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Medicine

स्वस्थ और घायल माउस दिलों में त्रि-आयामी फाइब्रोब्लास्ट संगठन के लिए परिष्कृत स्पष्टता-आधारित ऊतक समाशोधन

Published: May 16, 2021 doi: 10.3791/62023
Automatic Translation
1,2, 3, 2, 2
1Department of Molecular Genetics, Biochemistry, and Microbiology, University of Cincinnati College of Medicine, 2Division of Molecular Cardiovascular Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Confocal Imaging Core, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

Summary

ऊतक समाशोधन की एक परिष्कृत विधि विकसित की गई थी और वयस्क माउस दिल पर लागू की गई थी। इस विधि को घने, ऑटोफ्लोरेटेंट कार्डियक ऊतक को साफ करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जबकि एक आनुवंशिक रिपोर्टर रणनीति के लिए जिम्मेदार लेबल फाइब्रोब्लास्ट फ्लोरेसेंस को बनाए रखा गया था।

Abstract

हृदय रोग दुनिया भर में मृत्यु का सबसे प्रचलित कारण है और अक्सर बढ़ हृदय फाइब्रोसिस द्वारा चिह्नित किया जाता है जो परिवर्तित हृदय समारोह के साथ वेंट्रिकुलर कठोरता में वृद्धि का कारण बन सकता है। कार्डियक वेंट्रिकुलर फाइब्रोसिस में यह वृद्धि निवासी फाइब्रोब्लास्ट की सक्रियता के कारण होती है, हालांकि ये कोशिकाएं बेसलाइन पर या सक्रियण के बाद 3-आयामी (3-डी) दिल के भीतर कैसे काम करती हैं, अच्छी तरह से समझ में नहीं आती हैं। यह जांचने के लिए कि फाइब्रोब्लास्ट हृदय रोग और 3-डी दिल में उनकी गतिशीलता में कैसे योगदान देते हैं, एक परिष्कृत स्पष्टता-आधारित ऊतक समाशोधन और इमेजिंग विधि विकसित की गई थी जो पूरे माउस दिल के भीतर फ्लोरोसेंटली लेबल कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट दिखाती है। ऊतक निवासी फाइब्रोब्लास्ट आनुवंशिक रूप से Rosa26-loxP-eGFP फ्लोरोसेंट रिपोर्टर चूहों का उपयोग कर लेबल थे हृदय फाइब्रोब्लास्ट के साथ पार कर Tcf21-MerCreMer दस्तक लाइन में व्यक्त । इस तकनीक का उपयोग स्वस्थ चूहों में और हृदय रोग के फाइब्रोटिक माउस मॉडल में पूरे वयस्क बाएं वेंट्रिकल में फाइब्रोब्लास्ट स्थानीयकरण गतिशीलता का निरीक्षण करने के लिए किया गया था। दिलचस्प बात यह है कि एक चोट मॉडल में, घायल माउस दिल में कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट के अद्वितीय पैटर्न देखे गए जो अनुबंधीय दिशा में लिपटे फाइबर के बैंड का पालन करते थे। इस्कीमिक इंजरी मॉडल्स में फाइब्रोब्लास्ट डेथ हुई, जिसके बाद इनफाक्ट बॉर्डर जोन से रीपॉपुलेशन हुआ । सामूहिक रूप से, यह परिष्कृत हृदय ऊतक स्पष्ट तकनीक और डिजिटाइज्ड इमेजिंग सिस्टम एंटीबॉडी प्रवेश विफलता या ऊतक प्रसंस्करण के कारण खोए हुए फ्लोरेसेंस के आसपास के पिछले मुद्दों की सीमाओं के बिना दिल में कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट के 3-डी दृश्य के लिए अनुमति देता है।

Introduction

हालांकि कार्डियोमायोसाइट्स दिल में सबसे बड़ी मात्रा अंश शामिल हैं, हृदय फाइब्रोब्लास्ट अधिक बहुतायत से कर रहे है और गंभीर रूप से इस अंग की आधारभूत संरचनात्मक और reparative सुविधाओं को विनियमित करने में शामिल हैं । कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट अत्यधिक मोबाइल, यांत्रिक रूप से उत्तरदायी और फेनोटाइपिक रूप से उनके सक्रियण की सीमा के आधार पर होते हैं। एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) के सामान्य स्तर को बनाए रखने के लिए कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट आवश्यक हैं, और इन कोशिकाओं द्वारा बहुत कम या बहुत अधिक ईसीएम उत्पादन रोग1,2,3का कारण बन सकता है। रोग में उनके महत्व को देखते हुए, हृदय फाइब्रोब्लास्ट उपन्यास उपचार रणनीतियों की पहचान करने की दिशा में जांच का एक तेजी से महत्वपूर्ण विषय बन गए हैं, विशेष रूप से अत्यधिकफाइब्रोसिस4,5,6,7को सीमित करने के प्रयास में। चोट पर, फाइब्रोब्लास्ट एक अधिक सिंथेटिक सेल प्रकार में सक्रिय और अंतर करते हैं जिसे माइफिब्रोब्लास्ट के रूप में जाना जाता है, जो प्रचुर मात्रा में ईसीएम के रूप में प्रसारित और स्रावित हो सकता है, साथ ही अनुबंधीय गतिविधि भी होती है जो वेंट्रिकल्स को फिर से तैयार करने में मदद करती है।

जबकि कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स को 2-डीसंस्कृतियों6,8,9,10में उनके गुणों के लिए बड़े पैमाने पर मूल्यांकन किया गया है, 3-डी जीवित दिल में उनके गुणों और गतिशीलता के बारे में बहुत कम समझा जाता है, या तो बेसलाइन पर या रोग उत्तेजना के साथ। यहां, एक परिष्कृत विधि ऊतक स्पष्ट वयस्क माउस दिल को बनाए रखने के लिए वर्णित किया गया है, जबकि एक Rosa26-loxP-eGFP एक्स Tcf21-MerCreMer आनुवंशिक रिपोर्टर प्रणाली के साथ लेबल फाइब्रोब्लास्ट के फ्लोरेसेंस को बनाए रखने । दिल के भीतर, Tcf21 शांत फाइब्रोब्लास्ट4का एक अपेक्षाकृत विशिष्ट मार्कर है । टैमोक्सिफेन के बाद निष्क्रिय MerCreMer प्रोटीन को सक्रिय करने के लिए दिया जाता है, अनिवार्य रूप से सभी शांत फाइब्रोब्लास्ट स्थायी रूप से Rosa26 लोकस से बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (eGFP) व्यक्त करेंगे, जो वीवो में उनकी ट्रैकिंग के लिए अनुमति देता है ।

कई सुस्थापित ऊतक समाशोधन प्रोटोकॉल मौजूद हैं, जिनमें से कुछ दिल11, 12,13, 14,15,16,17पर लागू किए गए हैं। हालांकि, विभिन्न ऊतक समाशोधन प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले कई अभिकर्मकों को अंतर्जात फ्लोरेसेंस सिग्नल18को बुझाने के लिए पाया गया है। इसके अतिरिक्त, प्रचुर मात्रा में हेम समूह युक्त प्रोटीन के कारण वयस्क हृदय को स्पष्ट करना मुश्किल है जो ऑटोफ्लोरेसेंस19उत्पन्न करते हैं। इसलिए, इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य फाइब्रोब्लास्ट मार्कर फ्लोरेसेंस को घायल वयस्क हृदय में इष्टतम 3-डी दृश्य के लिए घायल वयस्क हृदय में एक साथ अवरोध के साथसंरक्षितकरनाथा।

पिछले अध्ययनों से इन कोशिकाओं को लेबल करने के लिए वीवो में कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट की जांच करने का प्रयास किया गया था, हालांकि इस तरह के अध्ययन एंटीबॉडी प्रवेश औरहृदय संवहनी संरचना14, 16,17,20द्वारा सीमित थे। हालांकि सलामन एट अल ने नवजात हृदय में सामयिक न्यूरोनल फ्लोरेसेंस के रखरखाव के साथ ऊतक समाशोधन दिखाया है, और नेहरहॉफ एट अल ने माइलॉयड कोशिकाओं को चिह्नित करते हुए फ्लोरेसेंस के रखरखाव को दिखाया है, पूरे वेंट्रिकुलर दीवार के माध्यम से अंतर्जात फ्लोरेसेंस का रखरखाव अभी तक प्रदर्शित नहीं किया गया है, जिसमें बेसलाइन पर या चोट के बाद वयस्क हृदय रेशेब्लास्ट का दृश्य शामिल है13,20। यह ऊतक समाशोधन प्रोटोकॉल स्पष्टता विधि (स्पष्ट लिपिड-एक्सचेंज किए गए एक्रिलामाइड-संकरित कठोर इमेजिंग/इम्यूनोस्टेपिंग/सीटू-संकरण-संगत ऊतक हाइड्रोगेल में) और पेगासोस (पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) से जुड़े सॉल्वेंट सिस्टम) के आधार पर पिछले प्रोटोकॉल के मिश्रण को परिष्कृत करता है। इस परिष्कृत प्रोटोकॉल ने बेसलाइन पर माउस दिल में कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट की अधिक मजबूत परीक्षा की अनुमति दी और वे विभिन्न प्रकार की चोट का जवाब कैसे देते हैं। प्रोटोकॉल सीधा और प्रजनन योग्य है और वीवो में कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट के व्यवहार की विशेषता में मदद करेगा।

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Protocol

चूहों से जुड़े सभी प्रयोगों को सिनसिनाटी चिल्ड्रन हॉस्पिटल मेडिकल सेंटर में इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (IACUC) द्वारा मंजूरी दी गई थी । संस्था भी AAALAC (प्रयोगशाला पशु देखभाल के प्रत्यायन के लिए अमेरिकन एसोसिएशन) प्रमाणित है । चूहों को गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से इच्छामृत्यु दी गई थी, और जीवित रहने वाली सर्जिकल प्रक्रियाओं से गुजर रहे चूहों को दर्द से राहत दी गई थी (नीचे देखें)। दर्द प्रबंधन और इच्छामृत्यु के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले सभी तरीके अमेरिकन वेटनरी मेडिकल एसोसिएशन की इच्छामृत्यु पर पैनल की सिफारिशों पर आधारित हैं। सभी चूहों को हर समय उपलब्ध पानी और भोजन के साथ मकई सिल बिस्तर इकाइयों में रखे गए थे। चूहों को एक ही लिंग के साथ एक पिंजरे में 4 रखे गए थे। सर्जरी या अघायल ऊतक समाशोधन के लिए, 6-8 सप्ताह पुराने पुरुष और महिला चूहों की बराबर संख्या का इस्तेमाल किया गया ।

नोट: बाँझ शल्य चिकित्सा शर्तों सभी सर्जरी में बनाए रखा गया । सर्जन साफ स्क्रब और एक बाँझ गाउन में बदल गया और फिर जूता कवर और एक हेयरनेट पहना । सर्जन तो क्लोरहेक्सीडीन के साथ अपने हाथ रगड़ और बाँझ सर्जिकल दस्ताने पहना । सर्जन एक तकनीशियन जो बेहोश, मुंडा, और चीरा साइट 3 बार प्रत्येक रगड़, 2% क्लोरोएक्सिडीन ग्लूकोनेट और ७०% आइसोप्रोपैनॉल के बीच बारी द्वारा सहायता प्रदान की गई थी । इसके बाद चूहों को सर्जन के पास लाया गया, और सर्जरी की गई । जानवरों के बीच, उपकरणों को मनका स्टरलाइजर में निष्फल किया गया था।

1. क्रे रिकॉम्बिनेशन

  1. क्रॉस Rosa26-loxP-eGFP चूहों (Rosa26-nLacZ [FVB । सीजी-जीटी (रोजा) 26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP) Glh/J]) TCf21-MerCreMer चूहों के साथ(चित्रा 1A)6,21।
  2. जब इस क्रॉस की संतान 6 सप्ताह की उम्र तक पहुंच जाती है, तो मकई के तेल में भंग 75 मिलीग्राम/किलो टैमोक्सिफेन का इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन प्रशासित करें। 22 इस टैमोक्सिफेन को दो बार प्रशासित करें, 48 घंटे के अलावा(चित्रा 1B)।
  3. टैमोक्सिफेन इंजेक्शन के बाद, चूहों को एक सप्ताह के लिए टैमोक्सिफेन भोजन (~ 0.4 ग्राम/किलो टैमोक्सिफेन साइट्रेट) के आहार पर रखें। टैमोक्सिफेन चाउ के एक सप्ताह के बाद, सर्जरी(चित्रा 1B)प्रदर्शन करने से पहले एक सप्ताह के लिए एक सामान्य ऑटोक्लेव चाउ आहार के लिए चूहों को वापस करें। अघायल नियंत्रण होने के लिए चूहों की एक उपयुक्त संख्या (3 प्रति शल्य चिकित्सा स्थिति) नामित करें। इन चूहों का बलिदान, और सामान्य चाउ आहार के एक सप्ताह के बाद नीचे चित्रित समाशोधन प्रक्रिया के लिए आगे बढ़ें।
  4. टैमोक्सिफेन आहार और पुनर्संयोजन के बाद, सर्जरी करें।

2. सर्जिकल मॉडल

  1. इस्केमिया/रिफ्यूजन (I/R)23,24
    1. हवादार बॉक्स में कमरे की हवा में 1.5% आइसोफ्लुन गैस के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें; बिजली के कतरनी के साथ उनके चेस्ट और गर्दन दाढ़ी, और फिर एक 2% क्लोरहेक्सीडीन ग्लूकोनेट लथपथ झाड़ू के साथ मुंडा क्षेत्रों साफ़ ।
    2. बेहोश चूहों की आंखों पर मरहम लगाकर सर्जरी के दौरान सूखापन को रोकने के लिए कृत्रिम आंसू मरहम का प्रयोग करें।
    3. श्वासनली के दृश्य की अनुमति देने के लिए सर्जिकल कैंची का उपयोग करके एक मध्य गर्दन कट करें। श्वासनली में इंस्टुबेशन ट्यूब रखकर 20 जी कैथेटर के साथ इंटूबेट करें और मध्य गर्दन चीरा के माध्यम से श्वासनली कैथेटर की कल्पना करें। चूहों को एक वेंटिलेटर पर रखें, जबकि आइसोफलून गैस (1.5%) कमरे की हवा में।
    4. सर्जिकल कैंची के साथ बाएं मोर्चे के अंग के नीचे एक चीरा बनाओ, और पसलियों 3 और 4 के बीच इंटरकोस्टल मांसपेशियों में कटौती। एक रिट्रैक्टर का उपयोग करके पसलियों को खुला फैलाएं।
    5. फेफड़ों को नुकसान से बचाने के लिए फेफड़ों और दिल के बीच खारा में भिगोए गए एक छोटे स्पंज को रखें।
    6. एक फिशहुक सुई (6.5 मिमी, 3/8 सी) का उपयोग करके, 8-0 का उपयोग करके बाएं कोरोनरी धमनी को रिलीज करने योग्य स्लिप गाँठ के साथ बांधें प्रोलीन।
    7. संदंश का उपयोग कर स्पंज निकालें।
    8. सीवन इंटरकोस्टल मांसपेशियों 4-0 लट रेशम और एक निरंतर सीवन का उपयोग कर बंद कर दिया, जबकि भी 8-0 के अंत बाहरी प्रोलीन स्लिप गाँठ।
    9. ऑक्सीक्लेडिंग स्लिप नॉट फैला हुआ के अंत के साथ सामयिक ऊतक चिपकने का उपयोग कर त्वचा चीरों को बंद करें।
    10. एक घंटे के ऑक्लूजन के बाद, आंतरिक रूप से कोरोनरी धमनी ऑक्क्यूशन को जारी करने के लिए स्लिप गाँठ के बाहरी छोर को खींचें, इस्केमिया से राहत दें और ईंधन के कारण।
    11. एक दर्द रिलीवर के रूप में सबडरमल इंजेक्शन (72 एच रिलीज) के माध्यम से 1 मिलीग्राम/एमएल विस्तारित रिलीज बुप्रेनॉर्फिन के 0.02 एमएल को प्रशासित करें, और चूहों को अन्य जानवरों से अलग 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ऑक्सीजनयुक्त इनक्यूबेशन कक्ष में रखें। चूहों की निगरानी कम से कम हर 15 मिनट जब तक वे संज्ञाहरण से बरामद किया है और एक उरस्थी या बैठे स्थिति को बनाए रखने में सक्षम हैं। चूहों को उनके नियमित आवास पर लौटा दें।
    12. सर्जरी के बाद 48 एच के लिए दर्द और संकट के लिए जानवरों का आकलन करें, और पूरी तरह से चंगा होने तक दैनिक चीरा साइट की निगरानी करें।
    13. बलिदान तक सर्जरी के बाद हाइड्रेशन, पोषण और समग्र कल्याण के लिए चूहों का निरीक्षण करें।
  2. मायोकार्डियल इंफेक्शन (एमआई)25,26,27
    1. चरण 2.1.1-2.1.7 करें।
    2. 4-0 लट रेशम का उपयोग करके इंटरकोस्टल मांसपेशियों को बंद करने के लिए एक निरंतर सीवन का उपयोग करें।
    3. सामयिक ऊतक चिपकने वाला का उपयोग कर त्वचा चीरा बंद करो।
    4. चरण 2.1.11-2.1.13 करें।
  3. एंजियोटेंसिन II/फेनिलेफ्रीन माइक्रो-ऑस्मोटिक पंप जलसेक
    1. बाँझ परिस्थितियों के तहत एंजियोटेंसिन II और 500 माइक्रोन/माइक्रोन वर्किंग सॉल्यूशन ऑफ फेनिलेफ्रीन का 10 μg/μL वर्किंग सॉल्यूशन तैयार करें (यानी, एक लैमिनार फ्लो हुड में) 1 मिलीग्राम एंजियोटेंसिन II को 100 माइक्रोल बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) और 250 मिलीग्राम फेनिलेफ्रीन हाइड्रोक्लोराइड को पीबीएस के 500 माइक्रोन में जोड़कर।
    2. माउस वजन के आधार पर माइक्रो-ऑस्मोटिक पंप को वितरित करने के लिए प्रत्येक कार्य समाधान और अंतिम मात्रा के कमजोर पड़ने की गणना करें।
      नोट: उदाहरण के लिए, एक 20 ग्राम माउस 20 ग्राम x 14 दिन x 1.5 μg/day = 420 μg एंजियोटेंसिन, या 42 μL काम समाधान की आवश्यकता है, साथ ही साथ 20 ग्राम x 14 दिन x 50 μg/day = 14000 μg pheleph हाइड्रोरिनक्लोराइड, या 28 μl काम समाधान के।
    3. प्रत्येक माउस के वजन के लिए, बाँझ पीबीएस में दवा के काम कर रहे स्टॉक को पतला करें और 27 जी सुई और 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके माइक्रो-ऑस्मोटिक पंप (0.25 माइक्रोल/एच, 14 दिन, लगभग 100 माइक्रोल) भरें।
      नोट: यह 1.5माइक्रोन∙जी-1∙जियटेंसिन II केदिन-1 और 50 μg∙g-1∙डे-1 फेनिलेफ्रीन हाइड्रोक्लोराइड की प्रवाह दर उत्पन्न करेगा।
    4. कमरे की हवा वाले हवादार कक्ष में 1.5% आइसोफ्लुने इनहेलेशन (प्रभाव के लिए) के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें।
    5. एनेस्थेटाइज्ड चूहों को ओपिन स्थिति में बाँझ सर्जिकल टेबल पर रखें, और आइसोफ्लुन गैस साँस लेने (1.5%) एक नाक शंकु के माध्यम से।
    6. सर्जरी के दौरान सूखापन को रोकने के लिए जानवर की आंखों पर कृत्रिम आंसू मरहम का प्रयोग करें।
    7. बिजली के बाल कतरनी के साथ प्रत्यारोपण क्षेत्र पर फर दाढ़ी, और क्षेत्र निष्फल इथेनॉल और एक बाँझ झाड़ू का उपयोग कर कटौती की जा करने के लिए । कंधे के ब्लेड के नीचे पीठ के दाईं पार्श्व की ओर माउस त्वचा की एपिडर्मल परत में सर्जिकल कैंची के साथ एक छोटा चीरा (लगभग 1 सेमी) बनाएं। मिनीपंप डालने के लिए प्रत्यारोपण के क्षेत्र में और उसके आसपास त्वचा को धीरे-धीरे फैलाने के लिए सर्जिकल कैंची की एक जोड़ी के सुस्त पक्षों का उपयोग करें।
    8. चीरा के भीतर माइक्रो-ऑस्मोटिक पंप रखें, और शारीरिक रूप से इसे त्वचा के नीचे पंप की मैन्युअल रूप से मालिश करके माउस के पृष्ठीय मिडलाइन के बाईं ओर पैंतरेबाज़ी करें।
    9. एक टेपर पॉइंट सुई के साथ 4-0 रेशम का उपयोग करके निरंतर सीवन के माध्यम से चीरा बंद करें।
    10. पंप प्रत्यारोपण के बाद, एनाल्जेसिया (72-एच धीमी रिलीज) के लिए सबडरमल इंजेक्शन के माध्यम से 0.1 मिलीग्राम/किलो शरीर के वजन की खुराक पर धीमी गति से रिलीज बुप्रेनोरफिन का प्रशासन करें। चूहों को अन्य जानवरों से अलग 37 डिग्री सेल्सियस पर ऑक्सीजनयुक्त इनक्यूबेशन कक्ष में रखें। चूहों की निगरानी कम से कम हर 15 मिनट जब तक वे संज्ञाहरण से ठीक हो जाते हैं और एक स्टर्नल या बैठे स्थिति को बनाए रख सकते हैं।
    11. 37 डिग्री सेल्सियस वार्मिंग कक्ष में संज्ञाहरण से वसूली पर, चूहों को अपने मानक आवास इकाइयों में वापस रखें।
    12. सर्जरी के बाद 48 एच के लिए दर्द और संकट के लिए चूहों की निगरानी करें, और पूरी तरह से चंगा होने तक दैनिक चीरा साइट की निगरानी करें।
    13. बलिदान तक सर्जरी के बाद हाइड्रेशन, पोषण और समग्र कल्याण के लिए चूहों का निरीक्षण करें।

3. एक संशोधित सक्रिय स्पष्टता प्रोटोकॉल का उपयोग कर वयस्क माउस दिल समाशोधन

  1. सर्जरी की सतह और 70% इथेनॉल के साथ सभी सर्जिकल उपकरणों की नसबंदी करके एक स्वच्छ शल्य क्षेत्र तैयार करें। पीबीएस (100 एमएल प्रत्येक) में कोल्ड 1x पीबीएस और 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) का समाधान तैयार करें। दस्ताने, लैब कोट, फेस मास्क और आंखों की सुरक्षा पहनें।
  2. 0.9% w/v सोडियम क्लोराइड समाधान में हेपरिन की 10 इकाइयों को कमजोर करके हेपरिन बफर तैयार करें। प्रत्येक माउस को 1 एमएल सिरिंज और 27 जी सुई का उपयोग करके हेपरिन-एनएसीएल के 60 माइक्रोन के साथ इंट्रापेरिटी रूप से इंजेक्ट करें।
  3. हेपरिन-एनएसीएल समाधान के इंजेक्शन के पांच मिनट बाद, चूहों को कमरे की हवा वाले हवादार कक्ष में 1.5% आइसोफ्लुनेलैन साँस (प्रभाव में) का उपयोग करके एनेस्थेटाइज करें।
  4. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा चूहों को इच्छामृत्यु, जिसमें सिर के पीछे फ्लैट, संदंश के बंद अंत के साथ आयोजित किया जाता है, जबकि रीढ़ की हड्डी का कॉलम पूंछ खींचकर उखड़ जाता है।
  5. एक कपास झाड़ू पर 70% इथेनॉल के साथ माउस की वेंट्रल सतह को साफ करें। सर्जिकल कैंची का उपयोग कर xiphoid प्रक्रिया के नीचे लगभग 3 सेमी वाष्पित चीरा बनाओ।
  6. अंतर्निहित पेट की दीवार के ऊतकों से त्वचा को अलग करके पेट को xiphoid प्रक्रिया तक छोड़ दें (त्वचा को पूंछ के निकटतम पकड़ें और त्वचा को सिर के निकटतम रिबकेज की ओर खींचें)। सर्जिकल कैंची का उपयोग कर xiphoid प्रक्रिया के नीचे 3 सेमी चमड़े के नीचे पेट की दीवार ऊतक में एक 2 सेमी पारक्षान चीरा बनाओ। इस ट्रांसवर्स चीरा से एक ऊर्ध्वाधर कट बनाओ, मिडलाइन ऊपर और रिबकेज के माध्यम से । रिबकेज को वापस पिन करें, दिल को उजागर करें।
  7. दिल से रक्त को साफ करने के लिए बेहतर वेना कावा और महाधमनी में ठंडे पीबीएस इंजेक्ट करने के लिए 27 जी सुई और 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करें (दिल के किसी भी स्थितीय हेरफेर को पंचर से बचने के लिए कुंद संदंश के साथ सावधानी से किया जाना चाहिए)।
    नोट: पर्याप्त पर्फ्यूजन को पूंछ चिकोटी और फेफड़ों के मलिनकिरण द्वारा नोट किया जा सकता है।
  8. फिक्सेशन प्रक्रिया शुरू करने के लिए बेहतर वेना कावा और महाधमनी में ठंडे 4% पीएफए इंजेक्ट करने के लिए 27 जी सुई और 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करें।
  9. दिलों को आबकारी करें । अटरिया, दाएं वेंट्रिकल और पट, और बाएं वेंट्रिकल को सीधे ब्लेड स्केलपेल का उपयोग करके अलग किया जाना चाहिए। इस टिश्यू को ठंडे 4% पीएफए से भरे 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में रखें, और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक न्यूटोटर पर रखें।
  10. अतिरिक्त पीएफए को हटाने के लिए ठंडे 1x पीबीएस के साथ प्रत्येक 1 घंटे के लिए दिल को 3 बार धोएं।
  11. 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में निम्नलिखित रसायनों को मिलाकर हाइड्रोगेल (सापेक्ष एक्रिलैमाइड/पॉलीएक्रीलामाइड संरचना के लिए A4P0 कहा जाता है) तैयार करें: 40% एक्रिलामाइड का 10%, 10% 1x पीबीएस, 80% आसुत पानी।
  12. हाइड्रोगेल में दिल को जलमग्न करने से ठीक पहले हाइड्रोगेल समाधान में फोटोनिटिनिएटर (2,2-अज़ोबिस [2-(2-इमिडाजोलिन-2yl) प्रोपेन) डाइहाइड्रोक्लोराइड) का 0.25% समाधान जोड़ें।
  13. दिल को हाइड्रोगेल युक्त शंकु नली में रखें। शंकु नली को पन्नी में लपेटें, और शारीरिक अशांति के बिना 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  14. 4 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 14 घंटे के बाद, दिल युक्त शंकु नली को 37 डिग्री सेल्सियस मनका स्नान में ले जाएं।
  15. मनका स्नान में 2.5 घंटे के बाद, हाइड्रोगेल से दिल को संदंश के साथ ध्यान से हटा दें।
  16. एक नटेटर पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 1x पीबीएस युक्त 15 एमएल शंकु नली में 1 घंटे के लिए 3 बार दिल धोएं।
  17. संदंश का उपयोग कर सक्रिय इलेक्ट्रोफोरेसिस मशीन की टोकरी में दिल रखें, और टोकरी पर ढक्कन रखें। सुनिश्चित करें कि ढक्कन सुरक्षित रूप से जगह में है।
  18. कक्ष में समाधान डालने से इलेक्ट्रोफोरेटिक समाशोधन समाधान के साथ सक्रिय इलेक्ट्रोफोरेसिस चैंबर जलाशय भरें।
  19. एक बार जब चैंबर इलेक्ट्रोफोरेटिक समाशोधन समाधान से भरा होता है, तो दिल युक्त टोकरी जलमग्न हो सकती है। इलेक्ट्रोफोरेसिस मशीन पर कैप को सुरक्षित रखें।
  20. इलेक्ट्रोफोरेसिस मशीन को 1.5 ए, 37 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 घंटे के लिए चलाएं।
  21. इलेक्ट्रोफोरेसिस के 1.5 घंटे के बाद, यह सुनिश्चित करने के लिए नेत्रहीन दिलों की जांच करें कि कोई अपारदर्शी ऊतक नहीं रहता है। यदि ऊतक के क्षेत्र अभी भी अपारदर्शी हैं, तो इलेक्ट्रोफोरेटिक कक्ष में इलेक्ट्रोफोरेसिस समाधान में दिल को फिर से जलमग्न करें, और एक समय में 0.5 घंटे के लिए इलेक्ट्रोफोरेसिस जारी रखें।
    नोट: इलेक्ट्रोफोरेसिस ऊतक क्षति के पहले संकेत पर बंद कर दिया जाना चाहिए (जैसे ऊतक अस्तव्यस्त) ।
  22. 15 एमएल शंकु नली में दिलों को धोएं जिसमें 1 घंटे के लिए 1x पीबीएस होते हैं, प्रत्येक बार, एक न्यूट्रीटर पर 37 डिग्री सेल्सियस पर।
  23. एन, एन, एन',एन'-टेट्रिकिस (2-हाइड्रोक्सीप्रोपाइल) एथिलेंडियामाइन युक्त 15 एमएल शंकु नली में दिलों को जलमग्न करें- एक विक्लोराइजिंग एजेंट जो हीम ऑटोफ्लोरेसेंस को कम करता है।
    नोट: इस समाधान को हर 24 घंटे में बदल दिया जाना चाहिए जब तक कि दिल पूरी तरह से स्पष्ट न हो जाएं (लगभग 2 दिन)।
  24. अतिरिक्त डिक्लोराइजिंग एजेंट को हटाने के लिए 1x पीबीएस 3 बार के साथ 15 एमएल शंकु नली में दिलों को धोएं।
  25. 0.02 एम फॉस्फेट बफर के 30 एमएल, 40 ग्राम 5-(एन-2, 3-डिहाइड्रोक्सीप्रोपिलेटीमिडो) के 2, 4, 6-त्रि-इयोडो-एन के संयोजन से अपवर्तक इंडेक्स मैचिंग सॉल्यूशन (रिम्स) तैयारकरें, एन '-बीआईएस(2, 3 डिहाइड्रोक्सीप्रोपिल) सरगर्मी के साथ आइसोफथैलमाइड (पूरी तरह से भंग किया जाना चाहिए-यह एक घंटे तक लग सकता है), सोडियम एजाइड का 5 मिलीग्राम, ट्वीन20 का 50 माइक्रोन, और 1 ग्राम 1,4-डायज़बीसाइक्लो [2.2.2] ऑक्टेन, और पीएच को 7.5 में समायोजित करें।
  26. इमेजिंग से पहले 48 घंटे के लिए रिम्स में दिलों को समतुलित करें।

