Summary
Une méthode raffinée de dégagement de tissu a été développée et appliquée au coeur adulte de souris. Cette méthode a été conçue pour effacer le tissu cardiaque dense et autofluorescent, tout en maintenant la fluorescence étiquetée de fibroblaste attribuée à une stratégie génétique de rapporteur.
Abstract
La maladie cardio-vasculaire est la cause la plus répandue de mortalité dans le monde entier et est souvent marquée par la fibrose cardiaque accrue qui peut mener à la rigidité ventriculaire accrue avec la fonction cardiaque changée. Cette augmentation de la fibrose ventriculaire cardiaque est due à l’activation des fibroblastes résidents, bien que la façon dont ces cellules fonctionnent dans le cœur à 3 dimensions (3D), à la ligne de base ou après l’activation, ne soit pas bien comprise. Pour examiner comment les fibroblastes contribuent aux maladies cardiaques et leur dynamique dans le cœur 3D, une méthode raffinée de nettoyage et d’imagerie des tissus basée sur CLARITY a été développée qui montre des fibroblastes cardiaques marqués par fluorescence dans tout le cœur de la souris. Les fibroblastes résidents des tissus ont été génétiquement marqués à l’aide de souris rapporteurs florescentes Rosa26-loxP-eGFP croisées avec le fibroblaste cardiaque exprimant la ligne knock-in Tcf21-MerCreMer. Cette technique a été employée pour observer la dynamique de localisation de fibroblaste dans tout le ventricule gauche adulte entier chez les souris saines et dans les modèles de souris fibrotiques de maladie cardiaque. Intéressant, dans un modèle de blessure, on a observé des modèles uniques des fibroblastes cardiaques dans le coeur blessé de souris qui a suivi des bandes des fibres enveloppées dans la direction contractile. Dans les modèles de dommages ischémiques, la mort de fibroblaste s’est produite, suivie du repeuplement de la zone frontière d’infarctus. Collectivement, cette technique de clarification des tissus cardiaques raffinée et ce système d’imagerie numérisé permettent la visualisation 3D des fibroblastes cardiaques dans le cœur sans les limitations de l’échec de pénétration des anticorps ou les problèmes précédents entourant la fluorescence perdue due au traitement des tissus.
Introduction
Bien que les cardiomyocytes comportent la plus grande fraction de volume dans le coeur, les fibroblastes cardiaques sont plus abondants et sont en critique impliqués en réglant les dispositifs structuraux et réparateurs de ligne de base de cet organe. Les fibroblastes cardiaques sont fortement mobiles, mécaniquement sensibles, et phénotypiquement s’étendant selon l’ampleur de leur activation. Les fibroblastes cardiaques sont nécessaires pour maintenir des niveaux normaux de matrice extracellulaire (ECM), et trop peu ou trop de production d’ECM par ces cellules peut conduire à la maladie1,2,3. Compte tenu de leur importance dans la maladie, les fibroblastes cardiaques sont devenus un sujet de recherche de plus en plus important pour identifier de nouvelles stratégies de traitement, en particulier en essayant de limiter la fibrose excessive4,5,6,7. En cas de blessure, les fibroblastes s’activent et se différencient en un type de cellule plus synthétique connu sous le nom de myofibroblaste, qui peut être prolifératif et sécrète un ECM abondant, ainsi que d’avoir une activité contractile qui aide à remodeler les ventricules.
Alors que les fibroblastes cardiaques ont été largement évalués pour leurs propriétés dans les cultures 2-D6,8,9,10,beaucoup moins est compris de leurs propriétés et dynamiques dans le cœur vivant 3-D, soit à la ligne de base ou avec la stimulation de la maladie. Ici, une méthode raffinée a été décrite pour effacer le tissu du cœur de souris adulte tout en maintenant la fluorescence des fibroblastes marqués avec un système de rapporteur génétique Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer. Au sein du cœur, Tcf21 est un marqueur relativement spécifique des fibroblastes quiescents4. Une fois que le tamoxifène est administré pour activer la protéine MerCreMer inductible, pratiquement tous les fibroblastes tranquilles exprimeront en permanence la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) du locus Rosa26, ce qui permet leur suivi in vivo.
De nombreux protocoles de nettoyage des tissus bien établis existent, dont certains ont été appliqués au cœur11,12,13,14,15,16,17. Cependant, de nombreux réactifs utilisés dans différents protocoles de nettoyage des tissus se sont avérés étancher les signaux de fluorescenceendogènes 18. De plus, le cœur adulte est difficile à effacer en raison des protéines abondantes contenant un groupe d’hèmes qui génèrent une autofluorescence19. Par conséquent, le but de ce protocole était de préserver la fluorescence de marqueur de fibroblaste avec l’inhibition simultanée de l’autofluorescence d’hème dans le coeur adulte blessé pour la visualisation 3D optimale in vivo12,13,14,16,17,20.
Les études précédentes tentant d’examiner le fibroblaste cardiaque in vivo ont employé des anticorps perfusés pour étiqueter ces cellules, bien que de telles études aient été limitées par la pénétration d’anticorps et la structure vasculaire cardiaque14,16,17,20. Bien que Salamon et al. aient montré un nettoyage tissulaire avec le maintien de la fluorescence neuronale topique dans le cœur néonatal, et que Nehrhoff et al. aient montré le maintien des cellules myéloïdes marquant la fluorescence, le maintien de la fluorescence endogène à travers toute la paroi ventriculaire n’a pas encore été démontré, y compris la visualisation des fibroblastes cardiaques adultes au départ ou après une blessure13,20. Ce protocole d’élimination des tissus affine un mélange de protocoles précédents basés sur la méthode CLARITY (imagerie rigide acrylamide-hybridée clairement échangée par les lipides/ hydrogel tissulaire compatible avec l’hybridation in situ) et le PEGASOS (système de solvant associé au polyéthylène glycol (PEG)). Ce protocole raffiné a permis un examen plus robuste des fibroblastes cardiaques dans le coeur de souris à la ligne de base et de la façon dont ils répondent à différents types de dommages. Le protocole est simple et reproductible et aidera à caractériser le comportement des fibroblastes cardiaques in vivo.
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Protocol
Toutes les expériences impliquant des souris ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du Cincinnati Children’s Hospital Medical Center. L’établissement est également certifié AAALAC (American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care). Des souris ont été euthanasiées par luxation cervicale, et des souris subissant des procédures chirurgicales de survie ont été données le soulagement de douleur (voir ci-dessous). Toutes les méthodes utilisées pour la gestion de la douleur et l’euthanasie sont basées sur les recommandations du groupe d’experts sur l’euthanasie de l’American Veterinary Medical Association. Toutes les souris étaient logées dans des unités de litière en épis de maïs avec de l’eau et de la nourriture disponibles en tout temps. Des souris ont été logées 4 dans une cage avec le même sexe. Pour la chirurgie ou la clairance tissulaire non blessée, un nombre égal de souris mâles et femelles âgées de 6 à 8 semaines ont été utilisées.
REMARQUE: Des conditions chirurgicales stériles ont été maintenues dans toutes les chirurgies. Le chirurgien s’est changé en gommages propres et en blouse stérile, puis a enfilé des couvre-chaussures et un filet à cheveux. Le chirurgien s’est ensuite frotté les mains avec de la chlorhexidine et a enfilé des gants chirurgicaux stériles. Le chirurgien a été aidé par un technicien qui a sous sédation, rasé, et nettoyé l’emplacement d’incision 3 fois chacun, alternant entre le gluconate de chlorohexidine de 2% et l’isopropanol de 70%. Les souris ont ensuite été amenées chez le chirurgien et une intervention chirurgicale a été effectuée. Entre les animaux, les instruments ont été stérilisés dans un stérilisateur de perles.
1. Recombinaison de la cre
- Souris Croisées Rosa26-loxP-eGFP (Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]) avec des souris Tcf21-MerCreMer(Figure 1A)6,21.
- Lorsque la progéniture de ce croisement atteint l’âge de 6 semaines, administrer une injection intrapéritonéale de 75 mg/kg de tamoxifène dissous dans de l’huile de maïs. 22 Administrer ce tamoxifène deux fois, à 48 h l’un de l’autre(figure 1B).
- Après les injections de tamoxifène, mettez les souris sur un régime de nourriture de tamoxifène (~ 0,4 g/kg de citrate de tamoxifène) pendant une semaine. Après une semaine de tamoxifène chow, ramener les souris à un régime chow autoclavé normal pendant une semaine avant d’effectuer la chirurgie(Figure 1B). Désigner un nombre approprié de souris (3 par condition chirurgicale) pour être des témoins non blessés. Sacrifiez ces souris et passez au processus de nettoyage délimité ci-dessous après une semaine de régime chow normal.
- Après le régime de tamoxifène et la recombinaison, effectuez une intervention chirurgicale.
2. Modèles chirurgicaux
- Ischémie/ré-perfusion (I/R)23,24
- Anesthésier les souris avec 1,5% d’isoflurane de gaz dans l’air de la pièce dans une boîte ventilée; rasez leur poitrine et leur cou avec des tondeuses électriques, puis frottez les zones rasées avec un écouvillon imbibé de gluconate de chlorhexidine à 2%.
- Utilisez une pommade lacrymale artificielle pour prévenir la sécheresse pendant la chirurgie en plaçant une pommade sur les yeux des souris sous sédateur.
- Effectuer une coupure à mi-cou à l’aide de ciseaux chirurgicaux pour permettre la visualisation de la trachée. Intubate avec un cathéter de 20 G en plaçant le tube d’intubation dans la trachée et visualiser le cathéter trachéal à travers l’incision de mi-cou. Placez les souris sur un ventilateur sous sédèse avec du gaz isoflurane (1,5%) dans l’air de la pièce.
- Faites une incision sous le membre antérieur gauche avec des ciseaux chirurgicaux et coupez les muscles intercostaux entre les côtes 3 et 4. Étalez les côtes ouvertes à l’aide d’un rétracteur.
- Placez une petite éponge imbibée de solution saline entre le poumon et le cœur pour éviter d’endommager le poumon.
- À l’aide d’une aiguille fishhook (6,5 mm, 3/8 c), attachez l’artère coronaire gauche avec un nœud coulissant libérable en utilisant 8-0 prolène.
- Retirez l’éponge à l’aide d’une pince.
- Suturer les muscles intercostaux fermés à l’aide de soie tressée 4-0 et d’une suture continue tout en extériorisant la fin du 8-0 nœud coulissant de prolène.
- Fermez les incisions de peau à l’aide d’un adhésif topique pour les tissus avec l’extrémité du nœud de glissement occluant dépassant.
- Après une heure d’occlusion, tirez l’extrémité extérieure du nœud de glissement pour libérer intérieurement l’occlusion de l’artère coronaire, soulageant l’ischémie et provoquant une ré-perfusion.
- Administrer 0,02 mL d’une buprénorphine à libération prolongée de 1 mg/mL par injection sous-cutanée (libération de 72 h) comme analgésique, et placer les souris dans une chambre d’incubation oxygénée à 37 °C, séparée des autres animaux. Surveiller les souris au moins toutes les 15 minutes jusqu’à ce qu’elles aient récupéré de l’anesthésie et soient capables de maintenir une position sternale ou assise. Ramener les souris à leur logement habituel.
- Évaluer les animaux pour la douleur et la détresse pendant 48 h après la chirurgie, et surveiller le site d’incision quotidiennement jusqu’à ce qu’il soit complètement guéri.
- Observez les souris pour l’hydratation, la nourriture et le bien-être général après la chirurgie jusqu’au sacrifice.
- Infarctus du myocarde (IM)25,26,27
- Effectuez les étapes 2.1.1 à 2.1.7.
- Utilisez une suture continue pour fermer les muscles intercostaux à l’aide de soie tressée 4-0.
- Fermez l’incision de la peau à l’aide d’un adhésif topique pour les tissus.
- Effectuez les étapes 2.1.11 à 2.1.13.
- Angiotensine II/phényléphrine perfusion de pompe micro-osmotique
- Préparer Préparer une solution de travail de 10 μg/μL d’angiotensine II et une solution de travail de phényléphrine de 500 μg/μL dans des conditions stériles (c.-à-d. dans une hotte à flux laminaire) en ajoutant 1 mg d’angiotensine II à 100 μL de solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS) et 250 mg de chlorhydrate de phényléphrine dans 500 μL de PBS.
- Calculer la dilution de chaque solution de travail et le volume final à distribuer à la pompe micro-osmotique en fonction du poids de la souris.
REMARQUE : Par exemple, une souris de 20 g nécessite 20 g x 14 jours x 1,5 μg/jour = 420 μg d’angiotensine, ou 42 μL de solution de travail, ainsi que 20 g x 14 jours x 50 μg/jour = 14000 μg de chlorhydrate de phényléphrine, ou 28 μL de solution de travail. - Pour le poids de chaque souris, diluer le stock de travail du médicament dans du PBS stérile et remplir les pompes micro-osmotiques (0,25 μL/h, 14 jours, environ 100 μL) à l’aide d’une aiguille de 27 G et d’une seringue de 1 mL.
REMARQUE: Cela générera un débit de 1,5 μg∙g-1∙jour-1 d’angiotensine II et de 50 μg∙g-1∙jour-1 de chlorhydrate de phényléphrine une fois placé chez les souris. - Anesthésier les souris avec 1,5% d’isoflurane inhalation (à effet) dans une chambre ventilée contenant de l’air de pièce.
- Placez les souris anesthésiées sur une table chirurgicale stérile en position opine et maintenez l’anesthésie par inhalation de gaz isoflurane (1,5%) à travers un cône de nez.
- Utilisez une pommade lacrymale artificielle sur les yeux de l’animal pour prévenir la sécheresse pendant la chirurgie.
- Rasez la fourrure sur la zone d’implantation avec des tondeuses électriques et stérilisez la zone à couper à l’aide d’éthanol et d’un écouvillon stérile. Faites une petite incision (environ 1 cm) avec des ciseaux chirurgicaux dans la couche épidermique de la peau de souris sur le côté latéral droit du dos, sous l’omoplate. Utilisez les côtés ternes d’une paire de ciseaux chirurgicaux pour étirer doucement la peau dans et autour de la zone d’implantation pour insérer la minipompe.
- Placez la pompe micro-osmotique dans l’incision et manœuvrez-la physiquement à gauche de la ligne médiane dorsale de la souris en massant manuellement la pompe sous la peau.
- Fermez l’incision via une suture continue à l’aide de soie 4-0 avec une aiguille conique.
- Après l’implantation à la pompe, administrer de la buprénorphine à libération lente à une dose de 0,1 mg/kg de poids corporel par injection sous-cutanée pour l’analgésie (libération lente de 72 h). Placer les souris dans une chambre d’incubation oxygénée à 37 °C, séparée des autres animaux. Surveillez les souris au moins toutes les 15 minutes jusqu’à ce qu’elles se remettent de l’anesthésie et puissent maintenir une position sternale ou assise.
- Après la récupération de l’anesthésie dans la chambre de réchauffement à 37 °C, replacez les souris dans leurs unités de logement standard.
- Surveiller les souris pour la douleur et la détresse pendant 48 h après la chirurgie, et surveiller le site d’incision quotidiennement jusqu’à ce qu’il soit complètement guéri.
- Observez les souris pour l’hydratation, la nourriture et le bien-être général après la chirurgie jusqu’au sacrifice.
3. Nettoyage des cœurs de souris adultes à l’aide d’un protocole CLARITY actif modifié
- Préparez une zone chirurgicale propre en stérilisant la surface chirurgicale et tous les outils chirurgicaux avec 70% d’éthanol. Préparer une solution de PBS 1x froid et de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans du PBS (100 mL chacun). Portez des gants, du sarrau de laboratoire, un masque facial et une protection oculaire.
- Préparer le tampon d’héparine en diluant 10 unités d’héparine dans une solution de chlorure de sodium à 0,9 % p/v. Injecter par voie intrapéritonéale à chaque souris 60 μL d’héparine-NaCl à l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une aiguille de 27 G.
- Cinq minutes après l’injection de solution d’héparine-NaCl, anesthésier les souris en utilisant 1,5% d’inhalation d’isoflurane (à effet) dans une chambre ventilée contenant de l’air de pièce.
- Euthanasier les souris par luxation cervicale, dans laquelle l’arrière de la tête est maintenu avec l’extrémité plate et fermée de la pince, tandis que la colonne vertébrale est disloquée en tirant la queue.
- Nettoyez la surface ventrale de la souris avec de l’éthanol à 70% sur un coton-tige. Faire une incision transversale de 3 cm à environ 3 cm sous le processus xiphoïde à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
- Séparez la peau du tissu de la paroi abdominale sous-jacente en dégoulinant l’abdomen jusqu’au processus xiphoïde (maintenez la peau la plus proche de la queue et tirez la peau la plus près de la tête vers le haut vers la cage thoracique). Faire une incision transversale de 2 cm dans le tissu de la paroi abdominale sous-cutanée 3 cm en dessous du processus xiphoïde à l’aide de ciseaux chirurgicaux. Faites une coupe verticale à partir de cette incision transversale, jusqu’à la ligne médiane et à travers la cage thoracique. Épinglez la cage thoracique en arrière, exposant le cœur.
- Utilisez une aiguille de 27 G et une seringue de 10 ml pour injecter du PBS froid dans la veine cave et l’aorte supérieures (toute manipulation positionnelle du cœur doit être faite avec soin avec une pince émoussée pour éviter la perforation) pour dégager le sang du cœur.
REMARQUE: Une perfusion suffisante peut être notée par contraction de la queue et décoloration des poumons. - Utilisez une aiguille de 27 G et une seringue de 10 ml pour injecter de la PFA froide à 4 % dans la veine cave supérieure et l’aorte pour commencer le processus de fixation.
- Exciser les cœurs. Les oreillettes, le ventricule droit et le septum, et le ventricule gauche devraient être séparés utilisant un scalpel de droite-lame. Placer ce tissu dans un tube à centrifuger de 15 mL rempli de PFA à 4 % froid et le placer sur un nutator à 4 °C pendant la nuit.
- Lavez le cœur 3 fois pendant 1 h chacune avec 1x PBS froid pour éliminer l’excès de PFA.
- Préparer l’hydrogel (appelé A4P0 pour la composition relative d’acrylamide/polyacrylamide) en mélangeant les produits chimiques suivants dans un tube centrifuge de 15 mL : 10 % d’acrylamide à 40 %, 10 % de PBS 1x, 80 % d’eau distillée.
- Ajouter la solution à 0,25 % du photoinitiateur (2,2-Azobis[2-(2-imidazolin-2yl)propane)dichlorhydrate) à la solution d’hydrogel juste avant d’immerger le cœur dans l’hydrogel.
- Placez le cœur dans un tube conique contenant l’hydrogel. Envelopper le tube conique dans du papier d’aluminium et incuber pendant une nuit à 4 °C sans perturbation physique.
- Après environ 14 h à 4 °C, déplacer le tube conique contenant le cœur vers un bain de perles à 37 °C.
- Après 2,5 h dans le bain de perles, retirez soigneusement le cœur de l’hydrogel avec une pince.
- Laver les cœurs 3 fois pendant 1 h chacun dans un tube conique de 15 mL contenant 1x PBS à 37 °C sur un nutator.
- Placez les cœurs dans le panier de la machine d’électrophorèse active à l’aide d’une pince et placez le couvercle sur le panier. Assurez-vous que le couvercle est bien en place.
- Remplissez le réservoir de la chambre d’électrophorèse active avec une solution de nettoyage électrophorétique en versant la solution dans la chambre.
- Une fois que la chambre est pleine de solution de compensation électrophorétique, le panier contenant le cœur peut être submergé. Placez le bouchon sur la machine d’électrophorèse en toute sécurité.
- Faire fonctionner la machine d’électrophorèse à 1,5 A, 37 °C pendant 1,5 h.
- Après 1,5 h d’électrophorèse, vérifiez visuellement les cœurs pour s’assurer qu’il ne reste aucun tissu opaque. Si les régions du tissu sont encore opaques, republiez le cœur dans une solution d’électrophorèse dans la chambre électrophorétique et poursuivez l’électrophorèse pendant 0,5 h à la fois.
REMARQUE: L’électrophorèse doit être interrompue dès les premiers signes de lésions tissulaires (comme l’effilochage des tissus). - Laver les cœurs dans un tube conique de 15 mL contenant 1x PBS pendant 1 h, 3 fois chacun, à 37 °C sur un nutator.
- Submerger les cœurs dans un tube conique de 15 mL contenant N,N,N′,N′-Tétrakis(2-Hydroxypropyl)éthylènediamine , un agent décolorant qui réduit l’autofluorescence de l’hème.
REMARQUE: Cette solution doit être changée toutes les 24 h jusqu’à ce que les cœurs soient complètement clairs (environ 2 jours). - Laver les cœurs dans un tube conique de 15 mL avec 1x PBS 3 fois pendant 1 h chacun pour éliminer l’excès d’agent décolorant.
- Préparer la solution d’appariement de l’indice de réfraction (RIMS) en combinant 30 mL de tampon phosphate 0,02 M, 40 g d’isotherme 5-(N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4,6-tri-iodo-N,N'-bis(2,3 dihydroxypropyl) isphtalamide sous agitation (doit être complètement dissous , cela peut prendre jusqu’à une heure), 5 mg d’azide de sodium, 50 μL de Tween20 et 1 g de 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane, et ajuster le pH à 7,5.
- Équilibrer les coeurs dans RIMS pendant 48 h avant l’imagerie.
4. Imagerie des cœurs dégagés à l’aide d’un microscope confocal à photon unique vertical
REMARQUE : L’appareil d’imagerie se compose de la moitié inférieure d’une boîte de Petri en verre de 10 cm, d’un réservoir inférieur imprimé en 3D, d’une lamelle ronde en verre et d’un réservoir supérieur imprimé en 3D(Figure 1C–E). Les documents imprimés en 3D ont été fabriqués à l’interne par le département d’ingénierie clinique de l’hôpital pour enfants de Cincinnati.
- Utilisez de la graisse sous vide pour sceller le réservoir inférieur imprimé en 3D dans une boîte de Petri en verre en plaçant une fine couche de graisse sous vide sur le fond de la pièce imprimée en 3D(Figure 1C).
NOTA : Le réservoir doit avoir la même hauteur que l’échantillon ionisé (c.-à-d. que l’échantillon ne doit pas être comprimé par la lame de couverture de verre placée dessus, et que l’échantillon ne doit pas non plus pouvoir flotter et se déplacer à l’intérieur du réservoir). - Remplissez le réservoir avec RIMS et retirez toutes les bulles avec une pointe de pipette. Placez soigneusement le cœur dans le RIMS avec la paroi ventriculaire gauche vers le haut, en veillant à ce qu’aucune bulle ne soit introduite dans la solution.
- Adhérez à une lamelle de couverture en verre sur la surface inférieure de la pièce supérieure du réservoir imprimée en 3D(figure supplémentaire 1A)à l’aide de graisse sous vide (encore une fois en plaçant une fine couche de graisse sous vide sur la pièce imprimée en 3D et en la plaçant sur le bordereau de couverture)(Figure 1D).
- Placez la lamelle de couverture en verre et le réservoir supérieur, la lamelle de couverture côté vers le bas, sur le réservoir inférieur(figure supplémentaire 1B),sans l’introduction de bulles. L’adhérence entre le RIMS et le patin de couverture fournira un joint entre les pièces du réservoir supérieur et inférieur(Figure 1E).
- Remplissez le réservoir supérieur avec du glycérol pour une utilisation avec un objectif d’immersion en glycérol 10x.
- Utilisez un seul microscope à photons équipé d’une tête de balayage confocale multiphotonique pour imager les cœurs dégagés.
- Abaissez l’étage du microscope à photon unique et placez la boîte de Petri contenant l’échantillon au centre de l’étage. Soulevez l’étage et abaissez l’objectif d’immersion de 10x glycérol dans le glycérol dans le réservoir supérieur de l’appareil d’échantillonnage. Assurez-vous que l’échantillon est au point en regardant le bord de l’échantillon à l’aide des oculaires.
- Passez de la vue de l’oculaire à la vue de la caméra sur l’ordinateur en cliquant sur le bouton en direct.
- Définissez les paramètres X et Y en localisant d’abord la partie la plus large de l’échantillon de tissu, qui devrait se trouver au fond de la boîte de Pétri.
- Cliquez sur Acquisition ND et multipoint personnalisé. Créez des multipoints en trouvant d’abord le milieu de l’échantillon de tissu en utilisant le joystick pour balayer de gauche à droite et de haut en bas.
- Ensuite, en fonction de la taille du tissu, déterminez la taille du pavage nécessaire (généralement 6 x 5 pour un cœur de souris âgé de 6 à 8 semaines). Pour ce faire, exécutez l’imagerie de test en capturant uniquement les paramètres X et Y (décochez z sous l’onglet Acquisition ND) pour vérifier si toute la longueur et la largeur du tissu ont été capturées.
- Pour définir les paramètres z, ouvrez la navigation XYZet cliquez sur les icônes haut et bas jusqu’à ce que vous trouvez le haut et le bas de l’exemple.
- Ouvrez le panneau de correction de l’intensité Z et ajustez la fluorescence en haut, au milieu et en bas du tissu pour corriger la densité tissulaire en augmentant ou en diminuant la puissance laser à chaque point z. Définissez-les en cliquant sur la flèche de jeu à droite du panneau Correction de l’intensité Z.
- Définissez la taille de l’étape Z dans le panneau Acquisition ND sur 5 μm.
- Une fois que les paramètres X, Y et Z du cœur sont délimités et que la correction de l’intensité z est définie, utilisez le microscope vertical automatisé avec un objectif d’immersion en glycérol 10x avec un scanner résonnant et des tubes photomultiplicateurs de phosphure d’arséniure de gallium (PMTs GaAsP) pour imager les cœurs dégagés. Assurez-vous que les onglets XY et Z sont cochés sous Acquisition ND, puis appuyez sur Exécuter la correction Z.
- Coudre, démixer et débruiter les images résultantes en ouvrant l’image multipoint dans le logiciel de traitement et en cliquant sur le bouton de point. Sous image, cliquez sur unmixing aveugle, 2 canaux, puis recherchez. et Sous image, cliquez sur denoise.ai, puis cliquez sur le canal fluorescent de choix (c’est-à-dire, GFP).
REMARQUE: Ce processus se traduit par une image 3D des fibroblastes GFP-positifs dans tout le ventricule gauche. - Utilisez un logiciel d’analyse secondaire pour identifier davantage les modèles et les tendances dans la dispersion des fibroblastes cardiaques. Utilisez la fonction Spots en exécutant le programme de l’Assistant Spots.
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Representative Results
Les fibroblastes cardiaques sont essentiels pour la fonction de base du coeur aussi bien que pour la réponse aux dommages cardiaques. Des tentatives précédentes de comprendre l’arrangement et la morphologie de ces cellules ont été conduites en grande partie dans des arrangements 2-D. Cependant, une technique raffinée de nettoyage des tissus cardiaques (Figure 2) et d’imagerie 3D a été publiée, ce qui permet la visualisation avancée et plus détaillée des fibroblastes cardiaques. Grâce à cette technique d’imagerie, les fibroblastes se sont avérés densément emballés et ont une morphologie fusiforme dans les cœurs non blessés(Figure 3, Vidéos supplémentaires S1–4).
Après que le dégagement ventriculaire gauche de tissu ait été accompli dans un coeur non blessé, le protocole a été appliqué à plusieurs modèles de dommages pour examiner comment ce protocole de dégagement exécuterait en étudiant le tissu blessé de coeur. Des souris ont été soumises aux dommages d’I/R par fermeture provisoire de l’artère coronaire gauche (LCA) pendant 1 h suivi de la ré-perfusion durant 3, 7, 14, ou 28 jours. Ces expériences ont prouvé qu’il y avait une perte de fibroblastes cardiaques dans la région ischémique juste après des dommages d’I/R, mais que par le jour 7 et le jour 14, les fibroblastes ont émigré ou ont proliféré pour repeupler ce secteur du coeur blessé. Au jour 28, la population de fibroblastes cardiaques entourant les zones blessées du cœur était à sa plus grande densité (Figure 4, Vidéos supplémentaires S5–8).
Les dommages d’IM sont un modèle chirurgical résultant de la ligature permanente de LCA (aucune ré-perfusion). Des coeurs qui avaient subi la chirurgie de MI ont été excisés à 1.5 et 3 jours suivant la chirurgie pour la fixation, le dégagement, et l’analyse. Il restait très peu de fibroblastes dans le ventricule gauche blessé à 1,5 jour après la chirurgie(figure 5A, vidéo supplémentaire S9). Cependant, au jour 3, les fibroblastes se sont d expansions et étaient présents dans la majeure partie du ventricule gauche, à l’exception d’une petite région, vraisemblablement après avoir migré dans une population de la zone frontalière et/ou proliféré à partir d’une population dans la zone frontalière(figure 5B, vidéo supplémentaire S10). Encore une fois, un logiciel d’analyse a été utilisé pour mieux visualiser la localisation des fibroblastes, et les zones de perte de fibroblastes cardiaques ont été décrites en orange(figure 5). Cette analyse a mieux montré la perte initiale de cellules au jour 1.5 suivant MI et comment les fibroblastes ont proliféré ou migré dans ce secteur endommagé par le jour 3 pour réparer ostensiblement le secteur et former une cicatrice.
En plus des dommages ischémiques, la réaction des fibroblastes cardiaques à l’hypertension artérielle n’est pas bien comprise. Pour découvrir la réponse de ces cellules à l’hypertension artérielle, l’angiotensine II et la phényléphrine ont été administrées. L’angiotensine II et la phényléphrine (Ang/PE) sont des médicaments qui provoquent une hypertension artérielle persistante et l’activation des fibroblastes cardiaques avec des zones de fibrose interstitielle, confirmées par l’application de ce protocole de nettoyage des tissus aux cœurs traités par ang/PE(figure 6A)5,28. Contrairement à la chirurgie ischémique, l’infusion d’Ang/PE sur plusieurs semaines n’a pas comme conséquence la perte de tissu cardiaque et l’amincissement de mur. Au lieu de cela, on a observé un résultat différent dans le comportement de fibroblaste suivant ces dommages.
