Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Raffineret KLARHED-baseret væv Clearing for tre-dimensionelle Fibroblast Organisation i sunde og sårede Mouse Hearts

doi: 10.3791/62023 Published: May 16, 2021

Summary

En raffineret metode til væv clearing blev udviklet og anvendt på den voksne mus hjerte. Denne metode blev designet til at rydde tæt, autofluorescerende hjertevæv, samtidig med at mærket fibroblast fluorescens tilskrives en genetisk reporter strategi.

Abstract

Hjerte-kar-sygdomme er den mest udbredte årsag til dødelighed på verdensplan og er ofte præget af øget hjertefibrose, der kan føre til øget ventrikelstivhed med ændret hjertefunktion. Denne stigning i hjerte ventrikulær fibrose skyldes aktivering af residente fibroblaster, selv om hvordan disse celler fungerer inden for 3-dimensionelle (3-D) hjerte, ved baseline eller efter aktivering, er ikke godt forstået. For at undersøge, hvordan fibroblaster bidrager til hjertesygdomme og deres dynamik i 3D-hjertet, blev der udviklet en raffineret KLARHED-baseret vævsclearing- og billeddannelsesmetode, der viser fluorescerende mærkede hjertefibroblaster i hele musehjertet. Væv bosiddende fibroblaster blev genetisk mærket ved hjælp af Rosa26-loxP-eGFP florescent reporter mus krydset med hjerte fibroblast udtrykke Tcf21-MerCreMer knock-in linje. Denne teknik blev brugt til at observere fibroblast lokalisering dynamik i hele voksne venstre hjertekammer i raske mus og i fibrotiske mus modeller af hjertesygdomme. Interessant, i en skade model, unikke mønstre af hjerte fibroblaster blev observeret i den skadede mus hjerte, der fulgte bands af indpakkede fibre i kontraktile retning. I iskæmiske skadesmodeller indtraf fibroblastdøden efterfulgt af en genopfyldning fra den infarkte grænsezone. Samlet set giver denne raffinerede hjertevævskonderingsteknik og digitaliserede billeddannelsessystem mulighed for 3D-visualisering af hjertefibroblaster i hjertet uden begrænsninger af antistofindtrængningssvigt eller tidligere problemer omkring tabt fluorescens på grund af vævsbehandling.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Selvom kardiomyocytter udgør den største volumenfraktion i hjertet, er hjertefibroblaster mere rigelige og er kritisk involveret i reguleringen af dette organs grundlæggende strukturelle og reparative træk. Hjertefibroblaster er meget mobile, mekanisk lydhøre og fænotypisk spænder afhængigt af omfanget af deres aktivering. Hjertefibroblaster er nødvendige for at opretholde normale niveauer af ekstracellulær matrix (ECM), og for lidt eller for meget ECM-produktion af disse celler kan føre til sygdom1,2,3. I betragtning af deres betydning i sygdom er hjertefibroblaster blevet et stadig vigtigere undersøgelsesemne til at identificere nye behandlingsstrategier, især i forsøget på at begrænse overdreven fibrose4,5,6,7. Ved skade aktiverer og differentierer fibroblaster sig til en mere syntetisk celletype kendt som en myofibroblast, som kan være proliferativ og udskille rigelig ECM, samt have kontraktil aktivitet, der hjælper med at ombygge ventriklerne.

Mens hjertefibroblaster er blevet grundigt evalueret for deres egenskaber i 2-D kulturer6,8,9,10, forstås meget mindre af deres egenskaber og dynamik i 3D levende hjerte, enten ved baseline eller med sygdomsstimulering. Her er en raffineret metode blevet beskrevet til væv rydde voksen mus hjertet og samtidig opretholde fluorescens af fibroblaster mærket med en Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer genetisk reporter system. I hjertet er Tcf21 en relativt specifik markør for hvilende fibroblaster4. Efter tamoxifen er givet for at aktivere det inducible MerCreMer protein, vil stort set alle hvilende fibroblaster permanent udtrykke forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP) fra Rosa26 locus, som giver mulighed for deres sporing in vivo.

Talrige veletablerede væv clearing protokoller findes, hvoraf nogle er blevet anvendt til hjertet11,12,13,14,15,16,17. Mange af de reagenser, der anvendes i forskellige vævsrydningsprotokoller, har imidlertid vist sig at slukke endogene fluorescenssignaler18. Derudover er det voksne hjerte svært at rydde på grund af rigelige heme gruppeholdige proteiner, der genererer autofluorescens19. Derfor var målet med denne protokol at bevare fibroblast markør fluorescens med samtidig hæmning af heme autofluorescens i det skadede voksne hjerte for optimal 3-D visualisering in vivo12,13,14,16,17,20.

Tidligere undersøgelser, der forsøgte at undersøge den anvendte hjertefibroblast in vivo perfunderede antistoffer til mærkning af disse celler, selv om sådanne undersøgelser var begrænset af antistofindtrængning og hjertevaskulær struktur14,16,17,20. Selv salamon et al. har vist væv clearing med vedligeholdelse af aktuelle neuronale fluorescens i neonatal hjerte, og Nehrhoff et al. har vist vedligeholdelse af fluorescens mærkning myeloid celler, vedligeholdelse af endogene fluorescens gennem hele ventrikelvæggen er endnu ikke blevet påvist, herunder visualisering af voksne hjerte fibroblaster ved baseline eller efter skade13,20. Denne vævsclearingprotokol forfiner en blanding af tidligere protokoller baseret på CLARITY-metoden (klar lipidbytteret acrylamid-hybridiseret stiv Imaging/immunostaining/in situ-hybridization-compatible tissue hydrogel) og PEGASOS (polyethylen glycol (PEG)-associeret opløsningsmiddelsystem). Denne raffinerede protokol tillod en mere robust undersøgelse af hjertefibroblaster i musehjertet ved baseline og af, hvordan de reagerer på forskellige typer skader. Protokollen er ligetil og reproducerbar og vil hjælpe med at karakterisere adfærden af hjertefibroblaster in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle forsøg med mus blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på Cincinnati Children's Hospital Medical Center. Institutionen er også AAALAC (American Association for Akkreditering af Laboratory Animal Care) certificeret. Mus blev aflivet via cervikal dislokation, og mus, der gennemgik overlevelse kirurgiske procedurer fik smertelindring (se nedenfor). Alle metoder, der anvendes til smertebehandling og aktiv dødshjælp er baseret på anbefalinger fra panelet om aktiv dødshjælp af American Veterinary Medical Association. Alle mus var opstaldet i majskolbestrøede enheder med vand og mad til rådighed på alle tidspunkter. Mus blev opstaldet 4 til et bur med samme køn. Til kirurgi eller uskadt vævsrydning blev der anvendt lige mange 6-8 uger gamle han- og hunmus.

BEMÆRK: Sterile kirurgiske tilstande blev opretholdt i alle operationer. Kirurgen ændret til rene krat og en steril kjole og derefter iført sko dækker og et hårnet. Kirurgen skrubbede derefter deres hænder med chlorhexidin og iførte sterile kirurgiske handsker. Kirurgen blev bistået af en tekniker, der bedøvet, barberet, og skrubbes indsnit site 3 gange hver, skiftevis mellem 2% chlorohexidin gluconat og 70% isopropanol. Musene blev derefter bragt til kirurgen, og kirurgi blev udført. Mellem dyr blev instrumenterne steriliseret i en perlesterilisator.

1. Rekombination af Cre

  1. Cross Rosa26-loxP-eGFP mus (Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]) med Tcf21-MerCreMer mus (Figur 1A)6,21.
  2. Når afkom af dette kryds når 6 uger, administreres en intraperitoneal injektion på 75 mg /kg tamoxifen opløst i majsolie. 22 Administrere denne tamoxifen to gange, 48 timer fra hinanden (figur 1B).
  3. Efter tamoxifen injektioner, sætte musene på en diæt af tamoxifen mad (~ 0,4 g/kg tamoxifen citrat) i en uge. Efter en uges tamoxifen chow returneres musene til en normal autoklaveret chow-diæt i en uge, før de udfører kirurgi (Figur 1B). Der skal udpeges et passende antal mus (3 pr. kirurgisk tilstand), som ikke er skadet. Ofre disse mus, og gå videre til clearing proces afgrænset nedenfor efter en uge af normal chow kost.
  4. Efter tamoxifen regime og rekombination, udføre kirurgi.

2. Kirurgiske modeller

  1. Iskæmi/reperfusion (I/R)23,24
    1. Bedøve mus med 1,5% isoflurane gas i rumluft i en ventileret kasse; barber deres bryst og hals med elektriske klippere, og skrub derefter de barberede områder med en 2% chlorhexidin gluconat-gennemblødt vatpind.
    2. Brug kunstig tåre salve for at forhindre tørhed under operationen ved at placere salve på øjnene af de bedøvede mus.
    3. Udfør en midt hals snit ved hjælp af kirurgisk saks til at tillade visualisering af luftrøret. Intubere med et 20 G kateter ved at placere intubationsrøret i luftrøret og visualisere trachealkateteret gennem midt halsindsnittet. Placer musene på en ventilator, mens de er bedøvet med isoflurane gas (1,5%) i rumluften.
    4. Lav et snit under venstre forreste lem med kirurgisk saks, og skær intercostal musklerne mellem ribben 3 og 4. Spred ribbenene åbne ved hjælp af en retractor.
    5. Placer en lille svamp gennemblødt i saltvand mellem lungerne og hjertet for at forhindre skader på lungerne.
    6. Ved hjælp af en fiskekrog nål (6,5 mm, 3 /8 c), binde venstre kranspulsåren med en slip knude ved hjælp af 8-0 prolene.
    7. Fjern svampen med pincet.
    8. Sutur intercostal muskler lukket ved hjælp af 4-0 flettet silke og en kontinuerlig sutur samtidig udvendiggøre slutningen af 8-0 prolen slip knude.
    9. Luk huden indsnit ved hjælp af topiske væv lim med udgangen af okkluderende slip knude fremspringende.
    10. Efter en times okklusion, trække den udvendige ende af slip knude til internt at frigive koronararterie okklusion, lindre iskæmi og forårsager reperfusion.
    11. 0,02 mL af en 1 mg/mL forlænget udløsnings buprenorphin via subdermal injektion (72 h frigivelse) som smertestillende middel, og placer musene i et iltet inkubationskammer ved 37 °C adskilt fra andre dyr. Overvåg musene mindst hver 15. minut, indtil de er kommet sig efter anæstesi og er i stand til at opretholde en sternal eller siddestilling. Returner musene til deres almindelige hus.
    12. Vurder dyrene for smerter og angst i 48 timer efter operationen, og overvåge indsnit site dagligt, indtil fuldt helbredt.
    13. Overhold musene for hydrering, næring og generel velvære efter operationen indtil ofring.
  2. Myokardie infarkt (MI)25,26,27
    1. Udfør trin 2.1.1-2.1.7.
    2. Brug en kontinuerlig sutur til at lukke intercostal muskler ved hjælp af 4-0 flettet silke.
    3. Luk huden snit ved hjælp af topiske væv lim.
    4. Udfør trin 2.1.11-2.1.13.
  3. Angiotensin II/phenylephrine mikro-osmotisk pumpe infusion
    1. Forbered Forbered en arbejdsopløsning på 10 μg/μL af angiotensin II og 500 μg/μL arbejdsopløsning phenylephrine under sterile forhold (dvs. i en laminarflowhætte) ved at tilsætte 1 mg angiotensin II til 100 μL steril fosfat buffered saltvand (PBS) og 250 mg phenylephrinehydrochlorid i 500 μL PBS.
    2. Fortyndingen af hver arbejdsopløsning og det endelige volumen skal fordeles på den mikro-osmotiske pumpe baseret på musens vægt.
      BEMÆRK: For eksempel, en mus på 20 g kræver 20 g x 14 dage x 1,5 μg/dag = 420 μg angiotensin eller 42 μL arbejdsopløsning samt 20 g x 14 dage x 50 μg/dag = 14000 μg phenylephrine hydrochlorid eller 28 μL arbejdsopløsning.
    3. For hver muss vægt fortyndes lægemidlets arbejdslager i steril PBS, og mikromoderne pumper (0,25 μL/h, 14 dage, ca. 100 μL) fyldes med en 27 G-nål og en 1 mL sprøjte.
      BEMÆRK: Dette vil generere en strømningshastighed på 1,5 μg∙g-1∙dages -1 angiotensin II og 50 μg∙g-1∙dages-1 phenylephrine hydrochlorid, når det er placeret i musene.
    4. Bedøve musene med 1,5% isofluran inhalation (til virkning) i et ventileret kammer, der indeholder rumluft.
    5. Placer de bedøvede mus på et sterilt kirurgisk bord i hundepositionen, og bevar anæstesi med isofluran gasinhalation (1,5%) gennem en næsekegler.
    6. Brug kunstig tåre salve på dyrets øjne for at forhindre tørhed under operationen.
    7. Barber pelsen over implantationsområdet med elektrisk hårklipper, og steriliser det område, der skal skæres ved hjælp af ethanol og en steril vatpind. Lav et lille snit (ca. 1 cm) med kirurgisk saks i det epidermale lag af musehuden på højre side af ryggen, under skulderbladet. Brug de kedelige sider af en kirurgisk saks til forsigtigt at strække huden i og omkring implantationsområdet for at indsætte minipump.
    8. Placer den mikro-osmotiske pumpe i indsnittet, og manøvrere den fysisk til venstre for musens dorsale midterlinje ved manuelt at massere pumpen under huden.
    9. Luk snittet via kontinuerlig sutur ved hjælp af 4-0 silke med en koniske punkt nål.
    10. Efter pumpeimplantation gives der langsom frigivelse af buprenorphin ved en dosis på 0,1 mg/kg legemsvægt via subdermal injektion for analgesi (72-timers langsom frigivelse). Musene anbringes i et iltet inkubationskammer ved 37 °C adskilt fra andre dyr. Overvåg musene mindst hver 15. minut, indtil de kommer sig efter anæstesi og kan opretholde en sternal eller siddende stilling.
    11. Når musene er kommet sig efter bedøvelse i opvarmningskammeret på 37 °C, skal de placere dem tilbage i deres standardopstaldningsenheder.
    12. Overvåg musene for smerter og angst i 48 timer efter operationen, og overvåge indsnit sted dagligt, indtil helt helet.
    13. Overhold musene for hydrering, næring og generel velvære efter operationen indtil ofring.

3. Rydning af voksne musehjerter ved hjælp af en ændret aktiv KLARHED-protokol

  1. Forbered et rent kirurgisk område ved at sterilisere kirurgi overflade og alle kirurgiske værktøjer med 70% ethanol. Forbered en opløsning af kold 1x PBS og 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS (100 ml hver). Brug handsker, kittel, ansigtsmaske og øjenværn.
  2. Heparinbufferen fremstilles ved at fortynde 10 enheder heparin i 0,9% m/v natriumchloridopløsning. Hver mus injiceres intraperitoneally med 60 μL heparin-NaCl ved hjælp af en 1 mL sprøjte og 27 G nål.
  3. Fem minutter efter injektionen af heparin-NaCl-opløsningen bedøves musene ved hjælp af 1,5% isofluraninhalation (for at virkning) i et ventileret kammer, der indeholder rumluft.
  4. Aflive musene ved livmoderhalskræft dislokation, hvori bagsiden af hovedet holdes med den flade, lukkede ende af pincet, mens rygsøjlen er forvredet ved at trække halen.
  5. Rengør musens ventrale overflade med 70% ethanol på en vatpind. Lav et 3 cm tværgående snit ca. 3 cm under xiphoidprocessen ved hjælp af kirurgisk saks.
  6. Adskil huden fra det underliggende mavevægvæv ved at degloving maven op til xiphoid processen (hold huden tættest på halen og træk huden tættest på hovedet op mod brystkassen). Lav et 2 cm tværgående snit i det subkutane bugvægsvæv 3 cm under xiphoidprocessen ved hjælp af kirurgisk saks. Lav et lodret snit fra dette tværgående snit, op midterlinjen og gennem brystkassen. Pin brystkassen tilbage, udsætter hjertet.
  7. Brug en 27 G nål og 10 mL sprøjte til at injicere kolde PBS i den overlegne vena cava og aorta (enhver positionel manipulation af hjertet skal ske omhyggeligt med stumpe pincet for at undgå punktering) for at rense blod fra hjertet.
    BEMÆRK: Tilstrækkelig perfusion kan noteres ved haletrækninger og misfarvning af lungerne.
  8. Brug en 27 G nål og 10 mL sprøjte til at injicere kolde 4% PFA i den overlegne vena cava og aorta for at begynde fikseringsprocessen.
  9. Fjerne hjerter. Atrierne, højre ventrikel og septum, og venstre hjertekammer bør adskilles ved hjælp af en straight-blade skalpel. Dette væv anbringes i et 15 mL centrifugerør fyldt med koldt 4% PFA og placeres på en nutator ved 4 °C natten over.
  10. Vask hjertet 3 gange i 1 time hver med kold 1x PBS for at fjerne overskydende PFA.
  11. Hydrogelen (hed A4P0 for relativ acrylamid/polyacrylamidsammensætning) fremstilles ved at blande følgende kemikalier i et 15 mL centrifugerør: 10% af 40% acrylamid, 10% 1x PBS, 80% destilleret vand.
  12. Fotoinitiatorens 0,25% opløsning (2,2-Azobis[2-(2-imidazolin-2yl)propan)dihydrochlorid) til hydrogelopløsningen lige før nedsænkning af hjertet i hydrogelen.
  13. Placer hjertet i et konisk rør, der indeholder hydrogel. Det koniske rør ombrydes i folie og inkuberes natten over ved 4 °C uden fysisk forstyrrelse.
  14. Efter ca. 14 timer ved 4 °C skal det koniske rør, der indeholder hjertet, flyttes til et perlebad på 37 °C.
  15. Efter 2,5 timer i perlebadet skal du forsigtigt fjerne hjertet fra hydrogelen med pincet.
  16. Hjertet vaskes 3 gange i 1 time hver i et konisk rør på 15 mL, der indeholder 1x PBS ved 37 °C på en tæller.
  17. Læg hjerterne i kurven på den aktive elektroforesemaskine ved hjælp af tang, og læg låget på kurven. Sørg for, at låget er sikkert på plads.
  18. Fyld det aktive elektroforesekammerreservoir med elektrofobtisk rydningsopløsning ved at hælde opløsningen ind i kammeret.
  19. Når kammeret er fyldt med elektrofobtisk rydningsopløsning, kan kurven, der indeholder hjertet, nedsænkes. Placer hætten på elektroforesemaskinen sikkert.
  20. Elektroforesemaskinen køres ved 1,5 A, 37 °C i 1,5 timer.
  21. Efter 1,5 h elektroforese skal du kontrollere hjerterne visuelt for at sikre, at der ikke er uigennemsigtigt væv tilbage. Hvis vævsområderne stadig er uigennemsigtige, nedsænkes hjertet igen i elektroforeseopløsning i det elektrofobtiske kammer, og elektroforese fortsættes i 0,5 timer ad gangen.
    BEMÆRK: Elektroforese bør afbrydes ved første tegn på vævsskader (såsom væv fraying).
  22. Hjertet vaskes i 15 mL konisk rør, der indeholder 1x PBS i 1 time, 3 gange hver, ved 37 °C på en nutator.
  23. Nedsænk hjerterne i et 15 mL konisk rør, der indeholder N,N,N',N'-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylendiamine - et decolorizing middel, der reducerer heme autofluorescens.
    BEMÆRK: Denne opløsning skal ændres hver 24. time, indtil hjerterne er helt klare (ca. 2 dage).
  24. Vask hjerterne i et 15 mL konisk rør med 1x PBS 3 gange i 1 time hver for at fjerne overskydende affarvningsmiddel.
  25. Forbered brydningsindeksmatchningsløsning (RIMS) ved at kombinere 30 ml 0,02 M fosfatbuffer, 40 g 5-(N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamid under omrøring (skal opløses fuldstændigt – dette kan tage op til en time), 5 mg natriumazid, 50 μL Tween20 og 1 g 1,4-diazabicyclo[2.2.2]oktan og justere pH-filen til 7,5.
  26. Ekvilibrere hjerter i RIMS i 48 timer før billedbehandling.

4. Imaging ryddet hjerter ved hjælp af en opretstående enkelt foton confocal mikroskop

BEMÆRK: Billedbehandlingsapparatet består af den nederste halvdel af en 10 cm glas petriskål, et 3D-printet bundreservoir, en rund glasovertræksdåse og et 3D-printet topreservoir (Figur 1C-E). 3D trykte materialer blev lavet in-house af Cincinnati Children's Hospital Clinical Engineering Department.

  1. Brug vakuumfedt til at forsegle det 3D-printede bundreservoir i en petriskål i glas ved at lægge et tyndt lag vakuumfedt på bunden af det 3D-printede stykke (Figur 1C).
    BEMÆRK: Beholderen skal have samme højde som den prøve, der afbildes (dvs. prøven må ikke komprimeres af glasovertræksdåsen, der er placeret oven på den, og prøven bør heller ikke kunne flyde og bevæge sig inden for beholderen).
  2. Fyld reservoiret med RIMS, og fjern alle bobler med en pipetspids. Placer hjertet i RIMS forsigtigt med venstre ventrikelvæg vendt op, hvilket sikrer, at der ikke indføres bobler i opløsningen.
  3. Hold et glasovertræk til bundfladen af det 3D-printede topbeholderstykke (Supplerende figur 1A) ved hjælp af vakuumfedt (igen ved at placere et tyndt lag vakuumfedt på det 3D-printede stykke og placere det på dækslet) (Figur 1D).
  4. Placer glasovertræksdækslet og topbeholderen, coverslip-siden nedad, på det nederste reservoir(supplerende figur 1B) uden at der indføres bobler. Vedhæftningen mellem RIMS og dækslet vil give en forsegling mellem top- og bundbeholderstykkerne (Figur 1E).
  5. Fyld det øverste reservoir med glycerol til brug med et 10x glycerol nedsænkningsmål.
  6. Brug et enkelt fotonmikroskop udstyret med et multifoton confocal scanningshoved til at afbilde de ryddede hjerter.
  7. Sænk fasen af det enkelte fotonmikroskop, og placer petriskålen, der indeholder prøven, midt på scenen. Hæv scenen, og sænk målet om 10x glycerol nedsænkning i glycerolen i prøveapparatets øverste reservoir. Sørg for, at prøven er i fokus ved at se på kanten af prøven ved hjælp af okularerne.
  8. Skift fra okularvisning til kameravisning på computeren ved at klikke på live-knappen.
    1. Indstil X- og Y-parametrene ved først at lokalisere den bredeste del af vævsprøven, som skal være i bunden af petriskålen.
    2. Klik på ND Acquisition og brugerdefinerede multipoint. Opret multipunkter ved først at finde midten af vævsprøven ved at bruge joysticket til at feje fra venstre mod højre og fra top til bund.
    3. Derefter, baseret på størrelsen af vævet, bestemme flisebelægning nødvendige størrelse (typisk 6 x 5 for en 6-8-ugers-gamle musehjerte). Gør dette ved at køre testbilleddannelse ved kun at opfange X- og Y-parametre (fjern markeringen af z under fanen ND Acquisition) for at kontrollere, om hele vævets længde og bredde blev fanget.
  9. Hvis du vil angive z-parametre, skal du åbne XYZ-navigationenog klikke på ikonerne op og ned, indtil du finder toppen og bunden af eksemplet.
    1. Åbn Z intensitet korrektion panel og justere fluorescens i toppen, midten og bunden af vævet til at korrigere for væv tæthed ved at øge eller mindske laser magt på hvert z punkt. Indstil disse ved at klikke på den indstillede pil til højre for panelet Z-intensitetskorrektion.
    2. Sæt Z-trinstørrelsen i ND Acquisition-panelet til 5 μm.
  10. Når X-, Y- og Z-parametrene i hjertet er afgrænset, og z-intensitetskorrektionen er indstillet, skal du bruge det automatiserede opretstående mikroskop med et 10x glycerol-nedsænkningsmål med en resonantscanner og gallium arsenidphosphid fotomultiplier rør (GaAsP PMTs) for at billedet de ryddede hjerter. Kontroller, at fanerne XY og Z er markeret under ND-anskaffelse, og tryk på Kør Z-rettelse.
  11. Sy, unmix, og denoise de resulterende billeder ved at åbne multipunktbilledet i behandlingssoftwaren og klikke på stingknappen. Klik på blind ubixingunder billede, 2 kanal, og findderefter . og Under billede, klik på denoise.ai, og klik derefter på den fluorescerende kanal valg (dvs. GFP).
    BEMÆRK: Denne proces resulterer i et 3D-billede af GFP-positive fibroblaster i hele venstre hjertekammer.
  12. Brug sekundær analysesoftware til yderligere at identificere mønstre og tendenser i spredningen af hjertefibroblaster. Brug funktionen Pletter ved at køre programmet til guiden Pletter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hjertefibroblaster er afgørende for hjertets baselinefunktion såvel som for reaktion på hjerteskade. Tidligere forsøg på at forstå arrangementet og morfologien af disse celler er stort set blevet udført i 2D-indstillinger. Der er imidlertid blevet offentliggjort en raffineret hjertere væv clearing (Figur 2) og 3-D billedbehandling teknik, som giver mulighed for avanceret, mere detaljeret visualisering af hjerte fibroblaster. Med denne billeddannelse teknik, fibroblaster blev anset for at være tæt pakket og har en spindelt morfologi i uskadt hjerter (Figur 3, Supplerende Videoer S1-4).

Efter venstre ventrikelvæv clearing var blevet gennemført i en uskadt hjerte, protokollen blev anvendt på flere skade modeller til at undersøge, hvordan denne clearing protokol ville udføre, når de studerer skadet hjertevæv. Mus blev udsat for I/R-skade ved midlertidig lukning af venstre kranspulsåre (LCA) i 1 time efterfulgt af reperfusion af 3, 7, 14 eller 28 dage. Disse eksperimenter viste, at der var et tab af hjerte fibroblaster i den iskæmiske region lige efter I / R skade, men at ved dag 7 og dag 14, fibroblaster migreret eller formeret til at befolke dette område af det sårede hjerte. På dag 28 var hjertefibroblastpopulationen omkring de sårede områder af hjertet på deres største tæthed (Figur 4, Supplerende Videoer S5-8).

MI skade er en kirurgisk model som følge af permanent LCA ligation (ingen reperfusion). Hjerter, der havde gennemgået MI-kirurgi, blev fjernet ved 1,5 og 3 dage efter operationen til fiksering, clearing og analyse. Der var meget få fibroblaster tilbage i den sårede venstre hjertekammer på 1,5 dage efter operationen(Figur 5A, Supplerende Video S9). Men ved dag 3, fibroblaster udvidet og var til stede i det meste af venstre hjertekammer bortset fra en lille region, formentlig har migreret i og / eller formeret fra en befolkning i grænseområdet (Figur 5B, Supplerende Video S10). Igen blev analysesoftware brugt til bedre at visualisere fibroblastlokalisering, og områder med tab af hjertefibroblaster blev skitseret i orange (Figur 5). Denne analyse viste bedre det oprindelige tab af celler på dag 1,5 efter MI, og hvordan fibroblaster enten spredte sig eller migrerede ind i det beskadigede område ved dag 3 for angiveligt at reparere området og danne et ar.

Ud over iskæmisk skade er reaktionen af hjertefibroblaster på forhøjet blodtryk ikke godt forstået. For at opdage disse cellers reaktion på forhøjet blodtryk blev angiotensin II og phenylephrine administreret. Angiotensin II og phenylephrine (Ang/PE) er lægemidler, der forårsager vedvarende højt blodtryk og hjertefibroblastaktivering med områder med interstitiel fibrose, bekræftet ved anvendelse af denne vævsclearingprotokol på ang/PE-behandlede hjerter (Figur 6A)5,28. I modsætning til iskæmisk kirurgi, infusion af Ang / PE over flere uger ikke resulterer i tab af hjertevæv og væg udtynding. I stedet blev et andet resultat observeret i fibroblast adfærd efter denne skade.

Som hjertet pumper, myocardium drejninger, efter en højrehåndet helix mønster29,30,31. I Ang/PE-modellen for skader justerede fibroblasterne langs aksen i dette højrehåndede helix-sammentrækningsmønster ved hjælp af den raffinerede vævsclearingprotokol (Figur 6B). Hypotesen til at forklare denne adfærd er, at hjerte fibroblaster var sensing retningen af ventrikelvæg stamme og tilpasning inden for myofibers at give den største støtte inden for ECM som fibrotisk respons akut udfoldet under agonist infusion (Figur 7). Et andet interessant resultat var, at fibroblaster syntes små og afrundede, i modsætning til spindel form ses i modeller af I / R og MI skade(Figur 6, Supplerende Video S11).

Figure 1
Figur 1: Mus og materialer, der anvendes til vævsrydningshjerter.
(A) Skematisk avlsstrategi for Tcf21-MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP mus, der anvendes til vævsrydning. (B) Tidslinje for tamoxifenbehandling og -kirurgi udført hos mus. Uskadte mus ofret på dag 14. (C) 3D printet godt til at holde hjertevæv forseglet til et glas Petri parabol med vakuum fedt. (D) Tilsætning af en rund coverlip vakuumfedt forseglet til toppen af 3-D trykt godt indstillet oven på bunden godt. (E) Væv ryddet hjerte i bunden godt af væv bedrift apparat, fyldt med brydningsindeks Matching Solution (RIMS). Coverslip (som i D) og top 3-D trykt godt stykke lagt over den nederste 3-D trykte reservoir komponent, der indeholder ryddet hjertevæv. Glycerol tilsættes til det øverste reservoir for glycerol nedsænkning mikroskopi. Skalastænger = 1 cm. Reservoirtegninger findes i supplerende figur 1. Forkortelse: eGFP = forbedret grønt fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Visuelt udseende af hjertevævsclearingstadier.
(A)Fra venstre mod højre: uklar venstre ventrikel, elektroforer venstre hjertekammer, elektroforer venstre ventrikel behandlet med crosslinker, elektroforer venstre ventrikel behandlet med crosslinker og inkuberet i RIMS. (B)Uklart og ryddet hele musen hjerte. (C) Venstre: uskadt, uklar venstre hjertekammer. Højre: uskadt, ryddet venstre hjertekammer. (D) Venstre: Uklar MI såret venstre hjertekammer. Til højre: Ryddet MI skadet venstre hjertekammer. Skalastænger = 0,5 cm. Forkortelse: MI = myokardieinfarkt. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Effekten af en ny clearingmetode for uskadte og sham-opererede rensede hjerter.
Ryddet (A) uskadt (skala bar = 400 μm) og (B) sham-opererede hjerter (skala bar = 500 μm) med Tcf21mcm x Rosa26eGFP fibroblaster (grøn) og pseudofarvede områder med øget fluorescens (lilla), der viser fibroblast lokalisering. Ledsagende videoer, der viser fibroblast videoer kan findes i supplerende videoer S1-2. Stillbilleder viser baggrundsrydning og vedligeholdelse af fibroblast-endogen fluorescens (grøn). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Dæmpning af tab af fibroblaster i iskæmi/reperfusionsskadede rensede hjerter over tid.
Ryddet hjertevæv fra de angivne I / R tidspunkter med Tcf21MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP fibroblaster (grøn), pseudofarvede områder med øget fluorescens (lilla), der viser fibroblast lokalisering, og orange skitserer områder blottet for fibroblaster. Øverste række: stillbilleder af venstre hjertekamre fra I/R-skadede rensede hjerter. Nederste række: stillbilleder af venstre hjertekamrene fra I / R-skadet ryddet hjerter med Imaris pletter funktion bruges til at se fibroblast mønstre lettere i hele venstre hjertekammer. Videoer af I / R-skadede ryddet hjerter viser ikke kun grov mønster af fibroblaster, men også klare billeder af de enkelte fibroblaster og deres morfologier kan findes i supplerende videoer S5-8. Skalastænger = 500 μm. Forkortelse: I/R = iskæmi/reperfusion. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Dæmpning af tab af hjertefibroblaster efter skade i myokardie-skadede renset hjerter over tid.
Ryddet hjertevæv fra MI hjerter med Tcf21MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP fibroblaster (grøn), pseudocolored områder med øget fluorescens (lilla) viser fibroblast lokalisering, og orange skitsere områder blottet for fibroblaster. Øverste række: Stillbilleder af væv ryddet venstre hjertekamrene fra MI-skadede hjerter (grøn). Nederste række: stillbilleder af væv ryddet venstre hjertekamrene fra MI-skadede hjerter (grøn) med Imaris pletter funktion (lilla) overlejret for at vise brutto fibroblast distribution. Videoer af væv ryddet venstre hjertekamrene fra MI-skadede hjerter viser brutto fibroblast arrangement i hjertet samt positionering og morfologi af de enkelte fibroblaster i denne 3D in vivo model (Supplerende videoer S7-8). Skalastænger: 1,5 dage = 1000 μm, 3 dage = 700 μm. Forkortelse: MI = myokardieinfarkt. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Renset væv fra Angiotensin/Phenylephrine-behandlede hjerter.
(A) Skematisk viser, hvordan Angiotensin / Phenylephrine pumper bruges til at administrere narkotika over en to-ugers periode efter tamoxifen aktivering af Tcf21MCM x eGFP. (B) Stillbillede, stillbillede + Imaris pletter, og video, der viser fibroblast organisation og morfologi i Ang / PE-behandlede hjerter (Supplerende Video S11) Scale barer = 500 μm. Forkortelser: Ang/PE = angiotensin II/phenylephrine; eGFP = forbedret grønt fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Repræsentative billeder af observeret fibroblastmønster i Angiotensin/Phenylephrine-behandlede hjerter.
(A, Cog D):Billeder af højrehåndet helix vride mønster af fibroblaster fra perspektivet af ydersiden af hjertekammer. (B) Billede af fibroblast mønstre fra perspektivet af indersiden af hjertekammer. Pile fremhæve lineære grupper af fibroblaster, der udgør vride mønster. Skalastænger = 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: 2D-gengivelser af billedbeholderapparater. (A) 2D-gengivelse af nederste halvdel af billedbeholderen. Dette reservoir er forseglet til petriskålen med vakuumfedt. Hjertet er placeret i midten åbning og nedsænket i RIMS. (B) 2D-gengivelse af den øverste halvdel af billedbeholderen. Glas coverlip er klæbet til flad bund af dette stykke med vakuum fedt. Dette er forsigtigt placeret på toppen af bundbeholderen. Top reservoir kan derefter fyldes med glycerol til billeddannelse. Enheder i mm. Forkortelser: 2D = todimensional; RIMS: Brydningsindeks matching løsning. Klik her for at downloade dette tal.

Video S1: Uskadt væv ryddet hjerte. Hjertefibroblaster (grøn) i en uskadt venstre hjertekammer var små, og mange blev afrundet med ikke mere end to cellulære fremskrivninger. Klik her for at downloade denne video.

Video S2: Sham væv ryddet hjerte. Hjertefibroblaster (grøn) i venstre hjertekammer af et sham-drevet musehjerte var små og for det meste runde med få fremskrivninger, svarende til hvad der blev set i uskadte hjerter. Klik her for at downloade denne video.

Video S3: Detaljeret fibroblast udsigt gennem ventrikelvæggen af en uskadt hjerte. Denne video begynder på den indvendige ventrikelvæg og zoomer mod hjertets yderside. Hjertefibroblaster (grøn) blev vist i detaljer og blev observeret at have afrundede eller lidt aflange cellelegemer med højst to cellulære fremskrivninger. Klik her for at downloade denne video.

Video S4: Detaljeret visning af dele af venstre ventrikelvæg af uskadt hjerte. Denne ~ 300-μm-dækkende del af ryddet uskadt mus hjerte viser 3-D arrangement af hjerte fibroblaster (grøn) og deres morfologier i detaljer. Klik her for at downloade denne video.

Video S5: Ryddet venstre hjertekammer på 3 dage I / R. Detaljeret visning af venstre hjertekammer viste, at efter I / R skade, der er et område med hjerte fibroblast tab. Det var også tydeligt, at fibroblaster (grøn) udviklede en langt mere langstrakt form i denne skadede tilstand i forhold til de mere afrundede morfologier set i uskadte og falske hjerter. Forkortelse: I/R = iskæmi/reperfusion. Klik her for at downloade denne video.

Video S6: Ryddet venstre hjertekammer på 7 dage I / R. Detaljeret visning af venstre hjertekammer viser, at området, der manglede fibroblaster, var mindre end det, der ses på dag 3 efter I/R-skade, senest 7 dage efter skade i skade. Der var flere fibroblaster (grøn) til stede, og interessant nok var nye cellemorfologier til stede. Specifikt havde nogle fibroblaster afrundede cellelegemer med flere fremspring, hvilket potentielt indikerer en ny eller udviklet rolle fibroblaster i dette miljø. Forkortelse: I/R = iskæmi/reperfusion. Klik her for at downloade denne video.

Video S7: Ryddet venstre hjertekammer på 14 dage I / R. Detaljeret visning af venstre hjertekammer viste, at der stadig var et område centralt for ventrikulær væg, der havde meget få fibroblaster, men fibroblaster (grøn) i periferien af dette tomrum fastholdt den meget aflange morfologi set i dag 7 post-I/R prøver. Interessant nok havde de få fibroblaster, der var til stede i den skadede region, en morfologi som den i uskadte hjerter - lille og afrundet. Forkortelse: I/R = iskæmi/reperfusion. Klik her for at downloade denne video.

Video S8: Ryddet venstre hjertekammer på 28 dage I / R. Detaljeret visning af hjertefibroblaster (grøn) på dag 28 efter I / R skade viste, at der var et lille område i den skadede region, der manglede fibroblaster. Det blev også bemærket, at der var en region med høj fibroblasttæthed omkring denne region, og at morfologierne i dette tætte område var meget aflange. Forkortelse: I/R = iskæmi/reperfusion. Klik her for at downloade denne video.

Video S9: Ryddet venstre hjertekammer af 1,5 dage MI. Der var meget få hjerte fibroblaster (grøn) tilbage i den sårede venstre hjertekammer på 1,5 dage efter MI, hjerte fibroblast død i hele denne region af hjertekammer. Forkortelse: MI = myokardieinfarkt. Klik her for at downloade denne video.

Video S10: Ryddet venstre hjertekammer af 3 dages MI. Der var et stort område blottet for hjertefibroblaster 3 dage efter MI, men nogle hjertefibroblaster (grøn) dukkede op igen i hjertekammeret, i modsætning til de fundne resultater efter 1,5 dage med MI. Også, hjerte fibroblast morfologi profiler var anderledes end dem, der ses i I / R tilskadekomne hjerter. Her var fibroblaster aflange, men der var andre, der havde afrundede cellelegemer (større end dem, der ses i uskadte hjerter), og en delpopulation af disse havde mange celleprojektioner. Forkortelser: MI = myokardieinfarkt; I/R = iskæmi/reperfusion. Klik her for at downloade denne video.

Video S11: Ryddet venstre hjertekammer af Ang / PE-behandlede mus. Der var ingen tilsyneladende tab af hjerte fibroblaster (grøn) efter Ang / PE behandling. Imidlertid var hjertefibroblaster for det meste små og afrundede eller små og aflange og syntes at tilpasse sig hjertets kontraktile mønstre. Forkortelse: Ang/PE = angiotensin II/phenylephrine. Klik her for at downloade denne video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne artikel præsenterer en raffineret metode til vævsrydning, der giver mulighed for visualisering af hjertefibroblaster in vivo, både ved baseline og efter skade, for at karakterisere og bedre forstå fibroblaster i musehjertet. Denne udvidede protokol omhandler begrænsninger i eksisterende vævsrydningsprotokoller , der har forsøgt at identificere bestemte celletyper i voksent eller neonatalt hjerte12,13,14,16,17,20. I de første forsøg på at rydde musehjertet blev den passive KLARHED-teknik brugt, hvori hjertet blev efterladt i en clearingbuffer på en nutator i ca. 1 uge for at give mulighed for passiv fordeling af bufferen i hele vævet15,18. Denne proces frembragte kun rydning af ca. 80 μm dybde i vævet (data ikke vist), hvilket er i overensstemmelse med tidligere observationer, hvorved der var behov for flere uger for at rydde et 1 dag gammelt neonatalt musehjerte13. Aktiv KLARHED ved hjælp af et aktivt elektroforesesystem, der er tilladt at rydde dybere gennem hele ventrikelvæggen, ca. 700 μm-1 mm dyb, over en kortere tidsramme12,18.

Men ved hjælp af denne tidligere offentliggjorte aktive KLARHED protokol førte til et tab af fibroblast fluorescens med høje niveauer af væv autofluorescens, som tidligere var blevet bemærket at forekomme i aktiv klarhed af Kolesova et al.12. For at gøre det muligt at opretholde fibroblast fluorescens blev den relevante fikseringsprotokol anset for at være af allerstørste betydning. For kort en fikseringsproces forårsagede tab af fluorescens under elektroforese. For lang en fikseringsproces forårsagede tab af fluorescens selv. Derfor blev det konstateret, at fiksering natten over ved 4 °C i 4 % PFA var optimal. For at forbedre baggrundsfluorescensproblemet blev der anvendt en affarvningssuger (et princip lånt fra CUBIC-metoden til clearing) for at reducere hemebinding inden for myoglobin og dermed reducere autofluorescens forårsaget af denne kromohore18. Affarvningsbehandling resulterede i en mere robust rydning af baggrundsfluorescens med vedligeholdelse af reporterfluorescens, således at de mærkede fibroblaster var mere udtalte (Figur 2A).

Endelig blev vævet ekvilibreret i brydningsindeksmatchningsopløsning (RIMS)(figur 2B-D)for at give mulighed for fuld optisk gennemsigtighed. Ved at matche det brydningsindeks af vævet med dets omgivelser, dette øgede den optiske gennemsigtighed i vævet, giver mulighed for dybere billeddannelse. Højhastigheds resonansscanning blev derefter brugt til at afbilde væv, da det er hurtigere end galvanisk scanning. Da musehjerter har lidt forskellige størrelser, blev der angivet individuelle XY-billedparametre og Z-intensitetskorrektioner. Med disse parametre var det muligt at forestille sig gennem det uskadte hjerte at visualisere fluorescerende fibroblaster i ca. 4 timer (Figur 3). Billedkvaliteten blev forbedret i efterbehandling efter billedbehandling ved hjælp af den ublandede og denoising analyse software til at reducere baggrunden og afklare fluorescens til stede i billedet. Derudover blev sekundær analysesoftware brugt til at fremhæve lokaliseringen af fluorescerende fibroblaster. Denne analyse efter billeddannelse blev brugt til klart at kommentere hjertefibroblaster ved at eliminere baggrund voxel-by-voxel (Figur 3, Figur 4, Figur 5, Figur 6).

Denne optimerede CLARITY-protokol er blevet anvendt til optisk klare både sårede og uskadte hjerter. Dette giver mulighed for en bedre forståelse af reaktionen af hjertefibroblaster til skade. Disse skader omfattede et tidsforløb med MI og I/R samt Ang/PE-dosering. Da iskæmisk skade svækker hjertevævet, er det afgørende, at der udvises større omhu under elektroforese for at opretholde vævsintegriteten. For både skade på I/R og MI kræves der en kortere elektroforeseperiode (≤1,5 h)32. Tidligere undersøgelser har ikke overvejet virkningerne af skade på vævsrydningsprocessen. Den nyligt optimerede protokol, der præsenteres her, imødekommer til skade, hvilket giver mulighed for rydning uden yderligere ødelæggelse af vævet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen oplysninger vedrørende indholdet af dette manuskript.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende CCHMC Confocal Imaging Core for deres hjælp og vejledning i udviklingen af denne model, samt Matt Batie fra Clinical Engineering for udformningen af alle 3D-trykte dele. Demetria Fischesser blev støttet af et uddannelsestilskud fra National Institutes of Health (NHLBI, T32 HL125204) og Jeffery D. Molkentin blev støttet af Howard Hughes Medical Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-0 braided silk Ethicon K871H
8-0 prolene Ethicon 8730H
40% Acrylamide Solution Bio-Rad 1610140
Angiotensin II Sigma A9525-50G
Artificial Tear Ointment Covetrus 048272
DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane) Millipore Sigma D27802-25G
GLUture topical tissue adhesive World Precision Instruments 503763
Heparin Sigma H0777
Imaris Start Analysis Software Oxford Instruments N/A
Micro-osmotic pumps Alzet Model 1002
Nikon Elements Analysis Software Nikon N/A
Nikon A1R HD upright microscope Nikon N/A
Normal autoclaved chow Labdiet 5010
Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N,
N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide
CosmoBio AXS-1002424
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Phenylephrine Hydrochloride Sigma P6126-10G
Photoinitiator Wako Chemicals VA-044
Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] Jackson Laboratories Jax Stock No:012429
Sodium Azide Sigma Aldrich S2002-5G
Sodium Chloride solution Hospira, Inc. NDC 0409-4888-10
Tamoxifen Sigma Aldrich T5648
Tamoxifen food Envigo TD.130860
Tween-20 Thermo Fisher Scientific BP337-500
Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent Millipore Sigma 122262-1L
X-Clarity electrophoretic clearing chamber Logos Biosystems C30001
X-Clarity electrophoretic clearing solution Logos Biosystems C13001
X-Clarity electrophoresis tissue basket Logos Biosystems C12001
X-Clarity electrophoresis tissue basket holder Logos Biosystems C12002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagaraju, C. K., et al. Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure. Journal of the American College of Cardiology. 73, (18), 2267-2282 (2019).
  2. Yoon, S., Eom, G. H. Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions. Experimental and Molecular Medicine. 51, (12), 1-9 (2019).
  3. Borlaug, B. A., Redfield, M. M. Diastolic and systolic heart failure are distinct phenotypes within the heart failure spectrum. Circulation. 123, 2006-2014 (2011).
  4. Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the cardiac fibroblast. Circulation Journal. 80, (11), 2269-2276 (2016).
  5. Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigation. 128, (5), 2127-2143 (2018).
  6. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
  7. Sadeghi, A. H., et al. Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling. Advanced Healthcare Materials. 6, (11), 1601434 (2017).
  8. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141, (22), 4267-4278 (2014).
  9. Bruns, D. R., et al. The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation. PLoS One. 14, (8), 0220573 (2019).
  10. Skiöldebrand, E., et al. Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion. Heliyon. 3, (10), 00406 (2017).
  11. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method. Cell Research. 28, 803-818 (2018).
  12. Kolesová, H., Čapek, M., Radochová, B., Janáček, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146, (2), 141-152 (2016).
  13. Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. Capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging. Journal of Visualized Experiments. (157), (2020).
  14. Wang, Z., et al. Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution. Biomedical Optics Express. 9, (2), 423-436 (2018).
  15. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, (4), 945-958 (2014).
  16. Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12, (7), 0182072 (2017).
  17. Perbellini, F., et al. Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue. Scientific Reports. 7, 5188 (2017).
  18. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
  19. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  20. Nehrhoff, I., et al. 3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper. Biomedical Optics Express. 7, (9), 3716-3720 (2016).
  21. Yamamoto, M., et al. A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis. Genesis. 47, (2), 107-114 (2009).
  22. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50, (5), 600-613 (2011).
  23. Means, C. K., et al. Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 292, (6), 2944-2951 (2007).
  24. Michael, L. H., et al. Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 269, (6), 2147-2154 (1995).
  25. Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286, (3), 1201-1207 (2004).
  26. Patten, R. D., et al. Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 274, (5), 1812-1820 (1998).
  27. Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 45, (2), 330-338 (2000).
  28. Vagnozzi, R. J., et al. An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy. Nature. 577, 405-409 (2020).
  29. Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1, (3), 366-376 (2008).
  30. Arts, T., et al. Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle. Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).
  31. Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. P. The muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars. American Journal of Pathology. 145, (4), 868-875 (1994).
  32. Hashmi, S., Al-Salam, S. Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: A comparison. International Journal of Clinical Experimental Pathology. 8, 8786-8796 (2015).
Raffineret KLARHED-baseret væv Clearing for tre-dimensionelle Fibroblast Organisation i sunde og sårede Mouse Hearts
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fischesser, D. M., Meyer, E. C., Sargent, M., Molkentin, J. D. Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts. J. Vis. Exp. (171), e62023, doi:10.3791/62023 (2021).More

Fischesser, D. M., Meyer, E. C., Sargent, M., Molkentin, J. D. Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts. J. Vis. Exp. (171), e62023, doi:10.3791/62023 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter