Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

تنقية الأنسجة المستندة إلى الوضوح لمنظمة الخلايا الليفية ثلاثية الأبعاد في قلوب الفئران الصحية والمصابة

Published: May 16, 2021 doi: 10.3791/62023
Automatic Translation
1,2, 3, 2, 2
1Department of Molecular Genetics, Biochemistry, and Microbiology, University of Cincinnati College of Medicine, 2Division of Molecular Cardiovascular Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Confocal Imaging Core, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

Summary

تم تطوير طريقة مكررة لإزالة الأنسجة وتطبيقها على قلب الماوس البالغ. تم تصميم هذه الطريقة لمسح كثيفة، والأنسجة القلبية autofluorescent، مع الحفاظ على مضان الخلايا الليفية المسمى يعزى إلى استراتيجية مراسل الجينية.

Abstract

أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الأكثر انتشارا للوفيات في جميع أنحاء العالم وغالبا ما تتميز بزيادة تليف القلب التي يمكن أن تؤدي إلى زيادة تصلب البطين مع تغيير وظيفة القلب. هذه الزيادة في التليف البطيني القلبي يرجع إلى تنشيط الخلايا الليفية المقيمة ، على الرغم من أن كيفية عمل هذه الخلايا داخل القلب ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) ، عند خط الأساس أو بعد التنشيط ، ليست مفهومة جيدا. لدراسة كيفية مساهمة الخلايا الليفية في أمراض القلب وديناميكياتها في القلب ثلاثي الأبعاد ، تم تطوير طريقة منقحة لإزالة الأنسجة والتصوير المستندة إلى CLARITY تظهر الخلايا الليفية القلبية المسماة بالفلورسنت داخل قلب الماوس بأكمله. تم تسمية الخلايا الليفية المقيمة في الأنسجة وراثيا باستخدام فئران المراسلة الفلورية Rosa26-loxP-eGFP المتقاطعة مع الأرومة الليفية القلبية التي تعبر عن خط طرق Tcf21-MerCreMer. وقد استخدمت هذه التقنية لمراقبة ديناميات توطين الخلايا الليفية في جميع أنحاء البطين الأيسر البالغ بأكمله في الفئران السليمة وفي نماذج الماوس الليفي لأمراض القلب. ومن المثير للاهتمام، في نموذج إصابة واحدة، لوحظت أنماط فريدة من الخلايا الليفية القلبية في قلب الفأر المصاب الذي تبع عصابات من الألياف الملفوفة في اتجاه الانكماش. وفي نماذج الإصابات الإقفارية، حدثت وفاة في الخلايا الليفية، أعقبها إعادة السكان من المنطقة الحدودية المحتشدة. بشكل جماعي ، تسمح تقنية توضيح الأنسجة القلبية المكررة ونظام التصوير الرقمي بالتصور ثلاثي الأبعاد للخلايا الليفية القلبية في القلب دون قيود فشل اختراق الأجسام المضادة أو القضايا السابقة المحيطة بالفلورسينس المفقود بسبب معالجة الأنسجة.

Introduction

على الرغم من أن خلايا القلب تشكل أكبر جزء حجم في القلب ، إلا أن الخلايا الليفية القلبية أكثر وفرة وتشارك بشكل حاسم في تنظيم السمات الهيكلية والتجزية الأساسية لهذا الجهاز. الخلايا الليفية القلبية هي متحركة للغاية، واستجابة ميكانيكيا، وتتراوح phenotypically اعتمادا على مدى تفعيلها. الخلايا الليفية القلبية ضرورية للحفاظ على المستويات الطبيعية للمصفوفة خارج الخلية (ECM)، وإنتاج ECM قليل جدا أو أكثر من اللازم من قبل هذه الخلايا يمكن أن يؤدي إلى المرض1،2،3. ونظرا لأهميتها في المرض ، أصبحت الخلايا الليفية القلبية موضوعا متزايد الأهمية للتحقيق نحو تحديد استراتيجيات العلاج الجديدة ، خاصة في محاولة للحد من التليف المفرط4و5و6و7. عند الإصابة ، تنشط الخلايا الليفية وتفرق إلى نوع خلية اصطناعية أكثر تعرف باسم الورم العضلي ، والتي يمكن أن تكون منتشرة وتفرز ECM وفيرة ، وكذلك نشاط انقباش يساعد على إعادة تشكيل البطينين.

في حين تم تقييم الخلايا الليفية القلبية على نطاق واسع لخصائصها في الثقافات ثنائية الأبعاد6و8و9و10، إلا أنه أقل بكثير من فهم خصائصها وديناميكياتها في القلب الحي ثلاثي الأبعاد ، إما عند خط الأساس أو مع تحفيز المرض. هنا ، وقد وصفت طريقة المكرر لمسح الأنسجة قلب الماوس الكبار مع الحفاظ على مضان الخلايا الليفية وصفت مع Rosa26 - loxP - eGFP x Tcf21 - MerCreMer نظام المراسل الجيني. داخل القلب، Tcf21 هو علامة محددة نسبيا من الخلايا الليفية هادئة4. بعد إعطاء تاموكسيفين لتنشيط بروتين MerCreMer غير القابل للانزدواج ، فإن جميع الخلايا الليفية هادئة ستعبر بشكل دائم عن البروتين الفلوري الأخضر المعزز (eGFP) من مكان Rosa26 ، والذي يسمح بتتبعها في الجسم الحي.

توجد العديد من بروتوكولات تطهير الأنسجة الراسخة ، وبعضها تم تطبيقه على القلب11،12،13،14،15،16،17. ومع ذلك، تم العثور على العديد من الكواشف المستخدمة في بروتوكولات مختلفة لإزالة الأنسجة لإرواء إشارات الفلورة الذاتية18. بالإضافة إلى ذلك ، من الصعب مسح قلب البالغين بسبب البروتينات الوفيرة التي تحتوي على مجموعة الهيم التي تولد autofluorescence19. لذلك ، كان الهدف من هذا البروتوكول هو الحفاظ على مضان علامة الورم الليفي مع تثبيط متزامن للفلورة الذاتية للهيم في قلب البالغين المصابين للحصول على التصور الأمثل ثلاثي الأبعاد في الجسم الحي12و13و14و16و17و20.

الدراسات السابقة في محاولة لفحص الورم الليفي القلب في الجسم الحي تستخدم الأجسام المضادة التي غرست لتسمية هذه الخلايا، على الرغم من أن هذه الدراسات كانت محدودة من قبل اختراق الأجسام المضادة وهيكل الأوعية الدمويةالقلبية 14،16،17،20. على الرغم من أن Salamon وآخرون قد أظهرت تطهير الأنسجة مع الحفاظ على مضان الخلايا العصبية الموضعية في قلب الوليد، وNehrhoff وآخرون أظهرت الحفاظ على الفلورية بمناسبة الخلايا النخاعية، والحفاظ على الفلورية الذاتية من خلال الجدار البطيني بأكمله لم يثبت بعد، بما في ذلك تصور الخلايا الليفية القلب الكبار في خط الأساس أو بعدالإصابة 13،20. هذا البروتوكول تطهير الأنسجة يصقل خليط من البروتوكولات السابقة على أساس طريقة وضوح (واضح تبادل الدهون الأكريلاميد الهجين التصوير جامدة / المناعة / في الموقع التهجين الأنسجة المتوافقة مع الهيدروجيل) وPEGASOS (البولي ايثيلين غليكول (PEG) المرتبطة نظام المذيبات). سمح هذا البروتوكول المكرر بفحص أقوى للخلايا الليفية القلبية في قلب الماوس عند خط الأساس وكيفية استجابتها لأنواع مختلفة من الإصابات. البروتوكول واضح وقابل للاستنساخ وسيساعد على توصيف سلوك الخلايا الليفية القلبية في الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب التي شملت الفئران من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في المركز الطبي لمستشفى سينسيناتي للأطفال. المؤسسة هي أيضا AAALAC (الجمعية الأمريكية لاعتماد رعاية الحيوان المختبرية) معتمدة. تم قتل الفئران عن طريق خلع عنق الرحم ، وأعطيت الفئران التي تخضع لإجراءات جراحية للبقاء على قيد الحياة تخفيف الألم (انظر أدناه). وتستند جميع الأساليب المستخدمة في إدارة الألم والقتل الرحيم إلى توصيات الفريق المعني بالقتل الرحيم التابع للجمعية الطبية البيطرية الأمريكية. تم إيواء جميع الفئران في وحدات الفراش كوب الذرة مع الماء والغذاء المتاحة في جميع الأوقات. تم إيواء الفئران 4 إلى قفص مع نفس الجنس. لأغراض الجراحة أو إزالة الأنسجة غير المصابة، تم استخدام أعداد متساوية من الفئران والإناث البالغة من العمر 6-8 أسابيع.

