Summary
שיטה מעודנת של ניקוי רקמות פותחה והוחלה על לב העכבר הבוגר. שיטה זו נועדה לנקות רקמת לב צפופה ו autofluorescent, תוך שמירה על פלואורסצנטיות פיברובלסט שכותרתו המיוחסת לאסטרטגיה כתב גנטי.
Abstract
מחלות לב וכלי דם הן הגורם השכיח ביותר לתמותה ברחבי העולם, והוא מסומן לעתים קרובות על ידי פיברוזיס לב מוגבר שיכול להוביל נוקשות חדרית מוגברת עם תפקוד לב שונה. עלייה זו פיברוזיס חדרית לב נובעת הפעלה של פיברובלסטים תושב, אם כי איך תאים אלה פועלים בתוך הלב 3 מימדי (3-D), בבסיס או לאחר ההפעלה, אינו מובן היטב. כדי לבחון כיצד פיברובלסטים תורמים למחלות לב ולדינמיקה שלהם בלב תלת-ממדי, פותחה שיטת ניקוי והדמיה מעודנת המבוססת על CLARITY המציגה פיברובלסטים לבביים בעלי תווית פלואורסצנטית בתוך לב העכבר כולו. פיברובלסטים תושבי רקמות תויגו גנטית באמצעות רוזה26-loxP-eGFP עכברים כתב פלורסנט חצה עם פיברובלסט הלב המבטא Tcf21-MerCreMer לדפוק בקו. טכניקה זו שימשה כדי לבחון דינמיקה לוקליזציה fibroblast לאורך כל החדר השמאלי הבוגר בעכברים בריאים במודלים עכבר סיבי של מחלות לב. מעניין, במודל פציעה אחד, דפוסים ייחודיים של פיברובלסטים לב נצפו בלב העכבר הפצוע שעקב אחר רצועות של סיבים עטופים בכיוון הכווץ. במודלים של פגיעה איסכמית, התרחש מוות פיברובלסטי, ואחריו אכלוס מחדש מאזור הגבול האוטם. באופן קולקטיבי, טכניקת הבהרה זו של רקמת לב מעודנת ומערכת הדמיה דיגיטלית מאפשרת הדמיה תלת-ממדית של פיברובלסטים לבביים בלב ללא מגבלות של כשל חדירת נוגדנים או בעיות קודמות סביב פלואורסצנטיות אבודה עקב עיבוד רקמות.
Introduction
למרות cardiomyocytes מהווים את שבר הנפח הגדול ביותר בלב, fibroblasts לב הם בשפע יותר והם מעורבים באופן קריטי בוויסות התכונות המבניות הבסיסיות של איבר זה. פיברובלסטים לבביים הם ניידים מאוד, מגיבים מכנית, ופנוטיפיים הנעים בהתאם למידת ההפעלה שלהם. פיברובלסטים לב נחוצים כדי לשמור על רמות נורמליות של מטריצה חוץ תאית (ECM), וייצור ECM מעט מדי או יותר מדי על ידי תאים אלה יכול להוביל למחלה1,2,3. בהתחשב בחשיבותם במחלות, פיברובלסטים לב הפכו לנושא חשוב יותר ויותר של חקירה לקראת זיהוי אסטרטגיות טיפול חדשניות, במיוחד בניסיון להגביל פיברוזיס מוגזם4,5,6,7. לאחר פציעה, fibroblasts להפעיל ולהבדיל לתוך סוג תא סינתטי יותר המכונה myofibroblast, אשר יכול להיות שגשוג להפריש ECM בשפע, כמו גם יש פעילות התכווצות המסייעת לשפץ את החדרים.
בעוד פיברובלסטים לב הוערכו בהרחבה עבור המאפיינים שלהם בתרבויות 2-D6,8,9,10, הרבה פחות מובן של המאפיינים שלהם ואת הדינמיקה בלב חי 3-D, או בבסיס או עם גירוי המחלה. כאן, שיטה מעודנת תוארה רקמה לנקות את לב העכבר הבוגר תוך שמירה על פלואורסצנטיות של fibroblasts שכותרתו עם Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer מערכת כתב גנטי. בתוך הלב, Tcf21 הוא סמן ספציפי יחסית של פיברובלסטים שקטים4. לאחר טמוקסיפן ניתנת כדי להפעיל את החלבון MerCreMer בלתי ניתן להסבר, למעשה כל fibroblasts רגיעה לצמיתות להביע חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGFP) מן הלוקוס Rosa26, אשר מאפשר המעקב שלהם vivo.
קיימים פרוטוקולים רבים לניקוי רקמות מבוססים, שחלקם הוחלו על הלב11,12,13,14,15,16,17. עם זאת, רבים של ריאגנטים המשמשים פרוטוקולים ניקוי רקמות שונים נמצאו להרוות אותות פלואורסצנטיים אנדוגני18. בנוסף, הלב הבוגר קשה לנקות בשל שפע של חלבונים המכילים קבוצת heme המייצרים שפעת אוטומטית19. לכן, מטרת פרוטוקול זה הייתה לשמר פלואורסצנטיות סמן פיברובלסט עם עיכוב בו זמנית של שפעת אוטומטית heme בלב הבוגר הפצוע להדמיה אופטימלית 3-D ב vivo12,13,14,16,17,20.
מחקרים קודמים שניסו לבחון את פיברובלסט הלב ב vivo השתמשו נוגדנים perfused לתייג תאים אלה, אם כי מחקרים כאלה היו מוגבלים על ידי חדירת נוגדנים ומבנה כלי דם לב14,16,17,20. למרות סלמון ואח 'הראו ניקוי רקמות עם שמירה על פלואורסצנטיות עצבית אקטואלי בלב יילודים, ו Nehrhoff et al. הראו תחזוקה של פלואורסצנטיות סימון תאים מיאלואידיים, שמירה על פלואורסצנטיות אנדוגני דרך כל הקיר החדרי עדיין לא הוכח, כולל הדמיה של fibroblasts לב למבוגרים בבסיס או בעקבות פציעה13,20. פרוטוקול ניקוי רקמות זה מזקק תערובת של פרוטוקולים קודמים המבוססים על שיטת CLARITY (מערכת ממסים נוקשה אקרילאמיד-היברידית-היברידית/חיסונית/בהידרוגל רקמה תואמת איטו-הכלאה) ו- PEGASOS (מערכת ממס הקשורה לפוליאתילן גליקול (PEG). פרוטוקול מעודן זה התיר בדיקה חזקה יותר של פיברובלסטים לב בלב העכבר בבסיס וכיצד הם מגיבים לסוגים שונים של פציעה. הפרוטוקול הוא פשוט לשחזור יעזור לאפיין את ההתנהגות של פיברובלסטים לב vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בעכברים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במרכז הרפואי של בית החולים לילדים בסינסינטי. המוסד הוא גם AAALAC (האגודה האמריקאית להסמכה של טיפול בבעלי חיים במעבדה) מוסמך. עכברים עברו המתת חסד באמצעות נקע בצוואר הרחם, ועכברים שעברו ניתוחי הישרדות קיבלו הקלה בכאב (ראו להלן). כל השיטות המשמשות לטיפול בכאב והמתת חסד מבוססות על המלצות הפאנל על המתת חסד של האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית. כל העכברים שוכנו ביחידות מצעים עם קלח תירס עם מים ומזון זמין בכל עת. עכברים שוכנו 4 לכלוב עם אותו המין. לצורך ניתוח או ניקוי רקמות לא נפגעו, נעשה שימוש במספרים שווים של עכברים זכריים ונקביים בני 6-8 שבועות.
הערה: תנאים כירורגיים סטריליים נשמרו בכל הניתוחים. המנתח החליף לשפשוף נקי ושמלה סטרילית ואז לבש כיסויי נעליים ורשת שיער. לאחר מכן, המנתח שפשף את ידיהם בכלורהקסידין וחבש כפפות כירורגיות סטריליות. המנתח נעזר בטכנאי שהרדים, גילח וקרצף את אתר החתך 3 פעמים כל אחד, לסירוגין בין 2% כלורוקסידין גלוקונאט ו 70% isopropanol. לאחר מכן הובאו העכברים למנתח ובוצעו ניתוחים. בין בעלי חיים, המכשירים היו מעוקרים בסטריילר חרוזים.
1. שילוב מחדש של הקרן
- עכברי קרוס רוזה26-לוקס-eGFP (רוזה26-nLacZ [FVB. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]) עם עכברי Tcf21-MerCreMer(איור 1A)6,21.
- כאשר צאצאיו של צלב זה מגיעים לגיל 6 שבועות, לנהל זריקה תוך-פריטונית של 75 מ"ג/ק"ג של טמוקסיפן מומס בשמן תירס. 22 נהל טמוקסיפן זה פעמיים, בהפרש של 48 שעות זה מזה (איור 1B).
- לאחר זריקות טמוקסיפן, לשים את העכברים על דיאטה של מזון טמוקסיפן (~ 0.4 גרם / ק"ג טמוקסיפן ציטראט) במשך שבוע אחד. לאחר שבוע של צ'או טמוקסיפן, החזירו את העכברים לתזונת צ'או אוטו-חלבית רגילה למשך שבוע לפני ביצוע הניתוח (איור 1B). לייעד מספר מתאים של עכברים (3 לכל מצב כירורגי) להיות פקדים לא נפגעים. להקריב את העכברים האלה, ולהמשיך את תהליך הסליקה להלן לאחר שבוע אחד של דיאטה צ'או נורמלי.
- בעקבות משטר טמוקסיפן ושילוב מחדש, לבצע ניתוח.
2. מודלים כירורגיים
- איסכמיה/רפרופוזיה (I/R)23,24
- להרדים עכברים עם 1.5% גז isoflurane באוויר החדר בקופסה מאווררת; לגלח את החזה והצוואר שלהם עם קוצץ חשמלי, ולאחר מכן לשפשף את האזורים המגולחים עם 2% כלורהקסידין גלוקונאט ספוג ספוג.
- השתמש משחת דמעה מלאכותית כדי למנוע יובש במהלך הניתוח על ידי הנחת משחה על העיניים של עכברים מסוממים.
- בצע חתך באמצע הצוואר באמצעות מספריים כירורגיים כדי לאפשר הדמיה של קנה הנשימה. לצנרר עם קטטר 20 G על ידי הצבת צינור הצנרור לתוך קנה הנשימה לדמיין את קטטר קנה הנשימה דרך החתך באמצע הצוואר. מניחים את העכברים על מאוורר בזמן מסומם עם גז isoflurane (1.5%) באוויר החדר.
- לעשות חתך מתחת לאיבר הקדמי השמאלי עם מספריים כירורגיים, לחתוך את השרירים הבין צלעיים בין צלעות 3 ו 4. מורחים את הצלעות פתוחות באמצעות מפשק.
- מניחים ספוג קטן ספוג מלוחים בין הריאה ללב כדי למנוע נזק לריאה.
- באמצעות מחט צחצוח דגים (6.5 מ"מ, 3/8 ג), לקשור את העורק הכלילי השמאלי עם קשר להחליק לשחרור באמצעות 8-0 פרולין, פרולין.
- הסר את הספוג באמצעות מלקחיים.
- לתפור את השרירים הבין צלעיים סגורים באמצעות משי קלוע 4-0 ותפר מתמשך תוך החיצוניות של סוף 8-0 קשר החלקת פרולין.
- סגור את החתכים בעור באמצעות דבק רקמה אקטואלי עם סוף הקשר להחליק חסימה בולטת.
- לאחר שעה אחת של חסימה, משוך את הקצה החיצוני של קשר ההחלקה כדי לשחרר באופן פנימי את חסימת העורקים הכליליים, להקל על האיסכמיה ולגרום להפרכה.
- לנהל 0.02 מ"ל של 1 מ"ג / מ"ל מהדורה מורחבת buprenorphine באמצעות הזרקה תת עורית (שחרור 72 שעות) כמו משכך כאבים, ומניחים את העכברים בתא דגירה מחומצן ב 37 מעלות צלזיוס, בנפרד מבעלי חיים אחרים. לפקח על העכברים לפחות כל 15 דקות עד שהם התאוששו מהרדמה והם מסוגלים לשמור על תנוחת עצם החזה או יושב. להחזיר את העכברים לדיור הרגיל שלהם.
- להעריך את בעלי החיים עבור כאב ומצוקה במשך 48 שעות לאחר הניתוח, ולפקח על אתר החתך מדי יום עד החלמה מלאה.
- שימו לב לעכברים על הידרציה, הזנה ורווחה כללית לאחר הניתוח עד להקרבה.
- אוטם שריר הלב (MI)25,26,27
- בצע שלבים 2.1.1–2.1.7.
- השתמש תפר מתמשך כדי לסגור את השרירים הבין צלעיים באמצעות 4-0 משי קלוע.
- סגור את החתך בעור באמצעות דבק רקמה אקטואלי.
- בצע שלבים 2.1.11–2.1.13.
- אנגיוטנסין II/פנילפרין מיקרו-אוסמוטי משאבה עירוי
- הכן פתרון עבודה 10 מיקרוגרם / μL של אנגיוטנסין II ו 500 מיקרוגרם / μL פתרון עבודה של פנילפרין בתנאים סטריליים (כלומר, במכסה המנוע זרימה למינארית) על ידי הוספת 1 מ"ג של אנגיוטנסין II כדי 100 μL של מלוחים אגירה סטרילי פוספט (PBS) ו 250 מ"ג של פנילפרין הידרוכלוריד לתוך 500 μL של PBS.
- לחשב את הדילול של כל פתרון עבודה ואת הנפח הסופי כדי לוותר על משאבה מיקרו אוסמוטית המבוססת על משקל העכבר.
הערה: לדוגמה, עכבר 20 גרם דורש 20 גרם x 14 ימים x 1.5 מיקרוגרם ליום = 420 מיקרוגרם אנגיוטנסין, או 42 μL של פתרון עבודה, כמו גם 20 גרם x 14 ימים x 50 מיקרוגרם ליום = 14000 מיקרוגרם פנילפרין הידרוכלוריד, או 28 מיקרוגרם של פתרון עבודה. - עבור המשקל של כל עכבר, לדלל את מלאי העבודה של התרופה PBS סטרילי ולמלא את משאבות מיקרו אוסמוטי (0.25 μL / h, 14 ימים, כ 100 μL) באמצעות מחט 27 G ומזרק 1 מ"ל.
הערה: זה ייצור קצב זרימה של 1.5 מיקרוגרם ∙ g-1∙ יום-1 של אנגיוטנסין II ו 50 מיקרוגרם ∙ g-1∙ יום-1 של פנילפרין הידרוכלוריד פעם ממוקם בעכברים. - יש להרדים את העכברים עם שאיפת 1.5% isoflurane (להשפעה) בתא מאוורר המכיל אוויר בחדר.
- מניחים את העכברים המרדים על שולחן כירורגי סטרילי בתנוחת האופין, ושומרים על הרדמה עם שאיפת גז isoflurane (1.5%) דרך קונוס אף.
- השתמש משחת דמעה מלאכותית על העיניים של החיה כדי למנוע יובש במהלך הניתוח.
- לגלח את הפרווה על אזור ההשתלה עם קוצץ שיער חשמלי, לעקר את האזור להיחתך באמצעות אתנול ספוגית סטרילית. בצע חתך קטן (כ 1 ס"מ) עם מספריים כירורגיים בשכבת האפידרמיס של עור העכבר בצד הצדדי הימני של הגב, מתחת להב הכתף. השתמש בצדדים המשעממים של זוג מספריים כירורגיים כדי למתוח בעדינות את העור באזור ההשתלה ובסביבתו כדי להכניס את המיני-קאמפ.
- מניחים את המשאבה המיקרו-אוסמוטית בתוך החתך, ומתמרנים אותה פיזית משמאל לקו האמצע הגבי של העכבר על ידי עיסוי ידני של המשאבה מתחת לעור.
- סגור את החתך באמצעות תפר מתמשך באמצעות משי 4-0 עם מחט נקודה להתחדד.
- לאחר השתלת משאבה, לנהל buprenorphine שחרור איטי במינון של 0.1 מ"ג / קילוגרם משקל גוף באמצעות הזרקה תת עורית עבור משככי כאבים (שחרור איטי 72 שעות). מניחים את העכברים בתא דגירה מחומצן ב 37 מעלות צלזיוס, בנפרד מבעלי חיים אחרים. לפקח על העכברים לפחות כל 15 דקות עד שהם מתאוששים מהרדמה והוא יכול לשמור על תנוחת עצם החזה או ישיבה.
- לאחר התאוששות מהרדמה בתא ההתחממות של 37 מעלות צלזיוס, החזירו את העכברים ליחידות הדיור הסטנדרטיות שלהם.
- לפקח על העכברים עבור כאב ומצוקה במשך 48 שעות לאחר הניתוח, ולפקח על אתר החתך מדי יום עד החלמה מלאה.
- שימו לב לעכברים על הידרציה, הזנה ורווחה כללית לאחר הניתוח עד להקרבה.
3. ניקוי לבבות עכבר בוגרים באמצעות פרוטוקול CLARITY פעיל שונה
- הכינו אזור כירורגי נקי על ידי עיקור משטח הניתוח וכל הכלים הכירורגיים עם 70% אתנול. הכינו פתרון של 1x PBS קר ו 4% paraformaldehyde (PFA) ב PBS (100 מ"ל כל אחד). ללבוש כפפות, חלוק מעבדה, מסכת פנים, והגנה על העיניים.
- הכן חיץ הפרין על ידי דילול 10 יחידות של הפרין ב 0.9% w / v פתרון נתרן כלורי. הזרק כל עכבר תוך-פיוריטוני עם 60 μL של הפרין-NaCl באמצעות מזרק 1 מ"ל ומחט 27 G.
- חמש דקות לאחר הזרקת פתרון הפרין-NaCl, להרדים את העכברים באמצעות שאיפת 1.5% isoflurane (כדי להשפיע) בתא מאוורר המכיל אוויר החדר.
- המתת עכברים על ידי נקע בצוואר הרחם, שבו החלק האחורי של הראש מוחזק עם הקצה השטוח, סגור של מלקחיים, בעוד עמוד השדרה נקע על ידי משיכת הזנב.
- נקה את משטח הגחון של העכבר עם 70% אתנול על צמר גפן. בצע חתך רוחבי 3 ס"מ כ 3 ס"מ מתחת לתהליך xiphoid באמצעות מספריים כירורגיים.
- להפריד את העור מרקמת דופן הבטן הבסיסית על ידי degloving את הבטן עד תהליך xiphoid (להחזיק את העור הקרוב ביותר לזנב ולמשוך את העור הקרוב ביותר לראש כלפי מעלה לכיוון בית החזה). הפוך חתך רוחבי 2 ס"מ ברקמת דופן הבטן התת עורית 3 ס"מ מתחת לתהליך xiphoid באמצעות מספריים כירורגיים. בצע חתך אנכי מחתך רוחבי זה, במעלה קו האמצע ודרך בית החזה. תצמיד את בית החזה בחזרה, חושף את הלב.
- השתמש במחט 27 G ומזרק 10 מ"ל כדי להזריק PBS קר לתוך וריד ורידים מעולה ואבי העורקים (כל מניפולציה מיקום של הלב צריך להיעשות בזהירות עם מלקחיים קהים כדי למנוע לנקב) כדי לנקות את הדם מהלב.
הערה: ניתן לציין זלוף מספיק על ידי עווית זנב ושינוי צבע של הריאות. - השתמש במחט 27 G ומזרק 10 מ"ל להזריק קר 4% PFA לתוך הווריד הווריד מעולה אבי העורקים כדי להתחיל את תהליך הקיבעון.
- לתמצת את הלבבות. יש להפריד את האטריה, החדר הימני והמחיצה, והחדרי השמאלי באמצעות אזמל להב ישר. מניחים את הרקמה לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל מלא קר 4% PFA, ומניחים על מאגף ב 4 מעלות צלזיוס לילה.
- לשטוף את הלב 3 פעמים עבור 1 h כל אחד עם קר 1x PBS כדי להסיר PFA עודף.
- הכן את הידרוג'ל (נקרא A4P0 עבור הרכב אקרילאמיד /פוליאקרילאמיד יחסי) על ידי ערבוב הכימיקלים הבאים בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל: 10% של 40% אקרילאמיד, 10% 1x PBS, 80% מים מזוקקים.
- הוסף את הפתרון 0.25% של photoinitiator (2,2-אזוביס[2-(2-imidazolin-2yl)propane)dihydrochloride) לפתרון הידרוג'ל רק לפני שקוע הלב הידרוג'ל.
- מניחים את הלב בצינור חרוט המכיל את הידרוג'ל. עוטפים את הצינור החרוט בנייר כסף, ודגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס ללא הפרעה פיזית.
- לאחר כ 14 שעות ב 4 מעלות צלזיוס, להעביר את הצינור חרוט המכיל את הלב לאמבט חרוזים 37 מעלות צלזיוס.
- לאחר 2.5 שעות באמבט החרוזים, להסיר את הלב מן הידרוג'ל בזהירות עם מלקחיים.
- לשטוף את הלבבות 3 פעמים עבור 1 שעות כל אחד בצינור חרוט 15 מ"ל המכיל 1x PBS ב 37 מעלות צלזיוס על מאגף.
- מניחים את הלבבות בסל של מכונת האלקטרופורזה הפעילה באמצעות מלקחיים, ומניחים את המכסה על הסל. ודא שהמכסה נמצא במקום.
- מלא את מאגר תא האלקטרופורזה הפעיל בתמיסת סליקה אלקטרופורטית על ידי שפיכת פתרון לתוך התא.
- ברגע שהתא מלא בתמיסת סליקה אלקטרופורטית, הסל המכיל את הלב יכול להיות שקוע. הנח את המכסה על מכונת האלקטרופורזה בצורה מאובטחת.
- הפעל את מכונת האלקטרופורזה ב 1.5 A, 37 °C (60 °F) עבור 1.5 שעות.
- לאחר 1.5 שעות של אלקטרופורזה, לבדוק את הלבבות חזותית כדי להבטיח כי אין רקמה אטומה נשאר. אם אזורים של הרקמה עדיין אטומים, להטביע מחדש את הלב בתמיסת אלקטרופורזה בתא האלקטרופורטי, ולהמשיך electrophoresis במשך 0.5 שעות בכל פעם.
הערה: יש להפסיק את האלקטרופורזה בסימנים ראשונים של נזק לרקמות (כגון שבירת רקמות). - לשטוף את הלבבות בצינור חרוט 15 מ"ל המכיל 1x PBS עבור 1 שעה, 3 פעמים כל אחד, ב 37 מעלות צלזיוס על מאגוז.
- לטבול את הלבבות בצינור חרוט 15 מ"ל המכיל N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)אתילנדיאמין – סוכן decolorizing המפחית שפעת אוטומטית heme.
הערה: פתרון זה צריך להיות שונה כל 24 שעות עד הלבבות ברורים לחלוטין (כ 2 ימים). - לשטוף את הלבבות בצינור חרוט 15 מ"ל עם 1x PBS 3 פעמים עבור 1 h כל אחד כדי להסיר עודף decolorizing סוכן.
- הכן פתרון התאמת אינדקס שבירה (RIMS) על ידי שילוב של 30 מ"ל של מאגר פוספט M 0.02, 40 גרם של 5-(N-2, 3-דיהידרוקסיpropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N,N'-bis (2, 3 דיהידרוקסיפרופיל) isophthalamide עם ערבוב (חייב להיות מומס לחלוטין - זה יכול לקחת עד שעה), 5 מ"ג של נתרן אזיד, 50 μL של Tween20, ו 1 גרם של 1,4-diazabicyclo[2.2.2]אוקטן, ולהתאים את ה- pH ל 7.5.
- משווים את הלבבות ב- RIMS למשך 48 שעות לפני ההדמיה.
4. הדמיה ניקתה לבבות באמצעות מיקרוסקופ פוטון קונפוקאלי יחיד זקוף
הערה: מנגנון ההדמיה מורכב מהמחצית התחתונה של צלחת פטרי מזכוכית 10 ס"מ, מאגר תחתון מודפס בתלת-ממד, כיסוי זכוכית עגול ומאגר עליון מודפס בתלת-ממד(איור 1C-E). חומרים מודפסים בתלת מימד נעשו בתוך הבית על ידי מחלקת ההנדסה הקלינית של בית החולים לילדים בסינסינטי.
- השתמשו בשמן ואקום כדי לאטום את המאגר התחתון המודפס בתלת-ממד לצלחת פטרי מזכוכית על-ידי הנחת שכבה דקה של שומן ואקום בתחתית היצירה המודפסת בתלת-ממד(איור 1C).
הערה: המאגר צריך להיות באותו גובה כמו המדגם להיות בתמונה (כלומר, המדגם לא צריך להיות דחוס על ידי כיסוי זכוכית להציב על גבי זה, ואת המדגם גם לא צריך להיות מסוגל לצוף ולנוע בתוך המאגר). - מלא את המאגר ב- RIMS והסר את כל הבועות עם קצה צינור. הנח את הלב ב- RIMS בזהירות עם הקיר החדר השמאלי הפונה כלפי מעלה, להבטיח כי אין בועות שהוכנסו לתוך הפתרון.
- הדבקת כיסוי זכוכית על המשטח התחתון של פיסת המאגר העליונה המודפסתבתלת-ממד (איור 1A משלימה)באמצעות גריז ואקום (שוב על-ידי הנחת שכבה דקה של שומן ואקום על החלק המודפס בתלת-ממד והנחתו על החלקה העליונה)(איור 1D).
- מניחים את כיסוי הזכוכית ואת המאגר העליון, מכסה את הצד כלפי מטה, על המאגר התחתון (איור משלים 1B),ללא כניסתה של בועות. הדבקה בין ה-RIMS לתעודת הכיסוי תספק חותם בין חלקי המאגר העליונים והתחתונים(איור 1E).
- מלא את המאגר העליון עם גליצרול לשימוש עם המטרה טבילה גליצרול 10x.
- השתמש במיקרוסקופ פוטון יחיד המצויד בראש סריקה קונפוקלית רב-פוטון כדי לדמות את הלבבות המנוקים.
- מנמיכים את השלב של מיקרוסקופ הפוטוני הבודד ומניחים את צלחת הפטרי המכילה את הדגימה במרכז הבמה. הרם את הבמה והורד את מטרת הטבילה גליצרול 10x לתוך גליצרול במאגר העליון של מנגנון המדגם. ודא שהדגימה נמצאת במוקד על-ידי התבוננות בקצה המדגם באמצעות העיניים.
- עבור מתצוגת eyepiece לתצוגת מצלמה במחשב על-ידי לחיצה על הכפתור החי.
- הגדר את הפרמטרים X ו- Y על ידי איתור הראשון את החלק הרחב ביותר של דגימת הרקמה, אשר צריך להיות בתחתית צלחת פטרי.
- לחץ על רכישת ND ונקודות מרובות מותאמות אישית. צור נקודות מרובות על-ידי מציאת אמצעי דגימת הרקמה תחילה באמצעות מוט ההיגוי כדי לטאטא משמאל לימין ומלמעלה למטה.
- לאחר מכן, בהתבסס על גודל הרקמה, קבעו את גודל הריצוף הדרוש (בדרך כלל 6 x 5 ללב עכבר בן 6-8 שבועות). עשה זאת על-ידי הפעלת הדמיית בדיקה על-ידי לכידת פרמטרי X ו- Y בלבד (בטל את הסימון z תחת הכרטיסיה רכישת ND) כדי לבדוק אם כל האורך והרוחב של הרקמה נלכדו.
- כדי להגדיר פרמטרי z, פתח את הניווט ב- XYZולחץ על הסמלים למעלה ולמטה עד שתמצא את החלק העליון והתחתון של המדגם.
- פתח את לוח תיקון עוצמת Z והתאם את הפלואורסצנטיות בחלק העליון, האמצעי והתחתון של הרקמה כדי לתקן את צפיפות הרקמות על-ידי הגדלה או הקטנה של עוצמת הלייזר בכל נקודת z. הגדר אותם על-ידי לחיצה על החץ המוגדר מימין ללוח 'תיקון עוצמת Z'.
- הגדר את גודל שלב Z בחלונית רכישת ND ל- 5 מיקרומטר.
- לאחר הפרמטרים X, Y, ו- Z של הלב מוגדרים תיקון בעוצמת z מוגדר, להשתמש במיקרוסקופ זקוף אוטומטי עם המטרה 10x גליצרול טבילה עם סורק מהדהד וצינורות גליום ארסניד פוסמולטיי (GAAsP PMTs) כדי לדמות את הלבבות פינה. ודא שהכרטיסיות XY ו- Z מסומנות תחת רכישת NDוהקש על הפעל תיקון Z.
- Stitch, unmix, ו denoise את התמונות וכתוצאה מכך על ידי פתיחת התמונה multipoint בתוכנת העיבוד ולחיצה על כפתור התפר. תחת תמונה, לחץ על unmixing עיוור, 2 ערוץ, ולאחר מכן למצוא. ותחת תמונה, לחץ על denoise.ai, ולאחר מכן לחץ על הערוץ פלואורסצנטי של בחירה (כלומר, GFP).
הערה: תהליך זה גורם לתמונה תלת-ממדית של פיברובלסטים חיוביים של GFP בכל החדר השמאלי. - השתמש בתוכנת ניתוח משנית כדי לזהות עוד יותר דפוסים ומגמות בפיזור פיברובלסטים לבביים. השתמש בפונקציה כתמים על-ידי הפעלת תוכנית אשף הנקודות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פיברובלסטים לבביים חיוניים לתפקוד בסיסי של הלב, כמו גם לתגובה לפגיעה לבבית. ניסיונות קודמים להבין את הסידור והמורפולוגיה של תאים אלה נערכו בעיקר בהגדרות דו-ממדיות. עם זאת, פורסמה טכניקת הדמיה תלת-ממדית מעודנת של רקמת לב (איור 2)ותל-ממדית, המאפשרת הדמיה מתקדמת ומפורטת יותר של פיברובלסטים לבביים. בטכניקת הדמיה זו נמצאו פיברובלסטים צפופים בעלי מורפולוגיה מרוכלת בלבבות לא נפגעים(איור 3, סרטונים משלימים S1–4).
לאחר ניקוי רקמת החדר השמאלי הושג בלב לא נפגע, הפרוטוקול הוחל על מספר מודלים פציעה כדי לבחון כיצד פרוטוקול סליקה זה יפעל בעת לימוד רקמת לב פצועה. עכברים היו נתונים לפציעה I / R על ידי סגירה זמנית של העורק הכלילי השמאלי (LCA) במשך 1 שעות ואחריו reperfusion שנמשך 3, 7, 14, או 28 ימים. ניסויים אלה הראו כי היה אובדן של פיברובלסטים לב באזור איסכמי מיד לאחר פציעת I / R, אבל זה ביום 7 וביום 14, fibroblasts היגרו או התפשטו כדי לאכלס מחדש את האזור הזה של הלב הפצוע. ביום ה-28, אוכלוסיית הפיברובלסטים הלבביים המקיפים את האזורים הפצועים בלב הייתה בצפיפות הגבוהה ביותר שלהם (איור 4, סרטונים משלימים S5–8).
פגיעה MI הוא מודל כירורגי הנובע קשירה LCA קבוע (אין reperfusion). לבבות שעברו ניתוח MI נכרתו בגיל 1.5 ו -3 ימים לאחר ניתוח לקיבעון, סליקה וניתוח. בחדר השמאלי הפצוע נותרו מעט מאוד פיברובלסטים ב-1.5 ימים לאחר הניתוח (איור 5A, וידאו משלים S9). עם זאת, ביום השלישי התרחבו הפיברובלסטים והיו נוכחים ברוב החדר השמאלי למעט אזור קטן אחד, ככל הנראה לאחר שהיגרו פנימה ו/או התפשטו מאוכלוסייה באזור הגבול (איור 5B, וידאו משלים S10). שוב, תוכנת ניתוח שימשה כדי לדמיין טוב יותר לוקליזציה פיברובלסט, ואזורים של אובדן פיברובלסטים לב היו מתוארים בכתום (איור 5). ניתוח זה הראה טוב יותר את האובדן הראשוני של תאים ביום 1.5 בעקבות MI וכיצד fibroblasts או התפשט או היגר לאזור פגום זה ביום 3 כדי לתקן לכאורה את האזור וליצור צלקת.
בנוסף לפציעה איסכמית, התגובה של פיברובלסטים לב ללחץ דם גבוה אינה מובנת היטב. כדי לגלות את התגובה של תאים אלה ללחץ דם גבוה, אנגיוטנסין II ו פנילפרין נוהלו. אנגיוטנסין II ופנילפרין (Ang/PE) הן תרופות הגורמות ללחץ דם גבוה מתמשך ולהפעלה פיברובלסטית לבבית עם אזורים של פיברוזיס ביניים, שאושרו באמצעות יישום פרוטוקול ניקוי רקמה זה ללבבות שטופלו ב- ang/PE (איור 6A)5,28. בניגוד לניתוח איסכמי, עירוי של Ang/PE במשך מספר שבועות אינו גורם לאובדן רקמת לב ודילול קיר. במקום זאת, תוצאה שונה נצפתה בהתנהגות פיברובלסט בעקבות פציעה זו.
כמו משאבות הלב, שריר הלב מתפתל, בעקבות דפוס סליל ימני29,30,31. במודל אנג/PE של פציעה, הפיברובלסטים התיישרו לאורך הציר של תבנית זו של התכווצות סליל ימנית באמצעות פרוטוקול ניקוי הרקמות המעודן (איור 6B). ההשערה להסביר התנהגות זו היא שפיברובלסטים לבביים הרגישו את הכיוון של זן הקיר החדרי והתיישרו בתוך המיופיברים כדי לספק את התמיכה הגדולה ביותר בתוך ה- ECM כאשר התגובה הפיברוטית התפתחה בחריפות במהלך עירוי אגוניסטי (איור 7). ממצא מעניין נוסף היה שהפיברובלסטים נראו קטנים מעוגלים, בניגוד לצורת הציר שנראתה בדגמים של פגיעת I/R ו-MI(איור 6, וידאו משלים S11).
איור 1: עכברים וחומרים המשמשים לניקוי לבבות מרקמות.
(A)סכמטי של אסטרטגיית רבייה עבור Tcf21-MerCreMer (mcm) x עכברי Rosa26eGFP המשמשים לניקוי רקמות. (B) ציר הזמן של טיפול טמוקסיפן וניתוח שבוצעו בעכברים. עכברים לא נפגעים הקריבו ביום ה-14. (C)3-D מודפס היטב להחזיק רקמת לב אטום צלחת פטרי זכוכית עם שומן ואקום. (D)תוספת של גריז ואקום כיסוי עגול אטום לחלק העליון של 3-D מודפס היטב להגדיר על גבי הבאר התחתונה. (ה)רקמה פינה את הלב בבאר התחתונה של מנגנון החזקת הרקמה, מלא פתרון התאמת אינדקס שבירה (RIMS). Coverslip (כמו D)ו 3-D העליון מודפס היטב חתיכה הניח על רכיב המאגר המודפס 3-D התחתון, המכיל רקמת לב פינה. גליצרול מתווסף למאגר העליון עבור מיקרוסקופ טבילה גליצרול. סרגלי קנה מידה = 1 ס"מ. את שרטוטי המאגר ניתן למצוא באיור 1 המשלים. קיצור: eGFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מראה חזותי של שלבי ניקוי רקמת לב.
(A)משמאל לימין: חדר שמאלי לא ברור, חדר שמאלי electrophoresed, חדר שמאלי electrophoresed מטופלים עם crosslinker, חדר שמאלי electrophoresed מטופלים עם crosslinker ו הדגירה ב RIMS. (B)לא ברור ופינה לב עכבר שלם. (ג)שמאל: לא נפגע, לא ברור החדר השמאלי. מימין: לא נפגע, פינה את החדר השמאלי. (ד)משמאל: MI לא ברור נפצע בחדר שמאל. מימין: ה-MI פצוע בחדר השמאלי. סרגלי קנה מידה = 0.5 ס"מ. קיצור: MI = אוטם שריר הלב. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: היעילות של שיטת סליקה חדשנית ללבבות נקיים שאינם נפגעים ומופעלים באופן מזויף.
פינה(A)לא נפגע (סרגל קנה מידה = 400 מיקרומטר) ו - (B) לבבות המופעלים על ידי sham (סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר) עם Tcf21mcm x Rosa26eGFP fibroblasts (ירוק) ואזורים מדומים של פלואורסצנטיות מוגברת (סגול) מראה לוקליזציה פיברובלסט. קטעי וידאו נלווים המציגים קטעי וידאו פיברובלסט ניתן למצוא קטעי וידאו משלימים S1-2. תמונות סטילס מראות ניקוי רקע ותחזוקה של פלואורסצנטיות פיברובלסט אנדוגנית (ירוק). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הנחתת אובדן פיברובלסטים באיסכמיה/רפרופוזיה פצועה פינה לבבות לאורך זמן.
רקמת לב מנוקה מנקודות זמן I/R המצוין עם Tcf21MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP fibroblasts (ירוק), אזורים פסאודוקולואריים של פלואורסצנטיות מוגברת (סגול) מראה לוקליזציה פיברובלסט, ואזורים חלוקה לרמות כתומים נטולי פיברובלסטים. שורה עליונה: תמונות סטילס של חדרי שמאל מלבבות מנוקים פצועי I/R. שורה תחתונה: תמונות סטילס של חדרי שמאל מלבבות מנוקים פצועי I/R עם כתמי אימריס מתפקדים כדי לראות דפוסים פיברובלסטיים בקלות רבה יותר בכל החדר השמאלי. קטעי וידאו של I /R פצועים לבבות פינה מראה לא רק דפוס ברוטו של fibroblasts, אלא גם תמונות ברורות של fibroblasts בודדים ואת morphologies שלהם ניתן למצוא קטעי וידאו משלימים S5-8. סרגלי קנה מידה = 500 מיקרומטר. קיצור: קלט/רי = איסכמיה/רפרופוזיה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הנחתה של אובדן פיברובלסטים לבביים בעקבות פציעה באוטם שריר הלב שנפצע בלבבות לאורך זמן.
רקמת לב מנוקה מלבבות MI עם Tcf21MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP fibroblasts (ירוק), אזורים מדומים של פלואורסצנטיות מוגברת (סגול) מראה לוקליזציה פיברובלסט, ואזורי חלוקה לרמות כתומים נטולי פיברובלסטים. שורה עליונה: תמונות סטילס של רקמה פינה חדרים שמאליים מלבבות פצועים MI (ירוק). שורה תחתונה: תמונות סטילס של רקמה פינה חדרים שמאליים מלבבות MI פצועים (ירוק) עם כתמי Imaris פונקציה (סגול) מכוסה כדי להראות התפלגות פיברובלסט ברוטו. קטעי וידאו של רקמה פינה חדרי שמאל מלבבות MI פצועים להראות הסדר פיברובלסט ברוטו בלב, כמו גם את המיקום והמורפולוגיה של fibroblasts בודדים במודל זה 3D ב vivo (קטעי וידאו משלימים S7-8). סרגלי קנה מידה: 1.5 יום = 1000 מיקרומטר, 3 ימים = 700 מיקרומטר. קיצור: MI = אוטם שריר הלב. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: רקמה נקייה מלבבות שטופלו באנגיוטנסין/פנילפרין.
(A) סכמטי מראה כיצד משאבות אנגיוטנסין / פנילפרין משמשים לניהול תרופות על פני תקופה של שבועיים לאחר הפעלת טמוקסיפן של Tcf21MCM x eGFP. (B) תמונת סטילס, תמונת סטילס + כתמי Imaris, ווידאו המציג ארגון ומורפולוגיה פיברובלסטים בלבבות שטופלו ב- Ang/PE (וידאו משלים S11) סרגלי קנה מידה = 500 מיקרומטר. קיצורים: Ang/PE = אנגיוטנסין II/פנילפרין; eGFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: תמונות מייצגות של תבנית פיברובלסט שנצפתה בלבבות שטופלו באנגיוטנסין/פנילפרין.
(A, Cו- D): תמונות של תבנית פיתול סליל ימנית של פיברובלסטים מנקודת המבט של החלק החיצוני של החדר. (ב) תמונה של דפוס פיברובלסט מנקודת המבט של החלק הפנימי של החדר. החצים מדגישים קבוצות ליניאריות של פיברובלסטים המרכיבים את תבנית הפיתול. סרגלי קנה מידה = 500 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור נוסף 1: עיבודים דו-מימדיים של מנגנון מאגר ההדמיה. (A)עיבוד דו-מימדי של החצי התחתון של מאגר ההדמיה. מאגר זה אטום לצלחת פטרי עם שומן ואקום. הלב ממוקם בפתח המרכזי ושקוע ב- RIMS. (B)עיבוד דו-מימדי של החצי העליון של מאגר ההדמיה. כיסוי זכוכית הוא דבק התחתון שטוח של חתיכה זו עם שומן ואקום. זה ממוקם בעדינות על גבי המאגר התחתון. לאחר מכן ניתן למלא את המאגר העליון בגליצרול להדמיה. יחידות במ"מ. קיצורים: דו-ממדי = דו-ממדי; RIMS: פתרון התאמת אינדקס שבירה. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.
וידאו S1: רקמה לא נפגעה פינה את הלב. פיברובלסטים לבביים (ירוקים) בחדר שמאלי לא נפגע היו קטנים, ורבים מהם היו מעוגלים עם לא יותר משתי תחזיות תאיות. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
וידאו S2: רקמת שאם פינה את הלב. פיברובלסטים לבביים (ירוקים) בחדר השמאלי של לב עכבר המופעל על ידי זיוף היו קטנים ובעיקר עגולים עם מעט תחזיות, בדומה למה שנראה בלבבות לא נפגעים. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
וידאו S3: מבט פיברובלסט מפורט דרך הקיר החדרי של לב לא נפגע. וידאו זה מתחיל על הקיר החדר הפנימי וזום לכיוון החלק החיצוני של הלב. פיברובלסטים לבביים (ירוקים) הוצגו בפירוט ונצפתה כגוף תא מעוגל או מוארך מעט עם לא יותר משתי תחזיות תאיות. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
וידאו S4: תצוגה מפורטת של קטע של קיר החדר השמאלי של לב לא נפגע. זה ~ 300-μm רחב קטע של לב העכבר לא נפגע פינה מראה את הסידור 3-D של פיברובלסטים לב (ירוק) ואת morphologies שלהם בפירוט. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
וידאו S5: פינה את החדר השמאלי של 3 יום קלט/רי. תצוגה מפורטת של החדר השמאלי הראתה כי בעקבות פציעת קלט/רי, יש אזור של אובדן פיברובלסט לבבי. כמו כן, היה ברור כי פיברובלסטים (ירוקים) פיתחו צורה מוארכת הרבה יותר במצב פצוע זה בהשוואה למורפולוגים מעוגלים יותר שנראו בלבבות לא פצועים ומפועבים. קיצור: קלט/רי = איסכמיה/רפרופוזיה. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
וידאו S6: החדר השמאלי פינה של 7 יום קלט/רי. תצוגה מפורטת של החדר השמאלי מראה כי על ידי 7 ימים לאחר פציעת קלט/רי, האזור חסר fibroblasts היה קטן יותר מזה שנראה ביום 3 לאחר פציעת קלט/רי. היו יותר פיברובלסטים (ירוקים) נוכחים, ומעניין, מורדולוגיות תאים חדשות היו נוכחים. באופן ספציפי, כמה fibroblasts היו גופי תא מעוגלים עם בליטות מרובות, פוטנציאל המציין תפקיד חדש או מפותח של fibroblasts בסביבה זו. קיצור: קלט/רי = איסכמיה/רפרופוזיה. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
וידאו S7: פינה את החדר השמאלי של 14 יום קלט/רי. מבט מפורט על החדר השמאלי הראה שעדיין יש אזור מרכזי בקיר החדרים שהיו בו מעט מאוד פיברובלסטים אך פיברובלסטים (ירוקים) בשולי חלל זה שמרו על המורפולוגיה המוארכת ביותר שנראתה ביום 7 דגימות שלאחר I /R. באופן מעניין, לפיברובלסטים המעטים שהיו באזור הפצוע הייתה מורפולוגיה כזאת בלב לא פצוע – קטן מעוגל. קיצור: קלט/רי = איסכמיה/רפרופוזיה. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
וידאו S8: פינה את החדר השמאלי של 28 יום קלט/רי. מבט מפורט על פיברובלסטים לבביים (ירוקים) ביום ה-28 בעקבות פגיעת קלט/רי הראה כי באזור הפצוע היה אזור קטן ללא פיברובלסטים. כמו כן נצפה כי היה אזור של צפיפות פיברובלסט גבוהה המקיפה את האזור הזה, וכי המטורפולוגיות באזור צפוף זה היו מוארכות מאוד. קיצור: קלט/רי = איסכמיה/רפרופוזיה. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
וידאו S9: פינה את החדר השמאלי של 1.5 יום MI. היו מעט מאוד פיברובלסטים לב (ירוק) שנותרו בחדר השמאלי הפצוע ב 1.5 ימים לאחר MI, מוות פיברובלסט לב ברחבי אזור זה של החדר. קיצור: MI = אוטם שריר הלב. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
וידאו S10: פינה את החדר השמאלי של 3 ימים MI. היה שטח גדול נטול פיברובלסטים לב 3 ימים לאחר MI, אבל כמה פיברובלסטים לב (ירוק) הופיעו מחדש בחדר, בניגוד לתוצאות שנמצאו לאחר 1.5 ימים של MI. כמו כן, פרופילי מורפולוגיה פיברובלסט לב היו שונים מאלה שנראו בלבבות פצועים I /R. כאן התארכו הפיברובלסטים, אך היו אחרים שעיגלו גופי תאים (גדולים יותר מאלה שנראו בלבבות לא פצועים) ולתת-אוכלוסייה של אלה היו תחזיות תאים רבות. קיצורים: MI = אוטם שריר הלב; קלט/רי = איסכמיה/רפרופוזיה. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
וידאו S11: החדר השמאלי פינה של עכברים Ang / PE שטופלו. לא היה אובדן לכאורה של פיברובלסטים לבביים (ירוקים) בעקבות טיפול אנג / PE. עם זאת, פיברובלסטים לב היו בעיקר קטנים מעוגלים או קטנים ומוארכים ונראה ליישר עם דפוסי התכווצות של הלב. קיצור: אנג/PE = אנגיוטנסין II/פנילפרין. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מציג שיטה מעודנת לניקוי רקמות המאפשרת הדמיה של פיברובלסטים לבביים ב vivo, הן בבסיס הפציעה והן בעקבותיה, כדי לאפיין ולהבין טוב יותר פיברובלסטים בלב העכבר. פרוטוקול משופר זה מטפל במגבלות בפרוטוקולים קיימים לניקוי רקמות שניסו לזהות סוגי תאים ספציפיים בלב הבוגר או בילודים12,13,14,16,17,20. בניסיונות הראשונים לנקות את לב העכבר, נעשה שימוש בטכניקת CLARITY הפסיבית, שבה הלב הושאר במאגר ניקוי על מאגף במשך כשבוע כדי לאפשר הפצה פסיבית של החיץ ברחבי הרקמה15,18. תהליך זה הפיק רק סליקה של כ 80 מיקרומטר של עומק לתוך הרקמה (נתונים שאינם מוצגים), אשר עולה בקנה אחד עם תצפיות קודמות לפיהן כמה שבועות נדרשו כדי לנקות את הלב 1 יום עכבריילודים 13. בהירות פעילה באמצעות מערכת אלקטרופורזה פעילה מאפשרת ניקוי עמוק יותר דרך כל הקיר החדרי, בעומק של כ-700 מיקרומטר–1 מ"מ, על פני מסגרת זמן קצרה יותר12,18.
עם זאת, באמצעות פרוטוקול בהירות פעיל שפורסם בעבר הוביל לאובדן פלואורסצנטיות פיברובלסט עם רמות גבוהות של שפעת אוטומטית של רקמות, אשר צוין בעבר להתרחש בהירות פעילה על ידי Kolesova ואח'12. כדי לאפשר תחזוקה של פלואורסצנטיות פיברובלסט, פרוטוקול הקיבעון המתאים נמצא בעל חשיבות עליונה. קצר מדי של תהליך קיבוע גרם לאובדן פלואורסצנטיות במהלך אלקטרופורזה. זמן רב מדי של תהליך קיבעון גרם לאובדן פלואורסצנטיות עצמה. לכן, קיבעון לילה ב 4 מעלות צלזיוס ב 4% PFA נמצאה אופטימלית. כדי לשפר את נושא פלואורסצנטיות הרקע, השריית קישוט (עיקרון שהושאל משיטת הסליקה מעוקב) שימשה להפחתת כריכת heme בתוך מיוגלובין, ולכן להפחית את שפעת אוטומטית הנגרמת על ידי כרומופורזה 18. טיפול טיהור הביא לניקוי חזק יותר של פלואורסצנטיות הרקע, עם שמירה על פלואורסצנטיות הכתבים כך שהפיברובלסטים המסומנים היו בולטים יותר (איור 2A).
לבסוף, כדי לאפשר שקיפות אופטית מלאה, הרקמה הייתה שווה בפתרון התאמת אינדקס שבירה (RIMS) (איור 2B-D). על ידי התאמת אינדקס השבירה של הרקמה לסביבתה, זה הגביר את השקיפות האופטית של הרקמה, ומאפשר הדמיה עמוקה יותר. סריקת מהדהד במהירות גבוהה שימשה לאחר מכן כדי לדמות רקמה כפי שהוא מהיר יותר מאשר סריקה גלוונומטרית. מכיוון שלבבות עכבר הם בגדלים שונים במקצת, הוגדרו פרמטרי דימות XY בודדים ותיקוני עוצמת Z. עם פרמטרים אלה, ניתן היה לדמיין דרך הלב הבלתי נפגע לדמיין פיברובלסטים פלואורסצנטיים בכ-4 שעות (איור 3). איכות התמונה שופרה בעיבוד שלאחר ההדמיה באמצעות תוכנת הניתוח unmixing ו denoising כדי להפחית את הרקע ולהבהיר את הפלואורסצנטיות הקיימת בתמונה. בנוסף, נעשה שימוש בתוכנת ניתוח משנית כדי להדגיש את לוקליזציה של פיברובלסטים פלואורסצנטיים. ניתוח פוסט-הדמיה זה שימש לביאור ברור של פיברובלסטים לבביים על ידי ביטול voxel-by-voxel ברקע(איור 3, איור 4, איור 5, איור 6).
פרוטוקול CLARITY ממוטב זה הוחל על לבבות פצועים ולא פצועים כאחד. זה מאפשר הבנה טובה יותר של התגובה של פיברובלסטים לב לפציעה. פציעות אלה כללו קורס זמן של MI ו- I / R, כמו גם מנון Ang / PE. כמו פגיעה איסכמית מחלישה רקמת הלב, זה קריטי כי טיפול גדול יותר נלקח במהלך electrophoresis כדי לשמור על שלמות הרקמות. אכן עבור פגיעה I / R ו- MI, תקופה קצרה יותר של אלקטרופורזה (≤1.5 שעות) נדרש32. מחקרים קודמים לא שקלו את ההשפעות של פציעה על תהליך ניקוי הרקמות. הפרוטוקול החדש שהותאם כאן מתאים לפציעה, ומאפשר סליקה ללא הרס נוסף של הרקמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין גילויים הקשורים לתוכן כתב היד הזה.
Acknowledgments
המחברים רוצים להכיר את CCHMC Confocal הדמיה ליבה על הסיוע וההדרכה שלהם בפיתוח של מודל זה, כמו גם מאט באטי מהנדסה קלינית עבור העיצוב של כל החלקים המודפסים 3D. דמטריה פישר נתמכה על ידי מענק הכשרה מהמכונים הלאומיים לבריאות (NHLBI, T32 HL125204) וג'פרי ד. מולקנטין נתמך על ידי המכון הרפואי הווארד יוז.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 braided silk | Ethicon | K871H | |
| 8-0 prolene | Ethicon | 8730H | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | |
| Angiotensin II | Sigma | A9525-50G | |
| Artificial Tear Ointment | Covetrus | 048272 | |
| DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane) | Millipore Sigma | D27802-25G | |
| GLUture topical tissue adhesive | World Precision Instruments | 503763 | |
| Heparin | Sigma | H0777 | |
| Imaris Start Analysis Software | Oxford Instruments | N/A | |
| Micro-osmotic pumps | Alzet | Model 1002 | |
| Nikon Elements Analysis Software | Nikon | N/A | |
| Nikon A1R HD upright microscope | Nikon | N/A | |
| Normal autoclaved chow | Labdiet | 5010 | |
| Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide |
CosmoBio | AXS-1002424 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Phenylephrine Hydrochloride | Sigma | P6126-10G | |
| Photoinitiator | Wako Chemicals | VA-044 | |
| Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] | Jackson Laboratories | Jax Stock No:012429 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium Chloride solution | Hospira, Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Tamoxifen food | Envigo | TD.130860 | |
| Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent | Millipore Sigma | 122262-1L | |
| X-Clarity electrophoretic clearing chamber | Logos Biosystems | C30001 | |
| X-Clarity electrophoretic clearing solution | Logos Biosystems | C13001 | |
| X-Clarity electrophoresis tissue basket | Logos Biosystems | C12001 | |
| X-Clarity electrophoresis tissue basket holder | Logos Biosystems | C12002 |
References
- Nagaraju, C. K., et al. Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure. Journal of the American College of Cardiology. 73 (18), 2267-2282 (2019).
- Yoon, S., Eom, G. H. Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions. Experimental and Molecular Medicine. 51 (12), 1-9 (2019).
- Borlaug, B. A., Redfield, M. M. Diastolic and systolic heart failure are distinct phenotypes within the heart failure spectrum. Circulation. 123, 2006-2014 (2011).
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the cardiac fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigation. 128 (5), 2127-2143 (2018).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Sadeghi, A. H., et al. Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling. Advanced Healthcare Materials. 6 (11), 1601434 (2017).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Bruns, D. R., et al. The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation. PLoS One. 14 (8), 0220573 (2019).
- Skiöldebrand, E., et al. Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion. Heliyon. 3 (10), 00406 (2017).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method. Cell Research. 28, 803-818 (2018).
- Kolesová, H., Čapek, M., Radochová, B., Janáček, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
- Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. Capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging. Journal of Visualized Experiments. (157), (2020).
- Wang, Z., et al. Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution. Biomedical Optics Express. 9 (2), 423-436 (2018).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12 (7), 0182072 (2017).
- Perbellini, F., et al. Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue. Scientific Reports. 7, 5188 (2017).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Nehrhoff, I., et al. 3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3716-3720 (2016).
- Yamamoto, M., et al. A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis. Genesis. 47 (2), 107-114 (2009).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
- Means, C. K., et al. Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 292 (6), 2944-2951 (2007).
- Michael, L. H., et al. Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 269 (6), 2147-2154 (1995).
- Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).
- Patten, R. D., et al. Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 274 (5), 1812-1820 (1998).
- Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 45 (2), 330-338 (2000).
- Vagnozzi, R. J., et al. An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy. Nature. 577, 405-409 (2020).
- Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 366-376 (2008).
- Arts, T., et al. Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle. Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).
- Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. P. The muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars. American Journal of Pathology. 145 (4), 868-875 (1994).
- Hashmi, S., Al-Salam, S. Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: A comparison. International Journal of Clinical Experimental Pathology. 8, 8786-8796 (2015).