4. इमेजिंग एक ईमानदार एकल फोटॉन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर दिलों को मंजूरी दे दी

नोट: इमेजिंग उपकरण में 10 सेमी ग्लास पेट्री डिश का निचला आधा हिस्सा, एक 3 डी मुद्रित नीचे जलाशय, एक गोल ग्लास कवरलिप, और एक 3 डी मुद्रित शीर्ष जलाशय(चित्रा 1सी-ई)शामिल हैं। सिनसिनाटी चिल्ड्रन हॉस्पिटल क्लीनिकल इंजीनियरिंग डिपार्टमेंट द्वारा 3डी प्रिंटेड मैटेरियल इन-हाउस बनाए गए थे ।

  1. वैक्यूम तेल का उपयोग करें 3 डी मुद्रित नीचे जलाशय को एक ग्लास पेट्री डिश में सील करने के लिए 3 डी मुद्रितटुकड़ा (चित्रा 1C)के नीचे वैक्यूम तेल की एक पतली परत डालकर।
    नोट: जलाशय एक ही ऊंचाई के रूप में नमूना छवि जा रहा है (यानी, नमूना इसके ऊपर रखा कांच कवरस्लिप द्वारा संकुचित नहीं किया जाना चाहिए, और नमूना भी तैरने और जलाशय के भीतर स्थानांतरित करने में सक्षम नहीं होना चाहिए) ।
  2. रिम्स के साथ जलाशय भरें, और एक पाइप टिप के साथ सभी बुलबुले को हटा दें। रिम्स में दिल को ध्यान से बाएं वेंट्रिकुलर दीवार का सामना करना पड़ रहा है, यह सुनिश्चित करना है कि कोई बुलबुले समाधान में पेश कर रहे हैं।
  3. वैक्यूम तेल का उपयोग करके 3 डी मुद्रित शीर्ष जलाशयटुकड़ा (पूरक चित्रा 1A)की निचली सतह पर एक ग्लास कवरलिप का पालन करें (फिर से 3 डी मुद्रित टुकड़े पर वैक्यूम तेल की एक पतली परत रखकर, और इसे कवर स्लिप पर रखकर)(चित्रा 1D)।
  4. बुलबुले की शुरूआत के बिना, नीचे जलाशय(पूरक चित्रा 1B)पर ग्लास कवरलिप और शीर्ष जलाशय, कवरलिप साइड नीचे रखें। रिम्स और कवर स्लिप के बीच आसंजन ऊपर और नीचे जलाशय के टुकड़ों(चित्रा 1E)के बीच एक मुहर प्रदान करेगा ।
  5. 10x ग्लाइसरोल विसर्जन उद्देश्य के साथ उपयोग के लिए ग्लाइसरोल के साथ शीर्ष जलाशय भरें।
  6. एक एकल फोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें जो स्वीकृत दिलों को छवि देने के लिए मल्टीफोटॉन कॉन्फोकल स्कैन हेड के साथ आउटफिट किया गया है।
  7. एकल फोटॉन माइक्रोस्कोप के चरण को कम करें, और नमूना युक्त पेट्री डिश को चरण के केंद्र में रखें। मंच उठाएं और नमूना उपकरण के शीर्ष जलाशय में ग्लिसरोल में 10x ग्लाइसरोल विसर्जन उद्देश्य को कम करें। सुनिश्चित करें कि नमूने को आईपीस का उपयोग करके नमूने के किनारे को देखकर ध्यान केंद्रित किया गया है।
  8. लाइव बटन पर क्लिक करके कंप्यूटर पर कैमरा व्यू के लिए आईपीस व्यू से स्विच करें।
    1. पहले ऊतक नमूने के सबसे व्यापक भाग का पता लगाकर एक्स और वाई पैरामीटर सेट करें, जो पेट्री डिश के नीचे होना चाहिए।
    2. ND अधिग्रहण और कस्टम मल्टीपॉइंटपर क्लिक करें । पहले जॉयस्टिक का उपयोग करके ऊतक नमूने के बीच खोजने के द्वारा मल्टीपॉइंट बनाएं ताकि बाएं से दाएं और ऊपर से नीचे तक झाडू लगाई जा सके।
    3. फिर, ऊतक के आकार के आधार पर, आवश्यक टाइलिंग आकार (आमतौर पर 6-8 सप्ताह पुराने माउस दिल के लिए 6 x 5) निर्धारित करें। केवल एक्स और वाई मापदंडों (एनडी अधिग्रहण टैबके तहत अनियंत्रित जेड) पर कब्जा करके परीक्षण इमेजिंग चलाकर ऐसा करें ताकि यह जांचा जा सके कि ऊतक की पूरी लंबाई और चौड़ाई पर कब्जा किया गया था या नहीं।
  9. जेड पैरामीटर सेट करने के लिए, XYZ नेविगेशनखोलें, और नमूने के ऊपर और नीचे खोजने तक ऊपर और नीचे माउस पर क्लिक करें।
    1. जेड तीव्रता सुधार पैनल खोलें और प्रत्येक जेड बिंदु पर लेजर शक्ति को बढ़ाकर या कम करके ऊतक घनत्व को सही करने के लिए ऊतक के शीर्ष, मध्य और नीचे फ्लोरेसेंस को समायोजित करें। जेड तीव्रता सुधार पैनल के दाईं ओर सेट तीर पर क्लिक करके इन्हें सेट करें।
    2. ND अधिग्रहण पैनल में जेड चरण का आकार 5 माइक्रोन सेट करें।
  10. एक्स, वाई, और जेड मापदंडों के बाद दिल चित्रित कर रहे हैं और जेड तीव्रता सुधार सेट किया जाता है, एक सुनाई देती स्कैनर और गैलियम आर्सेनाइड फॉस्फीड फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब (GaAsP PMTs) के साथ एक सुनाई देती है 10x ग्लाइसेरोल विसर्जन उद्देश्य के साथ स्वचालित ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग साफ दिल छवि के लिए। सुनिश्चित करें कि XY और Z टैब की जांच एनडी अधिग्रहणके तहत की जाए और रन जेड करेक्शन दबाएं।
  11. सिलाई, अनमिक्स, और प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर में मल्टीपॉइंट छवि खोलकर और सिलाई बटन पर क्लिक करके परिणामस्वरूप छवियों को डिनोज़ करें। छविके तहत , ब्लाइंड अनमिक्सिंगपर क्लिक करें , 2 चैनल,और फिर लगताहै । और छविके तहत, denoise.aiपर क्लिक करें, तो पसंद के फ्लोरोसेंट चैनल पर क्लिक करें (यानी, GFP)।
    नोट: इस प्रक्रिया के परिणामस्वरूप पूरे बाएं वेंट्रिकल में जीएफपी-पॉजिटिव फाइब्रोब्लास्ट की 3डी छवि होती है।
  12. कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट के फैलाव में पैटर्न और प्रवृत्तियों की पहचान करने के लिए माध्यमिक विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। स्पॉट जादूगर कार्यक्रम चलाकर स्पॉट समारोह का उपयोग करें।

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Representative Results

हृदय की चोट के साथ-साथ हृदय की चोट की प्रतिक्रिया के लिए हृदय फाइब्रोब्लास्ट दिल के बेसलाइन कार्य के लिए आवश्यक हैं। इन कोशिकाओं की व्यवस्था और आकृति विज्ञान को समझने के पिछले प्रयास काफी हद तक 2-डी सेटिंग्स में आयोजित किए गए हैं। हालांकि, एक परिष्कृत हृदय ऊतक समाशोधन(चित्रा 2)और 3-डी इमेजिंग तकनीक प्रकाशित की गई है, जो कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट के उन्नत, अधिक विस्तृत दृश्य के लिए अनुमति देता है। इस इमेजिंग तकनीक के साथ, फाइब्रोब्लास्ट घनी पैक पाए गए और अघायल दिलों में एक पतली आकृति विज्ञान है(चित्रा 3, पूरक वीडियो S1-4)।

बाएं वेंट्रिकुलर ऊतक समाशोधन के बाद एक घायल दिल में पूरा किया गया था, प्रोटोकॉल कई चोट मॉडल के लिए लागू किया गया था की जांच कैसे इस समाशोधन प्रोटोकॉल प्रदर्शन जब घायल दिल के ऊतकों का अध्ययन करेंगे । चूहों को 1 एच के लिए बाईं कोरोनरी धमनी (एलसीए) के अस्थायी बंद होने से आई/आर चोट के अधीन किया गया था और इसके बाद 3, 7, 14 या 28 दिनों तक चलने वाले रिफ्यूजन का शुभारंभ हुआ । इन प्रयोगों से पता चला है कि मैं/आर चोट के ठीक बाद इस्कीमिक क्षेत्र में हृदय फाइब्रोब्लास्ट का नुकसान हुआ था, लेकिन 7 और दिन 14 तक, फाइब्रोब्लास्ट चले गए या घायल दिल के इस क्षेत्र को फिर से आबाद करने के लिए पैदा हुए । 28 दिन तक, हृदय के घायल क्षेत्रों के आसपास हृदय फाइब्रोब्लास्ट आबादी उनकी सबसे बड़ी घनत्व(चित्रा 4, पूरक वीडियो S5-8)पर थे ।

एमआई चोट एक सर्जिकल मॉडल है जिसके परिणामस्वरूप स्थायी एलसीए लिगेशन (कोई रिफ्यूजन नहीं)। दिल है कि एमआई सर्जरी आया था १.५ और 3 दिनों में फिक्सेशन, समाशोधन, और विश्लेषण के लिए सर्जरी के बाद excised थे । सर्जरी के बाद १.५ दिन में घायल बाएं वेंट्रिकल में बहुत कम फाइब्रोब्लास्ट शेष थे(चित्रा 5A, पूरक वीडियो S9)। हालांकि, 3 दिन तक, फाइब्रोब्लास्ट का विस्तार हुआ और एक छोटे से क्षेत्र को छोड़कर अधिकांश बाएं वेंट्रिकल में मौजूद थे, संभवतः सीमा क्षेत्र में आबादी से माइग्रेट हो गए और/या प्रसारित(चित्रा 5B, पूरक वीडियो S10)। फिर, विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग फाइब्रोब्लास्ट स्थानीयकरण को बेहतर तरह से कल्पना करने के लिए किया गया था, और हृदय फाइब्रोब्लास्ट के नुकसान के क्षेत्रों को नारंगी(चित्रा 5)में रेखांकित किया गया था। इस विश्लेषण ने एमआई के बाद 1.5 दिन में कोशिकाओं के प्रारंभिक नुकसान को बेहतर तरीके से दिखाया और कैसे फाइब्रोब्लास्ट या तो 3 दिन तक उस क्षतिग्रस्त क्षेत्र में चले गए या जाहिरा तौर पर क्षेत्र की मरम्मत करने और एक निशान बनाने के लिए चले गए।

इस्कीमिक इंजरी के अलावा हाई ब्लड प्रेशर के लिए कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट की प्रतिक्रिया को अच्छी तरह से नहीं समझा जाता है। उच्च रक्तचाप के लिए इन कोशिकाओं की प्रतिक्रिया की खोज करने के लिए, एंजियोटेंसिन द्वितीय और फेनिलेफ्रीन प्रशासित किए गए थे। एंजियोटेंसिन II और फेनिलेफ्रीन (आंग/पीई) ऐसी दवाएं हैं जो इंटरस्टिशियल फाइब्रोसिस के क्षेत्रों के साथ लगातार उच्च रक्तचाप और कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट सक्रियण का कारण बनती हैं, जो इस ऊतक समाशोधन प्रोटोकॉल के आवेदन के माध्यम से आंग/पीई उपचारित दिलों(चित्रा 6A)5,28के लिए पुष्टि की जाती है । इस्कीमिक सर्जरी के विपरीत, कई हफ्तों से अधिक आंग/पीई के अर्क हृदय ऊतक और दीवार पतली के नुकसान में परिणाम नहीं है । इसके बजाय, इस चोट के बाद फाइब्रोब्लास्ट व्यवहार में एक अलग परिणाम देखा गया था।

दिल पंप के रूप में, मायोकार्डियम ट्विस्ट, एक दाएं हाथ हेलिक्स पैटर्न29,30,31केबाद । चोट के आंग/पीई मॉडल में, फाइब्रोब्लास्ट्स परिष्कृत ऊतक समाशोधन प्रोटोकॉल(चित्रा 6B)का उपयोग कर इस दाहिने हाथ हेलिक्स संकुचन पैटर्न की धुरी के साथ गठबंधन किया । इस व्यवहार को समझाने की परिकल्पना यह है कि कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट वेंट्रिकुलर वॉल स्ट्रेन की दिशा को भांप रहे थे और ईसीएम के भीतर सबसे बड़ा समर्थन प्रदान करने के लिए मायोफर के भीतर संरेखित कर रहे थे क्योंकि फाइब्रोटिक प्रतिक्रिया तीव्रता से एगोनिस्ट जलसेक(चित्रा 7)के दौरान सामने आई थी। एक और दिलचस्प निष्कर्ष यह था कि फाइब्रोब्लास्ट छोटे और गोल दिखाई दिए, जैसा कि I/R और MI चोट(चित्रा 6, पूरक वीडियो S11) के मॉडलों में देखे गए धुरी आकार के विपरीत था।

Figure 1
चित्रा 1: चूहों और सामग्री ऊतक समाशोधन दिलों के लिए इस्तेमाल किया ।
(A)टीसीएफ21-मरक्रेमर (एमसीएम) एक्स Rosa26eGFP चूहों के लिए प्रजनन रणनीति की योजनाबद्ध ऊतक समाशोधन के लिए इस्तेमाल किया । (ख)चूहों में किए गए टैमोक्सिफेन उपचार और सर्जरी की टाइमलाइन । 14 दिन में अघायल चूहों की बलि दी गई । (ग)3-डी अच्छी तरह से मुद्रित दिल के ऊतकों को वैक्यूम तेल के साथ एक ग्लास पेट्री डिश को सील करने के लिए । (घ)नीचे अच्छी तरह से नीचे के शीर्ष पर सेट 3-डी मुद्रित के शीर्ष पर सील एक गोल कवरस्लिप वैक्यूम तेल के अलावा । (ई)ऊतक ऊतक होल्डिंग उपकरण के नीचे कुएं में दिल को मंजूरी दे दी, अपवर्तक सूचकांक मिलान समाधान (रिम्स) से भरा । कवरलिप (जैसाकि डी में) और शीर्ष 3-डी मुद्रित अच्छी तरह से टुकड़ा नीचे 3-डी मुद्रित जलाशय घटक पर रखा, साफ दिल के ऊतकों युक्त । ग्लाइसरोल विसर्जन माइक्रोस्कोपी के लिए शीर्ष जलाशय में ग्लाइस्रोल जोड़ा जाता है। स्केल बार = 1 सेमी। जलाशय ब्लूप्रिंट पूरक चित्रा 1में पाया जा सकता है। संक्षिप्त नाम: eGFP = बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: हृदय ऊतक समाशोधन चरणों की दृश्य उपस्थिति।
(क)बाएं से दाएं: अस्वीकृत बाएं वेंट्रिकल, इलेक्ट्रोफोरेस्ड लेफ्ट वेंट्रिकल, इलेक्ट्रोफोरेस्ड लेफ्ट वेंट्रिकल का क्रॉसलिंकर के साथ इलाज किया गया, इलेक्ट्रोफोरेसेड लेफ्ट वेंट्रिकल का इलाज क्रॉसलिंकर के साथ और रिम्स में इनक्यूबेटेड । (ख)अस्पष्ट और पूरे माउस दिल को मंजूरी दे दी । (ग)बाएं: अघायल, अस्पष्ट बाएं वेंट्रिकल । दाएं: घायल, बाएं वेंट्रिकल को मंजूरी दे दी । (घ)बाएं: अस्वीकृत एमआई घायल बाएं वेंट्रिकल । दाएं: मंजूरी दे दी एमआई घायल बाएं वेंट्रिकल । स्केल बार = 0.5 सेमी। संक्षिप्त नाम: एमआई = मायोकार्डियल इंफेक्शन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: अघायल और नकली संचालित दिलों के लिए उपन्यास समाशोधन विधि की प्रभावकारिता।
मंजूरी दे दी(ए)अघायल (स्केल बार = 400 माइक्रोन) और(बी)नकली संचालित दिल (स्केल बार = 500 माइक्रोन) के साथ TCf21mcm x Rosa26eGFP फाइब्रोब्लास्ट (हरा) और बढ़ी हुई फ्लोरेसेंस (बैंगनी) के छद्म रंग वाले क्षेत्रों में फाइब्रोब्लास्ट स्थानीयकरण दिखा। फाइब्रोब्लास्ट वीडियो दिखाने वाले वीडियो पूरक वीडियो S1-2में पाए जा सकते हैं। अभी भी छवियां फाइब्रोब्लास्ट-एंडोजेनस फ्लोरेसेंस (हरे रंग) की पृष्ठभूमि समाशोधन और रखरखाव दिखाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: इस्केमिया/रिपरफ्यूजन-घायल दिलों में समय के साथ फाइब्रोब्लास्ट के नुकसान का क्षीणन ।
Tcf21MerCreMer (एमसीएम) एक्स Rosa26eGFP फाइब्रोब्लास्ट (हरा), वृद्धि हुई फ्लोरेसेंस (बैंगनी) फाइब्रोब्लास्ट स्थानीयकरण दिखाने के छद्म रंग क्षेत्रों के साथ संकेत I/R समय अंक से मंजूरी दे दी हृदय ऊतक, और नारंगी रूपरेखा फाइब्रोब्लास्ट से रहित क्षेत्रों । शीर्ष पंक्ति: अभी भी मैं से बाएं वेंट्रिकल की छवियों/आर-घायल दिलों को मंजूरी दे दी । नीचे पंक्ति: अभी भी I/R से बाएं वेंट्रिकल की छवियों Imaris स्पॉट समारोह के साथ मंजूरी दे दी दिल पूरे बाएं वेंट्रिकल में और अधिक आसानी से फाइब्रोब्लास्ट पैटर्न देखने के लिए इस्तेमाल किया । I/R-घायल दिलों के वीडियो न केवल फाइब्रोब्लास्ट के सकल पैटर्निंग दिखा, लेकिन यह भी व्यक्तिगत फाइब्रोब्लास्ट और उनके मॉर्फोलॉजी की स्पष्ट छवियों पूरक वीडियो S5-8 में पाया जा सकता है । स्केल बार = 500 माइक्रोन। संक्षिप्त नाम: I/R = इस्केमिया/reperfusion । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: समय के साथ दिल को साफ कर दिया मायोकार्डियल इंफेक्शन में चोट के बाद कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट के नुकसान का क्षीणन ।
Tcf21MerCreMer (एमसीएम) एक्स Rosa26eGFP फाइब्रोब्लास्ट (हरा), वृद्धि हुई फ्लोरेसेंस (बैंगनी) के छद्म रंग वाले क्षेत्रों के साथ एमआई दिलों से हृदय ऊतक को मंजूरी दे दी फाइब्रोब्लास्ट स्थानीयकरण दिखा रहा है, और नारंगी रूपरेखा फाइब्रोब्लास्ट से रहित क्षेत्रों । शीर्ष पंक्ति: अभी भी ऊतक की छवियों एमआई घायल दिल (हरे) से छोड़ दिया वेंट्रिकल को मंजूरी दे दी । नीचे पंक्ति: अभी भी ऊतक की छवियों को मंजूरी दे दी एमआई से बाएं वेंट्रिकल-घायल दिल (हरे) Imaris स्पॉट समारोह (बैंगनी) के साथ सकल फाइब्रोब्लास्ट वितरण दिखाने के लिए मढ़ा । एमआई-घायल दिलों से बाएं वेंट्रिकल्स को मंजूरी दिए गए ऊतकों के वीडियो दिल में सकल फाइब्रोब्लास्ट व्यवस्था के साथ-साथ वीवो मॉडल(पूरक वीडियो S7-8)में इस 3 डी में व्यक्तिगत फाइब्रोब्लास्ट की स्थिति और आकृति विज्ञान दिखाते हैं। स्केल बार: 1.5 दिन = 1000 माइक्रोन, 3 दिन = 700 माइक्रोन। संक्षिप्त नाम: एमआई = मायोकार्डियल इंफेक्शन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: एंजियोटेंसिन/फेनिलेफ्रीन-इलाज दिलों से ऊतक को मंजूरी दे दी ।
(क)योजनाबद्ध दिखा रहा है कि कैसे एंजियोटेंसिन/फेनिलेफ्रीन पंपों का उपयोग TCf21एमसीएम एक्स ईजीएफपी के टैमोक्सिफेन सक्रियण के बाद दो सप्ताह की अवधि में दवाओं का प्रशासन करने के लिए किया जाता है । (ख)अभी भी छवि, अभी भी छवि + Imaris स्पॉट, और वीडियो दिखा फाइब्रोब्लास्ट संगठन और Ang/पीई में आकृति विज्ञान-इलाज दिल(पूरक वीडियो S11)स्केल सलाखों = ५०० μm । संक्षिप्त: आंग/पीई = एंजियोटेंसिन II/फेनिलेफ्रीन; eGFP = बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: एंजियोटेंसिन/फेनिलेफ्रीन-इलाज दिलों में मनाया फाइब्रोब्लास्ट पैटर्न की प्रतिनिधि छवियां ।
(ए, सी,और डी):वेंट्रिकल के बाहर के नजरिए से फाइब्रोब्लास्ट के दाएं हाथ के हेलिक्स घुमा पैटर्न की छवियां। (ख) वेंट्रिकल के अंदर के नजरिए से फाइब्रोब्लास्ट पैटर्निंग की छवि । तीर फाइब्रोब्लास्ट के रैखिक समूहों को हाइलाइट करते हैं जो घुमा पैटर्न बनाते हैं। स्केल बार = 500 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 1: इमेजिंग जलाशय उपकरण के 2D प्रतिपादन। (A)इमेजिंग जलाशय के निचले आधे हिस्से का 2डी प्रतिपादन। इस जलाशय को वैक्यूम तेल के साथ पेट्री डिश में सील किया जाता है। दिल को केंद्र खोलने में रखा जाता है और रिम्स में डूब जाता है। (B)इमेजिंग जलाशय के शीर्ष आधे का 2डी प्रतिपादन। ग्लास कवरस्लिप वैक्यूम तेल के साथ इस टुकड़े के फ्लैट नीचे का पालन किया जाता है। यह धीरे से नीचे जलाशय के शीर्ष पर रखा गया है। शीर्ष जलाशय तो इमेजिंग के लिए ग्लिसरोल से भरा जा सकता है। मिमी में इकाइयां। संक्षिप्त रूप: 2D = दो आयामी; रिम्स: अपवर्तक सूचकांक मिलान समाधान। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो S1: घायल ऊतक दिल को मंजूरी दे दी । एक घायल बाएं वेंट्रिकल में कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट (हरा) छोटे थे, और कई दो सेलुलर अनुमानों से अधिक नहीं थे। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो S2: नकली ऊतक दिल को मंजूरी दे दी । एक नकली संचालित माउस दिल के बाएं वेंट्रिकल में कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट (हरा) छोटे थे और ज्यादातर कुछ अनुमानों के साथ गोल थे, जो अघायल दिलों में देखा गया था। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो S3: एक अघायल दिल की वेंट्रिकुलर दीवार के माध्यम से विस्तृत फाइब्रोब्लास्ट देखें। यह वीडियो इंटीरियर वेंट्रिकुलर दीवार पर शुरू होता है और दिल के बाहरी हिस्से की ओर ज़ूम करता है। कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट (हरे रंग) को विस्तार से दिखाया गया था और दो सेलुलर अनुमानों से अधिक के साथ गोल या थोड़ा विस्तारित सेल निकायों को देखा गया था। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो S4: अघायल दिल की बाईं वेंट्रिकुलर दीवार के खंड का विस्तृत दृश्य। यह ~ 300-μm-मंजूरी दे दी घायल माउस दिल के व्यापक अनुभाग हृदय फाइब्रोब्लास्ट (हरे) और विस्तार में उनके मॉर्फोलॉजी के 3-डी व्यवस्था से पता चलता है । कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो S5: 3 दिन मैं/R के बाएं वेंट्रिकल को मंजूरी दे दी बाएं वेंट्रिकल के विस्तृत दृश्य से पता चला है कि मैं/आर चोट के बाद, वहां हृदय फाइब्रोब्लास्ट नुकसान का एक क्षेत्र है । यह भी स्पष्ट था कि फाइब्रोब्लास्ट (ग्रीन) ने इस घायल हालत में अधिक गोलाकार और नकली दिलों में देखे गए मोरफोलोजी की तुलना में अधिक विस्तारित आकार विकसित किया। संक्षिप्त नाम: I/R = इस्केमिया/reperfusion । कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो S6: 7 दिन मैं/R के बाएं वेंट्रिकल को मंजूरी दे दी । बाएं वेंट्रिकल के विस्तृत दृश्य से पता चलता है कि 7 दिनों तक मैं/आर चोट के बाद, फाइब्रोब्लास्ट में कमी क्षेत्र से छोटा था कि 3 दिन से देखा मैं/ अधिक फाइब्रोब्लास्ट (हरे) मौजूद थे, और दिलचस्प बात यह है कि नए सेल मॉर्फोलोजी मौजूद थे। विशेष रूप से, कुछ फाइब्रोब्लास्ट ने कई फलाव के साथ सेल निकायों को गोल किया था, जो संभवतः इस वातावरण में फाइब्रोब्लास्ट की एक नई या विकसित भूमिका का संकेत देता है। संक्षिप्त नाम: I/R = इस्केमिया/reperfusion । कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो S7: 14 दिन मैं/R के छोड़ दिया वेंट्रिकल मंजूरी दे दी बाएं वेंट्रिकल के विस्तृत दृश्य से पता चला है कि वहां अभी भी एक क्षेत्र वेंट्रिकुलर दीवार है कि बहुत कुछ फाइब्रोब्लास्ट था, लेकिन फाइब्रोब्लास्ट (हरी) इस शूंय की परिधि पर 7 के बाद 7 के बाद में देखा अत्यधिक लम्बी आकृति विज्ञान बनाए रखा था । दिलचस्प बात यह है कि घायल क्षेत्र में मौजूद कुछ फाइब्रोब्लास्ट्स में घायल दिलों में इस तरह की आकृति विज्ञान था-छोटे और गोल । संक्षिप्त नाम: I/R = इस्केमिया/reperfusion । कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो S8: 28 दिन मैं/R के छोड़ दिया वेंट्रिकल मंजूरी दे दी मैं/आर चोट के बाद 28 दिन पर कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट (ग्रीन) के विस्तृत दृश्य से पता चला है कि घायल क्षेत्र में एक छोटा सा क्षेत्र था जिसमें फाइब्रोब्लास्ट का अभाव था । यह भी देखा गया कि इस क्षेत्र के आसपास उच्च फाइब्रोब्लास्ट घनत्व का क्षेत्र था, और इस घने क्षेत्र में मॉर्फोलोजी अत्यधिक लम्बी थीं। संक्षिप्त नाम: I/R = इस्केमिया/reperfusion । कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो S9: 1.5 दिन एमआई के बाएं वेंट्रिकल को मंजूरी दे दी। एमआई के बाद १.५ दिन में घायल लेफ्ट वेंट्रिकल में बहुत कम कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट (ग्रीन) शेष थे, वेंट्रिकल के इस पूरे क्षेत्र में कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट डेथ । संक्षिप्त नाम: एमआई = मायोकार्डियल इंफेक्शन। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो S10: 3 दिन एमआई के बाएं वेंट्रिकल को मंजूरी दे दी । एमआई के 3 दिन बाद कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट से रहित एक बड़ा क्षेत्र था, लेकिन कुछ कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट (ग्रीन) फिर से वेंट्रिकल में दिखाई दिए, एमआई के १.५ दिनों के बाद पाए गए परिणामों के विपरीत । इसके अलावा, कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट आकृति विज्ञान प्रोफाइल I/R घायल दिलों में देखा उन लोगों की तुलना में अलग थे । यहां फाइब्रोब्लास्ट को बढ़ाया गया था लेकिन कुछ ऐसे लोग थे जिन्होंने सेल निकायों को गोल किया था (अघायल दिलों में देखे गए लोगों की तुलना में बड़ा) और इनमें से एक उपजनसंख्या में कई सेल अनुमान थे। संक्षिप्त रूप: एमआई = मायोकार्डियल इंफेक्शन; I/R = इस्केमिया/रिफ्यूजन । कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो S11: आंग के बाएं वेंट्रिकल को मंजूरी दे दी/ आंग/पीई उपचार के बाद कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट (ग्रीन) का कोई स्पष्ट नुकसान नहीं हुआ । हालांकि, कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट ज्यादातर छोटे और गोल या छोटे और लम्बी थे और दिल के संकुचन पैटर्न के साथ संरेखित करने के लिए लग रहा था। संक्षिप्त नाम: आंग/पीई = एंजियोटेंसिन II/फेनिलेफ्रीन । कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यह लेख ऊतक समाशोधन के लिए एक परिष्कृत विधि प्रस्तुत करता है जो वीवो में कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट के दृश्य के लिए अनुमति देता है, दोनों बेसलाइन और निम्नलिखित चोट पर, माउस दिल में फाइब्रोब्लास्ट की विशेषता और बेहतर समझने के लिए। यह बढ़ाया प्रोटोकॉल मौजूदा ऊतक समाशोधन प्रोटोकॉल में सीमाओं को संबोधित करता है जिन्होंने वयस्क या नवजात हृदय में विशिष्ट कोशिका प्रकारों की पहचान करने का प्रयास किया है12,13,14,16,17,20. माउस दिल को साफ करने के प्रारंभिक प्रयासों में, निष्क्रिय स्पष्टता तकनीक का उपयोग किया गया था, जिसमें दिल को लगभग 1 सप्ताह के लिए एक न्यूटोटर पर एक समाशोधन बफर में छोड़ दिया गया था ताकि पूरे ऊतक15,18में बफर के निष्क्रिय वितरण की अनुमति दी जा सके। इस प्रक्रिया ने केवल ऊतक (डेटा नहीं दिखाए गए) में लगभग 80 माइक्रोन गहराई का समाशोधन किया, जो पिछले टिप्पणियों के अनुरूप है जिससे 1 दिन पुराने नवजात माउस दिल13को साफ करने के लिए कई हफ्तों की आवश्यकता थी। एक सक्रिय इलेक्ट्रोफोरेसिस प्रणाली का उपयोग करके सक्रिय स्पष्टता पूरे वेंट्रिकुलर दीवार के माध्यम से गहरी समाशोधन के लिए अनुमति दी जाती है, लगभग 700 माइक्रोन-1 मिमी गहरी, एक कम समय सीमा12,18पर।

हालांकि, इस पहले प्रकाशित सक्रिय स्पष्टता प्रोटोकॉल का उपयोग करने से ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस के उच्च स्तर के साथ फाइब्रोब्लास्ट फ्लोरेसेंस का नुकसान हुआ, जिसे पहले कोलेसोवा एट अल12द्वारा सक्रिय स्पष्टता में होने के लिए नोट किया गया था। फाइब्रोब्लास्ट फ्लोरेसेंस के रखरखाव के लिए अनुमति देने के लिए, उपयुक्त निर्धारण प्रोटोकॉल अत्यंत महत्वपूर्ण पाया गया था। एक निर्धारण प्रक्रिया से बहुत कम इलेक्ट्रोफोरेसिस के दौरान फ्लोरेसेंस की हानि हुई। एक निर्धारण प्रक्रिया के बहुत लंबे समय के कारण फ्लोरेसेंस का नुकसान हुआ। इसलिए 4% पीएफए में 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात फिक्सेशन इष्टतम पाया गया। पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस मुद्दे को सुधारने के लिए, एक डिक्लोराइजेशन सोख (समाशोधन की घन विधि से उधार लिया गया एक सिद्धांत) को मायोग्लोबिन के भीतर हेमी बाध्यकारी को कम करने के लिए नियोजित किया गया था, और इसलिए इस क्रोमोफोर18के कारण ऑटोफ्लोरेसेंस को कम किया गया था। डिकोलोराइजेशन उपचार के परिणामस्वरूप रिपोर्टर फ्लोरेसेंस के रखरखाव के साथ पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस का अधिक मजबूत समाशोधन हुआ ताकि लेबल किए गए फाइब्रोब्लास्ट अधिक स्पष्ट हो(चित्रा 2 ए)।

अंत में, पूर्ण ऑप्टिक पारदर्शिता के लिए अनुमति देने के लिए, ऊतक को अपवर्तक सूचकांक मिलान समाधान (रिम्स)(चित्रा 2बी-डी)में समतुल्य किया गया था। अपने परिवेश के साथ ऊतक के अपवर्तक सूचकांक का मिलान करके, इससे ऊतक की ऑप्टिक पारदर्शिता बढ़ी, जिससे गहरी इमेजिंग की अनुमति मिलती है। उच्च गति सुनाई देने वाली स्कैनिंग का उपयोग तब ऊतकों को छवि के लिए किया जाता था क्योंकि यह गैलेवनोमेट्रिक स्कैनिंग की तुलना में तेज होता है। क्योंकि माउस दिल थोड़ा अलग आकार हैं, व्यक्तिगत XY इमेजिंग मापदंडों और जेड तीव्रता सुधार सेट किए गए थे । इन मापदंडों के साथ, लगभग 4 घंटे(चित्रा 3)में फ्लोरोसेंट फाइब्रोब्लास्ट की कल्पना करने के लिए अघायल दिल के माध्यम से छवि करना संभव था। पृष्ठभूमि को कम करने और छवि में मौजूद फ्लोरेसेंस को स्पष्ट करने के लिए अनमिक्सिंग और डेनोइसिंग विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पोस्ट-इमेजिंग प्रसंस्करण में छवि की गुणवत्ता में सुधार किया गया था। इसके अतिरिक्त, फ्लोरोसेंट फाइब्रोब्लास्ट के स्थानीयकरण को उजागर करने के लिए माध्यमिक विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग किया गया था। इस पोस्ट-इमेजिंग विश्लेषण का उपयोग पृष्ठभूमि स्वर-बाय-वोक्सल(चित्रा 3, चित्रा 4, चित्रा 5, चित्रा 6)को नष्ट करके कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट को स्पष्ट रूप से एनोटेट करने के लिए किया गया था।

यह अनुकूलित स्पष्टता प्रोटोकॉल घायल और अघायल दोनों दिलों को ऑप्टिकल रूप से स्पष्ट करने के लिए लागू किया गया है। यह चोट के लिए कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट की प्रतिक्रिया की बेहतर समझ के लिए अनुमति देता है। इन चोटों में एमआई और आई/आर का टाइम कोर्स, साथ ही आंग/पीई डोजिंग भी शामिल था । चूंकि इस्कीमिक चोट हृदय ऊतक को कमजोर करती है, यह महत्वपूर्ण है कि ऊतक अखंडता बनाए रखने के लिए इलेक्ट्रोफोरेसिस के दौरान अधिक देखभाल की जाती है। वास्तव में दोनों मैं/आर और एमआई चोट के लिए, इलेक्ट्रोफोरेसिस (≤१.५ एच) की एक छोटी अवधि३२की आवश्यकता है । पिछले अध्ययनों ने ऊतक समाशोधन प्रक्रिया पर चोट के प्रभाव पर विचार नहीं किया है । यहां प्रस्तुत नए अनुकूलित प्रोटोकॉल चोट के लिए समायोजित करता है, ऊतक के आगे विनाश के बिना समाशोधन के लिए अनुमति देता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास इस पांडुलिपि की सामग्री से संबंधित कोई खुलासा नहीं है।

Acknowledgments

लेखक इस मॉडल के विकास में उनकी सहायता और मार्गदर्शन के लिए CCHMC कॉन्फोकल इमेजिंग कोर को स्वीकार करना चाहते हैं, साथ ही सभी 3 डी मुद्रित भागों के डिजाइन के लिए नैदानिक इंजीनियरिंग से मैट बाटी। डेमेट्रिया फिचेसर को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों से प्रशिक्षण अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, (NHLBI, T32 HL125204) और जेफरी डी मोल्केन्टिन को हावर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-0 braided silk Ethicon K871H
8-0 prolene Ethicon 8730H
40% Acrylamide Solution Bio-Rad 1610140
Angiotensin II Sigma A9525-50G
Artificial Tear Ointment Covetrus 048272
DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane) Millipore Sigma D27802-25G
GLUture topical tissue adhesive World Precision Instruments 503763
Heparin Sigma H0777
Imaris Start Analysis Software Oxford Instruments N/A
Micro-osmotic pumps Alzet Model 1002
Nikon Elements Analysis Software Nikon N/A
Nikon A1R HD upright microscope Nikon N/A
Normal autoclaved chow Labdiet 5010
Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N,
N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide		 CosmoBio AXS-1002424
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Phenylephrine Hydrochloride Sigma P6126-10G
Photoinitiator Wako Chemicals VA-044
Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] Jackson Laboratories Jax Stock No:012429
Sodium Azide Sigma Aldrich S2002-5G
Sodium Chloride solution Hospira, Inc. NDC 0409-4888-10
Tamoxifen Sigma Aldrich T5648
Tamoxifen food Envigo TD.130860
Tween-20 Thermo Fisher Scientific BP337-500
Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent Millipore Sigma 122262-1L
X-Clarity electrophoretic clearing chamber Logos Biosystems C30001
X-Clarity electrophoretic clearing solution Logos Biosystems C13001
X-Clarity electrophoresis tissue basket Logos Biosystems C12001
X-Clarity electrophoresis tissue basket holder Logos Biosystems C12002

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References

  1. Nagaraju, C. K., et al. Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure. Journal of the American College of Cardiology. 73 (18), 2267-2282 (2019).
  2. Yoon, S., Eom, G. H. Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions. Experimental and Molecular Medicine. 51 (12), 1-9 (2019).
  3. Borlaug, B. A., Redfield, M. M. Diastolic and systolic heart failure are distinct phenotypes within the heart failure spectrum. Circulation. 123, 2006-2014 (2011).
  4. Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the cardiac fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
  5. Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigation. 128 (5), 2127-2143 (2018).
  6. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
  7. Sadeghi, A. H., et al. Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling. Advanced Healthcare Materials. 6 (11), 1601434 (2017).
  8. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
  9. Bruns, D. R., et al. The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation. PLoS One. 14 (8), 0220573 (2019).
  10. Skiöldebrand, E., et al. Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion. Heliyon. 3 (10), 00406 (2017).
  11. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method. Cell Research. 28, 803-818 (2018).
  12. Kolesová, H., Čapek, M., Radochová, B., Janáček, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
  13. Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. Capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging. Journal of Visualized Experiments. (157), (2020).
  14. Wang, Z., et al. Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution. Biomedical Optics Express. 9 (2), 423-436 (2018).
  15. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  16. Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12 (7), 0182072 (2017).
  17. Perbellini, F., et al. Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue. Scientific Reports. 7, 5188 (2017).
  18. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
  19. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  20. Nehrhoff, I., et al. 3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3716-3720 (2016).
  21. Yamamoto, M., et al. A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis. Genesis. 47 (2), 107-114 (2009).
  22. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
  23. Means, C. K., et al. Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 292 (6), 2944-2951 (2007).
  24. Michael, L. H., et al. Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 269 (6), 2147-2154 (1995).
  25. Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).
  26. Patten, R. D., et al. Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 274 (5), 1812-1820 (1998).
  27. Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 45 (2), 330-338 (2000).
  28. Vagnozzi, R. J., et al. An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy. Nature. 577, 405-409 (2020).
  29. Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 366-376 (2008).
  30. Arts, T., et al. Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle. Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).
  31. Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. P. The muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars. American Journal of Pathology. 145 (4), 868-875 (1994).
  32. Hashmi, S., Al-Salam, S. Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: A comparison. International Journal of Clinical Experimental Pathology. 8, 8786-8796 (2015).

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Fischesser, D. M., Meyer, E. C., Sargent, M., Molkentin, J. D. Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts. J. Vis. Exp. (171), e62023, doi:10.3791/62023 (2021).

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