Summary
开发并应用于成年小鼠心脏的组织清除方法。这种方法旨在清除密集的，自动荧光的心脏组织，同时保持标记成纤维细胞荧光归因于遗传报告器策略。
Abstract
心血管疾病是全世界最常见的死亡原因，通常以心脏纤维化加剧为标志，这种纤维化会导致心室僵硬性随着心脏功能的改变而增加。心脏心室纤维化的增加是由于活化了常驻成纤维细胞，尽管这些细胞在三维（3-D）心脏内、基线或激活后如何运作，尚不清楚。为了检查成纤维细胞如何导致心脏病及其在三维心脏中的动力学，开发了一种精致的基于CLARITY的组织清除和成像方法，显示整个小鼠心脏内荧光标记的心脏成纤维细胞。组织常驻成纤维细胞是使用Roas26-loxP-eGFP荧光记者小鼠与表达Tcf21-MerCreMer敲门线的心脏成纤维细胞交叉的基因标记。该技术用于观察健康小鼠和心脏病纤维小鼠模型中整个成人左心室的成纤维细胞定位动力学。有趣的是，在一个损伤模型中，在受伤的小鼠心脏中观察到心脏成纤维细胞的独特模式，这些模式跟随包裹的纤维带向收缩方向。在缺血伤害模型中，成纤维细胞死亡发生，随后从梗塞边界区重新填充。总的来说，这种精炼的心脏组织澄清技术和数字成像系统允许心脏成纤维细胞的三维可视化，而不受抗体穿透失败或以前因组织处理而失去荧光的问题的限制。
Introduction
虽然心肌细胞是心脏中体积最大的部分，但心脏成纤维细胞更丰富，并且严重参与调节该器官的基线结构和修复特征。心脏成纤维细胞具有高度的移动性、机械反应能力和表型范围，具体取决于其激活的程度。心脏成纤维细胞是维持细胞外基质（ECM）正常水平所必需的，这些细胞产生太少或过多的ECM可能导致疾病1、2、3。鉴于心脏成纤维细胞在疾病中的重要性，在确定新的治疗策略方面，特别是试图限制过度纤维化4、5、6、7方面，已成为研究的日益重要的课题。受伤后，成纤维细胞激活并分化成一种更合成的细胞类型，称为肌纤维细胞，它可以是增殖和分泌丰富的 ECM，以及具有收缩活性，有助于改造心室。
虽然心脏成纤维细胞在二维文化6、8、9、10中对其特性进行了广泛的评估，但更不了解其在三维活心脏中的特性和动态，无论是基线还是疾病刺激。在这里，描述了一种精致的方法，组织清除成年小鼠的心脏，同时保持与Roas26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer遗传报告系统标记的成纤维细胞的荧光。在心脏内，Tcf21是静默成纤维细胞4的相对特定的标记。在给予塔莫西芬以激活不可受诱惑的MerCreMer蛋白后，基本上所有静默成纤维细胞都会永久表达来自Roas26轨迹的增强绿色荧光蛋白（eGFP），从而允许它们在体内跟踪。
有许多完善的组织清除协议存在，其中一些已经应用于心脏11，12，13，14，15，16，17。然而，许多用于不同组织清除协议的试剂被发现淬灭内源性荧光信号18。此外，成人心脏是很难清除，由于丰富的血红蛋白组含有蛋白质，产生自流19。因此，本协议的目标是保持成纤维细胞标记荧光与同时抑制血红细胞自身荧光在受伤的成人心脏，以最佳的三维可视化体内12，13，14，16，17，20。
先前的研究试图检查心脏成纤维细胞在体内使用香水抗体来标记这些细胞，虽然这样的研究受到抗体渗透和心脏血管结构14，16，17，20的限制。虽然萨拉蒙等人已经显示出组织清除与维持新生儿心脏局部神经元荧光，和Nehrhoff等人已显示维持荧光标记骨髓细胞，维持内源性荧光通过整个心室壁尚未证明，包括成人心脏成纤维细胞在基线或受伤后13，20的可视化。此组织清除协议根据 CLARITY 方法（透明脂质交换丙烯酰胺-杂交硬成像/免疫染色/原位混合兼容组织水凝胶）和 PEGASOS（聚乙二醇 （PEG） 相关溶剂系统）优化了先前协议的混合物。这一精炼的协议允许对处于基线的老鼠心脏中的心脏成纤维细胞以及它们对不同类型的损伤的反应进行更有力的检查。该协议是直接和可重复的，将有助于描述心脏成纤维细胞在体内的行为。
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Protocol
所有涉及小鼠的实验都得到了辛辛那提儿童医院医疗中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。该机构还通过了AALAC（美国实验室动物护理认证协会）认证。老鼠通过颈椎脱位被安乐死，接受生存外科手术的小鼠得到疼痛缓解（见下文）。用于疼痛管理和安乐死的所有方法都基于美国兽医医学协会安乐死小组的建议。所有的老鼠都被安置在玉米棒床上用品单元里，随时有水和食物。老鼠被安置在一个同性笼子里。对于手术或未受伤的组织清除，使用同等数量的6-8周大的雄性小鼠和雌性小鼠。
注：所有手术均维持无菌手术条件。外科医生换上干净的磨砂和无菌的礼服，然后穿上鞋套和发网。然后，外科医生用氯西丁擦洗他们的手，戴上无菌手术手套。外科医生得到一名技术人员的协助，他分别镇静、剃光和擦洗切口部位3次，交替使用2%的氯西丁葡萄糖酸盐和70%的异丙醇。老鼠随后被带到外科医生那里，并进行了手术。在动物之间，仪器在珠子消毒器中消毒。
1. 克雷重组
- 交叉罗莎26-洛克斯普-eGFP小鼠（罗莎26-纳茨[FVB.Cg-Gt （罗萨） 26Sortm1 （CAG-lacZ， -EGFP）Glh/J]） 与 Tcf21-梅尔克雷默小鼠 （图 1A）6，21。
- 当这个十字架的后代达到6周大时，在玉米油中溶解的75毫克/千克的塔莫西芬进行腹膜注射。22 管理此塔莫西芬两次， 相距 48 小时 （图 1B）.
- 塔莫西芬注射后，让小鼠食用塔莫西芬食物（+0.4克/千克塔莫西芬柠檬酸盐）一周。经过一个星期的塔莫西芬周，返回小鼠到正常的自切周饮食一个星期，然后再进行手术（图1B）。指定适当数量的小鼠（每个手术条件为3只）不受伤害的控制。牺牲这些老鼠，并按照一周的正常周食后，继续下面划划的清除过程。
- 在塔莫西芬方案和重组后，进行手术。
2. 外科模型
- 缺血/输液 （I/R）23，24
- 麻醉小鼠1.5%在通风盒中房间空气中的异氟烷气体：用电动剪子剃光胸部和颈部，然后用2%的氯西丁葡萄糖酸盐浸泡拭子擦洗剃光的区域。
- 使用人工泪膏，通过在镇静小鼠的眼睛上放置软膏来防止手术过程中的干燥。
- 使用手术剪刀进行中颈切口，使气管可视化。通过将管插入气管并通过中颈切口可视化气管导管，用 20 G 导管进行管状管。将小鼠放在呼吸机上，同时用异氟素气体镇静 （1.5%）在房间的空气。
- 用手术剪刀在左前肢下切开，并切开肋骨3和4之间的间肌肉。使用缩还器将肋骨展开。
- 将一小块海绵浸泡在肺和心脏之间的盐水中，以防止对肺部的损害。
- 使用鱼钩针（6.5毫米，3/8 c），用8-0将左冠状动脉与可释放滑结绑住普罗琳。
- 使用钳子取出海绵。
- 缝合使用 4 -0 编织丝绸和连续缝合关闭的间质肌肉， 同时也外部化 8 - 0 的结束普罗琳滑结。
- 使用局部组织粘合剂关闭皮肤切口，并突出显出遮光滑结的末端。
- 经过一个小时的闭塞，拉滑结的外端内部释放冠状动脉闭塞，缓解缺血，引起输液。
- 通过皮下注射（72 h释放）作为止痛药，将1毫克/mL延长释放丁丙诺啡的0.02 mL管理，并将小鼠置于37°C的含氧孵化室中，与其他动物分开。监测小鼠至少每15分钟，直到它们从麻醉中恢复过来，并能够保持一个骨架或坐姿。将老鼠送回它们的正常住所。
- 评估动物在手术后48小时疼痛和痛苦，并每天监测切口部位，直到完全愈合。
- 观察小鼠的水化、营养和手术后的整体福祉，直到做出牺牲。
- 心肌梗塞 （MI）25，26，27
- 执行步骤 2.1.1– 2.1.7。
- 使用连续的缝合线使用 4-0 编织丝绸关闭间骨肌肉。
- 使用局部组织粘合剂关闭皮肤切口。
- 执行步骤 2.1.11–2.1.13。
- 血管紧张素II/苯肾上腺素微渗透泵输液
- 准备准备血管紧张素 II 和 500μg/μL 无菌条件下苯甲肾上腺素工作溶液的 10μg/μL 工作解决方案（即， 在层压流罩中）将1毫克血管紧张素II添加到100微L无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）和250毫克盐酸苯甲苯甲酸酯中，加入500微L的PBS。
- 根据鼠标重量计算每个工作解决方案的稀释和最终体积，以分配给微渗透泵。
注：例如，20 克鼠标需要 20 g x 14 天 x 1.5 微克/天 = 420μg 血管紧张素或 42 μL 的工作解决方案，以及 20 g x 14 天 x 50 μg/天 = 14000 μg 苯甲苯甲酸氢氯化物或 28 μL 工作解决方案。 - 对于每只小鼠的重量，用无菌 PBS 稀释药物的工作库存，并使用 27 G 针头和 1 mL 注射器填充微渗透泵（0.25 μL/h，14 天，约 100 μL）。
注：这将产生1.5微克∙g-1∙天-1 血管紧张素II和50微克∙g-1∙天盐酸苯甲酸酯的 流动速率，一旦放置在小鼠。 - 在含有室内空气的通风室中，用1.5%的异氟烷吸入（效果）给小鼠麻醉。
- 将麻醉小鼠放在无菌手术台上，保持麻醉（1.5%）通过鼻锥。
- 在动物的眼睛上使用人工泪膏，以防止手术过程中干燥。
- 用电动剪发器在植入区剃毛，并用乙醇和无菌拭子对要切割的毛皮进行消毒。在背部右侧、肩部刀片下方的老鼠皮表皮层用手术剪刀切口（约1厘米）。使用一把手术剪刀的沉闷侧面，轻轻地伸展植入区域内和周围的皮肤，插入迷你泵。
- 将微渗透泵放在切口内，通过手动按摩皮肤下的泵，将其实际操纵到小鼠的后部中线左侧。
- 使用锥形针头使用 4-0 丝连续缝合关闭切口。
- 泵植入后，通过镇痛皮下注射（72-h缓慢释放）以0.1毫克/千克的体重缓慢释放丁丙诺啡。将小鼠置于37°C的含氧孵化室中，与其他动物分开。监测小鼠至少每15分钟，直到他们从麻醉中恢复过来，并可以保持一个骨架或坐姿。
- 在37°C的加热室麻醉恢复后，将小鼠放回其标准住房单元。
- 监测小鼠手术后48小时疼痛和痛苦，每天监测切口部位，直到完全愈合。
- 观察小鼠的水化、营养和手术后的整体福祉，直到做出牺牲。
3. 使用修改后的主动清晰协议清除成人鼠标心脏
- 通过用70%乙醇消毒手术表面和所有手术工具，准备一个干净的手术区域。在PBS中准备一个冷1倍PBS和4%的副甲醛（PFA）溶液（每个100毫克）。戴手套、实验室外套、面罩和眼睛保护。
- 通过在 0.9% 的氯化钠溶液中稀释 10 单位肝素来准备肝素缓冲。使用 1 mL 注射器和 27 G 针，在腹膜内为每只小鼠注射 60 μL 的肝素-NaCl。
- 注射肝素-NaCl溶液五分钟后，在含有室内空气的通风室中，使用1.5%异氟兰吸入（效果）对小鼠进行麻醉。
- 通过颈椎脱位对小鼠进行安乐死，其中后脑勺与扁平的、封闭的钳子末端保持，而脊柱则通过拉尾巴脱位。
- 用棉签上70%的乙醇清洁小鼠的腹腔表面。使用手术剪刀在 xiphoid 工艺下方约 3 厘米处进行 3 厘米的横切口。
- 通过将腹部脱脂至 xiphoid 过程（保持最接近尾部的皮肤，并将最靠近头部的皮肤向上拉向肋骨），将皮肤与底层腹部壁组织分离。使用手术剪刀在皮下腹壁组织下方 3 厘米处进行 2 厘米横切口。从这个横切口，中线和通过肋骨垂直切割。把肋骨钉回来，露出心脏。
- 使用 27 G 针头和 10 mL 注射器将冷 PBS 注射到高级静脉卡瓦和主动脉（心脏的任何位置操作都应小心使用钝钳避免穿刺），以清除心脏中的血液。
注意：足够的灌注可以通过尾部抽搐和肺部变色来注意到。 - 使用 27 G 针头和 10 mL 注射器将冷 4% PFA 注射到高级静脉卡瓦和主动脉中，以开始固定过程。
- 消灭心灵。使用直刀手术刀分离心室、右心室和隔膜以及左心室。将此组织放入充满冷 4% PFA 的 15 mL 离心管中，并在 4 °C 的夜间放在螺母上。
- 用冷1倍PBS清洗心脏3次，每次洗1小时，以去除多余的PFA。
- 通过在 15 mL 离心管中混合以下化学物质来准备水凝胶（称为 A4P0，用于相对丙烯酰胺/聚丙烯酰胺成分）：40% 丙烯酰胺的 10%、10% 1x PBS、80% 蒸馏水。
- 在将心脏浸入水凝胶中之前，将光基启动器（2，2-Azobis[2-（2-伊米佐林-2yl）丙烷）二氢氯化物）的0.25%溶液添加到盐凝胶溶液中。
- 将心脏放在含有水凝胶的圆锥管中。将圆锥管包裹在铝箔中，在 4 °C 的夜间孵化，不会受到物理干扰。
- 在 4 °C 时约 14 小时后，将包含心脏的圆锥管移到 37 °C 的珠子浴池。
- 在珠子浴中2.5小时后，用钳子小心地将心脏从水凝胶中取出。
- 在15 mL圆锥管中，在37°C的螺母上，将心脏洗3次，每次洗1小时。
- 使用钳子将心脏放在主动电泳机的篮子中，并将盖子放在篮子上。确保盖子牢固到位。
- 将溶液倒入腔室，用电泳清除液填充活动电磷化室储液。
- 一旦腔室充满电泳清除溶液，包含心脏的篮子就会被淹没。将盖牢固地放在电泳机上。
- 以 1.5 A、37 °C 运行电泳机，持续 1.5 小时。
- 在1.5小时的电泳后，通过视觉检查心脏，以确保没有不透明的组织残留。如果组织区域仍然不透明，在电泳室中重新将心脏浸入电泳溶液中，并一次继续电泳 0.5 h。
注意：电泳应在组织损伤（如组织磨损）的最初迹象时停止。 - 在含有 1x PBS 的 15 mL 圆锥管中清洗心脏，每次 1 小时 3 次，在螺母上 37 °C。
- 将心脏浸入含有N、N、N、N+，N+-四氯苯丙胺（2-羟基丙胺）的15mL圆锥管中，这是一种可减少血红素自动荧光的脱色剂。
注意：此解决方案应每 24 小时更改一次，直到心完全清醒（约 2 天）。 - 用1倍PBS在15mL圆锥管中清洗心脏3次，每次1小时，以去除多余的脱色剂。
- 通过组合 30 mL 的 0.02 M 磷酸盐缓冲器、40 克 5-（N -2、3-二羟基丙酰胺）-2、4、6-三-iodo-N、N'-bis （2， 3 二羟基丙基）是眼酰胺与搅拌（必须完全溶解 - 这可能需要长达一个小时）， 5 毫克的阿齐德钠， 50μL 的 Tween20， 和 1 克 1，4-二甲基二甲基苯丙烷 [2.2.2] 辛烷值， 并将 pH 值调整到 7.5.
- 在成像前将 RIMS 中的心脏平衡 48 小时。
4. 使用直立的单光子共聚焦显微镜对心脏进行成像
注：成像设备由10厘米玻璃培养皿的下半部分、3D打印底部储液层、圆形玻璃盖片和3D打印顶部储液池（图1C_E）组成。3D打印材料由辛辛那提儿童医院临床工程部内部制作。
- 使用真空润滑脂将一层薄薄的真空润滑脂放在 3D 打印件（图 1C）的底部，将 3D 打印底部的储层密封成玻璃培养皿。
注意：储层的高度应与正在成像的样品相同（即样品不应被放在上面的玻璃盖滑压，样品也不应在储层内漂浮和移动）。 - 将储液池填充RIMS，并用管道尖端取出所有气泡。将心脏小心地放在 RIMS 中，左心室壁朝上，确保解决方案中不会引入气泡。
- 使用真空润滑脂（再次将薄薄的真空润滑脂涂在 3D 打印件上，并将其放置在盖滑上）（图 1D），将玻璃盖滑贴在 3D 打印的顶储层片（补充图1A）的底部表面。
- 将玻璃盖片和顶部储层，盖片侧向下，放在底部储层（补充图1B），不引入气泡。RIMS 和盖滑之间的粘附将在顶部和底部储层之间提供密封（图 1E）。
- 将顶部储液池中加满甘油，以达到10倍甘油浸入目标。
- 使用配备多光子圆锥形扫描头的单个光子显微镜来映像已清除的心。
- 降低单光子显微镜的阶段，并将包含样品的培养皿放在舞台中央。提高阶段，降低样品装置顶部储液池中的甘油中的10倍甘油浸入目标。使用目镜查看样品边缘，确保样品聚焦。
- 点击 实时 按钮，从目镜视图切换到计算机上的相机视图。
- 设置 X 和 Y 参数 ，首先定位组织样本的最宽部分，该部分应位于培养皿的底部。
- 单击 ND 获取 和 自定义多点。通过使用操纵杆从左到右和从上到下进行扫描，首先找到组织样本的中间，创建多个点。
- 然后，根据组织的大小，确定所需的瓷砖大小（通常为6×5的6×8周大的老鼠心脏）。通过运行测试成像，只需捕获 X 和 Y 参数（在 ND 获取选项卡下取消选中z），以检查是否捕获了组织的整个长度和宽度。
- 要设置z参数，请打开XYZ 导航，然后单击上下图标，直到找到示例的顶部和底部。
- 打开Z 强度校正面板，通过增加或减少每个 z 点的激光功率来调整组织顶部、中间和底部的荧光，以校正组织密度。通过单击Z 强度校正面板右侧的设置箭头来设置这些。
- 将ND 收购面板中的Z 步幅设置为 5 μm。
- 在对心脏的 X、Y 和 Z 参数进行描述并设置 z 强度校正后，使用带有 10 倍甘油浸入目标的自动直立显微镜，并配有共振扫描仪和磷化砷化钠光倍增管 （GaAsP PMT） 来映像已清除的心脏。确保在ND 收购下检查XY和Z 选项卡，并按Run Z 校正。
- 通过打开处理软件中的多点图像并单击拼接按钮，缝合、取消混合和除名生成的图像。在图像下，单击盲解密，2个通道，然后找到。在图像下，单击denoise.ai，然后单击所选荧光通道（即GFP）。
注意：此过程导致整个左心室中 GFP 阳性成纤维细胞的 3D 图像。 - 使用二次分析软件进一步识别心脏成纤维细胞分散的模式和趋势。通过运行 点 向导程序来使用 点 功能。
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Representative Results
心脏成纤维细胞对于心脏的基线功能以及心脏损伤的反应至关重要。以前试图了解这些细胞的排列和形态，主要是在二维设置中进行的。然而，一个精致的心脏组织清除（图2）和三维成像技术已经发布，这使得心脏成纤维细胞的先进，更详细的可视化。通过这种成像技术，发现成纤维细胞密集，在未受伤的心脏中有一个旋转形态（图3，补充视频S1–4）。
在未受伤的心脏完成左心室组织清除后，该协议应用于几个损伤模型，以检查此清除方案在研究受伤心脏组织时会如何执行。小鼠因暂时关闭左冠状动脉（LCA）1小时而遭受I/R损伤，随后进行持续3天、7天、14天或28天的输液。这些实验表明，在I/R损伤后，缺血区心脏成纤维细胞就丧失了，但到第7天和第14天，成纤维细胞迁移或增殖，以重新填充受伤心脏的这一区域。到第28天，心脏受伤区域周围的心脏成纤维细胞数量密度最大（图4，补充视频S5-8）。
MI 损伤是永久 LCA 连合（无输液）引起的手术模型。接受MI手术的心脏在手术后1.5天和3天切除，用于固定、清除和分析。手术后1.5天，受伤的左心室中只剩下很少的成纤维细胞（图5A，补充视频S9）。然而，到第3天，成纤维细胞扩大，并存在于大多数左心室，除了一个小区域，大概已经迁移和/或从边境地区的人口增殖（图5B，补充视频S10）。同样，分析软件被用来更好地可视化成纤维细胞本地化，心脏成纤维细胞损失的区域用橙色（图5）概述。这一分析更好地显示了MI之后第1.5天细胞的初始损失，以及成纤维细胞如何在第3天扩散或迁移到受损区域，表面上修复了该区域并形成疤痕。
除了缺血性损伤外，心脏成纤维细胞对高血压的反应也没有得到很好的理解。为了发现这些细胞对高血压的反应，对血管紧张素II和苯甲肾上腺素进行了施用。血管紧张素II和苯肾上腺素（Ang/PE）是导致持续高血压和心脏成纤维细胞激活与间歇性纤维化区域的药物，通过应用这种组织清除协议确认安/PE治疗的心脏（图6A）5，28。与缺血手术相比，在几周内输注Ang/PE不会导致心脏组织损失和壁变薄。相反，在受伤后成纤维细胞行为中观察到不同的结果。
当心脏泵，心肌扭曲，按照右手螺旋模式29，30，31。在 Ang/PE 损伤模型中，成纤维细胞使用精制组织清除协议 （图 6B）沿着这种右手螺旋收缩模式的轴线对齐。解释这种行为的假设是，心脏成纤维细胞感觉到心室壁应变的方向，并在肌瘤内对齐，以提供ECM内最大的支持，因为纤维反应在激动剂输液期间急剧展开（图7）。另一个有趣的发现是，成纤维细胞显得小而圆润，而不是在I/R和MI损伤模型中看到的主轴形状（图6，补充视频S11）。
图1：用于组织清除心脏的小鼠和材料。
（A） 用于组织清除的Tcf21-梅尔克雷默（mcm）x 罗莎26eGFP小鼠的育种策略示意图。（B） 在小鼠身上进行塔莫西芬治疗和手术的时间表。没有受伤的老鼠在第14天牺牲了。（C） 3D 打印井，将心脏组织密封在带有真空润滑脂的玻璃培养皿上。（D） 在底部油井顶部密封的圆形盖唇真空润滑脂顶部添加。（E） 组织清除心脏在组织持有装置的底部井，充满了折射指数匹配溶液（RIMS）。盖片（如 D）和顶部3D打印井片铺设在底部的三维打印储液层组件，包含清除的心脏组织。甘油被添加到顶部储液池中，用于甘油浸入显微镜。秤条 =1 厘米。水库蓝图可以在 补充图1中找到。缩写：eGFP = 增强型绿色荧光蛋白。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：心脏组织清除阶段的视觉外观。
（A） 从左到右：未清除的左心室、电泳左心室、用交联器处理的电磷左心室、用交叉链接器处理的电磷左心室，并在RIMS中孵育。（B） 清除了整个老鼠的心脏。（C） 左：未受伤，左心室不明。右图：未受伤，清除左心室。（D） 左： 不明 MI 受伤左心室。右图： 清除 Mi 受伤的左心室。比例杆 = 0.5 厘米。缩写：MI=心肌梗塞。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：新颖的清除方法对未受伤和虚假操作的清除心脏的有效性。
清除（A） 未受伤 （比例杆 = 400μm） 和（B）假心 （比例杆 = 500μm） 与 Tcf21mcm x Rosa26eGFP 成纤维细胞 （绿色） 和假彩色区域增加荧光 （紫色） 显示成纤维细胞本地化.附带的视频显示成纤维细胞视频可以在 补充视频S1–2中找到。静止图像显示成纤维细胞内源荧光（绿色）的背景清除和维护。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：随着时间的流变/输液受伤，纤维细胞损失的衰减清除了心脏。
清除心脏组织从指示的 I/R 时间点与 Tcf21MerCreMer （mcm） x Rosa26eGFP 成纤维细胞 （绿色）， 假彩色区域增加荧光 （紫色） 显示成纤维细胞本地化， 和橙色概述区域缺乏成纤维细胞.顶行：左心室的静止图像从I/R受伤清除心脏。下排：左心室的静止图像从I/R受伤清除心脏与Imaris斑点功能用于看到成纤维细胞模式更容易在整个左心室。I/R 受伤清除心脏的视频不仅显示成纤维细胞的毛图案，而且还显示单个成纤维细胞及其形态的清晰图像，可在 补充视频 S5–8 中找到。比例杆 =500 μm。缩写：I/R = 缺血/输液。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：心肌梗塞损伤后心脏成纤维细胞损失的衰减随着时间的推移清除心脏。
清除MI心脏组织与TCf21MerCreMer（mcm）x罗莎26eGFP成纤维细胞（绿色），假彩色区域增加荧光（紫色）显示成纤维细胞本地化，和橙色概述区域缺乏成纤维细胞。顶行：组织从MI受伤的心脏（绿色）清除左心室的静止图像。下排：组织清除左心室从MI受伤的心脏（绿色）与Imaris斑点功能（紫色）覆盖的静止图像，以显示毛成纤维细胞分布。从MI受伤心脏清除左心室的组织视频显示心脏毛成纤维细胞排列，以及在这个3D体内模型（补充视频S7-8）中个体成纤维细胞的定位和形态。比例杆：1.5 天 = 1000μm，3 天 = 700μm。缩写：MI=心肌梗塞。 请单击此处查看此图的较大版本。
图6：从血管紧张素/苯肾上腺素治疗的心脏清除组织。
（A） 示意图显示在塔莫西芬激活 Tcf21MCM x eGFP 后两周内，血管紧张素/苯肾上腺素泵如何用于药物管理。（B） 静止图像， 静止图像 + Imaris 点， 和视频显示成纤维细胞组织和形态在昂/ PE 治疗的心脏 （补充视频 S11） 规模酒吧 = 500μm.缩写：昂/PE = 血管紧张素 II/苯肾上腺素;eGFP=增强型绿色荧光蛋白。 请单击此处查看此图的较大版本。
图7：在血管紧张素/苯甲肾上腺素治疗的心脏中观察到的成纤维细胞模式的代表图像。
（A、C和D）：从心室外侧的角度看，右手螺旋扭曲成纤维细胞图案的图像。 （B） 从心室内部的角度对成纤维细胞图案进行成像。箭头突出显示构成扭曲图案的成纤维细胞的线性组。比例杆 =500 μm。请单击此处查看此图的较大版本。
增补图1：成像储液库设备的二元渲染。 （A） 成像储层下半部分的二元渲染。这个储液藏用真空油脂密封在培养皿上。心脏被放置在中心开口，并淹没在RIMS中。（B） 成像储层上半部分的二元渲染。玻璃盖片粘在平底，带有真空润滑脂。这是轻轻地放置在底部水库的顶部。然后，顶部储液罐可以充满甘油进行成像。单位在毫米。缩写：2D = 二维：RIMS：折射索引匹配解决方案。 请单击此处下载此图。
视频S1：未受伤的组织清除心脏。 心脏成纤维细胞（绿色）在一个未受伤的左心室是小的，许多四舍五入不超过两个细胞投影。 请点击这里下载此视频。
视频 S2： 沙姆组织清除心脏。 心脏成纤维细胞（绿色）在一个假手术的小鼠心脏的左心室是小的，大多是圆的，几乎没有投影，类似于在未受伤的心脏看到。 请点击这里下载此视频。
视频 S3：通过未受伤心脏的心室壁观看详细的成纤维细胞视图。 此视频从内部心室壁开始，向心脏外部缩放。心脏成纤维细胞（绿色）被详细显示，并观察到有圆形或稍微拉长的细胞体，不超过两个细胞投影。 请点击这里下载此视频。
视频 S4：未受伤心脏左心室壁部分的详细视图。 这个约300μm宽的清除未受伤的小鼠心脏部分详细显示了心脏成纤维细胞（绿色）的三维排列及其形态。 请点击这里下载此视频。
视频 S5： 清除左心室 3 天 I/R. 左心室的详细视图显示，I/R受伤后，心脏成纤维细胞损失区域。同样明显的是，成纤维细胞（绿色）在这种受伤的条件下发展出一种更拉长的形状，而在未受伤和虚假的心灵中看到的更圆润的形态。缩写：I/R = 缺血/输液。 请点击这里下载此视频。
视频 S6： 清除 7 天 I/R 的左心室。 左心室的详细视图显示，在 I/R 受伤后 7 天内，缺少成纤维细胞的区域比 I/R 损伤后第 3 天看到的面积要小。有更多的成纤维细胞（绿色）存在，有趣的是，新的细胞形态存在。具体来说，一些成纤维细胞具有多重突起的圆细胞体，可能表明成纤维细胞在这种环境中具有新的或发展的作用。缩写：I/R = 缺血/输液。 请点击这里下载此视频。
视频 S7： 清除了 14 天 I/R 的左心室。 左心室的详细视图显示，心室壁中央仍有一个区域，其成纤维细胞很少，但这个空隙外围的成纤维细胞（绿色）保持了I/R后第7天样本中高度拉长的形态。有趣的是，在受伤地区存在的少数成纤维细胞在未受伤的心脏中有一个这样的形态——小而圆。缩写：I/R = 缺血/输液。 请点击这里下载此视频。
视频 S8： 清除左心室 28 天 I/R. I/R受伤后第28天心脏成纤维细胞（绿色）的详细观察表明，受伤区域有一小片区域缺乏成纤维细胞。还观察到，该地区周围有一个高成纤维细胞密度的区域，而且这个密集区域的形态高度拉长。缩写：I/R = 缺血/输液。 请点击这里下载此视频。
视频 S9： 清除左心室 1.5 天 Mi 。 在MI心脏成纤维细胞死亡1.5天后，受伤的左心室中仅存很少心脏成纤维细胞（绿色），心脏成纤维细胞在整个心室区域死亡。缩写：MI=心肌梗塞。 请点击这里下载此视频。
视频 S10： 清除 3 天 Mi 的左心室。 在MI3天后，心脏成纤维细胞大面积不存在，但一些心脏成纤维细胞（绿色）重新出现在心室中，这与MI1.5天后发现的结果不同。此外，心脏成纤维细胞形态特征与在I/R受伤心脏中看到的形态特征不同。在这里，成纤维细胞被拉长，但也有其他有圆的细胞体（比那些在未受伤的心脏看到）和这些亚人口有许多细胞投影。缩写：MI=心肌梗塞;I/R = 缺血/输液。 请点击这里下载此视频。
视频 S11：清除安/PE 治疗小鼠的左心室。 在Ang/PE治疗后，心脏成纤维细胞（绿色）没有明显损失。然而，心脏成纤维细胞大多是小而圆或小和拉长，似乎与心脏的收缩模式一致。缩写：安/PE = 血管紧张素 II/苯肾上腺素。 请点击这里下载此视频。
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Discussion
本文提出了一种精炼的组织清除方法，允许在内在心脏成纤维细胞的可视化，无论是在基线和受伤后，以特征和更好地了解成纤维细胞在小鼠的心脏。这个增强的协议解决了现有的组织清除协议的限制，试图确定特定的细胞类型在成人或新生儿心脏12，13，14，16，17，20。在最初试图清除小鼠心脏时，使用了被动的CLARITY技术，其中心脏被留在坚果上的清除缓冲区约1周，以便在整个组织15，18中被动分布缓冲。这个过程只产生约80μm的深度清除到组织（数据未显示），这是符合以前的观察，其中需要几个星期来清除1天大的新生儿鼠心脏13。使用主动电泳系统进行主动清晰度，可在较短的时间段内，通过整个心室壁（约 700 μm–1 mm 深）进行更深入的清除。
然而，使用这个以前公布的活性CLARITY协议导致纤维细胞荧光与高水平的组织自身荧光损失，这以前曾注意到发生在活动CLARITY由科列索娃等人12。为了保持成纤维细胞荧光，发现适当的固定方案至关重要。固定过程太短会导致电泳期间荧光损失。固定过程过长会导致荧光本身的丧失。因此，在 4% PFA 中，隔夜固定在 4 °C 是最佳的。为了改善背景荧光问题，采用了装饰浸泡（从CICCO清除方法中借用的一个原理）来减少肌红蛋白中的血红素结合，从而减少这种色谱18引起的自流。脱色处理使背景荧光的清除更加牢固，并维持了记者的荧光，使标记的成纤维细胞更加明显（图2A）。
最后，为了实现完全的光学透明度，组织在折射索引匹配解决方案 （RIMS） （图 2B– D）中等于。通过将组织的折射指数与其周围环境相匹配，这提高了组织的光学透明度，从而允许更深入的成像。高速共振扫描然后被用来成像组织，因为它比电测扫描更快。由于鼠标心的大小略有不同，因此设置了单独的 XY 成像参数和 Z 强度校正。有了这些参数，就可以通过未受伤的心脏在大约4小时内（图3）对荧光成纤维细胞进行成像。通过使用脱混和去名分析软件来减少背景并澄清图像中存在的荧光，在成像后处理中提高了图像质量。此外，还使用二次分析软件突出荧光成纤维细胞的本地化。此成像后分析用于通过消除背景逐声素（图 3 、图 4、图5、图 6）来明确注释心脏成纤维细胞。
此优化的 CLARITY 协议已应用于光学清除受伤和未受伤的心脏。这可以更好地了解心脏成纤维细胞对损伤的反应。这些伤害包括MI和I/R的时间课程，以及安/PE配给。由于缺血性损伤会削弱心脏组织，因此在电泳期间要更加小心，以保持组织完整性。事实上，对于I/R和MI损伤，需要较短的电泳周期（≤1.5小时）32。先前的研究没有考虑损伤对组织清除过程的影响。此处介绍的新优化协议可容纳伤害，允许在不进一步破坏组织的情况下进行清除。
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Disclosures
作者没有披露与本手稿内容有关的内容。
Acknowledgments
作者要感谢CCHMC康福克斯成像核心在开发该模型的帮助和指导，以及来自临床工程的马特·巴蒂对所有3D打印部件的设计。德米特里亚·菲切瑟得到了国家卫生研究院（NHLBI，T32 HL125204）的培训补助金的支持，杰弗瑞·莫尔肯廷得到了霍华德·休斯医学研究所的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 braided silk | Ethicon | K871H | |
| 8-0 prolene | Ethicon | 8730H | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | |
| Angiotensin II | Sigma | A9525-50G | |
| Artificial Tear Ointment | Covetrus | 048272 | |
| DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane) | Millipore Sigma | D27802-25G | |
| GLUture topical tissue adhesive | World Precision Instruments | 503763 | |
| Heparin | Sigma | H0777 | |
| Imaris Start Analysis Software | Oxford Instruments | N/A | |
| Micro-osmotic pumps | Alzet | Model 1002 | |
| Nikon Elements Analysis Software | Nikon | N/A | |
| Nikon A1R HD upright microscope | Nikon | N/A | |
| Normal autoclaved chow | Labdiet | 5010 | |
| Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide |
CosmoBio | AXS-1002424 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Phenylephrine Hydrochloride | Sigma | P6126-10G | |
| Photoinitiator | Wako Chemicals | VA-044 | |
| Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] | Jackson Laboratories | Jax Stock No:012429 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium Chloride solution | Hospira, Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Tamoxifen food | Envigo | TD.130860 | |
| Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent | Millipore Sigma | 122262-1L | |
| X-Clarity electrophoretic clearing chamber | Logos Biosystems | C30001 | |
| X-Clarity electrophoretic clearing solution | Logos Biosystems | C13001 | |
| X-Clarity electrophoresis tissue basket | Logos Biosystems | C12001 | |
| X-Clarity electrophoresis tissue basket holder | Logos Biosystems | C12002 |
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