Comme le cœur pompe, le myocarde se tord, suivant un motif d’hélice droitier29,30,31. Dans le modèle Ang/PE de blessure, les fibroblastes se sont alignés le long de l’axe de ce modèle de contraction de l’hélice droitière à l’aide du protocole de nettoyage tissulaire raffiné(figure 6B). L’hypothèse pour expliquer ce comportement est que les fibroblastes cardiaques détectaient la direction de la déformation de la paroi ventriculaire et s’alignaient dans les myofibers pour fournir le plus grand soutien dans l’ECM car la réponse fibrotique se dépliait intensément pendant la perfusion agoniste(Figure 7). Une autre découverte intéressante était que les fibroblastes semblaient petits et arrondis, par opposition à la forme de fuseau observée dans les modèles de blessures I / R et MI (Figure 6, Vidéo supplémentaire S11).
Figure 1 : Souris et matériaux utilisés pour nettoyer les cœurs des tissus.
(A) Schéma de la stratégie de reproduction des souris Tcf21-MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP utilisées pour le nettoyage des tissus. (B) Chronologie du traitement et de la chirurgie du tamoxifène effectués chez la souris. Souris non blessées sacrifiées le jour 14. (C) 3-D bien imprimé pour maintenir le tissu cardiaque scellé à une boîte de Petri en verre avec de la graisse sous vide. (D) Ajout d’une graisse sous vide à lamelle ronde scellée au sommet du puits imprimé en 3D placé au-dessus du puits inférieur. (E) Cœur dégagé par le tissu dans le puits inférieur de l’appareil de maintien des tissus, rempli de solution d’appariement de l’indice de réfraction (RIMS). Coverslip (comme en D)et top 3-D imprimé bien pièce posée sur le composant inférieur du réservoir imprimé en 3D, contenant du tissu cardiaque dégagé. Le glycérol est ajouté au réservoir supérieur pour la microscopie à immersion de glycérol. Barres d’échelle = 1 cm. Les plans du réservoir se trouvent dans la figure supplémentaire 1. Abréviation : eGFP = protéine fluorescente verte améliorée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Ill. 2 : Aspect visuel des stades de nettoyage des tissus cardiaques.
(A) De gauche à droite : ventricule gauche non défait, ventricule gauche électrophore, ventricule gauche électrophore traité avec réticulation, ventricule gauche électrophore traité avec réticulation et incubé dans RIMS. (B) Cœur entier de souris non nettoyé et effacé. (C) Gauche : ventricule gauche non blessé et non défait. Droite: ventricule gauche non blessé et dégagé. (D)Gauche: MI non nettoyé a blessé ventricule gauche. À droite : L’IM effacé a blessé le ventricule gauche. Barres d’échelle = 0,5 cm. Abréviation : MI = infarctus du myocarde. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 : Efficacité de la nouvelle méthode de nettoyage pour les cœurs dégagés non blessés et opérés par imposture.
Débrégés(A)non blessés (barre d’échelle = 400 μm) et(B)cœurs opérés par imposture (barre d’échelle = 500 μm) avec des fibroblastes Tcf21mcm x Rosa26eGFP (vert) et des zones pseudocolores de fluorescence accrue (violet) montrant la localisation des fibroblastes. Les vidéos d’accompagnement montrant des vidéos sur les fibroblastes peuvent être trouvées dans les vidéos supplémentaires S1–2. Des images fixes montrent le nettoyage de fond et le maintien de la fluorescence endogène des fibroblastes (vert). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Ill. 4 : Atténuation de la perte de fibroblastes dans les cœurs dégagés atteints d’ischémie ou de réperfusion au fil du temps.
Le tissu cardiaque dégagé des points de temps I/R indiqués avec les fibroblastes de Tcf21MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP (vert), les zones pseudocolores de la fluorescence accrue (violet) montrant la localisation des fibroblastes, et les zones de contour orange dépourvues de fibroblastes. Rangée du haut : images fixes de ventricules gauches de cœurs dégagés blessés par I/R. Rangée du bas : images fixes de ventricules gauches de cœurs dégagés blessés par I/R avec la fonction de taches d’Imaris utilisée pour voir des modèles de fibroblaste plus facilement dans tout le ventricule gauche. Des vidéos de cœurs dégagés blessés par I/R montrant non seulement des motifs bruts de fibroblastes, mais aussi des images claires de fibroblastes individuels et de leurs morphologies peuvent être trouvées dans les vidéos supplémentaires S5-8. Barres d’échelle = 500 μm. Abréviation : I/R = ischémie/ré-perfusion. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Ill. 5 : Atténuation de la perte de fibroblastes cardiaques à la suite d’une blessure dans les cœurs dégagés blessés par infarctus du myocarde au fil du temps.
Tissu cardiaque dégagé des coeurs mi avec des fibroblastes de Tcf21MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP (vert), zones pseudocolores de fluorescence accrue (violet) montrant la localisation des fibroblastes, et orange décrivant les zones dépourvues de fibroblastes. Rangée du haut : Images fixes de tissus dégagés ventricules gauches de cœurs blessés par l’IM (vert). Rangée du bas : images fixes de ventricules gauches dégagés de tissus de cœurs mi-blessés (vert) avec la fonction de taches d’Imaris (violet) superposée pour montrer la distribution brute de fibroblaste. Des vidéos de ventricules gauches dégagés de tissus de cœurs blessés par l’IM montrent la disposition grossière des fibroblastes dans le cœur ainsi que le positionnement et la morphologie des fibroblastes individuels dans ce modèle in vivo 3D (Vidéos supplémentaires S7–8). Barres d’échelle : 1,5 jour = 1000 μm, 3 jours = 700 μm. Abréviation : MI = infarctus du myocarde. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Ill. 6 : Tissus dégagés des cœurs traités à l’angiotensine et à la phényléphrine.
(A) Schéma montrant comment les pompes angiotensine/phényléphrine sont utilisées pour administrer des médicaments sur une période de deux semaines suivant l’activation du tamoxifène de Tcf21MCM x eGFP. (B) Image fixe, image fixe + taches Imaris, et vidéo montrant l’organisation et la morphologie des fibroblastes dans les cœurs traités par Ang/PE (Vidéo supplémentaire S11) Barres d’échelle = 500 μm. Abréviations : Ang/PE = angiotensine II/phényléphrine; eGFP = protéine fluorescente verte améliorée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Ill. 7 : Images représentatives du profil de fibroblastes observés dans les cœurs traités à l’angiotensine et à la phényléphrine.
(A, C, et D): Images de l’hélice droitière se tordant le modèle des fibroblastes du point de vue de l’extérieur du ventricule. (B) Image du modelage des fibroblastes du point de vue de l’intérieur du ventricule. Les flèches mettent en évidence des groupes linéaires de fibroblastes qui composent le motif de torsion. Barres d’échelle = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Rendus 2D de l’appareil de réservoir d’imagerie. (A) Rendu 2D de la moitié inférieure du réservoir d’imagerie. Ce réservoir est scellé à la boîte de Pétri avec de la graisse sous vide. Le cœur est placé dans l’ouverture centrale et immergé dans rims. (B) Rendu 2D de la moitié supérieure du réservoir d’imagerie. La lamelle de couverture en verre est collée au fond plat de cette pièce avec de la graisse sous vide. Ceci est doucement placé sur le dessus du réservoir inférieur. Le réservoir supérieur peut ensuite être rempli de glycérol pour l’imagerie. Unités en mm. Abréviations : 2D = bidimensionnel; RIMS: Solution d’appariement d’index de réfraction. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.
Vidéo S1 : Un tissu non blessé a dégagé le cœur. Les fibroblastes cardiaques (vert) dans un ventricule gauche non blessé étaient petits, et beaucoup ont été arrondis avec pas plus de deux projections cellulaires. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo S2: Le tissu factice a dégagé le cœur. Les fibroblastes cardiaques (verts) dans le ventricule gauche d’un cœur de souris feinte-opéré étaient petits et la plupart du temps ronds avec peu de projections, semblables à ce qui a été vu dans les coeurs indemne. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo S3: Vue détaillée des fibroblastes à travers la paroi ventriculaire d’un cœur non blessé. Cette vidéo commence sur le mur ventriculaire intérieur et zoome vers l’extérieur du cœur. Des fibroblastes cardiaques (vert) ont été montrés en détail et ont été observés pour avoir arrondi ou légèrement allongé des corps cellulaires avec pas plus de deux projections cellulaires. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo S4: Vue détaillée de la section de la paroi ventriculaire gauche du cœur non blessé. Cette section d’environ 300 μm de large du cœur de souris non blessé effacé montre en détail l’arrangement 3D des fibroblastes cardiaques (vert) et leurs morphologies. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo S5: Ventricule gauche dégagé de 3 jours I / R. La vue détaillée du ventricule gauche a prouvé qu’après des dommages d’I/R, il y a un secteur de perte cardiaque de fibroblaste. Il était également évident que les fibroblastes (verts) ont développé une forme beaucoup plus allongée dans cet état blessé par rapport aux morphologies plus arrondies vues dans les coeurs indemne et faux. Abréviation : I/R = ischémie/ré-perfusion. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo S6: Ventricule gauche dégagé de 7 jours I / R. La vue détaillée du ventricule gauche prouve que par 7 jours suivant des dommages d’I/R, le secteur manquant en fibroblastes était plus petit que cela vu par le jour 3 suivant des dommages d’I/R. Il y avait plus de fibroblastes (verts) présents, et intéressant, de nouvelles morphologies de cellules étaient présentes. Plus précisément, certains fibroblastes avaient des corps cellulaires arrondis avec des saillies multiples, indiquant potentiellement un rôle nouveau ou développé des fibroblastes dans cet environnement. Abréviation : I/R = ischémie/ré-perfusion. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo S7: Ventricule gauche dégagé de 14 jours I / R. La vue détaillée du ventricule gauche a prouvé qu’il y avait encore un secteur central au mur ventriculaire qui a eu très peu de fibroblastes mais les fibroblastes (verts) sur la périphérie de ce vide ont maintenu la morphologie fortement allongée vue dans les échantillons de poteau-I/R du jour 7. Fait intéressant, les quelques fibroblastes qui étaient présents dans la région blessée avaient une morphologie semblable à celle des cœurs indemnes, petits et arrondis. Abréviation : I/R = ischémie/ré-perfusion. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo S8: Ventricule gauche dégagé de 28 jours I / R. La vue détaillée des fibroblastes cardiaques (vert) le jour 28 suivant des dommages d’I/R a prouvé qu’il y avait un petit secteur dans la région blessée qui manquait des fibroblastes. On l’a également observé qu’il y avait une région de densité élevée de fibroblaste entourant cette région, et que les morphologies dans ce secteur dense étaient fortement allongées. Abréviation : I/R = ischémie/ré-perfusion. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo S9: Ventricule gauche dégagé de 1,5 jour MI. Il y avait très peu de fibroblastes cardiaques (vert) restant dans le ventricule gauche blessé à 1.5 jours après MI, mort cardiaque de fibroblaste dans toute cette région du ventricule. Abréviation : MI = infarctus du myocarde. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo S10: Ventricule gauche dégagé de 3 jours MI. Il y avait un grand secteur exempt de fibroblastes cardiaques pendant 3 jours après MI, mais quelques fibroblastes cardiaques (vert) sont réaapparus dans le ventricule, à la différence des résultats trouvés après 1.5 jours de MI. En outre, les profils de morphologie cardiaque de fibroblaste étaient différents de ceux vus dans les coeurs blessés d’I/R. Ici les fibroblastes étaient allongés mais il y en avait d’autres qui avaient des corps cellulaires arrondis (plus grands que ceux vus dans les coeurs non blessés) et une sous-population de ceux-ci avait beaucoup de projections de cellules. Abréviations : MI = infarctus du myocarde; I/R = ischémie/ré-perfusion. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo S11 : Ventricule gauche dégagé de souris traitées à l’Ang/PE. Il n’y avait aucune perte apparente de fibroblastes cardiaques (vert) après traitement d’Ang/PE. Cependant, les fibroblastes cardiaques étaient la plupart du temps petits et arrondis ou petits et allongés et ont semblé s’aligner avec les modèles contractiles du coeur. Abréviation : Ang/PE = angiotensine II/phényléphrine. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
Cet article présente une méthode raffinée pour le dégagement de tissu qui tient compte de la visualisation des fibroblastes cardiaques in vivo, à la ligne de base et après des dommages, pour caractériser et mieux comprendre des fibroblastes dans le coeur de souris. Ce protocole amélioré répond aux limites des protocoles existants de nettoyage des tissus qui ont tenté d’identifier des types de cellules spécifiques dans le cœur adulte ou néonatal12,13,14,16,17,20. Dans les premières tentatives d’effacement du cœur de souris, la technique passive CLARITY a été utilisée, dans laquelle le cœur a été laissé dans un tampon de dégagement sur un nutator pendant environ 1 semaine pour permettre une distribution passive du tampon dans tout le tissu15,18. Ce processus n’a produit qu’une clairance d’environ 80 μm de profondeur dans le tissu (données non présentées), ce qui est cohérent avec les observations précédentes selon lesquelles plusieurs semaines ont été nécessaires pour éliminer un cœur de souris néonatale âgé de 1 jour13. La CLARTÉ active à l’aide d’un système d’électrophorèse actif a permis un dégagement plus profond à travers toute la paroi ventriculaire, d’environ 700 μm–1 mm de profondeur, sur une période plus courte12,18.
Cependant, l’utilisation de ce protocole clarity actif précédemment publié a conduit à une perte de fluorescence des fibroblastes avec des niveaux élevés d’autofluorescence tissulaire, qui avait été précédemment noté pour se produire dans la CLARTÉ active par Kolesova et al.12. Pour tenir compte de l’entretien de la fluorescence de fibroblaste, le protocole approprié de fixation s’est avéré de la plus haute importance. Trop court d’un processus de fixation a causé la perte de fluorescence pendant l’électrophorèse. Trop long d’un processus de fixation a causé la perte de la fluorescence elle-même. Par conséquent, la fixation pendant la nuit à 4 °C dans 4% PFA s’est avérée optimale. Pour améliorer le problème de fluorescence de fond, un trempage de décoloration (un principe emprunté à la méthode CUBique de nettoyage) a été utilisé pour réduire la liaison de l’hème au sein de la myoglobine, et donc réduire l’autofluorescence causée par ce chromophore18. Le traitement de décoloration a entraîné une élimination plus robuste de la fluorescence de fond, avec le maintien de la fluorescence rapporteure afin que les fibroblastes marqués soient plus prononcés(figure 2A).
Enfin, pour permettre une transparence optique complète, le tissu a été équilibré dans la solution d’appariement de l’indice de réfraction (RIMS)(Figure 2B–D). En assortissant l’index réfractif du tissu avec son environnement, ceci a augmenté la transparence optique du tissu, permettant l’imagerie plus profonde. Le balayage résonnant à grande vitesse a ensuite été utilisé pour imager le tissu car il est plus rapide que le balayage galvanométrique. Étant donné que les cœurs de souris sont de tailles légèrement différentes, les paramètres d’imagerie XY individuels et les corrections d’intensité Z ont été définis. Avec ces paramètres, il a été possible d’imager à travers le cœur non blessé pour visualiser les fibroblastes fluorescents en environ 4 h(figure 3). La qualité de l’image a été améliorée dans le traitement post-imagerie en utilisant le logiciel d’analyse de démixage et de débruitage pour réduire le fond et clarifier la fluorescence présente dans l’image. En plus, le logiciel secondaire d’analyse a été employé pour mettre en évidence la localisation des fibroblastes fluorescents. Cette analyse post-imagerie a été utilisée pour annoter clairement les fibroblastes cardiaques en éliminant le voxel de fond par voxel (Figure 3, Figure 4, Figure 5, Figure 6).
Ce protocole CLARITY optimisé a été appliqué pour effacer optiquement les cœurs blessés et non blessés. Cela permet de mieux comprendre la réaction des fibroblastes cardiaques aux blessures. Ces blessures comprenaient un cours de temps d’IM et d’I/R, ainsi que le dosage d’Ang/PE. Car les dommages ischémiques affaiblissent le tissu cardiaque, il est essentiel qu’un plus grand soin soit pris pendant l’électrophorèse pour maintenir l’intégrité de tissu. En effet pour les blessures I/R et MI, une période d’électrophorèse plus courte (≤1,5 h) est nécessaire32. Les études précédentes n’ont pas considéré les effets des dommages sur le processus de dégagement de tissu. Le protocole nouvellement optimisé présenté ici tient compte des dommages, permettant le dégagement sans autre destruction du tissu.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucune divulgation liée au contenu de ce manuscrit.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le CCHMC Confocal Imaging Core pour son aide et ses conseils dans le développement de ce modèle, ainsi que Matt Batie de Clinical Engineering pour la conception de toutes les pièces imprimées en 3D. Demetria Fischesser a bénéficié d’une subvention de formation des National Institutes of Health (NHLBI, T32 HL125204) et Jeffery D. Molkentin a été soutenu par le Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 braided silk | Ethicon | K871H | |
| 8-0 prolene | Ethicon | 8730H | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | |
| Angiotensin II | Sigma | A9525-50G | |
| Artificial Tear Ointment | Covetrus | 048272 | |
| DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane) | Millipore Sigma | D27802-25G | |
| GLUture topical tissue adhesive | World Precision Instruments | 503763 | |
| Heparin | Sigma | H0777 | |
| Imaris Start Analysis Software | Oxford Instruments | N/A | |
| Micro-osmotic pumps | Alzet | Model 1002 | |
| Nikon Elements Analysis Software | Nikon | N/A | |
| Nikon A1R HD upright microscope | Nikon | N/A | |
| Normal autoclaved chow | Labdiet | 5010 | |
| Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide |
CosmoBio | AXS-1002424 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Phenylephrine Hydrochloride | Sigma | P6126-10G | |
| Photoinitiator | Wako Chemicals | VA-044 | |
| Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] | Jackson Laboratories | Jax Stock No:012429 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium Chloride solution | Hospira, Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Tamoxifen food | Envigo | TD.130860 | |
| Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent | Millipore Sigma | 122262-1L | |
| X-Clarity electrophoretic clearing chamber | Logos Biosystems | C30001 | |
| X-Clarity electrophoretic clearing solution | Logos Biosystems | C13001 | |
| X-Clarity electrophoresis tissue basket | Logos Biosystems | C12001 | |
| X-Clarity electrophoresis tissue basket holder | Logos Biosystems | C12002 |
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