ملاحظة: تم الحفاظ على الحالات الجراحية العقيمة في جميع العمليات الجراحية. تحول الجراح إلى فرك نظيف وثوب معقم ثم قام بارتداء أغلفة الأحذية وشبكة شعر. ثم قام الجراح بتنظيف أيديهم بالكلورهيكسيدين وارتداء قفازات جراحية معقمة. وساعد الجراح من قبل فني الذي مخدر, حلق, وتنظيف موقع شق 3 مرات لكل منهما, بالتناوب بين 2٪ جلوكونات الكلوروهيكسيدين و 70٪ ايزوبروبانول. ثم تم إحضار الفئران إلى الجراح، وأجريت عملية جراحية. بين الحيوانات ، تم تعقيم الأدوات في معقم حبة.

1. إعادة تركيب كري

  1. عبر Rosa26-loxP-eGFP الفئران (Rosa26-nLacZ [FVB. CG-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]) مع فئران Tcf21-MerCreMer (الشكل 1A)6،21.
  2. عندما يصل نسل هذا الصليب إلى 6 أسابيع من العمر ، يمكنك إعطاء حقنة داخل الصفاق من 75 ملغم / كجم من تاموكسيفين المذاب في زيت الذرة. 22 إدارة هذا تاموكسيفين مرتين، 48 ساعة عن بعضها البعض (الشكل 1B).
  3. بعد حقن تاموكسيفين، وضع الفئران على نظام غذائي من الغذاء تاموكسيفين (~ 0.4 غرام / كجم تاموكسيفين سيترات) لمدة أسبوع واحد. بعد أسبوع واحد من الطعام تاموكسيفين، والعودة الفئران إلى نظام غذائي تشاو autoclaved العادي لمدة أسبوع واحد قبل إجراء عملية جراحية(الشكل 1B). تعيين عدد مناسب من الفئران (3 لكل حالة جراحية) لتكون ضوابط غير مصاب. التضحية هذه الفئران، والمضي قدما في عملية المقاصة المحددة أدناه بعد أسبوع واحد من النظام الغذائي تشاو العادي.
  4. بعد نظام تاموكسيفين وإعادة التركيب، قم بإجراء عملية جراحية.

2. نماذج جراحية

  1. الإقفارية/التروية (I/R)23،24
    1. تخدير الفئران مع 1.5٪ غاز isoflurane في هواء الغرفة في مربع التهوية. حلق صدورهم وأعناقهم مع المقصات الكهربائية، ومن ثم فرك المناطق حلق مع مسحة 2٪ كلورهيكسيدين جلوكونات غارقة.
    2. استخدام مرهم المسيل للدموع الاصطناعية لمنع الجفاف أثناء الجراحة عن طريق وضع مرهم على عيون الفئران مخدرة.
    3. إجراء قطع منتصف الرقبة باستخدام مقص الجراحية للسماح التصور من القصبة الهوائية. Intubate مع قسطرة 20 G عن طريق وضع أنبوب التنبيب في القصبة الهوائية وتصور القسطرة القصبي من خلال شق منتصف الرقبة. ضع الفئران على جهاز التنفس الصناعي أثناء تخديرها بغاز الأيزوفلوران (1.5٪) في هواء الغرفة.
    4. إجراء شق تحت الطرف الأمامي الأيسر مع مقص الجراحية، وقطع العضلات الوربي بين الأضلاع 3 و 4. انشر الأضلاع المفتوحة باستخدام الروافد.
    5. ضع إسفنجة صغيرة غارقة في محلول ملحي بين الرئة والقلب لمنع تلف الرئة.
    6. باستخدام إبرة fishhook (6.5 ملم، 3/8 ج)، ربط الشريان التاجي الأيسر مع عقدة زلة قابلة للإفراج باستخدام 8-0 البرولين.
    7. إزالة الإسفنج باستخدام ملقط.
    8. خياطة العضلات الوربي مغلقة باستخدام الحرير مضفر 4-0 وخياطة مستمرة في حين الخارج أيضا نهاية 8-0 عقدة زلة البرولين.
    9. أغلق شقوق الجلد باستخدام لاصق الأنسجة الموضعية مع نهاية عقدة الانزلاق المغلقة البارزة.
    10. بعد ساعة واحدة من الانسداد، اسحب الطرف الخارجي من عقدة الانزلاق لإطلاق انسداد الشريان التاجي داخليا، وتخفيف نقص التروية والتسبب في إعادة التروية.
    11. إدارة 0.02 مل من 1 ملغ / مل الإفراج الموسعة البوبرينورفين عن طريق الحقن تحت الجلد (72 ه الإفراج) كمسكن للألم, ووضع الفئران في غرفة حضانة المؤوكسجين في 37 درجة مئوية, منفصلة عن الحيوانات الأخرى. مراقبة الفئران على الأقل كل 15 دقيقة حتى أنها قد تعافى من التخدير وقادرة على الحفاظ على وضع القص أو الجلوس. أعد الفئران إلى مسكنها العادي.
    12. تقييم الحيوانات للألم والضيق لمدة 48 ساعة بعد الجراحة، ورصد موقع شق يوميا حتى تلتئم تماما.
    13. مراقبة الفئران للترطيب والتغذية والرفاه العام بعد الجراحة حتى التضحية.
  2. احتشاء عضلة القلب (MI)25،26،27
    1. تنفيذ الخطوات 2.1.1-2.1.7.
    2. استخدام خياطة مستمرة لإغلاق العضلات الوربية باستخدام الحرير مضفر 4-0.
    3. أغلق شق الجلد باستخدام لاصق الأنسجة الموضعية.
    4. تنفيذ الخطوات 2.1.11-2.1.13.
  3. ضخ مضخة أنجيوتنسين الثاني/الفينيليفرين التناضحي الدقيق
    1. إعداد حل عمل 10 ميكروغرام /ميكرولتر من أنجيوتنسين الثاني و 500 ميكروغرام / ميكرولتر حل العمل من الفينيليفرين في ظل ظروف معقمة (أي، في غطاء محرك السيارة تدفق صفح) عن طريق إضافة 1 ملغ من أنجيوتنسين الثاني إلى 100 ميكرولتر من الفوسفات المعقم العازلة المالحة (PBS) و 250 ملغ من هيدروكلوريد الفينيليفرين إلى 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
    2. حساب تخفيف كل حل العمل والحجم النهائي للاستغناء عن مضخة التناضح الدقيق على أساس وزن الماوس.
      ملاحظة: على سبيل المثال، يتطلب فأر 20 جراما 20 جراما × 14 يوما × 1.5 ميكروغرام/يوم = 420 ميكروغرام أنجيوتنسين، أو 42 ميكرولتر من محلول العمل، بالإضافة إلى 20 جراما × 14 يوما × 50 ميكروغرام/يوم = 14000 ميكروجرام هيدروكلوريد فينيلفرين، أو 28 ميكرولتر من حل العمل.
    3. لوزن كل فأر، تمييع المخزون العامل من المخدرات في برنامج تلفزيوني عقيم وملء مضخات التناضح الدقيق (0.25 ميكرولتر / ساعة، 14 يوما، ما يقرب من 100 ميكرولتر) باستخدام إبرة 27 G وحقنة 1 مل.
      ملاحظة: هذا سوف تولد معدل تدفق 1.5 ميكروغرام ∙ ز-1∙ يوم-1 من أنجيوتنسين الثاني و 50 ميكروغرام ∙ ز-1∙ يوم-1 من هيدروكلوريد الفينيليفرين وضعت مرة واحدة في الفئران.
    4. تخدير الفئران مع استنشاق isoflurane 1.5٪ (للتأثير) في غرفة التهوية التي تحتوي على هواء الغرفة.
    5. ضع الفئران المخدرة على طاولة جراحية معقمة في وضع الأوبين، وحافظ على التخدير مع استنشاق غاز الأيزوفلوران (1.5٪) من خلال مخروط الأنف.
    6. استخدام مرهم المسيل للدموع الاصطناعية على عيون الحيوان لمنع جفاف أثناء الجراحة.
    7. حلق الفراء فوق منطقة الزرع مع مقصات الشعر الكهربائية، وتعقيم المنطقة ليتم قطع باستخدام الإيثانول ومسحة معقمة. إجراء شق صغير (حوالي 1 سم) مع مقص الجراحية في طبقة البشرة من جلد الماوس على الجانب الجانبي الأيمن من الظهر، تحت شفرة الكتف. استخدم الجوانب المملة لزوج من المقص الجراحي لتمديد الجلد برفق في منطقة الزرع وحولها لإدخال الضخة الصغيرة.
    8. ضع المضخة التناضحية الدقيقة داخل الشق ، وناور جسديا إلى يسار الخط الوسطي الظهري للفأر عن طريق تدليك المضخة يدويا تحت الجلد.
    9. أغلق الشق عن طريق خياطة مستمرة باستخدام الحرير 4-0 مع إبرة نقطة تفتق.
    10. بعد زرع المضخة، قم بإعطاء البوبرينورفين بطيئ الإطلاق بجرعة 0.1 ملغم/كجم من وزن الجسم عن طريق الحقن تحت الجلد للتسكين (إطلاق بطيء 72 ساعة). ضع الفئران في غرفة حضانة مؤوكسجينة عند 37 درجة مئوية ، منفصلة عن الحيوانات الأخرى. مراقبة الفئران على الأقل كل 15 دقيقة حتى يتعافى من التخدير ويمكن الحفاظ على وضع القص أو الجلوس.
    11. عند التعافي من التخدير في غرفة الاحترار 37 درجة مئوية ، ضع الفئران مرة أخرى في وحداتها السكنية القياسية.
    12. مراقبة الفئران للألم والضيق لمدة 48 ساعة بعد الجراحة، ورصد موقع شق يوميا حتى تلتئم تماما.
    13. مراقبة الفئران للترطيب والتغذية والرفاه العام بعد الجراحة حتى التضحية.

3. مسح قلوب الماوس الكبار باستخدام بروتوكول CLARITY النشط المعدلة

  1. إعداد منطقة جراحية نظيفة عن طريق تعقيم سطح الجراحة وجميع الأدوات الجراحية مع الإيثانول 70٪. إعداد حل من البرد 1x PBS و 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) في برنامج تلفزيوني (100 مل لكل منهما). ارتداء قفازات، معطف المختبر، قناع الوجه، وحماية العين.
  2. إعداد العازلة الهيبارين عن طريق تخفيف 10 وحدات من الهيبارين في 0.9٪ ث / v محلول كلوريد الصوديوم. حقن كل فأر intraperitoneally مع 60 ميكرولتر من الهيبارين-NaCl باستخدام حقنة 1 مل وإبرة 27 G.
  3. بعد خمس دقائق من حقن محلول الهيبارين-NaCl ، قم بالتخدير للفئران باستخدام استنشاق الأيزوفلوران بنسبة 1.5٪ (للتأثير) في غرفة التهوية التي تحتوي على هواء الغرفة.
  4. قتل الفئران عن طريق خلع عنق الرحم ، حيث يتم عقد الجزء الخلفي من الرأس مع شقة ، نهاية مغلقة من ملقط ، في حين يتم خلع العمود الفقري عن طريق سحب الذيل.
  5. تنظيف سطح البطن من الماوس مع الإيثانول 70٪ على مسحة القطن. إجراء شق عرضي 3 سم حوالي 3 سم تحت عملية xiphoid باستخدام مقص الجراحية.
  6. فصل الجلد من نسيج جدار البطن الكامنة عن طريق إزالة البطن حتى عملية xiphoid (عقد الجلد الأقرب إلى الذيل وسحب الجلد الأقرب إلى الرأس نحو القفص الصدري). إجراء شق عرضي 2 سم في نسيج جدار البطن تحت الجلد 3 سم تحت عملية xiphoid باستخدام مقص الجراحية. جعل قطع عمودي من هذا الشق العرضي، حتى خط الوسط وعبر القفص الصدري. ثبت القفص الصدري مرة أخرى، وكشف القلب.
  7. استخدام إبرة 27 G ومحاقنة 10 مل لحقن برنامج تلفزيوني الباردة في كافا فينا متفوقة وorta (أي تلاعب الموضعية للقلب ينبغي أن يتم بعناية مع ملقط حاد لتجنب ثقب) لمسح الدم من القلب.
    ملاحظة: يمكن ملاحظة التشوه الكافي عن طريق ارتعاش الذيل وتلون الرئتين.
  8. استخدام إبرة 27 G ومحقنة 10 مل لحقن الباردة 4٪ PFA في كافا فينا متفوقة وorta لبدء عملية التثبيت.
  9. استأصل القلوب. يجب فصل الأذين والبطين الأيمن والحاجز والبطين الأيسر باستخدام مشرط مستقيم النصل. ضع هذا النسيج في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل مملوء ببرودة PFA بنسبة 4٪، وضع على جهاز نوتاتور عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  10. غسل القلب 3 مرات لمدة 1 ساعة مع كل برنامج تلفزيوني 1x الباردة لإزالة PFA الزائدة.
  11. إعداد هيدروجيل (يطلق عليه A4P0 لتكوين الاكريلاميد النسبي / البولياكريلاميد) عن طريق خلط المواد الكيميائية التالية في أنبوب الطرد المركزي 15 مل: 10٪ من 40٪ أكريلاميد، 10٪ 1x PBS، 80٪ ماء مقطر.
  12. إضافة الحل 0.25٪ من البروبان الضوئي (2،2-Azobis [2-(2-imidazolin-2yl)البروبان)dihydrochloride) إلى محلول الهيدروجيل فقط قبل غمر القلب في الهيدروجيل.
  13. ضع القلب في أنبوب مخروطي يحتوي على الهيدروجيل. التفاف أنبوب مخروطي في احباط، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية دون اضطراب جسدي.
  14. بعد حوالي 14 ساعة عند 4 درجات مئوية، حرك الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على القلب إلى حمام حبة 37 درجة مئوية.
  15. بعد 2.5 ساعة في حمام حبة، وإزالة القلب من الهيدروجيل بعناية مع ملقط.
  16. غسل القلوب 3 مرات لمدة 1 ساعة لكل منهما في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على برنامج تلفزيوني 1x في 37 درجة مئوية على نوتاتور.
  17. ضع القلوب في سلة آلة الكهربائي النشطة باستخدام ملقط، ووضع الغطاء على السلة. تأكد من أن الغطاء في مكانه بشكل آمن.
  18. ملء خزان غرفة الكهربية النشطة مع حل المقاصة الكهربائية عن طريق صب الحل في الغرفة.
  19. بمجرد أن تمتلئ الغرفة بحل التطهير الكهربائي ، يمكن غمر السلة التي تحتوي على القلب. ضع الغطاء على آلة الكهرومورفوريس بشكل آمن.
  20. تشغيل آلة الكهربائي في 1.5 A، 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة.
  21. بعد 1.5 ساعة من الكهروفورسيس، تحقق من القلوب بصريا للتأكد من عدم وجود أنسجة مبهمة. إذا كانت مناطق الأنسجة لا تزال مبهمة، إعادة غمر القلب في محلول الكهربائي في غرفة كهربائية، والاستمرار في الكهروفورسيس لمدة 0.5 ساعة في وقت واحد.
    ملاحظة: يجب إيقاف الإلكتروفورسيس عند ظهور العلامات الأولى لتلف الأنسجة (مثل تآكل الأنسجة).
  22. غسل القلوب في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على برنامج تلفزيوني 1x لمدة 1 ساعة، 3 مرات لكل منهما، في 37 درجة مئوية على نوتاتور.
  23. غمر قلوب في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على N,N,N′,N′-Tetrakis(2-هيدروكسي بروبيل)إيثيلينديامين – عامل إزالة اللون الذي يقلل من autofluorescence هيمي.
    ملاحظة: يجب تغيير هذا الحل كل 24 ساعة حتى القلوب واضحة تماما (حوالي 2 أيام).
  24. غسل القلوب في أنبوب مخروطي 15 مل مع 1x PBS 3 مرات لمدة 1 ساعة لكل منهما لإزالة عامل إزالة اللون الزائد.
  25. إعداد معامل الانكسار مطابقة الحل (RIMS) من خلال الجمع بين 30 مل من 0.02 متر الفوسفات العازلة، 40 غرام من 5-(N-2، 3-dihydroxypropylacetamido)-2، 4، 6-ثلاثي-iodo-N،N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) ايزيفثالاميد مع اثارة (يجب أن تذوب تماما– وهذا يمكن أن يستغرق ما يصل الى ساعة), 5 ملغ من أزيد الصوديوم, 50 ميكرولتر من Tween20, و 1 غرام من 1,4-diazabicyclo[2.2.2]أوكتان, وضبط درجة الحموضة إلى 7.5.
  26. توازن القلوب في RIMS لمدة 48 ساعة قبل التصوير.

4. مسح الصور قلوب باستخدام المجهر واحد تستقيم كونفوجكال فوتون

ملاحظة: يتكون جهاز التصوير من النصف السفلي من طبق بيتري زجاجي طوله 10 سم، وخزان قاع مطبوع ثلاثي الأبعاد، وزلزلة زجاجية مستديرة، وخزان علوي مطبوع ثلاثي الأبعاد(الشكل 1C-E). تم صنع مواد مطبوعة ثلاثية الأبعاد داخليا من قبل قسم الهندسة السريرية في مستشفى سينسيناتي للأطفال.

  1. استخدام الشحوم فراغ لختم خزان القاع المطبوعة 3D في طبق بيتري الزجاج عن طريق وضع طبقة رقيقة من الشحوم فراغ على الجزء السفلي من قطعة مطبوعة 3D(الشكل 1C).
    ملاحظة: يجب أن يكون الخزان بنفس ارتفاع العينة التي يتم تصويرها (أي، لا ينبغي ضغط العينة بواسطة غطاء الزجاج الموضوع فوقه، كما يجب ألا تكون العينة قادرة على الطفو والتحرك داخل الخزان).
  2. ملء الخزان مع RIMS، وإزالة جميع فقاعات مع طرف pipet. ضع القلب في RIMS بعناية مع الجدار البطيني الأيسر المواجه لأعلى ، مما يضمن عدم إدخال أي فقاعات في الحل.
  3. الالتزام غطاء الزجاج إلى السطح السفلي من قطعة خزان 3D المطبوعة أعلى (الشكل التكميلي 1A) باستخدام الشحوم فراغ (مرة أخرى عن طريق وضع طبقة رقيقة من الشحوم فراغ على قطعة مطبوعة 3D، ووضعها على زلة الغطاء) (الشكل 1D).
  4. وضع غطاء الزجاج والخزان العلوي، coverlip الجانب إلى أسفل، على الخزان السفلي (الشكل التكميلي 1B)،دون إدخال فقاعات. الالتصاق بين RIMS وغطاء زلة سيوفر ختم بين أعلى وأسفل قطعة الخزان(الشكل 1E).
  5. ملء الخزان العلوي مع الجلسرين للاستخدام مع هدف الغمر 10x الجلسرين.
  6. استخدام مجهر فوتون واحد مجهزة رئيس مسح confocal متعددةphoton لصورة قلوب مسحها.
  7. خفض مرحلة المجهر فوتون واحد، ووضع طبق بيتري التي تحتوي على عينة في وسط المرحلة. رفع المرحلة وخفض هدف الغمر 10x الجلسرين في الجلسرين في الخزان العلوي للجهاز عينة. تأكد من أن العينة في بؤرة التركيز من خلال النظر إلى حافة العينة باستخدام العدسة.
  8. قم بالتبديل من عرض العدسة إلى عرض الكاميرا على الكمبيوتر من خلال النقر على الزر المباشر.
    1. تعيين المعلمات X و Y عن طريق تحديد موقع أول أوسع جزء من عينة الأنسجة، والتي ينبغي أن تكون في الجزء السفلي من طبق بيتري.
    2. انقر على اكتساب ND والعرف متعدد النقاط. إنشاء نقاط متعددة عن طريق العثور أولا على منتصف عينة الأنسجة باستخدام عصا التحكم لاكتساح اليسار إلى اليمين ومن أعلى إلى أسفل.
    3. ثم، استنادا إلى حجم الأنسجة، حدد حجم التبليط اللازم (عادة 6 × 5 لقلب فأر عمره 6-8 أسابيع). القيام بذلك عن طريق تشغيل اختبار التصوير عن طريق التقاط فقط X و Y المعلمات (إلغاء تحديد z تحت علامة التبويب اكتساب ND)للتحقق ما إذا كان تم التقاط طول وعرض الأنسجة بأكملها.
  9. لتعيين المعلمات z، افتح التنقل XYZ، وانقر على الرموز صعودا وهبوطا حتى العثور على أعلى وأسفل العينة.
    1. افتح لوحة تصحيح كثافة Z واضبط الفلورسينس في أعلى الأنسجة ووسطها وأسفلها لتصحيح كثافة الأنسجة عن طريق زيادة أو تقليل قوة الليزر عند كل نقطة z. تعيين هذه بالنقر على السهم مجموعة على يمين لوحة تصحيح كثافة Z.
    2. تعيين حجم الخطوة Z في لوحة اكتساب ND إلى 5 ميكرومتر.
  10. بعد تحديد المعلمات X و Y و Z للقلب وتعيين تصحيح شدة z ، استخدم المجهر المستقيم الآلي مع هدف غمر 10x glycerol مع ماسح ضوئي رنانة وأنابيب الفوسفيدية الضوئية (GaAsP PMTs) لتصوير القلوب المطهرة. تأكد من أن علامات التبويب XY و Z يتم فحصها ضمن اكتساب ND، واضغط على تصحيح Run Z.
  11. غرزة، unmix، وdenoise الصور الناتجة عن طريق فتح صورة متعددة النقاط في برنامج المعالجة والنقر على زر غرزة. تحت الصورة، انقر على التميي ، 2 قناة، ثم ابحث. وتحت الصورة، انقر على denoise.ai، ثم انقر على قناة الفلورسنت المفضلة (أي GFP).
    ملاحظة: ينتج عن هذه العملية صورة ثلاثية الأبعاد للخلايا الليفية الإيجابية ل GFP في البطين الأيسر بالكامل.
  12. استخدام برامج التحليل الثانوي لتحديد المزيد من الأنماط والاتجاهات في تشتت الخلايا الليفية القلبية. استخدم الدالة البقع عن طريق تشغيل برنامج معالج البقع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الخلايا الليفية القلبية ضرورية لوظيفة خط الأساس للقلب وكذلك للاستجابة لإصابة القلب. وقد أجريت محاولات سابقة لفهم ترتيب ومورفولوجيا هذه الخلايا إلى حد كبير في إعدادات 2-D. ومع ذلك ، تم نشر تقنية تطهير الأنسجة القلبية المكررة(الشكل 2)وتقنية التصوير ثلاثي الأبعاد ، والتي تسمح بالتصور المتقدم والأكثر تفصيلا للخلايا الليفية القلبية. مع هذه التقنية التصوير، تم العثور على الخلايا الليفية لتكون معبأة بكثافة ولها مورفولوجيا مغزل في قلوب غير مصاب (الشكل 3، أشرطة الفيديو التكميلية S1-4).

بعد أن تم إنجاز تطهير الأنسجة البطينية اليسرى في قلب غير مصاب ، تم تطبيق البروتوكول على العديد من نماذج الإصابات لدراسة كيفية أداء بروتوكول المقاصة هذا عند دراسة أنسجة القلب المصابة. تعرضت الفئران لإصابة I/R عن طريق الإغلاق المؤقت للشريان التاجي الأيسر (LCA) لمدة ساعة واحدة تليها إعادة التروية لمدة 3 أو 7 أو 14 أو 28 يوما. أظهرت هذه التجارب أن هناك فقدان الخلايا الليفية القلبية في المنطقة الإقفارية مباشرة بعد إصابة I / R ، ولكن بحلول اليوم 7 واليوم 14 ، هاجرت الخلايا الليفية أو انتشرت لإعادة إسكان هذه المنطقة من القلب المصاب. بحلول اليوم 28 ، كان عدد الخلايا الليفية القلبية المحيطة بالمناطق المصابة في القلب في أكبر كثافة لها (الشكل 4، مقاطع الفيديو التكميلية S5-8).

إصابة MI هو نموذج الجراحية الناتجة عن ربط LCA دائم (لا إعادة التروية). تم استئصال القلوب التي خضعت لجراحة MI في 1.5 و 3 أيام بعد الجراحة للتثبيت والمقاصة والتحليل. كان هناك عدد قليل جدا من الخلايا الليفية المتبقية في البطين الأيسر المصاب في 1.5 أيام بعد الجراحة (الشكل 5A, فيديو تكميلي S9). ومع ذلك، بحلول اليوم الثالث، توسعت الخلايا الليفية وكانت موجودة في معظم البطين الأيسر باستثناء منطقة صغيرة واحدة، ويفترض أنها هاجرت و/أو انتشرت من السكان في المنطقة الحدودية(الشكل 5B، فيديو إضافي S10). مرة أخرى ، تم استخدام برامج التحليل لتصور أفضل توطين الخلايا الليفية ، وتم تحديد مناطق فقدان الخلايا الليفية القلبية باللون البرتقالي(الشكل 5). أظهر هذا التحليل بشكل أفضل الخسارة الأولية للخلايا في اليوم 1.5 بعد MI وكيف انتشرت الخلايا الليفية أو هاجرت إلى تلك المنطقة المتضررة بحلول اليوم الثالث لإصلاح المنطقة ظاهريا وتشكيل ندبة.

بالإضافة إلى الإصابة الإقفارية ، فإن رد فعل الخلايا الليفية القلبية على ارتفاع ضغط الدم ليس مفهوما جيدا. لاكتشاف استجابة هذه الخلايا لارتفاع ضغط الدم، تم إعطاء أنجيوتنسين الثاني وفينيليفرين. Angiotensin الثاني وفينيليفرين (Ang / PE) هي الأدوية التي تسبب ارتفاع ضغط الدم المستمر وتنشيط الخلايا الليفية القلبية مع مناطق التليف الخلالي ، وأكد من خلال تطبيق هذا البروتوكول تطهير الأنسجة إلى قلوب ang / PE المعالجة (الشكل 6A)5،28. على النقيض من الجراحة الإقفارية ، فإن ضخ Ang / PE على مدى عدة أسابيع لا يؤدي إلى فقدان أنسجة القلب وترقق الجدار. بدلا من ذلك، لوحظت نتيجة مختلفة في سلوك الخلايا الليفية بعد هذه الإصابة.

كما مضخات القلب، والتقلبات عضلة القلب، وبعد نمط الحلزون اليد اليمنى29،30،31. في نموذج Ang/PE للإصابة ، انحازت الخلايا الليفية على طول محور نمط انكماش الحلزون الأيمن هذا باستخدام بروتوكول إزالة الأنسجة المكررة(الشكل 6B). الفرضية لتفسير هذا السلوك هو أن الخلايا الليفية القلبية كانت تستشعر اتجاه إجهاد جدار البطين وتصطف داخل الألياف العضلية لتوفير أكبر دعم داخل ECM حيث تكشفت الاستجابة الليفية بشكل حاد أثناء التسريب الناهض(الشكل 7). آخر للاهتمام هو أن النتائج التي ظهرت الخلايا الليفية الصغيرة وتقريبها ، على عكس شكل المغزل ينظر في نماذج من I / R و MI الاصابة (الشكل 6، التكميلية فيديو S11).

Figure 1
الشكل 1: الفئران والمواد المستخدمة لتطهير القلوب الأنسجة.
(أ) التخطيطي لاستراتيجية تربية ل Tcf21-MerCreMer (mcm) × Rosa26eGFP الفئران المستخدمة لإزالة الأنسجة. (ب) الجدول الزمني للعلاج تاموكسيفين والجراحة التي أجريت في الفئران. الفئران غير المصابة ضحت في اليوم 14. (ج) 3-D المطبوعة جيدا لعقد أنسجة القلب مختومة إلى طبق بيتري الزجاج مع الشحوم فراغ. (D) إضافة الشحوم فراغ غطاء مستدير مختومة إلى أعلى مجموعة جيدة المطبوعة 3-D على رأس البئر السفلي. (ه)مسح الأنسجة القلب في البئر السفلي من جهاز عقد الأنسجة، مليئة معامل الانكسار مطابقة الحل (RIMS). Coverlip (كما هو الحال في D)وأعلى 3-D قطعة البئر المطبوعة وضعت على الجزء السفلي 3-D مكون الخزان المطبوعة, تحتوي على أنسجة القلب مسح. يضاف الجلسرين إلى الخزان العلوي للفحص المجهري للغمر بالجلسرين. أشرطة المقياس = 1 سم. يمكن العثور على مخططات الخزان في الشكل التكميلي 1. اختصار: eGFP = البروتين الفلوري الأخضر المحسن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: المظهر البصري لمراحل إزالة الأنسجة القلبية.
(أ) من اليسار إلى اليمين: البطين الأيسر غير واضح, البطين الأيسر الكهربائي, البطين الأيسر الكهربائي تعامل مع crosslinker, البطين الأيسر الكهربائي تعامل مع crosslinker, البطين الأيسر الكهربائي تعامل مع crosslinker واحتضانها في RIMS. (ب) مسح ومسح قلب الماوس كله. (ج) اليسار: البطين الأيسر غير المصاب وغير الواضح. اليمين: البطين الأيسر غير المصاب والمخلى. (D) اليسار: غير واضح MI أصيب البطين الأيسر. اليمين: مسح MI أصيب البطين الأيسر. أشرطة المقياس = 0.5 سم. اختصار: MI = احتشاء عضلة القلب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: فعالية طريقة المقاصة الجديدة للقلوب غير المصابة والخدعية التي تم مسحها.
مسح (A) غير مصاب (شريط مقياس = 400 ميكرومتر) و (B) قلوب تعمل بالعار (شريط مقياس = 500 ميكرومتر) مع Tcf21mcm x Rosa26eGFP الخلايا الليفية (الأخضر) والمناطق pseudocolored من زيادة الفلورسينس (الأرجواني) تظهر توطين الخلايا الليفية. يمكن العثور على مقاطع الفيديو المصاحبة التي تعرض مقاطع فيديو الخلايا الليفية في مقاطع الفيديو التكميلية S1-2. تظهر الصور الثابتة مسح الخلفية والحفاظ على الفلورة الذاتية الليفية (الخضراء). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تخفيف فقدان الخلايا الليفية في نقص التروية / إعادة التروية المصابين مسح القلوب مع مرور الوقت.
مسح الأنسجة القلبية من نقاط الوقت I / R المشار إليها مع Tcf21MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP الخلايا الليفية (الأخضر)، والمناطق الزائفة اللون من زيادة الفلورسينس (الأرجواني) تظهر توطين الخلايا الليفية، والبرتقال تحديد المناطق الخالية من الخلايا الليفية. الصف العلوي: صور ثابتة للبطينين الأيسرين من قلوب مصابة ب I/R. الصف السفلي: الصور الثابتة للبطينين الأيسرين من قلوب I/R-المصابة مع وظيفة البقع Imaris المستخدمة لرؤية أنماط الخلايا الليفية بسهولة أكبر في البطين الأيسر بأكمله. أشرطة الفيديو من I / R الجرحى مسح قلوب تظهر ليس فقط الأنماط الإجمالية للخلايا الليفية، ولكن أيضا صور واضحة من الخلايا الليفية الفردية ومورفولوجياتها يمكن العثور عليها في أشرطة الفيديو التكميلية S5-8. أشرطة المقياس = 500 ميكرومتر. اختصار: I/R = نقص التروية/إعادة التروية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تخفيف فقدان الخلايا الليفية القلبية بعد الإصابة في احتشاء عضلة القلب المصابين مسح القلوب مع مرور الوقت.
مسح الأنسجة القلبية من قلوب MI مع Tcf21MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP الخلايا الليفية (الأخضر)، والمناطق الزائفة اللون من زيادة الفلورسينس (الأرجواني) تظهر توطين الخلايا الليفية، والبرتقال تحديد المناطق الخالية من الخلايا الليفية. الصف العلوي: صور ثابتة للأنسجة مسح البطينين الأيسرين من قلوب MI المصابة (الأخضر). الصف السفلي: صور ثابتة للأنسجة مسح البطينين الأيسرين من قلوب MI المصابة (الأخضر) مع وظيفة البقع Imaris (الأرجواني) مضاف لإظهار توزيع الخلايا الليفية الإجمالي. أشرطة الفيديو من الأنسجة مسح البطينين الأيسر من قلوب MI المصابين تظهر ترتيب الخلايا الليفية الإجمالي في القلب، فضلا عن تحديد المواقع ومورفولوجيا الخلايا الليفية الفردية في هذا النموذج 3D في الجسم الحي (أشرطة الفيديو التكميلية S7-8). أشرطة المقياس: 1.5 يوم = 1000 ميكرومتر، 3 أيام = 700 ميكرومتر. اختصار: MI = احتشاء عضلة القلب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: الأنسجة المطهية من قلوب معالجة أنجيوتنسين/فينيليفرين.
(أ)التخطيطي تبين كيف تستخدم مضخات Angiotensin / Phenylephrine لإدارة المخدرات على مدى فترة أسبوعين بعد تفعيل تاموكسيفين من Tcf21MCM x eGFP. (ب) صورة ثابتة، صورة ثابتة + بقع Imaris، وفيديو يظهر تنظيم الورم الليفي ومورفولوجيا في قلوب Ang/PE المعالجة(فيديو إضافي S11) أشرطة المقياس = 500 ميكرومتر. المختصرات: آنغ/بي = أنجيوتنسين الثاني/فينيليفرين؛ eGFP = البروتين الفلوري الأخضر المحسن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: صور تمثيلية لنمط الخلايا الليفية الملاحظ في قلوب معالجة أنجيوتنسين/فينيليفرين.
(A, C, و D): صور من نمط التواء الحلزون الأيمن من الخلايا الليفية من منظور خارج البطين. (ب) صورة للتشنج الليفي من منظور داخل البطين. الأسهم تسليط الضوء على مجموعات خطية من الخلايا الليفية التي تشكل نمط التواء. أشرطة المقياس = 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: الاداءات ثنائية الأبعاد لجهاز خزان التصوير. (أ) تقديم 2D من النصف السفلي من خزان التصوير. هذا الخزان مغلق على طبق بيتري مع الشحوم فراغ. يتم وضع القلب في فتحة المركز وغمره في RIMS. (ب) 2D تقديم النصف العلوي من خزان التصوير. يتم الالتزام الزجاج coverlip إلى أسفل شقة من هذه القطعة مع الشحوم فراغ. يتم وضع هذا بلطف على رأس الخزان السفلي. ويمكن بعد ذلك ملء الخزان العلوي مع الجلسرين للتصوير. وحدات في مم. الاختصارات: 2D = ثنائي الأبعاد؛ RIMS: حل مطابقة الفهرس الانكساري. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

فيديو S1: الأنسجة غير المصابة مسح القلب. كانت الخلايا الليفية القلبية (الخضراء) في البطين الأيسر غير المصاب صغيرة ، وتم تقريب العديد منها مع ما لا يزيد عن إسقاطين خلويين. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

فيديو S2: نسيج الشام مسح القلب. كانت الخلايا الليفية القلبية (الخضراء) في البطين الأيسر لقلب فأر يعمل بالشمس صغيرة وتدور في الغالب مع عدد قليل من التوقعات ، على غرار ما شوهد في قلوب غير مصابة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

فيديو S3: عرض مفصل للخلايا الليفية من خلال الجدار البطيني لقلب غير مصاب. يبدأ هذا الفيديو على الجدار البطيني الداخلي ويقترب من السطح الخارجي للقلب. وقد تبين بالتفصيل أن الخلايا الليفية القلبية (الخضراء) قد استدارت أو ممدودة قليلا من أجسام الخلايا التي لا يزيد عددها عن إسقاطين خلويين. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

فيديو S4: عرض مفصل لقسم من الجدار البطيني الأيسر من القلب غير المصاب. يظهر هذا القسم الذي يبلغ عرضه ~300 ميكرومتر من قلب الفأر غير المصاب الذي تم مسحه الترتيب ثلاثي الأبعاد للخلايا الليفية القلبية (الخضراء) ومورفولوجياتها بالتفصيل. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

فيديو S5: مسح البطين الأيسر من 3 أيام I/R. عرض مفصل للبطين الأيسر أظهرت أنه بعد إصابة I / R ، هناك منطقة من فقدان الخلايا الليفية القلبية. وكان من الواضح أيضا أن الخلايا الليفية (الخضراء) وضعت شكل ممدود أكثر من ذلك بكثير في هذه الحالة المصابة بالمقارنة مع مورفولوجيا أكثر استدارة ينظر في قلوب غير مصابة وعارية. اختصار: I/R = نقص التروية/إعادة التروية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

فيديو S6: مسح البطين الأيسر من 7 أيام I/R. تظهر الرؤية التفصيلية للبطين الأيسر أنه بحلول 7 أيام بعد إصابة I/R ، كانت المنطقة التي تفتقر إلى الخلايا الليفية أصغر من تلك التي شهدها اليوم الثالث بعد إصابة I /R. كان هناك المزيد من الخلايا الليفية (الخضراء) الحاضر، والمثير للاهتمام، كانت موجودة مورفولوجيا الخلايا الجديدة. على وجه التحديد ، كان لبعض الخلايا الليفية أجسام خلايا مستديرة مع نتوءات متعددة ، مما يشير إلى دور جديد أو متطور للخلايا الليفية في هذه البيئة. اختصار: I/R = نقص التروية/إعادة التروية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

فيديو S7: مسح البطين الأيسر من 14 يوم I/R. وأظهرت رؤية مفصلة للبطين الأيسر أنه لا تزال هناك منطقة مركزية للجدار البطيني الذي كان عدد قليل جدا من الخلايا الليفية ولكن الخلايا الليفية (الخضراء) على هامش هذا الفراغ حافظت على مورفولوجيا ممدود للغاية ينظر في اليوم 7 عينات ما بعد I / R. ومن المثير للاهتمام أن الخلايا الليفية القليلة التي كانت موجودة في المنطقة المصابة كان لها مورفولوجيا مثل تلك الموجودة في قلوب غير مصابة - صغيرة ومستديرة. اختصار: I/R = نقص التروية/إعادة التروية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

فيديو S8: مسح البطين الأيسر من 28 يوم I/R. أظهرت رؤية تفصيلية للخلايا الليفية القلبية (الخضراء) في اليوم 28 بعد إصابة I /R أن هناك منطقة صغيرة في المنطقة المصابة تفتقر إلى الخلايا الليفية. ولوحظ أيضا أن هناك منطقة ذات كثافة عالية في الخلايا الليفية تحيط بهذه المنطقة، وأن المورفولوجيا في هذه المنطقة الكثيفة ممدودة للغاية. اختصار: I/R = نقص التروية/إعادة التروية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

فيديو S9: مسح البطين الأيسر من 1.5 يوم MI. كان هناك عدد قليل جدا من الخلايا الليفية القلبية (الخضراء) المتبقية في البطين الأيسر المصاب في 1.5 أيام بعد MI, وفاة الخلايا الليفية القلبية في جميع أنحاء هذه المنطقة من البطين. اختصار: MI = احتشاء عضلة القلب. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

فيديو S10: مسح البطين الأيسر من 3 أيام MI. كانت هناك منطقة كبيرة خالية من الخلايا الليفية القلبية بعد 3 أيام من MI ، ولكن بعض الخلايا الليفية القلبية (الخضراء) ظهرت مرة أخرى في البطين ، على عكس النتائج التي تم العثور عليها بعد 1.5 يوم من MI. أيضا، كانت ملامح مورفولوجيا الخلايا الليفية القلبية مختلفة عن تلك التي شوهدت في قلوب المصابين I / R. هنا كانت الخلايا الليفية ممدود ولكن كان هناك غيرها من الأجسام الخلية التي تقريب (أكبر من تلك التي شوهدت في قلوب غير مصاب) واكتظاظ هذه كان العديد من الإسقاطات الخلية. الاختصارات: MI = احتشاء عضلة القلب؛ I/R = نقص التروية/التروية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

فيديو S11: البطين الأيسر مسح من الفئران Ang/PE المعالجة. لم يكن هناك فقدان واضح للخلايا الليفية القلبية (الخضراء) بعد علاج Ang /PE. ومع ذلك ، كانت الخلايا الليفية القلبية صغيرة في الغالب ومستديرة أو صغيرة وممدودة ويبدو أنها تتماشى مع أنماط انقباش القلب. اختصار: آنغ / PE = أنجيوتنسين الثاني / الفينيليفرين. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تقدم هذه المقالة طريقة مكررة لتطهير الأنسجة التي تسمح بتصور الخلايا الليفية القلبية في الجسم الحي ، سواء عند خط الأساس أو بعد الإصابة ، لتوصيف وفهم الخلايا الليفية بشكل أفضل في قلب الماوس. يعالج هذا البروتوكول المعزز القيود في بروتوكولات إزالة الأنسجة الموجودة التي حاولت تحديد أنواع خلايا محددة في قلب البالغين أو حديثي الولادة12و13و14و16و17و20. في المحاولات الأولية لمسح قلب الفأر ، تم استخدام تقنية CLARITY السلبية ، حيث ترك القلب في حاجز مقاصة على نوتاتور لمدة أسبوع تقريبا للسماح بالتوزيع السلبي للحاجز في جميع أنحاء الأنسجة15،18. أنتجت هذه العملية فقط تطهير ما يقرب من 80 ميكرومتر من العمق في الأنسجة (البيانات غير المعروضة) ، وهو ما يتفق مع الملاحظات السابقة حيث كانت هناك حاجة إلى عدة أسابيع لمسح قلب فأر حديثي الولادة البالغ من العمر يوما واحدا13. CLARITY النشط باستخدام نظام الكهربائي النشط يسمح لمسح أعمق من خلال الجدار البطيني بأكمله، ما يقرب من 700 ميكرومتر-1 ملم عميق، على مدى فترة زمنية أقصر12،18.

ومع ذلك ، فإن استخدام هذا البروتوكول النشط المنشور سابقا CLARITY أدى إلى فقدان تفلور الخلايا الليفية مع مستويات عالية من الفلورة الذاتية للأنسجة ، والتي لوحظت سابقا أن تحدث في الوضوح النشط من قبل Kolesovaوآخرون. وللسماح بالحفاظ على فلورة الخلايا الليفية، وجد أن بروتوكول التثبيت المناسب له أهمية قصوى. تسبب قصيرة جدا من عملية التثبيت فقدان الفلورسينس أثناء الكهرومورفوريسيس. تسببت فترة طويلة جدا من عملية التثبيت فقدان الفلورسينس نفسها. لذلك، تم العثور على تثبيت بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في 4٪ PFA ليكون الأمثل. لتحسين مسألة مضان الخلفية ، تم استخدام نقع إزالة اللون (وهو مبدأ مستعار من طريقة CUBIC للمقاصة) للحد من ربط الهيم داخل الميوجلوبين ، وبالتالي تقليل الفلورة الذاتية الناجمة عن هذا الكروموفوري18. وأدى علاج إزالة اللون في تطهير أكثر قوة من مضان الخلفية، مع الحفاظ على مضان المراسل بحيث كانت الخلايا الليفية المسماة أكثروضوحا (الشكل 2A).

وأخيرا، للسماح بالشفافية البصرية الكاملة، تم توازن النسيج في محلول مطابقة مؤشر الانكسار (RIMS)(الشكل 2B-D). من خلال مطابقة مؤشر الانكسار للأنسجة مع محيطه ، زاد هذا من الشفافية البصرية للأنسجة ، مما سمح بتصوير أعمق. ثم تم استخدام المسح الرنان عالي السرعة لتصوير الأنسجة لأنها أسرع من المسح الجلفانومتري. نظرا لأن قلوب الماوس مختلفة قليلا، تم تعيين معلمات التصوير XY الفردية وتصحيحات كثافة Z. مع هذه المعلمات، كان من الممكن لصورة من خلال القلب غير مصاب لتصور الخلايا الليفية الفلورية في حوالي 4 ساعة(الشكل 3). تم تحسين جودة الصورة في معالجة ما بعد التصوير باستخدام برنامج تحليل التشوه والتشويس لتقليل الخلفية وتوضيح الإضاءة الموجودة في الصورة. وبالإضافة إلى ذلك، استخدم برنامج التحليل الثانوي لتسليط الضوء على توطين الخلايا الليفية الفلورية. تم استخدام هذا التحليل بعد التصوير لشرح الخلايا الليفية القلبية بوضوح عن طريق القضاء على الخلفية voxel بواسطة voxel (الشكل 3، الشكل 4، الشكل 5، الشكل 6).

تم تطبيق بروتوكول CLARITY الأمثل هذا لمسح القلوب المصابة وغير المصابة بصريا. وهذا يسمح لفهم أفضل لرد فعل الخلايا الليفية القلبية للإصابة. وشملت هذه الإصابات دورة زمنية من MI و I / R ، فضلا عن التحسس آنغ / PE. وبما أن الإصابة الإقفارية تضعف أنسجة القلب، فمن الأهمية بمكان أن يتم توخي المزيد من الحذر أثناء الإلكتروفوريس للحفاظ على سلامة الأنسجة. في الواقع لكل من I / R و MI الإصابة ، مطلوب فترة أقصر من الكهربائي (≤1.5 ساعة)32. لم تنظر الدراسات السابقة في آثار الإصابة على عملية إزالة الأنسجة. البروتوكول الأمثل حديثا المعروضة هنا يستوعب للإصابة، مما يسمح لإزالة دون مزيد من التدمير للأنسجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا يوجد لدى المؤلفين أي إفصاحات تتعلق بمحتوى هذه المخطوطة.

Acknowledgments

ويود المؤلفون أن يعترفوا بجوهر التصوير Confocal CCHMC لمساعدتهم وتوجيههم في تطوير هذا النموذج ، وكذلك مات باتي من الهندسة السريرية لتصميم جميع الأجزاء المطبوعة ثلاثية الأبعاد. تم دعم ديميتريا فيشيسر بمنحة تدريبية من المعاهد الوطنية للصحة ، (NHLBI ، T32 HL125204) وجيفري د. مولكينتين بدعم من معهد هوارد هيوز الطبي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-0 braided silk Ethicon K871H
8-0 prolene Ethicon 8730H
40% Acrylamide Solution Bio-Rad 1610140
Angiotensin II Sigma A9525-50G
Artificial Tear Ointment Covetrus 048272
DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane) Millipore Sigma D27802-25G
GLUture topical tissue adhesive World Precision Instruments 503763
Heparin Sigma H0777
Imaris Start Analysis Software Oxford Instruments N/A
Micro-osmotic pumps Alzet Model 1002
Nikon Elements Analysis Software Nikon N/A
Nikon A1R HD upright microscope Nikon N/A
Normal autoclaved chow Labdiet 5010
Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N,
N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide		 CosmoBio AXS-1002424
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Phenylephrine Hydrochloride Sigma P6126-10G
Photoinitiator Wako Chemicals VA-044
Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] Jackson Laboratories Jax Stock No:012429
Sodium Azide Sigma Aldrich S2002-5G
Sodium Chloride solution Hospira, Inc. NDC 0409-4888-10
Tamoxifen Sigma Aldrich T5648
Tamoxifen food Envigo TD.130860
Tween-20 Thermo Fisher Scientific BP337-500
Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent Millipore Sigma 122262-1L
X-Clarity electrophoretic clearing chamber Logos Biosystems C30001
X-Clarity electrophoretic clearing solution Logos Biosystems C13001
X-Clarity electrophoresis tissue basket Logos Biosystems C12001
X-Clarity electrophoresis tissue basket holder Logos Biosystems C12002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagaraju, C. K., et al. Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure. Journal of the American College of Cardiology. 73 (18), 2267-2282 (2019).
  2. Yoon, S., Eom, G. H. Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions. Experimental and Molecular Medicine. 51 (12), 1-9 (2019).
  3. Borlaug, B. A., Redfield, M. M. Diastolic and systolic heart failure are distinct phenotypes within the heart failure spectrum. Circulation. 123, 2006-2014 (2011).
  4. Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the cardiac fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
  5. Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigation. 128 (5), 2127-2143 (2018).
  6. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
  7. Sadeghi, A. H., et al. Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling. Advanced Healthcare Materials. 6 (11), 1601434 (2017).
  8. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
  9. Bruns, D. R., et al. The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation. PLoS One. 14 (8), 0220573 (2019).
  10. Skiöldebrand, E., et al. Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion. Heliyon. 3 (10), 00406 (2017).
  11. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method. Cell Research. 28, 803-818 (2018).
  12. Kolesová, H., Čapek, M., Radochová, B., Janáček, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
  13. Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. Capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging. Journal of Visualized Experiments. (157), (2020).
  14. Wang, Z., et al. Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution. Biomedical Optics Express. 9 (2), 423-436 (2018).
  15. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  16. Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12 (7), 0182072 (2017).
  17. Perbellini, F., et al. Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue. Scientific Reports. 7, 5188 (2017).
  18. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
  19. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  20. Nehrhoff, I., et al. 3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3716-3720 (2016).
  21. Yamamoto, M., et al. A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis. Genesis. 47 (2), 107-114 (2009).
  22. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
  23. Means, C. K., et al. Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 292 (6), 2944-2951 (2007).
  24. Michael, L. H., et al. Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 269 (6), 2147-2154 (1995).
  25. Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).
  26. Patten, R. D., et al. Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 274 (5), 1812-1820 (1998).
  27. Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 45 (2), 330-338 (2000).
  28. Vagnozzi, R. J., et al. An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy. Nature. 577, 405-409 (2020).
  29. Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 366-376 (2008).
  30. Arts, T., et al. Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle. Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).
  31. Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. P. The muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars. American Journal of Pathology. 145 (4), 868-875 (1994).
  32. Hashmi, S., Al-Salam, S. Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: A comparison. International Journal of Clinical Experimental Pathology. 8, 8786-8796 (2015).

Tags

الطب، العدد 171، تطهير أنسجة القلب، احتشاء عضلة القلب، ارتفاع ضغط الدم، الورم الليفي، التصوير ثلاثي الأبعاد، فأر البالغين
تنقية الأنسجة المستندة إلى الوضوح لمنظمة الخلايا الليفية ثلاثية الأبعاد في قلوب الفئران الصحية والمصابة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fischesser, D. M., Meyer, E. C.,… More

Fischesser, D. M., Meyer, E. C., Sargent, M., Molkentin, J. D. Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts. J. Vis. Exp. (171), e62023, doi:10.3791/62023 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter