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Medicine

Raffinata compensazione dei tessuti basata su CLARITY per l'organizzazione tridimensionale dei fibroblasti nei cuori di topo sani e feriti

doi: 10.3791/62023 Published: May 16, 2021

Summary

Un metodo raffinato di compensazione dei tessuti è stato sviluppato e applicato al cuore adulto del topo. Questo metodo è stato progettato per cancellare il tessuto cardiaco denso e autofluorescente, pur mantenendo la fluorescenza dei fibroblasti etichettata attribuita a una strategia genetica reporter.

Abstract

Le malattie cardiovascolari sono la causa più diffusa di mortalità in tutto il mondo ed è spesso contrassegnata da una fibrosi cardiaca aumentata che può portare a una maggiore rigidità ventricolare con funzione cardiaca alterata. Questo aumento della fibrosi ventricolare cardiaca è dovuto all'attivazione di fibroblasti residenti, anche se il modo in cui queste cellule operano all'interno del cuore tridimensionale (3D), al basale o dopo l'attivazione, non è ben compreso. Per esaminare come i fibroblasti contribuiscono alle malattie cardiache e alle loro dinamiche nel cuore 3D, è stato sviluppato un raffinato metodo di pulizia e imaging dei tessuti basato su CLARITY che mostra fibroblasti cardiaci etichettati fluorescentmente all'interno dell'intero cuore del topo. I fibroblasti residenti nei tessuti sono stati geneticamente etichettati utilizzando topi reporter florescenti Rosa26-loxP-eGFP incrociati con il fibroblasto cardiaco che esprime la linea di knock-in Tcf21-MerCreMer. Questa tecnica è stata utilizzata per osservare la dinamica di localizzazione dei fibroblasti in tutto il ventricolo sinistro adulto nei topi sani e nei modelli fibrotici di topo di malattie cardiache. È interessante notare che, in un modello di lesione, sono stati osservati modelli unici di fibroblasti cardiaci nel cuore del topo ferito che seguiva bande di fibre avvolte nella direzione della contrattile. Nei modelli di lesioni ischemiche si è verificata la morte dei fibroblasti, seguita dal ripopolamento dalla zona di confine infarto. Collettivamente, questa raffinata tecnica di chiar chiaritura del tessuto cardiaco e il sistema di imaging digitalizzato consentono la visualizzazione 3D dei fibroblasti cardiaci nel cuore senza i limiti del fallimento della penetrazione degli anticorpi o problemi precedenti che circondano la fluorescenza persa a causa della lavorazione dei tessuti.

Introduction

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Sebbene i cardiomiociti costificheranno la più grande frazione di volume nel cuore, i fibroblasti cardiaci sono più abbondanti e sono coinvolti criticamente nella regolazione delle caratteristiche strutturali e riparatrici di base di questo organo. I fibroblasti cardiaci sono altamente mobili, meccanicamente reattivi e fenotipicamente variano a seconda dell'entità della loro attivazione. I fibroblasti cardiaci sono necessari per mantenere i normali livelli di matrice extracellulare (ECM), e una produzione troppo piccola o troppo di ECM da parte di queste cellule puòportare alla malattia 1,2,3. Data la loro importanza nella malattia, i fibroblasti cardiaci sono diventati un argomento di indagine sempre più importante verso l'identificazione di nuove strategie di trattamento, specialmente nel tentativo di limitare l'eccessiva fibrosi4,5,6,7. Al momento della lesione, i fibroblasti si attivano e si differenziano in un tipo di cellula più sintetica noto come miofibroblasto, che può essere proliferativo e secernore abbondante ECM, oltre ad avere un'attività contrattile che aiuta a rimodellare i ventricoli.

Mentre i fibroblasti cardiaci sono stati ampiamente valutati per le loro proprietà nelle colture 2D6,8,9,10, molto meno si comprende le loro proprietà e dinamiche nel cuore vivente 3D, sia al basale che con la stimolazione della malattia. Qui, è stato descritto un metodo raffinato per liberare il cuore del topo adulto mantenendo la fluorescenza dei fibroblasti etichettati con un sistema di reporter genetico Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer. All'interno del cuore, Tcf21 è un marcatore relativamente specifico di fibroblasti quiescenti4. Dopo che il tamoxifene è stato somministrato per attivare la proteina MerCreMer induttiva, essenzialmente tutti i fibroblasti quiescenti esprimeranno permanentemente proteine fluorescenti verdi potenziate (eGFP) dal locus Rosa26, che consente il loro tracciamento in vivo.

Esistono numerosi protocolli di compensazione dei tessuti consolidati, alcuni dei quali sono stati applicati al cuore11,12,13,14,15,16,17. Tuttavia, molti dei reagenti utilizzati in diversi protocolli di compensazione dei tessuti sono stati trovati per spegnere i segnali di fluorescenza endogena18. Inoltre, il cuore adulto è difficile da cancellare a causa delle abbondanti proteine contenenti gruppo di eme che generano autofluorescenza19. Pertanto, l'obiettivo di questo protocollo era quello di preservare la fluorescenza marcatore fibroblasto con l'inibizione simultanea dell'autofluorescenza dell'eme nel cuore adulto ferito per una visualizzazione 3D ottimale in vivo12,13,14,16,17,20.

Studi precedenti che tentavano di esaminare il fibroblasto cardiaco in vivo impiegavano anticorpi perfusi per etichettare queste cellule, sebbene tali studi fossero limitati dalla penetrazione degli anticorpi e dalla strutturavascolare cardiaca 14,16,17,20. Sebbene Salamon et al. Questo protocollo di compensazione dei tessuti affina una miscela di protocolli precedenti basati sul metodo CLARITY (sistema solvente rigido ibrido con acrilammide (PEG) e PEGASOS (sistema solvente associato al polietilene glicole (PEG). Questo raffinato protocollo ha permesso un esame più robusto dei fibroblasti cardiaci nel cuore del topo al basale e di come rispondono a diversi tipi di lesioni. Il protocollo è semplice e riproducibile e aiuterà a caratterizzare il comportamento dei fibroblasti cardiaci in vivo.

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Protocol

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Tutti gli esperimenti che coinvolgono topi sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Cincinnati Children's Hospital Medical Center. L'istituto è anche certificato AAALAC (American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care). I topi sono stati eutanasiati tramite lussazione cervicale e ai topi sottoposti a procedure chirurgiche di sopravvivenza è stato somministrato sollievo dal dolore (vedi sotto). Tutti i metodi utilizzati per la gestione del dolore e l'eutanasia si basano sulle raccomandazioni del panel sull'eutanasia dell'American Veterinary Medical Association. Tutti i topi erano alloggiati in unità di biancheria da letto in pannocchie di mais con acqua e cibo disponibili in ogni momento. I topi erano ospitati 4 in una gabbia con lo stesso sesso. Per l'intervento chirurgico o la pulizia del tessuto illeso, è stato utilizzato un numero uguale di topi maschi e femmine di 6-8 settimane.

NOTA: Le condizioni chirurgiche sterili sono state mantenute in tutti gli interventi chirurgici. Il chirurgo si è trasformato in scrub puliti e un abito sterile e poi ha indossato copriscarpe e una rete per capelli. Il chirurgo ha quindi lavato le mani con clorexidina e indossato guanti chirurgici sterili. Il chirurgo è stato assistito da un tecnico che ha sedato, rasato e lavato il sito di incisione 3 volte ciascuno, alternando tra il 2% di gluconato di cloroesidina e il 70% di isopropanolo. I topi sono stati poi portati dal chirurgo e l'intervento chirurgico è stato eseguito. Tra gli animali, gli strumenti sono stati sterilizzati in uno sterilizzatore di perline.

1. Cre ricombinazione

  1. Attraversare topi Rosa26-loxP-eGFP (Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]) con topi Tcf21-MerCreMer (Figura 1A)6,21.
  2. Quando la prole di questa croce raggiunge le 6 settimane di età, somministrare un'iniezione intraperitoneale di 75 mg / kg di tamoxifene sciolto in olio di mais. 22 Somministrare questo tamoxifene due volte, distante 48 ore(figura 1B).
  3. Dopo le iniezioni di tamoxifene, mettere i topi a dieta di cibo tamoxifene (~ 0,4 g / kg di citrato di tamoxifene) per una settimana. Dopo una settimana di tamoxifene chow, riportare i topi a una normale dieta chow autoclavata per una settimana prima di eseguire un intervento chirurgico (Figura 1B). Designare un numero appropriato di topi (3 per condizione chirurgica) da iminare. Sacrifica questi topi e procedi al processo di compensazione delineato di seguito dopo una settimana di normale dieta chow.
  4. Dopo il regime di tamoxifene e la ricombinazione, eseguire un intervento chirurgico.

2. Modelli chirurgici

  1. Ischemia/riperfusione (I/R)23,24
    1. Anestetizzare i topi con gas isoflurane all'1,5% nell'aria ambiente in una scatola ventilata; radersi il petto e il collo con tosaerba elettriche, quindi strofinare le aree rasate con un tampone imbevuto di gluconato di clorexidina al 2%.
    2. Utilizzare unguento lacrimale artificiale per prevenire la secchezza durante l'intervento chirurgico posizionando un unguento sugli occhi dei topi sedati.
    3. Eseguire un taglio a metà collo utilizzando forbici chirurgiche per consentire la visualizzazione della trachea. Intubato con un catetere da 20 G posizionando il tubo di intubazione nella trachea e visualizzando il catetere tracheale attraverso l'incisione del collo centrale. Posizionare i topi su un ventilatore mentre sono sedati con gas isoflurane (1,5%) nell'aria della stanza.
    4. Fai un'incisione sotto l'arto anteriore sinistro con forbici chirurgiche e taglia i muscoli intercostali tra le costole 3 e 4. Stendere le nervature aperte utilizzando un riavvolgitore.
    5. Posizionare una piccola spugna imbevuta di soluzione salina tra il polmone e il cuore per evitare danni al polmone.
    6. Utilizzando un ago fishhook (6,5 mm, 3/8 c), legare l'arteria coronarica sinistra con un nodo di slittamento rilasciabile utilizzando 8-0 prolene.
    7. Rimuovere la spugna con le forcep.
    8. Sutura i muscoli intercostali chiusi con seta intrecciata 4-0 e una sutura continua mentre esternalizzano anche la fine dell'8-0 nodo di slittamento prolene.
    9. Chiudere le incisioni cutanee utilizzando adesivo di tessuto topico con l'estremità del nodo di scorrimento occluding sporgente.
    10. Dopo un'ora di occlusione, tirare l'estremità esterna del nodo di slittamento per rilasciare internamente l'occlusione dell'arteria coronarica, alleviando l'ischemia e causando una riperfusione.
    11. Somministrare 0,02 mL di una buprenorfina a rilascio prolungato da 1 mg/mL mediante iniezione subdermica (rilascio di 72 ore) come antidolorifico e posizionare i topi in una camera di incubazione ossigenata a 37 °C, separata dagli altri animali. Monitorare i topi almeno ogni 15 minuti fino a quando non si sono ripresi dall'anestesia e sono in grado di mantenere una posizione sternale o seduta. Riportare i topi al loro alloggio regolare.
    12. Valutare gli animali per il dolore e l'angoscia per 48 ore dopo l'intervento chirurgico e monitorare quotidianamente il sito di incisione fino a quando non sono completamente guariti.
    13. Osserva i topi per l'idratazione, il nutrimento e il benessere generale dopo l'intervento chirurgico fino al sacrificio.
  2. Infarto miocardico (MI)25,26,27
    1. Eseguire i passaggi da 2.1.1 a 2.1.7.
    2. Usa una sutura continua per chiudere i muscoli intercostali usando seta intrecciata 4-0.
    3. Chiudere l'incisione cutanea utilizzando adesivo per tessuti topici.
    4. Eseguire i passaggi da 2.1.11 a 2.1.13.
  3. Infusione di pompa micro-osmotica angiotensina II/fenilefrina
    1. Preparare Preparare una soluzione di lavoro di 10 μg/μL di angiotensina II e 500 μg/μL di soluzione di lavoro di fenilefrina in condizioni sterili (cioè, in una cappa di flusso laminare) aggiungendo 1 mg di angiotensina II a 100 μL di salina tamponata di fosfato sterile (PBS) e 250 mg di fenilefrina cloridrato in 500 μL di PBS.
    2. Calcolare la diluizione di ogni soluzione di lavoro e il volume finale per erogare alla pompa micro-osmotica in base al peso del mouse.
      NOTA: Ad esempio, un topo da 20 g richiede 20 g x 14 giorni x 1,5 μg/giorno = 420 μg di angiotensina, o 42 μL di soluzione di lavoro, nonché 20 g x 14 giorni x 50 μg/giorno = 14000 μg di cloridrato di fenilefrina o 28 μL di soluzione di lavoro.
    3. Per il peso di ciascun topo, diluire il materiale di lavoro del farmaco in PBS sterile e riempire le pompe micro-osmotiche (0,25 μL/h, 14 giorni, circa 100 μL) utilizzando un ago da 27 G e una siringa da 1 ml.
      NOTA: Questo genererà una portata di 1,5 μg-g-1-giorno-1 di angiotensina II e 50 μg-g-1-giorno-1 di cloridrato di fenilefrina una volta posto nei topi.
    4. Anestetizzare i topi con l'1,5% di inalazione di isoflurane (a effetto) in una camera ventilata contenente aria ambiente.
    5. Posizionare i topi anestetizzati su una tavola chirurgica sterile in posizione opina e mantenere l'anestesia con inalazione di gas isoflurane (1,5%) attraverso un cono del naso.
    6. Usa un unguento lacrimale artificiale sugli occhi dell'animale per prevenire la secchezza durante l'intervento chirurgico.
    7. Radere la pelliccia sopra l'area di impianto con tosaerba elettriche e sterilizzare l'area da tagliare usando etanolo e un tampone sterile. Fare una piccola incisione (circa 1 cm) con forbici chirurgiche nello strato epidermico della pelle del topo sul lato laterale destro della schiena, sotto la scapola. Utilizzare i lati opachi di un paio di forbici chirurgiche per allungare delicatamente la pelle all'interno e intorno all'area dell'impianto per inserire la minipompa.
    8. Posizionare la pompa micro-osmotica all'interno dell'incisione e manovrarla fisicamente a sinistra della linea mediana dorsale del mouse massaggiando manualmente la pompa sotto la pelle.
    9. Chiudere l'incisione tramite sutura continua utilizzando seta 4-0 con un ago a punta di cono.
    10. Dopo l'impianto della pompa, somministrare buprenorfina a lento rilascio a una dose di 0,1 mg /kg di peso corporeo tramite iniezione subdermica per l'analgesia (rilascio lento di 72 ore). Posizionare i topi in una camera di incubazione ossigenata a 37 °C, separati dagli altri animali. Monitorare i topi almeno ogni 15 minuti fino a quando non si riprendono dall'anestesia e possono mantenere una posizione sternale o seduta.
    11. Al momento del recupero dall'anestesia nella camera riscaldante a 37 °C, riposizionare i topi nelle loro unità abitative standard.
    12. Monitorare i topi per il dolore e l'angoscia per 48 ore dopo l'intervento chirurgico e monitorare quotidianamente il sito di incisione fino a quando non è completamente guarito.
    13. Osserva i topi per l'idratazione, il nutrimento e il benessere generale dopo l'intervento chirurgico fino al sacrificio.

3. Cancellare i cuori dei topi adulti utilizzando un protocollo CLARITY attivo modificato

  1. Preparare un'area chirurgica pulita sterilizzando la superficie chirurgica e tutti gli strumenti chirurgici con il 70% di etanolo. Preparare una soluzione di PBS freddo 1x e 4% di paraformaldeide (PFA) in PBS (100 mL ciascuno). Indossare guanti, camice da laboratorio, maschera per il viso e protezione degli occhi.
  2. Preparare il tampone di eparina diluire 10 unità di eparina in soluzione di cloruro di sodio dello 0,9%. Iniettare ogni topo per via intraperitoneale con 60 μL di eparina-NaCl utilizzando una siringa da 1 ml e un ago da 27 G.
  3. Cinque minuti dopo l'iniezione di soluzione di eparina-NaCl, anestetizzare i topi usando l'1,5% di inalazione di isoflurane (a effetto) in una camera ventilata contenente aria ambiente.
  4. Eutanasia i topi per lussazione cervicale, in cui la parte posteriore della testa è tenuta con l'estremità piatta e chiusa delle forcep, mentre la colonna vertebrale viene lussata tirando la coda.
  5. Pulire la superficie ventrale del mouse con il 70% di etanolo su un batuffolo di cotone. Fai un'incisione trasversale di 3 cm circa 3 cm sotto il processo xifoide usando forbici chirurgiche.
  6. Separare la pelle dal tessuto della parete addominale sottostante deglogando l'addome fino al processo xifoide (tenere la pelle più vicina alla coda e tirare la pelle più vicina alla testa verso la gabbia toracica). Fai un'incisione trasversale di 2 cm nel tessuto della parete addominale sottocutanea 3 cm sotto il processo xifoide usando forbici chirurgiche. Fai un taglio verticale da questa incisione trasversale, su per la linea mediana e attraverso la gabbia toracica. Pin la gabbia toracica indietro, esponendo il cuore.
  7. Utilizzare un ago da 27 G e una siringa da 10 ml per iniettare PBS freddo nella vena cava superiore e nell'aorta (qualsiasi manipolazione posizionale del cuore deve essere eseguita con attenzione con pinzette smussate per evitare foratura) per liberare il sangue dal cuore.
    NOTA: Una perfusione sufficiente può essere notata dalla contrazione della coda e dallo scolorimento dei polmoni.
  8. Utilizzare un ago da 27 G e una siringa da 10 ml per iniettare freddo 4% di PFA nella vena cava e nell'aorta superiori per iniziare il processo di fissazione.
  9. Asporta i cuori. L'atri, il ventricolo destro e il setto e il ventricolo sinistro devono essere separati usando un bisturi a lama dritta. Mettere questo tessuto in un tubo di centrifuga da 15 ml riempito con PFA freddo al 4% e posizionare su un nutator a 4 °C durante la notte.
  10. Lavare il cuore 3 volte per 1 h ciascuno con PBS freddo 1x per rimuovere la PFA in eccesso.
  11. Preparare l'idrogel (chiamato A4P0 per la composizione relativa di acrilammide/poliacrilammide) mescolando le seguenti sostanze chimiche in un tubo di centrifuga da 15 ml: 10% di acrilammide 40%, 10% 1x PBS, 80% acqua distillata.
  12. Aggiungere la soluzione allo 0,25% del fotoiniziolatore (2,2-Azobis[2-(2-imidazolina-2il)propano)diidrocloruro) alla soluzione di idrogel poco prima di immergere il cuore nell'idrogel.
  13. Posizionare il cuore in un tubo conico contenente l'idrogel. Avvolgere il tubo conico in un foglio e incubare durante la notte a 4 °C senza disturbi fisici.
  14. Dopo circa 14 ore a 4 °C, spostare il tubo conico contenente il cuore in un bagno di perline a 37 °C.
  15. Dopo 2,5 ore nel bagno di perline, rimuovere il cuore dall'idrogel con attenzione con le forcep.
  16. Lavare i cuori 3 volte per 1 h ciascuno in un tubo conico da 15 ml contenente 1x PBS a 37 °C su un nutator.
  17. Posizionare i cuori nel cestello della macchina per elettroforesi attiva utilizzando le forcep e posizionare il coperchio sul cestello. Assicurarsi che il coperchio sia saldamente in posizione.
  18. Riempire il serbatoio attivo della camera di elettroforesi con soluzione di compensazione elettroforetica versando la soluzione nella camera.
  19. Una volta che la camera è piena di soluzione di compensazione elettroforetica, il cestello contenente il cuore può essere sommerso. Posizionare il tappo sulla macchina per elettroforesi in modo sicuro.
  20. Eseguire la macchina per elettroforesi a 1,5 A, 37 °C per 1,5 ore.
  21. Dopo 1,5 ore di elettroforesi, controllare visivamente i cuori per assicurarsi che non rimanga tessuto opaco. Se le regioni del tessuto sono ancora opache, immergere di nuovo il cuore in soluzione di elettroforesi nella camera elettroforetica e continuare l'elettroforesi per 0,5 ore alla volta.
    NOTA: L'elettroforesi deve essere interrotta ai primi segni di danno tissutale (come lo sfilacciamento dei tessuti).
  22. Lavare i cuori in un tubo conico da 15 ml contenente 1 PBS per 1 h, 3 volte ciascuno, a 37 °C su un nutator.
  23. Immergere i cuori in un tubo conico da 15 ml contenente N,N,N′,N′-Tetrakis(2-idrossipropil)etilendiammina- un agente decolorante che riduce l'autofluorescenza dell'eme.
    NOTA: Questa soluzione deve essere cambiata ogni 24 ore fino a quando i cuori non sono completamente chiari (circa 2 giorni).
  24. Lavare i cuori in un tubo conico da 15 ml con 1x PBS 3 volte per 1 h ciascuno per rimuovere l'agente decolorante in eccesso.
  25. Preparare la soluzione rims (Refractive Index Matching Solution) combinando 30 mL di tampone fosfato da 0,02 M, 40 g di 5-(N-2, 3-diidrossipropilacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 diidrossipropil) isoftalamomide con agitazione (deve essere completamente sciolto — questo può richiedere fino a un'ora), 5 mg di azide di sodio, 50 μL di Tween20 e 1 g di 1,4-diazabiciclo[2.2.2]ottano, e regolare il pH a 7,5.
  26. Equilibrare i cuori in RIMS per 48 ore prima dell'imaging.

4. Imaging di cuori chiari utilizzando un microscopio confocale singolo fotone verticale

NOTA: L'apparecchio di imaging è costituito dalla metà inferiore di una piastra di Petri in vetro da 10 cm, da un serbatoio inferiore stampato in 3D, da un coverslip rotondo in vetro e da un serbatoio superiore stampato in 3D(Figura 1C-E). I materiali stampati in 3D sono stati realizzati internamente dal Cincinnati Children's Hospital Clinical Engineering Department.

  1. Utilizzare il grasso sottovuoto per sigillare il serbatoio inferiore stampato in 3D in una piastra di Petri in vetro mettendo un sottile strato di grasso sottovuoto sul fondo del pezzo stampato in 3D(Figura 1C).
    NOTA: Il serbatoio deve avere la stessa altezza del campione che viene immaginato (cioè, il campione non deve essere compresso dal coperchio di vetro posto sopra di esso e anche il campione non dovrebbe essere in grado di galleggiare e muoversi all'interno del serbatoio).
  2. Riempire il serbatoio con RIMS e rimuovere tutte le bolle con una punta di pipetta. Posizionare il cuore nel RIMS con cura con la parete ventricolare sinistra rivolta verso l'alto, assicurando che non siano introdotte bolle nella soluzione.
  3. Aderire a una coverlip di vetro alla superficie inferiore del pezzo del serbatoio superiore stampato in 3D (Figura supplementare 1A) utilizzando grasso sottovuoto (ancora una volta posizionando un sottile strato di grasso sottovuoto sul pezzo stampato in 3D e posizionandolo sullo scivolo di copertura)(Figura 1D).
  4. Posizionare il coperchio in vetro e il serbatoio superiore, lato coverslip verso il basso, sul serbatoio inferiore (Figura supplementare 1B), senza l'introduzione di bolle. L'adesione tra il RIMS e lo slittamento del coperchio fornirà una tenuta tra i pezzi del serbatoio superiore e inferiore(Figura 1E).
  5. Riempire il serbatoio superiore con glicerolo per l'uso con un obiettivo di immersione in glicerolo 10x.
  6. Usa un singolo microscopio fotone dotato di una testa di scansione confocale multifoton per immagini i cuori chiari.
  7. Abbassare lo stadio del microscopio singolo fotone e posizionare la piastra di Petri contenente il campione al centro dello stadio. Sollevare lo stadio e abbassare l'obiettivo di immersione del glicerolo 10x nel glicerolo nel serbatoio superiore dell'apparato campione. Assicurarsi che il campione sia a fuoco osservando il bordo del campione utilizzando gli oculari.
  8. Passare dalla vista oculare alla visualizzazione della fotocamera sul computer facendo clic sul pulsante live.
    1. Impostare i parametri X e Y individuando prima la parte più ampia del campione di tessuto, che dovrebbe essere nella parte inferiore della piastra di Petri.
    2. Fare clic su Acquisizione ND e multipunto personalizzato. Creare più punti trovando prima il centro del campione di tessuto utilizzando il joystick per spazzare da sinistra a destra e dall'alto verso il basso.
    3. Quindi, in base alle dimensioni del tessuto, determinare la dimensione di piastrellatura necessaria (in genere 6 x 5 per un cuore di topo di 6-8 settimane). Eseguire l'imaging di prova acquisendo solo i parametri X e Y (deselezionare z nella scheda Acquisizione ND) per verificare se l'intera lunghezza e larghezza del tessuto sono state catturate.
  9. Per impostare i parametri z, aprire la navigazione XYZe fare clic sulle icone su e giù fino a trovare la parte superiore e inferiore dell'esempio.
    1. Aprite il pannello di correzione dell'intensità Z e regolate la fluorescenza nella parte superiore, centrale e inferiore del tessuto per correggere la densità dei tessuti aumentando o diminuendo la potenza del laser in ogni punto z. Impostate questi clic sulla freccia impostata a destra del pannello Correzione intensità Z.
    2. Impostate la dimensione del passo Z nel pannello Acquisizione ND su 5 μm.
  10. Dopo aver delineato i parametri X, Y e Z del cuore e impostare la correzione dell'intensità Z, utilizzare il microscopio verticale automatico con un obiettivo di immersione del glicerolo 10x con uno scanner risonante e tubi fotomoltiplicatori di fosfuro di arseniuro di gallio (PMT GaAsP) per immaginire i cuori chiari. Assicurarsi che le schede XY e Z siano selezionate in Acquisizione ND epremere Esegui correzione Z.
  11. Cucire, unmix e denoizzare le immagini risultanti aprendo l'immagine multipunto nel software di elaborazione e facendo clic sul pulsante di punto. In immaginefare clic su unmixing cieco, 2 canalie quindi trovare. e Sotto immagine, fare clic denoise.ai,quindi fare clic sul canale fluorescente preferito (ad esempio, GFP).
    NOTA: Questo processo si traduce in un'immagine 3D di fibroblasti positivi alla GFP nell'intero ventricolo sinistro.
  12. Utilizzare un software di analisi secondaria per identificare ulteriormente modelli e tendenze nella dispersione dei fibroblasti cardiaci. Utilizzare la funzione Spots eseguendo il programma di creazione guidata spot.

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Representative Results

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I fibroblasti cardiaci sono essenziali per la funzione basale del cuore e per la risposta a lesioni cardiache. Precedenti tentativi di comprendere la disposizione e la morfologia di queste cellule sono stati condotti in gran parte in ambienti 2D. Tuttavia, è stata pubblicata una raffinataschiaritura deitessuti cardiaci ( Figura 2 ) e una tecnica di imaging 3D, che consente una visualizzazione avanzata e più dettagliata dei fibroblasti cardiaci. Con questa tecnica di imaging, i fibroblasti sono risultati densamente imballati e hanno una morfologia spinosa nei cuori illesi (Figura 3, Video supplementari S1-4).

Dopo che la pulizia del tessuto ventricolare sinistro era stata effettuata in un cuore illeso, il protocollo è stato applicato a diversi modelli di lesioni per esaminare come avrebbe funzionato questo protocollo di compensazione quando si studiava il tessuto cardiaco ferito. I topi sono stati sottoposti a lesioni da I/R per chiusura temporanea dell'arteria coronarica sinistra (LCA) per 1 h seguita da una riperfusione della durata di 3, 7, 14 o 28 giorni. Questi esperimenti hanno dimostrato che c'era una perdita di fibroblasti cardiaci nella regione ischemica subito dopo la lesione da I/R, ma che al giorno 7 e al giorno 14, i fibroblasti migravano o proliferavano per ripopolare quest'area del cuore ferito. Al giorno 28, la popolazione di fibroblasti cardiaci che circondava le aree ferite del cuore era alla loro massima densità(Figura 4, Video supplementari S5-8).

La lesione mi è un modello chirurgico risultante dalla legatura permanente dell'LCA (nessuna riperfusione). I cuori che erano stati sottoposti a chirurgia mi sono stati asportati a 1,5 e 3 giorni dopo l'intervento chirurgico per la fissazione, la compensazione e l'analisi. Sono rimasti pochissimi fibroblasti nel ventricolo sinistro ferito a 1,5 giorni dall'intervento chirurgico(Figura 5A, Video supplementare S9). Tuttavia, al giorno 3, i fibroblasti si espansero e furono presenti nella maggior parte del ventricolo sinistro ad eccezione di una piccola regione, presumibilmente essendo migrati e/o proliferati da una popolazione nella zona di confine(Figura 5B, Video supplementare S10). Anche in questo caso, il software di analisi è stato utilizzato per visualizzare meglio la localizzazione dei fibroblasti e le aree di perdita di fibroblasti cardiaci sono state descritte in arancione (Figura 5). Questa analisi ha mostrato meglio la perdita iniziale di cellule al giorno 1.5 dopo l'MI e come i fibroblasti proliferavano o migravano in quell'area danneggiata entro il giorno 3 per riparare apparentemente l'area e formare una cicatrice.

Oltre alla lesione ischemica, la reazione dei fibroblasti cardiaci all'ipertensione non è ben compresa. Per scoprire la risposta di queste cellule all'ipertensione, sono state somministrate angiotensina II e fenilefrina. L'angiotensina II e la fenilefrina (Ang/PE) sono farmaci che causano un'ipertensione persistente e l'attivazione dei fibroblasti cardiaci con aree di fibrosi interstiziale, confermate attraverso l'applicazione di questo protocollo di compensazione dei tessuti ai cuori trattati con ang/PE(Figura 6A)5,28. A differenza della chirurgia ischemica, l'infusione di Ang / PE per diverse settimane non si traducono in perdita di tessuto cardiaco e assottigliamento delle pareti. Invece, è stato osservato un risultato diverso nel comportamento dei fibroblasti a seguito di questa lesione.

Come le pompe cardiache, il miocardio si attorciglia, seguendo un motivo a elicadestrorsa 29,30,31. Nel modello di lesione Ang/PE, i fibroblasti si sono allineati lungo l'asse di questo modello di contrazione dell'elica destrorsa utilizzando il raffinato protocollo di compensazione dei tessuti (Figura 6B). L'ipotesi per spiegare questo comportamento è che i fibroblasti cardiaci stavano rilevando la direzione del ceppo della parete ventricolare e allineandosi all'interno delle miofibre per fornire il massimo supporto all'interno dell'ECM mentre la risposta fibrotica si svolgeva acutamente durante l'infusione agonista (Figura 7). Un'altra scoperta interessante è stata che i fibroblasti sono apparsi piccoli e arrotondati, in contrapposizione alla forma del mandrino vista nei modelli di lesione I/R e MI(Figura 6, Video supplementare S11).

Figure 1
Figura 1: Topi e materiali utilizzati per la pulizia dei tessuti dei cuori.
(A) Schema della strategia di allevamento per topi Tcf21-MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP utilizzati per la pulizia dei tessuti. (B) Cronologia del trattamento e della chirurgia del tamoxifene eseguiti nei topi. Topi illesi sacrificati il giorno 14. (C) Stampato bene 3D per contenere il tessuto cardiaco sigillato su una piastra di Petri di vetro con grasso sottovuoto. (D) Aggiunta di un grasso per vuoto a copra tondo sigillato sulla parte superiore del pozzo stampato in 3D sulla parte superiore del pozzo inferiore. (E) Tessuto ripulito cuore nel pozzo inferiore dell'apparato di tenuta dei tessuti, riempito con soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione (RIMS). Coverslip (come in D)e il pezzo superiore stampato in 3D posato sul componente inferiore del serbatoio stampato in 3D, contenente tessuto cardiaco cancellato. Il glicerolo viene aggiunto al serbatoio superiore per la microscopia ad immersione al glicerolo. Barre di scala = 1 cm. I progetti del serbatoio sono disponibili nella Figura supplementare 1. Abbreviazione: eGFP = proteina fluorescente verde migliorata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Aspetto visivo delle fasi di pulizia dei tessuti cardiaci.
(A) Da sinistra a destra: ventricolo sinistro non chiaro, ventricolo sinistro elettroforeso, ventricolo sinistro elettroforeso trattato con reticolo incrociato, ventricolo sinistro elettroforeso trattato con reticolo incrociato e incubato in RIMS. (B) Cuore topo intero non chiarito e cancellato. (C) A sinistra: ventricolo sinistro illeso e non chiaro. A destra: illeso, cancellato ventricolo sinistro. (D) A sinistra: mi ferito poco chiaro ventricolo sinistro. Destra: Cancellato mi ferito ventricolo sinistro. Barre di scala = 0,5 cm. Abbreviazione: MI = infarto miocardico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Efficacia del nuovo metodo di compensazione per cuori liberati illesi e operati in modo fittizio.
Cuori sgombrato(A) illesi (barra di scala = 400 μm) e (B) cuori a farsa (barra di scala = 500 μm) con fibroblasti Tcf21mcm x Rosa26eGFP (verde) e aree pseudocolori di maggiore fluorescenza (viola) che mostrano localizzazione dei fibroblasti. I video di accompagnamento che mostrano video di fibroblasti sono disponibili nei video supplementari S1-2. Le immagini fisse mostrano la pulizia dello sfondo e il mantenimento della fluorescenza fibroblasto-endogena (verde). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Attenuazione della perdita di fibroblasti nell'ischemia/cuori liberati feriti da riperfusione nel tempo.
Tessuto cardiaco cancellato dai punti di tempo I/R indicati con fibroblasti Tcf21MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP (verde), aree pseudocolori di maggiore fluorescenza (viola) che mostrano localizzazione dei fibroblasti e aree di delineazione arancioni prive di fibroblasti. Prima fila: immagini fisse dei ventricoli sinistro dei cuori cancellati feriti da I/R. Fila inferiore: immagini fisse dei ventricoli sinistro provenienti da cuori chiari feriti da I/R con funzione macchie di Imaris utilizzate per vedere più facilmente i modelli di fibroblasti in tutto il ventricolo sinistro. I video di cuori cancellati feriti da I/R che mostrano non solo il modello grossolano dei fibroblasti, ma anche immagini chiare dei singoli fibroblasti e delle loro morfologie possono essere trovati nei video supplementari S5-8. Barre di scala = 500 μm. Abbreviazione: I/R = ischemia/riperfusione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Attenuazione della perdita di fibroblasti cardiaci a seguito di lesioni nei cuori sgomberati feriti da infarto del miocardio nel tempo.
Tessuto cardiaco cancellato dai cuori MI con Tcf21MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP fibroblasti (verde), aree pseudocolori di maggiore fluorescenza (viola) che mostrano localizzazione dei fibroblasti e aree di delineazione arancione prive di fibroblasti. Riga superiore: Immagini fisse di ventricoli sinistro cancellati dai cuori feriti dall'MI (verde). Fila inferiore: immagini fisse di ventricoli sinistro liberati dai cuori feriti da MI (verde) con funzione macchie di Imaris (viola) sovrapposte per mostrare la distribuzione lorda dei fibroblasti. I video dei ventricoli sinistro liberati dai cuori feriti dall'MI mostrano una disposizione grave dei fibroblasti nel cuore, nonché il posizionamento e la morfologia dei singoli fibroblasti in questo modello 3D in vivo(video supplementari S7-8). Barre di scala: 1,5 giorni = 1000 μm, 3 giorni = 700 μm. Abbreviazione: MI = infarto miocardico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Tessuto eliminato dai cuori trattati con angiotensina/fenilefrina.
(A) Schema che mostra come le pompe Angiotensina/Fenilefrina vengono utilizzate per somministrare farmaci per un periodo di due settimane dopo l'attivazione del tamoxifene di Tcf21MCM x eGFP. (B) Immagine fissa, fermo immagine + macchie di Imaris e video che mostra l'organizzazione e la morfologia dei fibroblasti nei cuori trattati con Ang/PE (Video supplementare S11) Barre di scala = 500 μm. Abbreviazioni: Ang/PE = angiotensina II/fenilefrina; eGFP = proteina fluorescente verde migliorata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Immagini rappresentative del modello di fibroblasto osservato nei cuori trattati con angiotensina/fenilefrina.
(A, Ce D): Immagini di effetto di torsione dell'elica destrorsa dei fibroblasti dal punto di vista dell'esterno del ventricolo. (B) Immagine del patterning dei fibroblasti dal punto di vista dell'interno del ventricolo. Le frecce evidenziano gruppi lineari di fibroblasti che compongono il modello di torsione. Barre di scala = 500 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: rendering 2D di apparecchiature per serbatoi di imaging. (A) rendering 2D della metà inferiore del serbatoio di imaging. Questo serbatoio è sigillato alla piastra di Petri con grasso sottovuoto. Il cuore è posto nell'apertura centrale e immerso in RIMS. (B) rendering 2D della metà superiore del serbatoio di imaging. Il copripasto in vetro è adere al fondo piatto di questo pezzo con grasso sottovuoto. Questo è delicatamente posizionato sopra il serbatoio inferiore. Il serbatoio superiore può quindi essere riempito con glicerolo per l'imaging. Unità in mm. Abbreviazioni: 2D = bidimensionale; RIMS: Soluzione di corrispondenza indici di rifrazione. Clicca qui per scaricare questa cifra.

Video S1: Il tessuto illeso ha ripulito il cuore. I fibroblasti cardiaci (verdi) in un ventricolo sinistro illeso erano piccoli, e molti erano arrotondati con non più di due proiezioni cellulari. Clicca qui per scaricare questo video.

Video S2: Tessuto fittizio cuore cancellato. I fibroblasti cardiaci (verdi) nel ventricolo sinistro di un cuore di topo azionato da sham erano piccoli e per lo più rotondi con poche proiezioni, simili a quanto si vedeva nei cuori illesi. Clicca qui per scaricare questo video.

Video S3: Vista dettagliata dei fibroblasti attraverso la parete ventricolare di un cuore illeso. Questo video inizia sulla parete ventricolare interna e ingrandisce verso l'esterno del cuore. I fibroblasti cardiaci (verdi) sono stati mostrati in dettaglio e sono stati osservati avere corpi cellulari arrotondati o leggermente allungati con non più di due proiezioni cellulari. Clicca qui per scaricare questo video.

Video S4: Vista dettagliata della sezione della parete ventricolare sinistra del cuore illeso. Questa sezione larga ~300 μm del cuore di topo illeso cancellato mostra la disposizione 3D dei fibroblasti cardiaci (verdi) e le loro morfologie in dettaglio. Clicca qui per scaricare questo video.

Video S5: Cancellato il ventricolo sinistro di 3 giorni di I/R. Una visione dettagliata del ventricolo sinistro ha mostrato che a seguito di una lesione da I/R, c'è un'area di perdita di fibroblasti cardiaci. Era anche evidente che i fibroblasti (verdi) sviluppavano una forma molto più allungata in questa condizione ferita rispetto alle morfologie più arrotondate viste nei cuori illesi e finti. Abbreviazione: I/R = ischemia/riperfusione. Clicca qui per scaricare questo video.

Video S6: Cancellato il ventricolo sinistro di 7 giorni di I/R. Una visione dettagliata del ventricolo sinistro mostra che, entro 7 giorni dalla lesione da I/R, l'area priva di fibroblasti era inferiore a quella osservata dal giorno 3 dopo la lesione da I/R. C'erano più fibroblasti (verdi) presenti e, cosa interessante, erano presenti nuove morfologie cellulari. In particolare, alcuni fibroblasti avevano corpi cellulari arrotondati con protrusioni multiple, che potenzialmente indicavano un ruolo nuovo o sviluppato dei fibroblasti in questo ambiente. Abbreviazione: I/R = ischemia/riperfusione. Clicca qui per scaricare questo video.

Video S7: Ventricolo sinistro cancellato di I/R di 14 giorni. Una vista dettagliata del ventricolo sinistro ha mostrato che c'era ancora un'area centrale nella parete ventricolare che aveva pochissimi fibroblasti ma i fibroblasti (verdi) alla periferia di questo vuoto hanno mantenuto la morfologia altamente allungata vista nei campioni post-I/R del giorno 7. È interessante notare che i pochi fibroblasti presenti nella regione ferita avevano una morfologia come quella nei cuori illesi, piccoli e arrotondati. Abbreviazione: I/R = ischemia/riperfusione. Clicca qui per scaricare questo video.

Video S8: Ventricolo sinistro cancellato di 28 giorni I/R. Una visione dettagliata dei fibroblasti cardiaci (verdi) il giorno 28 successivo alla lesione da I/R ha mostrato che c'era una piccola area nella regione ferita che mancava di fibroblasti. È stato anche osservato che c'era una regione ad alta densità di fibroblasti che circondava questa regione, e che le morfologie in questa densa area erano molto allungate. Abbreviazione: I/R = ischemia/riperfusione. Clicca qui per scaricare questo video.

Video S9: Cancellato il ventricolo sinistro di MI di 1,5 giorni. C'erano pochissimi fibroblasti cardiaci (verdi) rimasti nel ventricolo sinistro ferito a 1,5 giorni dopo l'MI, morte di fibroblasti cardiaci in tutta questa regione del ventricolo. Abbreviazione: MI = infarto miocardico. Clicca qui per scaricare questo video.

Video S10: Cancellato il ventricolo sinistro di MI di 3 giorni. C'era una vasta area priva di fibroblasti cardiaci 3 giorni dopo l'MI, ma alcuni fibroblasti cardiaci (verdi) sono ricresi nel ventricolo, a differenza dei risultati trovati dopo 1,5 giorni di MI. Inoltre, i profili morfologici dei fibroblasti cardiaci erano diversi da quelli osservati nei cuori feriti da I/R. Qui i fibroblasti erano allungati ma ce n'erano altri che avevano corpi cellulari arrotondati (più grandi di quelli visti nei cuori illesi) e una sottopopolazione di questi aveva molte proiezioni cellulari. Abbreviazioni: MI = infarto miocardico; I/R = ischemia/riperfusione. Clicca qui per scaricare questo video.

Video S11: Ventricolo sinistro cancellato dei topi trattati con Ang/PE. Non vi è stata alcuna apparente perdita di fibroblasti cardiaci (verdi) a seguito del trattamento Ang/PE. Tuttavia, i fibroblasti cardiaci erano per lo più piccoli e arrotondati o piccoli e allungati e sembravano allinearsi con i modelli contrattili del cuore. Abbreviazione: Ang/PE = angiotensina II/fenilefrina. Clicca qui per scaricare questo video.

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Discussion

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Questo articolo presenta un metodo raffinato per la pulizia dei tessuti che consente la visualizzazione di fibroblasti cardiaci in vivo, sia al basale che a seguito di lesioni, per caratterizzare e comprendere meglio i fibroblasti nel cuore del topo. Questo protocollo avanzato affronta le limitazioni nei protocolli di compensazione dei tessuti esistenti che hanno tentato di identificare tipi di cellule specifiche nel cuore adulto o neonatale12,13,14,16,17,20. Nei primi tentativi di liberare il cuore del topo, è stata utilizzata la tecnica passiva CLARITY, in cui il cuore è stato lasciato in un tampone di compensazione su un nutator per circa 1 settimana per consentire la distribuzione passiva del tampone in tutto iltessuto 15,18. Questo processo ha prodotto solo una compensazione di circa 80 μm di profondità nel tessuto (dati non mostrati), il che è coerente con le osservazioni precedenti in base alle quali erano necessarie diverse settimane per cancellare un cuore di topo neonatale di 1 giorno13. La CHIAREZZA attiva utilizzando un sistema di elettroforesi attiva ha permesso una pulizia più profonda attraverso l'intera parete ventricolare, profonda circa 700 μm–1 mm, su un lasso ditempo più breve 12,18.

Tuttavia, l'utilizzo di questo protocollo CLARITY attivo precedentemente pubblicato ha portato a una perdita di fluorescenza dei fibroblasti con alti livelli di autofluorescenza tissutale, che in precedenza era stato notato accadere in clarity attivo da Kolesova etal. Per consentire il mantenimento della fluorescenza dei fibroblasti, è stato riscontrato che l'adeguato protocollo di fissazione è della massima importanza. Troppo a corto di un processo di fissazione ha causato la perdita di fluorescenza durante l'elettroforesi. Troppo a lungo di un processo di fissazione ha causato la perdita di fluorescenza stessa. Pertanto, la fissazione notturna a 4 °C nel 4% di PFA è risultato ottimale. Per migliorare il problema della fluorescenza di fondo, è stato utilizzato un ammollo di decolorazione (un principio preso in prestito dal metodo CUBIC di compensazione) per ridurre il legame dell'eme all'interno della mioglobina, e quindi ridurre l'autofluorescenza causata da questo cromoforo18. Il trattamento di decolorazione ha portato a una più robusta pulizia della fluorescenza di fondo, con il mantenimento della fluorescenza del reporter in modo che i fibroblasti etichettati fossero più pronunciati(Figura 2A).

Infine, per consentire la piena trasparenza ottica, il tessuto è stato equilibrato in Refractive Index Matching Solution (RIMS) (Figura 2B-D). Abbinando l'indice di rifrazione del tessuto all'ambiente circostante, ciò ha aumentato la trasparenza ottica del tessuto, consentendo immagini più profonde. La scansione risonante ad alta velocità è stata quindi utilizzata per l'immagine del tessuto in quanto è più veloce della scansione galvanometrica. Poiché i cuori del mouse sono di dimensioni leggermente diverse, sono stati impostati singoli parametri di imaging XY e correzioni di intensità Z. Con questi parametri, è stato possibile l'immagine attraverso il cuore illeso per visualizzare i fibroblasti fluorescenti in circa 4 ore(Figura 3). La qualità dell'immagine è stata migliorata nell'elaborazione post-imaging utilizzando il software di analisi unmixing e denoising per ridurre lo sfondo e chiarire la fluorescenza presente nell'immagine. Inoltre, è stato utilizzato un software di analisi secondaria per evidenziare la localizzazione dei fibroblasti fluorescenti. Questa analisi post-imaging è stata utilizzata per annotare chiaramente i fibroblasti cardiaci eliminando il voxel di fondo per voxel (Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6).

Questo protocollo CLARITY ottimizzato è stato applicato per cancellare otticamente sia i cuori feriti che i cuori illesi. Ciò consente una migliore comprensione della reazione dei fibroblasti cardiaci alle lesioni. Queste lesioni includevano un corso di tempo di MI e I / R, così come il dosing Ang / PE. Poiché la lesione ischemica indebolisce il tessuto cardiaco, è fondamentale prestare maggiore attenzione durante l'elettroforesi per mantenere l'integrità dei tessuti. Infatti, sia per le lesioni da I/R che per mi, è richiesto un periodo più breve di elettroforesi (≤1,5 ore)32. Studi precedenti non hanno preso in considerazione gli effetti della lesione sul processo di compensazione dei tessuti. Il protocollo appena ottimizzato qui presentato ospita lesioni, consentendo la pulizia senza ulteriore distruzione del tessuto.

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Disclosures

Gli autori non hanno informazioni relative al contenuto di questo manoscritto.

Acknowledgments

Gli autori vorrebbero riconoscere il CCHMC Confocal Imaging Core per la loro assistenza e guida nello sviluppo di questo modello, nonché Matt Batie di Clinical Engineering per la progettazione di tutte le parti stampate in 3D. Demetria Fischesser è stata sostenuta da una borsa di formazione del National Institutes of Health (NHLBI, T32 HL125204) e Jeffery D. Molkentin è stata sostenuta dall'Howard Hughes Medical Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-0 braided silk Ethicon K871H
8-0 prolene Ethicon 8730H
40% Acrylamide Solution Bio-Rad 1610140
Angiotensin II Sigma A9525-50G
Artificial Tear Ointment Covetrus 048272
DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane) Millipore Sigma D27802-25G
GLUture topical tissue adhesive World Precision Instruments 503763
Heparin Sigma H0777
Imaris Start Analysis Software Oxford Instruments N/A
Micro-osmotic pumps Alzet Model 1002
Nikon Elements Analysis Software Nikon N/A
Nikon A1R HD upright microscope Nikon N/A
Normal autoclaved chow Labdiet 5010
Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N,
N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide
CosmoBio AXS-1002424
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Phenylephrine Hydrochloride Sigma P6126-10G
Photoinitiator Wako Chemicals VA-044
Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] Jackson Laboratories Jax Stock No:012429
Sodium Azide Sigma Aldrich S2002-5G
Sodium Chloride solution Hospira, Inc. NDC 0409-4888-10
Tamoxifen Sigma Aldrich T5648
Tamoxifen food Envigo TD.130860
Tween-20 Thermo Fisher Scientific BP337-500
Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent Millipore Sigma 122262-1L
X-Clarity electrophoretic clearing chamber Logos Biosystems C30001
X-Clarity electrophoretic clearing solution Logos Biosystems C13001
X-Clarity electrophoresis tissue basket Logos Biosystems C12001
X-Clarity electrophoresis tissue basket holder Logos Biosystems C12002

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References

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Raffinata compensazione dei tessuti basata su CLARITY per l'organizzazione tridimensionale dei fibroblasti nei cuori di topo sani e feriti
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Fischesser, D. M., Meyer, E. C., Sargent, M., Molkentin, J. D. Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts. J. Vis. Exp. (171), e62023, doi:10.3791/62023 (2021).More

Fischesser, D. M., Meyer, E. C., Sargent, M., Molkentin, J. D. Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts. J. Vis. Exp. (171), e62023, doi:10.3791/62023 (2021).

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