggande och behandling av olika typer av tumörer.

Introduction

Dendritiska celler (DC) är centrala aktörer i immunsystemet. De är en mångsidig grupp celler specialiserade på antigenpresentation och deras huvudsakliga funktion är att överbrygga medfödd och adaptiv immunitet1,2. Viktigt är att DC inte bara spelar en viktig roll i effektiva och specifika patogenstyrda svar utan också är involverade i många aspekter av antitumörimmunitet1,3.

På grund av deras exklusiva roll i värdimmunitet kom DC i fokus som målceller för vaccination4. Ett tillvägagångssätt är att rikta antigener till DC in vivo för att inducera antigenspecifika immunsvar och under de senaste åren har ett stort antal studier ägnats åt att definiera lämpliga receptorer och inriktningsstrategier1,4. Ett exempel är C-typ lektinreceptorn DEC-205, som kan riktas mot DEC-205-specifika antikroppar för att inducera endocytos. Viktigt är att DEC-205-inriktning i kombination med lämpliga adjuvanser har visat sig effektivt inducera långlivade och skyddande CD4+ och CD8+ T-celler, liksom antikroppssvar, även mot tumörantigener3,5,6,7,8,9.

Det finns ett antal studier som visar att konjugerade antigener riktade till DC är överlägsna fria icke-konjugerade antigen3,5,10,11,12. Detta gör konjugationen av antigenet till respektive DC-inriktning moiety ett centralt steg i DC-inriktningsmetoder. När det gäller dc-inriktning via antikroppar eller antikroppsfragment kan antigener vara antingen kemiskt eller genetiskt kopplade och endera strategin ger sina egna (dis)fördelar1. Å ena sidan finns det i genetiskt konstruerade antikropps-antigenkonstruktioner en kontroll över antigendosen samt den plats som ger överlägsen jämförbarhet mellan del1. Samtidigt behöver dock kemisk konjugation mindre förberedelse och ger större flexibilitet, särskilt när man försöker testa och jämföra olika antigener och/eller vaccinationsstrategier i experimentella och prekliniska modeller.

Här presenterar vi ett protokoll för effektiv och tillförlitlig kemisk konjugation av ovalbumin (OVA) som modellproteinantigen till en DEC-205-specifik IgG2a-antikropp (αDEC-205) lämplig för in vivo DC-inriktning hos möss. Först renas αDEC-205 från NLDC-145 hybridomceller13. För kemisk konjugation används heterobifunctional tvärlänk sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC), som innehåller NHS (N-hydroxysuccinimide) ester- och maleimidegrupper, vilket möjliggör kovalent konjugation av amine- och sulfhydrylinnehållande molekyler. Specifikt reagerar de primära aminer av antikroppen initialt med sulfo-SMCC och den resulterande maleimidaktiverade αDEC-205 reagerar sedan med det sulfhydrylinnehållande OVA-proteinet reducerat genom TCEP-HCl (Tris(2-karboxytyl) fosfinhydroklorid). Slutprodukten är kemiskt konjugerad αDEC-205/OVA(figur 1). Utöver kemisk konjugation i sig beskriver vårt protokoll avlägsnande av överskott av OVA från konjugat samt verifiering av framgångsrik konjugation genom western blot analys och en specifik enzym-linked immunosorbent analys. Vi har framgångsrikt använt detta tillvägagångssätt tidigare för att kemiskt konjugera OVA och andra proteiner eller immunogenic peptider till αDEC-205. Vi visar effektiv bindning till CD11c+ celler in vitro samt effektiv induktion av cellulär och humoral immunitet in vivo.

Visst finns det nackdelar med denna metod som i parti-till-parti jämförbarhet och i den exakta doseringen av antigenet inom den slutliga konjugaten. Icke desto mindre ger kemisk konjugation experimentell flexibilitet i valet av antikropp och proteinantigen jämfört med genetiskt konstruerade konstruktioner. Därför anser vi att detta tillvägagångssätt är särskilt värdefullt vid utvärdering av olika antigener för deras effektivitet i DC-inriktning i prekliniska musmodeller, viktigt även i samband med specifika antitumör immunsvar.

Protocol

Alla beskrivna djurförsök godkändes av den lokala myndigheten (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit; filnummer 33.12-42502-04-10/0108) och utfördes i enlighet med nationella och institutionella riktlinjer. 1. Produktion av αDEC-205 från hybridom cellinjen NLDC-145 För antikroppsproduktion, tina kryopreserverade NLDC-145-celler som producerar αDEC-205 vid 37 °C i ett vattenbad. Expandera cellerna vid 37 °C och 5% CO2. Två…

Representative Results

Kemisk konjugation av αDEC-205 till OVA-protein med hjälp av detta protokoll möjliggör vanligtvis effektiv generering av αDEC-205/OVA för in vivo DC-inriktningsmetoder. Det finns olika strategier för att verifiera själva tekniken och för att testa funktionaliteten hos den resulterade konjugaten. Western blot analys och ELISA används för att verifiera framgångsrik konjugation och samtidigt upptäcka potentiellt vänsterfri OVA (figur 2). <…

Discussion

Kemisk konjugation av en endocytosreceptorspecifik antikropp och ett proteinantigen ger ett effektivt och, viktigast av allt, också flexibelt tillvägagångssätt för in vivo DC-inriktning i prekliniska musmodeller. Med vårt protokoll tillhandahåller vi ett effektivt tillvägagångssätt för framgångsrik konjugation av modellantigenet OVA till en DEC-205-specifik IgG-antikropp.

I vårt protokoll renas αDEC-205 från en hybridomcelllinje och tidigare har vi renat antikroppen med…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna tackar S. Prettin för expertteknisk hjälp. Detta arbete stöddes av ett bidrag från Helmholtz Association of German Research Centers (HGF) som tillhandahölls som en del av Helmholtz Alliance ”Immunotherapy of Cancers’ (HCC_WP2b).

Materials

antibody buffer 2 % 2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T
antibody buffer 5 % 5 % milk powder (w/v) in TBS-T
blocking buffer (ELISA) 10 % FBS in PBS
blocking buffer 4 % 4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T
blocking buffer 10 % 10 % milk powder (w/v) in TBS-T
cell culture flask T25 Greiner Bio-One 690175 we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 )
cell culture flask T75 Greiner Bio-One 658175 we use standard CELLSTAR  filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195) 
cell culture flask T175 Greiner Bio-One 661175 we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195)
centrifugal concentrator MWCO 10 kDa Sartorius VS2001 Vivaspin 20 centrifugal concentrator
centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 – 20 ml Thermo Fisher Scientific 88532 Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available 
centrifuge bottles Nalgene 525-2314 PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany
coating buffer (ELISA) 0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6)
desalting columns MWCO 7 kDa Thermo Fisher Scientific 89891 Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL
detection reagent ELISA (HRPO substrate) Sigma-Aldrich/Merck T8665-100ML 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system
detection reagent western blot (HRPO substrate) Roche/Merck 12 015 200 01 Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche)
dialysis tubing MWCO 12 – 14 kDa SERVA Electrophoresis 44110 Visking dialysis tubing, 16 mm diameter
ELISA 96-well plate Thermo Fisher Scientific 442404 MaxiSorp Nunc-Immuno Plate
fetal calf serum PAN-BIOtech P40-47500 FBS Good forte
ISF-1 medium Biochrom/bioswisstec F 9061-01
milk powder Carl Roth T145.2 powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket
NLDC-145 hybridoma ATCC HB-290 if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC
non-reducing SDS sample buffer 4 x  for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue
ovalbumin Hyglos (via BioVendor) 321000 EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used
PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles Nunc In Vitro 734-2394 standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 – 500 ml volume; obtained from VWR, Germany  
pH indicator strips Merck 109535 pH indicator strips 0-14
polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot) Jackson ImmunoResearch  112-035-062 obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot
polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody  (ELISA) Jackson ImmunoResearch  112-035-068 obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA
polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot) Jackson ImmunoResearch  111-035-045  obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot
polyclonal rabbit αOVA (ELISA) Abcam ab181688 used at 3 ng/µl
polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot) OriGene R1101 used at 1:3,000 for western blot
Protein G Sepharose column Merck/Millipore P3296 5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)
protein standard Thermo Fisher Scientific 26616 PageRuler Prestained Protein ladder 10 – 180 kDa
PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane Merck/Millipore IPVH00010 immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane
rubber plug Omnilab 5230217 DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm)
silicone tube Omnilab 5430925 DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm)
Slim-Fast we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder
stopping solution (ELISA) 1M H2SO4
sulfo-SMCC Thermo Fisher Scientific 22322 Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg)
syringe filter unit 0.22 µm  Merck/Millipore SLGV033RS Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized 
syringe 10 ml Omnilab Disposable syringes Injekt® Solo B.Braun
Sterican® cannulas B. Braun Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow
TBS-T Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20
TCEP-HCl Thermo Fisher Scientific A35349
tubing connector Omnilab Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube

References

  1. Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy. Pharmaceutics. 12 (7), 12070663 (2020).
  2. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
  3. Wculek, S. K., et al. Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy. Nature Reviews: Immunology. 20 (1), 7-24 (2020).
  4. Kastenmuller, W., Kastenmuller, K., Kurts, C., Seder, R. A. Dendritic cell-targeted vaccines–hope or hype. Nature Reviews: Immunology. 14 (10), 705-711 (2014).
  5. Bonifaz, L. C., et al. In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination. Journal of Experimental Medicine. 199 (6), 815-824 (2004).
  6. Boscardin, S. B., et al. Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 599-606 (2006).
  7. Hossain, M. K., Wall, K. A. Use of Dendritic Cell Receptors as Targets for Enhancing Anti-Cancer Immune Responses. Cancers. 11 (3), 11030418 (2019).
  8. Johnson, T. S., et al. Inhibition of melanoma growth by targeting of antigen to dendritic cells via an anti-DEC-205 single-chain fragment variable molecule. Clinical Cancer Research. 14 (24), 8169-8177 (2008).
  9. Trumpfheller, C., et al. The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2574-2579 (2008).
  10. Idoyaga, J., et al. Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2384-2389 (2011).
  11. Sancho, D., et al. Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin. Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2098-2110 (2008).
  12. Volckmar, J., et al. Targeted antigen delivery to dendritic cells elicits robust antiviral T cell-mediated immunity in the liver. Scientific Reports. 7, 43985 (2017).
  13. Kraal, G., Breel, M., Janse, M., Bruin, G. Langerhans’ cells, veiled cells, and interdigitating cells in the mouse recognized by a monoclonal antibody. Journal of Experimental Medicine. 163 (4), 981-997 (1986).
  14. Volckmar, J., et al. The STING activator c-di-AMP exerts superior adjuvant properties than the formulation poly(I:C)/CpG after subcutaneous vaccination with soluble protein antigen or DEC-205-mediated antigen targeting to dendritic cells. Vaccine. 37 (35), 4963-4974 (2019).

Play Video

Cite This Article
Volckmar, J., Knop, L., Hirsch, T., Frentzel, S., Erck, C., van Ham, M., Stegemann-Koniszewski, S., Bruder, D. Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (168), e62018, doi:10.3791/62018 (2021).

View Video