Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Raffinert CLARITY-basert vevsrydding for tredimensjonal fibroblastorganisasjon i sunne og skadde musehjerter

doi: 10.3791/62023 Published: May 16, 2021

Summary

En raffinert metode for vevsrydding ble utviklet og brukt på det voksne musehjertet. Denne metoden ble designet for å fjerne tett, autofluorescerende hjertevev, samtidig som den opprettholder merket fibroblastfluorescens tilskrevet en genetisk reporterstrategi.

Abstract

Kardiovaskulær sykdom er den mest utbredte årsaken til dødelighet over hele verden og er ofte preget av økt hjertefibrose som kan føre til økt ventrikulær stivhet med endret hjertefunksjon. Denne økningen i hjerte ventrikulær fibrose skyldes aktivering av bosatte fibroblaster, selv om hvordan disse cellene opererer i det 3-dimensjonale (3D) hjertet, ved baseline eller etter aktivering, ikke er godt forstått. For å undersøke hvordan fibroblaster bidrar til hjertesykdom og deres dynamikk i 3D-hjertet, ble det utviklet en raffinert CLARITY-basert vevsryddings- og avbildningsmetode som viser fluorescerende merkede hjertefibroblaster i hele musehjertet. Vevsboende fibroblaster ble genetisk merket ved hjelp av Rosa26-loxP-eGFP florescent reporter mus krysset med hjertefibroblast som uttrykker Tcf21-MerCreMer knock-in linje. Denne teknikken ble brukt til å observere fibroblast lokaliseringsdynamikk gjennom hele voksen venstre ventrikel hos friske mus og i fibrotiske musemodeller av hjertesykdom. Interessant, i en skademodell, ble unike mønstre av hjertefibroblaster observert i det skadede musehjertet som fulgte bånd av innpakkede fibre i kontraktilretningen. I iskemiske skademodeller oppstod fibroblastdød, etterfulgt av repopulering fra den infarkte grensesonen. Samlet gir denne raffinerte hjertevevsklargjøringsteknikken og digitalisert bildebehandlingssystem mulighet for 3D-visualisering av hjertefibroblaster i hjertet uten begrensningene av antistoffinntrengningssvikt eller tidligere problemer rundt tapt fluorescens på grunn av vevsbehandling.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Selv om kardiomyocytter utgjør den største volumfraksjonen i hjertet, er hjertefibroblaster mer rikelig og er kritisk involvert i å regulere de grunnleggende strukturelle og reparative egenskapene til dette organet. Hjertefibroblaster er svært mobile, mekanisk responsive og fenotypiske, avhengig av omfanget av aktiveringen. Hjertefibroblaster er nødvendige for å opprettholde normale nivåer av ekstracellulær matrise (ECM), og for lite eller for mye ECM-produksjon av disse cellene kan føre til sykdom1,2,3. Gitt deres betydning i sykdom, har hjertefibroblaster blitt et stadig viktigere tema for undersøkelse mot å identifisere nye behandlingsstrategier, spesielt i forsøk på å begrense overdreven fibrose4,5,6,7. Ved skade aktiverer og differensierer fibroblaster til en mer syntetisk celletype kjent som en myofibroblast, som kan være proliferativ og utskiller rikelig ECM, samt har kontraktil aktivitet som bidrar til å ombygge ventriklene.

Mens hjertefibroblaster har blitt grundig evaluert for sine egenskaper i 2D-kulturer6,8,9,10, er mye mindre forstått av deres egenskaper og dynamikk i 3D levende hjerte, enten ved baseline eller med sykdomstimulering. Her har en raffinert metode blitt beskrevet for å vev fjerne det voksne musehjertet mens du opprettholder fluorescensen til fibroblaster merket med et Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer genetisk reportersystem. I hjertet er Tcf21 en relativt spesifikk markør for passiv fibroblaster4. Etter at tamoxifen er gitt for å aktivere det induserbare MerCreMer-proteinet, vil i hovedsak alle quiescent fibroblaster permanent uttrykke forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP) fra Rosa26-locus, noe som gjør det mulig for deres sporing in vivo.

Det finnes mange veletablerte vevsryddingsprotokoller, hvorav noen er brukt på hjertet11,12,13,14,15,16,17. Imidlertid har mange av reagensene som brukes i forskjellige vevsryddingsprotokoller blitt funnet å slukke endogene fluorescenssignaler18. I tillegg er voksenhjertet vanskelig å fjerne på grunn av rikelig heme gruppeholdige proteiner som genererer autofluorescence19. Derfor var målet med denne protokollen å bevare fibroblastmarkørfluorescens med samtidig hemming av heme autofluorescence i det skadede voksne hjertet for optimal 3D-visualisering in vivo12,13,14,16,17,20.

Tidligere studier som forsøkte å undersøke hjertefibroblast in vivo brukte perfused antistoffer for å merke disse cellene, selv om slike studier var begrenset av antistoff penetrasjon og hjertevaskulær struktur14,16,17,20. Selv om Salamon et al. har vist vevsrydding med vedlikehold av aktuell nevronal fluorescens i neonatalhjertet, og Nehrhoff et al. har vist vedlikehold av fluorescens som markerer myeloide celler, er vedlikehold av endogen fluorescens gjennom hele ventrikkelveggen ennå ikke demonstrert, inkludert visualisering av voksne hjertefibroblaster ved baseline eller etter skade13,20. Denne vevsryddingsprotokollen foredler en blanding av tidligere protokoller basert på CLARITY-metoden (klar lipid-utvekslet akrylamid-hybridisert stiv imaging / immunostaining / in situ-hybridiseringskompatibel vevshydrgel) og PEGASOS (polyetylenglykol (PEG)-assosiert løsningsmiddelsystem). Denne raffinerte protokollen tillot en mer robust undersøkelse av hjertefibroblaster i musehjertet ved baseline og hvordan de reagerer på ulike typer skader. Protokollen er grei og reproduserbar og vil bidra til å karakterisere oppførselen til hjertefibroblaster in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle eksperimenter med mus ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Cincinnati Children's Hospital Medical Center. Institusjonen er også AAALAC (American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care) sertifisert. Mus ble euthanized via cervical dislocation, og mus som gjennomgår overlevelse kirurgiske prosedyrer ble gitt smertelindring (se nedenfor). Alle metoder som brukes for smertebehandling og eutanasi er basert på anbefalinger fra panelet om eutanasi fra American Veterinary Medical Association. Alle mus ble plassert i maiskolbelagte enheter med vann og mat tilgjengelig til enhver tid. Mus ble plassert 4 til et bur med samme kjønn. For kirurgi eller uskadet vevsrydding ble like mange 6-8 uker gamle mannlige og kvinnelige mus brukt.

MERK: Sterile kirurgiske tilstander ble opprettholdt i alle operasjoner. Kirurgen skiftet til rene skrubber og en steril kjole og deretter donned skodeksler og et hårnett. Kirurgen skrubbet deretter hendene med klorhexidin og donned sterile kirurgiske hansker. Kirurgen ble assistert av en tekniker som bedøvet, barberte og skrubbet snittstedet 3 ganger hver, vekslende mellom 2% klorohexidin glukonat og 70% isopropanol. Musene ble deretter brakt til kirurgen, og kirurgi ble utført. Mellom dyr ble instrumentene sterilisert i en perlesterilisator.

1. Cre rekombinasjon

  1. Kryss Rosa26-loxP-eGFP mus (Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]) med Tcf21-MerCreMer-mus (Figur 1A)6,21.
  2. Når avkom av dette korset når 6 ukers alder, administrer en intraperitoneal injeksjon på 75 mg / kg tamoxifen oppløst i maisolje. 22 Administrer denne tamoksifen to ganger, 48 timer fra hverandre (Figur 1B).
  3. Etter tamoxifen injeksjoner, legg musene på en diett av tamoxifen mat (~ 0,4 g / kg tamoxifen citrat) i en uke. Etter en uke med tamoxifen chow, returner musene til en vanlig autoklavert chow diett i en uke før du utfører kirurgi (Figur 1B). Angi et passende antall mus (3 per kirurgisk tilstand) som skal være uskadede kontroller. Ofre disse musene, og fortsett til clearingprosessen avgrenset nedenfor etter den ene uken med vanlig chow diett.
  4. Etter tamoksifenregimet og rekombinasjonen, utfør kirurgi.

2. Kirurgiske modeller

  1. Iskemi/reperfusjon (I/R)23,24
    1. Bedøv mus med 1,5% isoflurangass i romluft i en ventilert boks; barber brystet og nakken med elektriske clippers, og skrubb deretter de barberte områdene med en 2% klorhexidin glukonat-gjennomvåt vattpinne.
    2. Bruk kunstig tåre salve for å forhindre tørrhet under operasjonen ved å plassere salve på øynene til de bedøvede musene.
    3. Utfør en midt-hals kutt ved hjelp av kirurgisk saks for å tillate visualisering av luftrøret. Intuber med et 20 G kateter ved å plassere intubasjonsrøret i luftrøret og visualisere trakealkateteret gjennom midthalsens snitt. Plasser musene på en respirator mens de er bedøvet med isoflurangass (1,5%) i romluft.
    4. Lag et snitt under venstre fremre lem med kirurgisk saks, og kutt intercostalmuskulaturen mellom ribber 3 og 4. Spred ribbenene åpne ved hjelp av en retraktor.
    5. Legg en liten svamp gjennomvåt i saltvann mellom lungen og hjertet for å forhindre skade på lungen.
    6. Bruk en fiskekrok nål (6,5 mm, 3/8 c), bind venstre koronararterie med en utleid glideknute ved hjelp av 8-0 prolen.
    7. Fjern svampen med tang.
    8. Suturer intercostal musklene lukket ved hjelp av 4-0 flettet silke og en kontinuerlig sutur samtidig som du eksteriører slutten av 8-0 prolene slip knute.
    9. Lukk hudinnsnittene ved hjelp av aktuelt vevslim med enden av okkluderende glideknuten som stikker ut.
    10. Etter en time med okklusjon trekker du den ytre enden av glideknuten for å frigjøre koronararteriens okklusjon internt, lindre iskemien og forårsake reperfusjon.
    11. Administrer 0,02 ml av en 1 mg/ml forlenget frigjøringsbulprenorfin via subdermal injeksjon (72 h frigjøring) som smertestillende, og plasser musene i et oksygenert inkubasjonskammer ved 37 °C, atskilt fra andre dyr. Overvåk musene minst hver 15 min til de har kommet seg fra anestesi og er i stand til å opprettholde en sternal eller sittestilling. Returner musene til deres vanlige hus.
    12. Vurder dyrene for smerte og nød i 48 timer etter operasjonen, og overvåk snittstedet daglig til det er fullstendig helbredet.
    13. Observer musene for hydrering, næring og generelt velvære etter operasjonen til offer.
  2. Hjerteinfarkt (MI)25,26,27
    1. Utfør trinn 2.1.1–2.1.7.
    2. Bruk en kontinuerlig sutur for å lukke intercostal muskler ved hjelp av 4-0 flettet silke.
    3. Lukk hudinnsnittet ved hjelp av aktuelt vevslim.
    4. Utfør trinn 2.1.11–2.1.13.
  3. Angiotensin II/fenylefrin mikro-osmotisk pumpeinfusjon
    1. Forbered Forbered en 10 μg/μL arbeidsløsning av angiotensin II og 500 μg/μL arbeidsløsning av fenylefrin under sterile forhold (dvs. i en laminær strømningshette) ved å tilsette 1 mg angiotensin II til 100 μL steril fosfatbufret saltvann (PBS) og 250 mg fenylefrinhydroklorid i 500 μL PBS.
    2. Beregn fortynning av hver arbeidsløsning og sluttvolum for å dispensere til den mikro-osmotiske pumpen basert på musevekt.
      MERK: En mus på 20 g krever for eksempel 20 g x 14 dager x 1,5 μg/dag = 420 μg angiotensin, eller 42 μL arbeidsløsning, samt 20 g x 14 dager x 50 μg/dag = 14000 μg fenylefri hydroklorid, eller 28 μl arbeidsløsning.
    3. For vekten av hver mus, fortynn arbeidsmassen til legemidlet i steril PBS og fyll de mikro-osmotiske pumpene (0,25 μL / t, 14 dager, ca. 100 μL) ved hjelp av en 27 G nål og 1 ml sprøyte.
      MERK: Dette vil generere en strømningshastighet på 1,5 μg∙g-1∙dag-1 angiotensin II og 50 μg∙g-1∙dag-1 av fenylefrinhydroklorid en gang plassert i musene.
    4. Bedøv musene med 1,5% isofluraninnånding (til effekt) i et ventilert kammer som inneholder romluft.
    5. Plasser de bedøvede musene på et sterilt kirurgisk bord i opinstilling, og oppretthold anestesi med isoflurangassinnånding (1,5%) gjennom en nesekjegle.
    6. Bruk kunstig tåre salve på dyrets øyne for å forhindre tørrhet under operasjonen.
    7. Barber pelsen over implantasjonsområdet med elektriske hårklippere, og steriliser området som skal kuttes ved hjelp av etanol og en steril vattpinne. Lag et lite snitt (ca. 1 cm) med kirurgisk saks i det epidermale laget av musehuden på høyre side av ryggen, under skulderbladet. Bruk de kjedelige sidene av en par kirurgiske saks for å forsiktig strekke huden i og rundt implantasjonsområdet for å sette inn minipumpen.
    8. Plasser den mikro-osmotiske pumpen innenfor snittet, og manøvrer den fysisk til venstre for musens dorsale midtlinje ved å massere pumpen manuelt under huden.
    9. Lukk snittet via kontinuerlig sutur ved hjelp av 4-0 silke med en konisk nål.
    10. Etter pumpeimplantasjon, administrer langsom frigjøring buprenorfin i en dose på 0,1 mg/kg kroppsvekt via subdermal injeksjon for analgesi (72-timers langsom frigjøring). Plasser musene i et oksygenert inkubasjonskammer ved 37 °C, atskilt fra andre dyr. Overvåk musene minst hver 15 min til de gjenoppretter fra anestesi og kan opprettholde en sternal eller sittestilling.
    11. Ved utvinning fra anestesi i 37 °C varmekammer, plasser musene tilbake i sine standard boligenheter.
    12. Overvåk musene for smerte og nød i 48 timer etter operasjonen, og overvåk snittstedet daglig til det er fullstendig helbredet.
    13. Observer musene for hydrering, næring og generelt velvære etter operasjonen til offer.

3. Rydding av voksne musehjerter ved hjelp av en modifisert aktiv CLARITY-protokoll

  1. Forbered et rent kirurgisk område ved å sterilisere operasjonsoverflaten og alle kirurgiske verktøy med 70% etanol. Forbered en løsning av kald 1x PBS og 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS (100 ml hver). Bruk hansker, labfrakk, ansiktsmaske og øyebeskyttelse.
  2. Forbered heparinbufferen ved å fortynne 10 enheter heparin i 0,9% m/v natriumkloridoppløsning. Injiser hver mus intraperitonealt med 60 μL heparin-NaCl ved hjelp av en 1 ml sprøyte og 27 G nål.
  3. Fem minutter etter injeksjonen av heparin-NaCl-oppløsning, bedøv musene ved hjelp av 1,5% isofluraninnånding (til effekt) i et ventilert kammer som inneholder romluft.
  4. Euthanize musene ved cervical dislokasjon, hvor baksiden av hodet holdes med den flate, lukkede enden av tang, mens ryggsøylen er dislocated ved å trekke halen.
  5. Rengjør musens ventrale overflate med 70% etanol på en bomullspinne. Lag et 3 cm tverrsnitt ca. 3 cm under xiphoid-prosessen ved hjelp av kirurgisk saks.
  6. Skill huden fra det underliggende bukveggvevet ved å degloving magen opp til xiphoid-prosessen (hold huden nærmest halen og trekk huden nærmest hodet opp mot ribbeina). Lag et 2 cm tverrsnitt i det subkutane bukveggvevet 3 cm under xiphoid-prosessen ved hjelp av kirurgisk saks. Lag et vertikalt kutt fra dette tverrgående snittet, opp midtlinjen og gjennom ribbeina. Fest ribbeina tilbake og eksponer hjertet.
  7. Bruk en 27 G nål og 10 ml sprøyte for å injisere kald PBS i den overlegne vena cava og aorta (enhver posisjonell manipulering av hjertet bør gjøres nøye med stumpe tang for å unngå punktering) for å fjerne blod fra hjertet.
    MERK: Tilstrekkelig perfusjon kan noteres ved halerykninger og misfarging av lungene.
  8. Bruk en 27 G nål og 10 ml sprøyte for å injisere kald 4% PFA i den overlegne vena cava og aorta for å starte fikseringsprosessen.
  9. Sluke hjertene. Atri, høyre ventrikel og septum, og venstre ventrikel skal skilles ved hjelp av en rettblads skalpell. Plasser dette vevet i et 15 ml sentrifugerør fylt med kald 4% PFA, og legg på en mutter ved 4 °C over natten.
  10. Vask hjertet 3 ganger i 1 time hver med kaldt 1x PBS for å fjerne overflødig PFA.
  11. Forbered hydrogelen (kalt A4P0 for relativ akrylamid/polyakrylamidsammensetning) ved å blande følgende kjemikalier i et 15 ml sentrifugerør: 10% av 40% akrylamid, 10% 1x PBS, 80% destillert vann.
  12. Tilsett 0,25% oppløsning av fotoinitiatoren (2,2-Azobis[2-(2-imidazolin-2yl)propan)dihydrochloride) til hydrogeloppløsningen like før du senker hjertet i hydrogelen.
  13. Plasser hjertet i et konisk rør som inneholder hydrogelen. Vikle det koniske røret i folie, og inkuber over natten ved 4 °C uten fysiske forstyrrelser.
  14. Etter ca. 14 timer ved 4 °C flytter du det koniske røret som inneholder hjertet, til et 37 °C perlebad.
  15. Etter 2,5 timer i perlebadet, fjern hjertet fra hydrogelen forsiktig med tang.
  16. Vask hjertene 3 ganger i 1 time hver i et 15 ml konisk rør som inneholder 1x PBS ved 37 °C på en mutter.
  17. Plasser hjertene i kurven til den aktive elektroforesemaskinen ved hjelp av tang, og legg lokket på kurven. Påse at lokket sitter godt på plass.
  18. Fyll det aktive elektroforesekammerbeholderen med elektroforetisk avregningsløsning ved å helle oppløsning i kammeret.
  19. Når kammeret er fullt av elektroforetisk clearingløsning, kan kurven som inneholder hjertet nedsenkes. Plasser hetten sikkert på elektroforesemaskinen.
  20. Kjør elektroforesemaskinen ved 1,5 A, 37 °C i 1,5 timer.
  21. Etter 1,5 h elektroforese, kontroller hjertene visuelt for å sikre at det ikke gjenstår noe ugjennomsiktig vev. Hvis vevets regioner fortsatt er ugjennomsiktige, senk hjertet i elektroforeseoppløsning i det elektroforetiske kammeret, og fortsett elektroforese i 0,5 timer om gangen.
    MERK: Elektroforese bør seponeres ved første tegn på vevsskade (for eksempel vevsfraying).
  22. Vask hjertene i 15 ml konisk rør som inneholder 1x PBS i 1 t, 3 ganger hver, ved 37 °C på en mutter.
  23. Senk hjertene ned i et 15 ml konisk rør som inneholder N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)etylendiamin – et decolorizing middel som reduserer heme autofluorescence.
    MERK: Denne løsningen bør skiftes hver 24.
  24. Vask hjertene i et 15 ml konisk rør med 1x PBS 3 ganger i 1 time hver for å fjerne overflødig decolorizing agent.
  25. Forbered brytningsindeksmatchingsløsning (RIMS) ved å kombinere 30 ml 0,02 M fosfatbuffer, 40 g 5-(N-2, 3-dihydroksypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroksypropyl) er oftalamid med røring (må være helt oppløst – dette kan ta opptil en time), 5 mg natriumazid, 50 μL Tween20 og 1 g 1,4-diazykabiclo[2.2.2]oktan, og juster pH til 7,5.
  26. Likevekt hjertene i RIMS i 48 timer før avbildning.

4. Imaging ryddet hjerter ved hjelp av en oppreist enkelt foton konfekt mikroskop

MERK: Bildeapparatet består av den nederste halvdelen av en Petri-tallerken på 10 cm glass, et 3D-trykt bunnreservoar, en rund glassdeksler og et 3D-trykt toppreservoar (Figur 1C–E). 3D-trykte materialer ble laget internt av Cincinnati Children's Hospital Clinical Engineering Department.

  1. Bruk vakuumfett til å forsegle det 3D-trykte bunnbeholderen i en Petri-tallerken av glass ved å sette et tynt lag med vakuumfett på bunnen av det 3D-trykte stykket (Figur 1C).
    MERK: Reservoaret skal ha samme høyde som prøven som avbildes (det vil si at prøven ikke skal komprimeres av glassdekslene som er plassert på toppen av den, og prøven skal heller ikke kunne flyte og bevege seg i reservoaret).
  2. Fyll reservoaret med RIMS, og fjern alle bobler med en pipetspiss. Plasser hjertet forsiktig i RIMS med venstre ventrikkelvegg vendt opp, slik at ingen bobler blir introdusert i løsningen.
  3. Fest et glassdeksler til bunnoverflaten på det 3D-trykte toppreservoarstykket (Tilleggsfigur 1A) ved hjelp av vakuumfett (igjen ved å plassere et tynt lag med vakuumfett på det 3D-trykte stykket og plassere det på dekselslippet) (Figur 1D).
  4. Plasser glassdekslene og toppreservoaret, dekslene på siden ned, på bunnreservoaret (Supplerende figur 1B), uten innføring av bobler. Vedheftet mellom RIMS og dekselslippet vil gi en forsegling mellom de øverste og nederste reservoardelene (figur 1E).
  5. Fyll toppreservoaret med glyserol for bruk med et 10x glyserol nedsenkingsmål.
  6. Bruk et enkelt fotonmikroskop utstyrt med et multifotonsk konfokalt skannehode for å avbilde de ryddede hjertene.
  7. Senk scenen av det enkle fotonmikroskopet, og legg Petri-parabolen som inneholder prøven i midten av scenen. Løft scenen og senk 10x glyserol nedsenkingsmålet inn i glyserol i det øverste reservoaret i prøveapparatet. Sørg for at prøven er i fokus ved å se på kanten av prøven ved hjelp av okularene.
  8. Bytt fra okularvisning til kameravisning på datamaskinen ved å klikke på live-knappen.
    1. Sett X- og Y-parametrene ved først å finne den bredeste delen av vevsprøven, som skal være på bunnen av Petri-parabolen.
    2. Klikk på ND Acquisition og custom multipoint. Lag flere punkt ved først å finne midten av vevsprøven ved å bruke styrespaken til å feie fra venstre mot høyre og fra topp til bunn.
    3. Deretter, basert på størrelsen på vevet, bestem flisstørrelsen som trengs (vanligvis 6 x 5 for et 6-8 uker gammelt musehjerte). Gjør dette ved å kjøre testavbildning ved bare å registrere X- og Y-parametere (fjern merket for z under kategorien ND-anskaffelse) for å kontrollere om hele lengden og bredden på vevet ble fanget opp.
  9. Hvis du vil angi z -parametere, åpner du XYZ-navigasjonenog klikker opp- og nedikonene til du finner toppen og bunnen av eksemplet.
    1. Åpne Z-intensitetskorrigeringspanelet og juster fluorescensen øverst, midt og nederst i vevet for å korrigere for vevstetthet ved å øke eller redusere lasereffekten ved hvert z-punkt. Angi disse ved å klikke på innstilt pil til høyre for Z-intensitetskorrigeringspanelet.
    2. Sett Z-trinnstørrelsen i ND Acquisition-panelet til 5 μm.
  10. Etter at X-, Y- og Z-parametrene i hjertet er avgrenset og z-intensitetskorreksjon er satt, bruk det automatiserte oppreiste mikroskopet med et 10x glyserol-nedsenkingsmål med en resonansskanner og gallium arsenidfosfid fotomultiplierrør (GaAsP PMTs) for å avbilde de ryddede hjertene. Kontroller at det er merket av for XY- og Z-kategoriene under ND-anskaffelse, og trykk Kjør Z-korrigering.
  11. Sy sammen, unmix og denoise de resulterende bildene ved å åpne flerpunktsbildet i prosesseringsprogramvaren og klikke på sømknappen. Under bildeklikker du blind unmixing, 2 channel, og deretter finnerdu . og Under bildeklikker du på denoise.ai, og deretter klikker du på den fluorescerende kanalen du velger (dvs. GFP).
    MERK: Denne prosessen resulterer i et 3D-bilde av GFP-positive fibroblaster i hele venstre ventrikel.
  12. Bruk sekundær analyseprogramvare for å identifisere mønstre og trender i spredningen av hjertefibroblaster ytterligere. Bruk Spots-funksjonen ved å kjøre spots-veiviserprogrammet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hjertefibroblaster er avgjørende for hjertets basisfunksjon så vel som for respons på hjerteskade. Tidligere forsøk på å forstå ordningen og morfologien til disse cellene har i stor grad blitt utført i 2D-innstillinger. Imidlertid er det publisert en raffinert hjertevevsrydding (figur 2) og 3D-bildeteknikk, noe som muliggjør avansert, mer detaljert visualisering av hjertefibroblaster. Med denne bildeteknikken ble fibroblaster funnet å være tett pakket og har en spindelformet morfologi i uskadede hjerter (Figur 3, Tilleggsvideoer S1-4).

Etter at venstre ventrikulær vevsrydding hadde blitt oppnådd i et uskadet hjerte, ble protokollen brukt på flere skademodeller for å undersøke hvordan denne clearingprotokollen ville fungere når man studerte skadet hjertevev. Mus ble utsatt for I/R-skade ved midlertidig lukking av venstre koronararterie (LCA) i 1 time etterfulgt av reperfusjon som varte i 3, 7, 14 eller 28 dager. Disse eksperimentene viste at det var tap av hjertefibroblaster i den iskemiske regionen rett etter I / R-skade, men at ved dag 7 og dag 14 migrerte fibroblaster eller spredte seg for å fylle opp dette området av det skadede hjertet. Ved dag 28 var hjertefibroblastpopulasjonen rundt de skadede områdene i hjertet i sin største tetthet (Figur 4, Tilleggsvideoer S5-8).

MI-skade er en kirurgisk modell som følge av permanent LCA-ligation (ingen reperfusjon). Hjerter som hadde gjennomgått MI-kirurgi ble utskilt ved 1,5 og 3 dager etter operasjonen for fiksering, rydding og analyse. Det var svært få fibroblaster igjen i den skadde venstre ventrikelen på 1,5 dager etter operasjonen (Figur 5A, Supplemental Video S9). Men etter dag 3 utvidet fibroblaster og var til stede i det meste av venstre ventrikel bortsett fra en liten region, antagelig etter å ha migrert inn og / eller spredt seg fra en befolkning i grensesonen (Figur 5B, Supplemental Video S10). Igjen ble analyseprogramvare brukt til bedre å visualisere fibroblast lokalisering, og områder med tap av hjertefibroblaster ble skissert i oransje (Figur 5). Denne analysen viste bedre det første tapet av celler på dag 1,5 etter MI og hvordan fibroblaster enten spredte seg eller migrerte inn i det skadede området etter dag 3 for å angivelig reparere området og danne et arr.

I tillegg til iskemisk skade er reaksjonen av hjertefibroblaster til høyt blodtrykk ikke godt forstått. For å oppdage disse cellenes respons på høyt blodtrykk ble angiotensin II og fenylefrin administrert. Angiotensin II og fenylefrin (Ang/PE) er legemidler som forårsaker vedvarende høyt blodtrykk og hjertefibroblastaktivering med områder med interstitiell fibrose, bekreftet ved bruk av denne vevsryddingsprotokollen til ang/PE-behandlede hjerter (Figur 6A)5,28. I motsetning til iskemisk kirurgi fører infusjon av Ang/PE over flere uker ikke til tap av hjertevev og veggfortynning. I stedet ble et annet resultat observert i fibroblast oppførsel etter denne skaden.

Når hjertet pumper, vrir myokardiet seg etter et høyrehendt helixmønster29,30,31. I Ang/PE-skademodellen justerte fibroblastene langs aksen til dette høyrehendte helixkontraksjonsmønsteret ved hjelp av den raffinerte vevsryddingsprotokollen (Figur 6B). Hypotesen for å forklare denne oppførselen er at hjertefibroblaster sensing retningen av ventrikulære veggstammer og justert i myofibers å gi størst støtte i ECM som fibrotisk respons akutt utfoldet under agonist infusjon (Figur 7). Et annet interessant funn var at fibroblaster virket små og avrundede, i motsetning til spindelformen sett i modeller av I / R og MI-skade (Figur 6, Supplerende video S11).

Figure 1
Figur 1: Mus og materialer som brukes til vevsrydding av hjerter.
(A) Skjematisk av avlsstrategi for Tcf21-MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP mus som brukes til vevsrydding. (B) Tidslinje for tamoksifenbehandling og kirurgi utført hos mus. Uskadede mus ofret på dag 14. (C) 3D trykt godt for å holde hjertevev forseglet til en glass Petri tallerken med vakuumfett. (D) Tilsetning av rund deksler støvsugerfett forseglet til toppen av den 3D-trykte brønnen som er satt oppå den nederste brønnen. (E) Vev ryddet hjertet i den nederste brønnen av vev holding apparatet, fylt med Refractive Index Matching Solution (RIMS). Coverlip (som i D) og topp 3D trykt brønnstykke lagt over den nederste 3D-trykte reservoarkomponenten, som inneholder ryddet hjertevev. Glyserol legges til toppreservoaret for glyserol nedsenkningsmikroskopi. Skalastenger = 1 cm. Reservoartegninger finnes i supplerende figur 1. Forkortelse: eGFP = forbedret grønt fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Visuelt utseende av hjertevevsryddingsstadier.
(A) Fra venstre til høyre: uklar venstre ventrikel, elektroforert venstre ventrikel, elektroforert venstre ventrikel behandlet med crosslinker, elektroforert venstre ventrikel behandlet med crosslinker og inkubert i RIMS. (B) Uklart og ryddet hele musehjertet. (C) Venstre: uskadet, uklar venstre ventrikel. Høyre: uskadet, ryddet venstre ventrikel. (D) Venstre: Uklar MI skadet venstre ventrikel. Høyre: Ryddet MI skadet venstre ventrikel. Skalastenger = 0,5 cm. Forkortelse: MI = hjerteinfarkt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Effekt av ny clearingmetode for uskadede og skamdrevne, ryddede hjerter.
Ryddet (A) uskadet (skala bar = 400 μm) og (B) sham-operert hjerter (skala bar = 500 μm) med Tcf21mcm x Rosa26eGFP fibroblaster (grønn) og pseudocolored områder av økt fluorescens (lilla) viser fibroblast lokalisering. Tilhørende videoer som viser fibroblastvideoer finner du i Tilleggsvideoer S1-2. Stillbilder viser bakgrunnsrydding og vedlikehold av fibroblast-endogen fluorescens (grønn). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Demping av tap av fibroblaster i iskemi/reperfusjonsskadede, klarerte hjerter over tid.
Fjernet hjertevev fra de angitte I/R-tidspunktene med Tcf21MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP fibroblaster (grønn), pseudofargede områder med økt fluorescens (lilla) som viser fibroblast lokalisering, og oransje disposisjonsområder uten fibroblaster. Øverste rad: stillbilder av venstre ventrikler fra I/R-skadde, klarerte hjerter. Nederste rad: Stillbilder av venstre ventrikler fra I/R-skadde, ryddede hjerter med Imaris flekker fungerer lettere for å se fibroblastermønstre i hele venstre ventrikel. Videoer av I/R-skadde, klarerte hjerter som ikke bare viser grov mønster av fibroblaster, men også klare bilder av individuelle fibroblaster og deres morfologier finnes i Supplemental Videos S5-8. Skalastenger = 500 μm. Forkortelse: I/R = iskemi/reperfusjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Demping av tap av hjertefibroblaster etter skade i hjerteinfarkt-skadde friske hjerter over tid.
Ryddet hjertevev fra MI-hjerter med Tcf21MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP fibroblaster (grønn), pseudofargede områder med økt fluorescens (lilla) som viser fibroblast lokalisering, og oransje disposisjonsområder blottet for fibroblaster. Øverste rad: Stillbilder av vev ryddet venstre ventrikler fra MI-skadede hjerter (grønn). Nederste rad: Stillbilder av vev ryddet venstre ventrikler fra MI-skadde hjerter (grønn) med Imaris flekker funksjon (lilla) overlaid å vise brutto fibroblast distribusjon. Videoer av vev ryddet venstre ventrikler fra MI-skadede hjerter viser brutto fibroblast arrangement i hjertet samt posisjonering og morfologi av individuelle fibroblaster i denne 3D in vivo-modellen (Supplerende videoer S7-8). Skalastenger: 1,5 dag = 1000 μm, 3 dager = 700 μm. Forkortelse: MI = hjerteinfarkt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Ryddet vev fra Angiotensin/Fenylefrinbehandlede hjerter.
(A) Skjematisk som viser hvordan Angiotensin/Fenylefrinpumper brukes til å administrere legemidler over en to-ukers periode etter tamoxifen-aktivering av Tcf21MCM x eGFP. (B) Stillbilde, stillbilde + Imaris flekker, og video som viser fibroblast organisasjon og morfologi i Ang / PE-behandlet hjerter (Supplemental Video S11) Skalastenger = 500 μm. Forkortelser: Ang/PE = angiotensin II/fenylefrin; eGFP = forbedret grønt fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Representative bilder av observert fibroblastmønster i Angiotensin/Fenylefrinbehandlede hjerter.
(A, Cog D): Bilder av høyrehendt helix vridningsmønster av fibroblaster fra perspektivet til utsiden av ventrikelen. (B) Bilde av fibroblastmønster fra perspektivet på innsiden av ventrikelen. Piler fremhever lineære grupper av fibroblaster som utgjør vridningsmønsteret. Skalastenger = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur 1: 2D-gjengivelser av bildebehandlingsreservoarapparat. (A) 2D-gjengivelse av nedre halvdel av bildebehandlingsreservoaret. Dette reservoaret er forseglet til Petri-parabolen med vakuumfett. Hjertet er plassert i midtåpningen og nedsenket i RIMS. (B) 2D-gjengivelse av øvre halvdel av bildebehandlingsreservoaret. Glassdeksler festes til flat bunn av dette stykket med vakuumfett. Dette er forsiktig plassert på toppen av bunnreservoaret. Topp reservoaret kan deretter fylles med glyserol for avbildning. Enheter i mm. Forkortelser: 2D = todimensjonal; RIMS: Refraktiv indeksmatchingsløsning. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Video S1: Uskadet vev ryddet hjerte. Hjertefibroblaster (grønne) i en uskadet venstre ventrikel var små, og mange ble avrundet med ikke mer enn to cellulære projeksjoner. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Video S2: Sham vev ryddet hjerte. Hjertefibroblaster (grønn) i venstre ventrikel av et sham-operert musehjerte var små og for det meste runde med få projeksjoner, lik det som ble sett i uskadede hjerter. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Video S3: Detaljert fibroblastvisning gjennom ventrikkelveggen til et uskadet hjerte. Denne videoen begynner på den indre ventrikkelveggen og zoomer mot utsiden av hjertet. Hjertefibroblaster (grønn) ble vist i detalj og ble observert å ha avrundede eller litt langstrakte cellelegemer med ikke mer enn to cellulære projeksjoner. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Video S4: Detaljert visning av delen av venstre ventrikkelvegg av uskadet hjerte. Denne ~ 300-μm brede delen av det ryddede uskadede musehjertet viser 3D-arrangementet av hjertefibroblaster (grønn) og deres morfologier i detalj. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Video S5: Ryddet venstre ventrikel på 3 dagers I/R. Detaljert visning av venstre ventrikel viste at etter I / R-skade er det et område med hjertefibroblasttap. Det var også tydelig at fibroblaster (grønn) utviklet en mye lengre form i denne skadede tilstanden i forhold til de mer avrundede morfologiene sett i uskadede og falske hjerter. Forkortelse: I/R = iskemi/reperfusjon. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Video S6: Ryddet venstre ventrikel på 7 dagers I/R. Detaljert visning av venstre ventrikel viser at innen 7 dager etter I/R-skade var området som manglet fibroblaster mindre enn det man så på dag 3 etter I/R-skade. Det var flere fibroblaster (grønn) til stede, og interessant nok var nye cellemorfologier til stede. Spesielt hadde noen fibroblaster avrundede cellelegemer med flere fremspring, noe som potensielt indikerer en ny eller utviklet rolle som fibroblaster i dette miljøet. Forkortelse: I/R = iskemi/reperfusjon. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Video S7: Ryddet venstre ventrikel på 14 dagers I/R. Detaljert utsikt over venstre ventrikel viste at det fortsatt var et område sentralt i ventrikkelveggen som hadde svært få fibroblaster, men fibroblaster (grønn) i periferien av dette tomrommet opprettholdt den svært langstrakte morfologien sett i dag 7 post-I / R-prøver. Interessant nok hadde de få fibroblaster som var til stede i den skadede regionen en morfologi som det i uskadede hjerter - små og avrundede. Forkortelse: I/R = iskemi/reperfusjon. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Video S8: Ryddet venstre ventrikel på 28 dagers I/R. Detaljert visning av hjertefibroblaster (grønn) på dag 28 etter I/R-skade viste at det var et lite område i den skadede regionen som manglet fibroblaster. Det ble også observert at det var en region med høy fibroblasttetthet rundt denne regionen, og at morfologiene i dette tette området var svært langstrakte. Forkortelse: I/R = iskemi/reperfusjon. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Video S9: Ryddet venstre ventrikel av 1,5 dagers MI. Det var svært få hjertefibroblaster (grønne) igjen i den skadde venstre ventrikelen 1,5 dager etter MI, hjertefibroblastdød i hele denne regionen av ventrikelen. Forkortelse: MI = hjerteinfarkt. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Video S10: Ryddet venstre ventrikel av 3 dagers MI. Det var et stort område uten hjertefibroblaster 3 dager etter MI, men noen hjertefibroblaster (grønne) dukket opp igjen i ventrikelen, i motsetning til resultatene som ble funnet etter 1,5 dager med MI. Også hjertefibroblast morfologi profiler var annerledes enn de som er sett i I / R skadede hjerter. Her var fibroblaster langstrakte, men det var andre som hadde avrundede cellelegemer (større enn de som ble sett i uskadede hjerter) og en underbefolkning av disse hadde mange celleprojeksjoner. Forkortelser: MI = hjerteinfarkt; I/R = iskemi/reperfusjon. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Video S11: Ryddet venstre ventrikel av Ang/PE-behandlede mus. Det var ingen tilsynelatende tap av hjertefibroblaster (grønn) etter Ang/PE-behandling. Imidlertid var hjertefibroblaster for det meste små og avrundede eller små og langstrakte og syntes å samsvare med hjertets kontraktile mønstre. Forkortelse: Ang/PE = angiotensin II/fenylefrin. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne artikkelen presenterer en raffinert metode for vevsrydding som gjør det mulig å visualisere hjertefibroblaster in vivo, både ved baseline og etter skade, for å karakterisere og bedre forstå fibroblaster i musehjertet. Denne forbedrede protokollen tar for seg begrensninger i eksisterende vevsklareringsprotokoller som har forsøkt å identifisere bestemte celletyper i voksen- eller nyfødthjertet12,13,14,16,17,20. I de første forsøkene på å fjerne musehjertet ble den passive CLARITY-teknikken brukt, hvor hjertet ble igjen i en clearingbuffer på en mutter i omtrent 1 uke for å tillate passiv fordeling av bufferen gjennom hele vevet15,18. Denne prosessen produserte bare rydding av ca. 80 μm dybde i vevet (data ikke vist), noe som er i samsvar med tidligere observasjoner der flere uker var nødvendig for å fjerne et 1 dag gammelt neonatalt musehjerte13. Aktiv CLARITY ved hjelp av et aktivt elektroforesesystem som er tillatt for dypere rydding gjennom hele ventrikkelveggen, ca. 700 μm–1 mm dyp, over en kortere tidsramme12,18.

Bruk av denne tidligere publiserte aktive CLARITY-protokollen førte imidlertid til tap av fibroblastfluorescens med høye nivåer av vevs autofluorescens, som tidligere hadde blitt notert å forekomme i aktiv CLARITY av Kolesova et al.12. For å tillate vedlikehold av fibroblastfluorescens, ble riktig fikseringsprotokoll funnet å være av største betydning. For kort fikseringsprosess forårsaket tap av fluorescens under elektroforese. For lang fikseringsprosess forårsaket tap av fluorescens selv. Derfor ble overnattingsfiksering ved 4 °C hos 4 % PFA funnet å være optimal. For å forbedre bakgrunnsfluorescensproblemet ble det brukt en decolorization soak (et prinsipp lånt fra CUBIC-metoden for rydding) for å redusere hemebinding i myoglobin, og derfor redusere autofluorescence forårsaket av denne kromofor18. Decolorization behandling resulterte i mer robust rydding av bakgrunnsfluorescens, med vedlikehold av reporter fluorescens slik at de merkede fibroblaster var mer uttalt (Figur 2A).

Til slutt, for å muliggjøre full optisk gjennomsiktighet, ble vevet likevektet i Refractive Index Matching Solution (RIMS) (Figur 2B-D). Ved å matche vevets brytningsindeks med omgivelsene, økte dette vevets optiske gjennomsiktighet, noe som muliggjør dypere avbildning. Høyhastighets resonansskanning ble deretter brukt til å avbilde vev, da det er raskere enn galvanisometrisk skanning. Fordi musehjerter har litt forskjellige størrelser, ble individuelle XY-bildeparametere og Z-intensitetskorrigeringer angitt. Med disse parametrene var det mulig å avbilde gjennom det uskadede hjertet for å visualisere fluorescerende fibroblaster i ca. 4 timer (figur 3). Bildekvaliteten ble forbedret i etteravbildningsbehandling ved å bruke den unmixing og denoising analyse programvare for å redusere bakgrunnen og avklare fluorescensen som finnes i bildet. I tillegg ble sekundæranalyseprogramvare brukt til å markere lokalisering av fluorescerende fibroblaster. Denne postavbildningsanalysen ble brukt til å tydelig kommentere hjertefibroblaster ved å eliminere bakgrunn voxel-by-voxel (Figur 3, Figur 4, Figur 5, Figur 6).

Denne optimaliserte CLARITY-protokollen er brukt på optisk klare både skadde og uskadede hjerter. Dette gir en bedre forståelse av reaksjonen av hjertefibroblaster til skade. Disse skadene inkluderte et tidsforløp for MI og I/R, samt Ang/PE dosering. Siden iskemisk skade svekker hjertevevet, er det avgjørende at det tas større forsiktighet under elektroforese for å opprettholde vevsintegriteten. Faktisk for både I / R- og MI-skade kreves en kortere periode med elektroforese (≤1,5 h)32. Tidligere studier har ikke vurdert effekten av skade på vevsryddingsprosessen. Den nylig optimaliserte protokollen som presenteres her, har plass til skade, noe som gjør det mulig å rydde uten ytterligere ødeleggelse av vevet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen avsløringer knyttet til innholdet i dette manuskriptet.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å anerkjenne CCHMC Confocal Imaging Core for deres hjelp og veiledning i utviklingen av denne modellen, samt Matt Batie fra Clinical Engineering for utformingen av alle 3D-trykte deler. Demetria Fischesser ble støttet av et opplæringsstipend fra National Institutes of Health, (NHLBI, T32 HL125204) og Jeffery D. Molkentin ble støttet av Howard Hughes Medical Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-0 braided silk Ethicon K871H
8-0 prolene Ethicon 8730H
40% Acrylamide Solution Bio-Rad 1610140
Angiotensin II Sigma A9525-50G
Artificial Tear Ointment Covetrus 048272
DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane) Millipore Sigma D27802-25G
GLUture topical tissue adhesive World Precision Instruments 503763
Heparin Sigma H0777
Imaris Start Analysis Software Oxford Instruments N/A
Micro-osmotic pumps Alzet Model 1002
Nikon Elements Analysis Software Nikon N/A
Nikon A1R HD upright microscope Nikon N/A
Normal autoclaved chow Labdiet 5010
Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N,
N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide
CosmoBio AXS-1002424
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Phenylephrine Hydrochloride Sigma P6126-10G
Photoinitiator Wako Chemicals VA-044
Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] Jackson Laboratories Jax Stock No:012429
Sodium Azide Sigma Aldrich S2002-5G
Sodium Chloride solution Hospira, Inc. NDC 0409-4888-10
Tamoxifen Sigma Aldrich T5648
Tamoxifen food Envigo TD.130860
Tween-20 Thermo Fisher Scientific BP337-500
Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent Millipore Sigma 122262-1L
X-Clarity electrophoretic clearing chamber Logos Biosystems C30001
X-Clarity electrophoretic clearing solution Logos Biosystems C13001
X-Clarity electrophoresis tissue basket Logos Biosystems C12001
X-Clarity electrophoresis tissue basket holder Logos Biosystems C12002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagaraju, C. K., et al. Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure. Journal of the American College of Cardiology. 73, (18), 2267-2282 (2019).
  2. Yoon, S., Eom, G. H. Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions. Experimental and Molecular Medicine. 51, (12), 1-9 (2019).
  3. Borlaug, B. A., Redfield, M. M. Diastolic and systolic heart failure are distinct phenotypes within the heart failure spectrum. Circulation. 123, 2006-2014 (2011).
  4. Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the cardiac fibroblast. Circulation Journal. 80, (11), 2269-2276 (2016).
  5. Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigation. 128, (5), 2127-2143 (2018).
  6. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
  7. Sadeghi, A. H., et al. Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling. Advanced Healthcare Materials. 6, (11), 1601434 (2017).
  8. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141, (22), 4267-4278 (2014).
  9. Bruns, D. R., et al. The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation. PLoS One. 14, (8), 0220573 (2019).
  10. Skiöldebrand, E., et al. Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion. Heliyon. 3, (10), 00406 (2017).
  11. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method. Cell Research. 28, 803-818 (2018).
  12. Kolesová, H., Čapek, M., Radochová, B., Janáček, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146, (2), 141-152 (2016).
  13. Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. Capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging. Journal of Visualized Experiments. (157), (2020).
  14. Wang, Z., et al. Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution. Biomedical Optics Express. 9, (2), 423-436 (2018).
  15. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, (4), 945-958 (2014).
  16. Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12, (7), 0182072 (2017).
  17. Perbellini, F., et al. Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue. Scientific Reports. 7, 5188 (2017).
  18. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
  19. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  20. Nehrhoff, I., et al. 3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper. Biomedical Optics Express. 7, (9), 3716-3720 (2016).
  21. Yamamoto, M., et al. A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis. Genesis. 47, (2), 107-114 (2009).
  22. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50, (5), 600-613 (2011).
  23. Means, C. K., et al. Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 292, (6), 2944-2951 (2007).
  24. Michael, L. H., et al. Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 269, (6), 2147-2154 (1995).
  25. Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286, (3), 1201-1207 (2004).
  26. Patten, R. D., et al. Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 274, (5), 1812-1820 (1998).
  27. Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 45, (2), 330-338 (2000).
  28. Vagnozzi, R. J., et al. An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy. Nature. 577, 405-409 (2020).
  29. Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1, (3), 366-376 (2008).
  30. Arts, T., et al. Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle. Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).
  31. Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. P. The muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars. American Journal of Pathology. 145, (4), 868-875 (1994).
  32. Hashmi, S., Al-Salam, S. Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: A comparison. International Journal of Clinical Experimental Pathology. 8, 8786-8796 (2015).
Raffinert CLARITY-basert vevsrydding for tredimensjonal fibroblastorganisasjon i sunne og skadde musehjerter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fischesser, D. M., Meyer, E. C., Sargent, M., Molkentin, J. D. Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts. J. Vis. Exp. (171), e62023, doi:10.3791/62023 (2021).More

Fischesser, D. M., Meyer, E. C., Sargent, M., Molkentin, J. D. Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts. J. Vis. Exp. (171), e62023, doi:10.3791/62023 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter