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Medicine

Refinado CLARIDAD Basada En La Limpieza De Tejidos Para La Organización De Fibroblastos TridimensionalEs En Corazones De Ratón Sanos Y Lesionados

doi: 10.3791/62023 Published: May 16, 2021

Summary

Un método refinado de claro del tejido fue desarrollado y aplicado al corazón adulto del ratón. Este método fue diseñado para despejar el tejido cardiaco denso, autofluorescente, mientras que mantiene la fluorescencia etiquetada del fibroblasto atribuida a una estrategia genética del reportero.

Abstract

La enfermedad cardiovascular es la causa más frecuente de mortalidad en todo el mundo y a menudo se caracteriza por una fibrosis cardíaca aumentada que puede conducir a un aumento de la rigidez ventricular con una función cardíaca alterada. Este aumento en fibrosis ventricular cardiaca es debido a la activación de fibroblastos residentes, aunque cómo estas células funcionan dentro del corazón de 3 dimensiones (3-D), en la línea de fondo o después de la activación, no se entienda bien. Para examinar cómo los fibroblastos contribuyen a la enfermedad cardíaca y su dinámica en el corazón 3-D, un método refinado del claro y de la proyección de imagen CLARIDAD-basado del tejido fue desarrollado que muestra los fibroblastos cardiacos fluorescente etiquetados dentro del corazón entero del ratón. Los fibroblastos residentes del tejido fueron etiquetados genético usando los ratones florescentes del reportero de Rosa26-loxP-eGFP cruzados con el fibroblasto cardiaco que expresaba la línea knock-in de Tcf21-MerCreMer. Esta técnica fue utilizada para observar dinámica de la localización del fibroblasto a través del ventrículo izquierdo adulto entero en ratones sanos y en modelos fibróticos del ratón de la enfermedad cardíaca. Interesante, en un modelo de lesión, los patrones únicos de fibroblastos cardiacos fueron observados en el corazón dañado del ratón que siguió las vendas de fibras envueltas en la dirección contráctil. En modelos isquémicos de lesión, ocurrió la muerte del fibroblasto, seguida por la repoblación de la zona fronteriza del infarto. Colectivamente, esta técnica de clarificación de tejido cardíaco refinado y sistema de imágenes digitalizado permite la visualización en 3-D de fibroblastos cardíacos en el corazón sin las limitaciones de la falla de penetración de anticuerpos o problemas anteriores que rodean la fluorescencia perdida debido al procesamiento de tejidos.

Introduction

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Aunque los cardiomyocytes comprendan la fracción de volumen más grande del corazón, los fibroblastos cardiacos son más abundantes y están implicados críticamente en la regulación de las características estructurales y reparadoras de la línea de fondo de este órgano. Los fibroblastos cardiacos son altamente móviles, mecánicamente responsivos, y fenotípicamente que se extienden dependiendo del grado de su activación. Los fibroblastos cardíacos son necesarios para mantener los niveles normales de matriz extracelular (MEC), y muy poca o demasiada producción de MEC por estas células puede conducir a la enfermedad1,2,3. Dada su importancia en la enfermedad, los fibroblastos cardíacos se han convertido en un tema de investigación cada vez más importante hacia la identificación de nuevas estrategias de tratamiento, especialmente en el intento de limitar la fibrosis excesiva4,5,6,7. Tras la lesión, los fibroblastos se activan y se diferencian en un tipo de célula más sintética conocida como miofibroblasto, que puede ser proliferativa y secretar abundante ECM, así como tener actividad contráctil que ayuda a remodelar los ventrículos.

Mientras que los fibroblastos cardiacos se han evaluado extensivamente para sus propiedades en las culturas 2-D6,8,9,10,mucho menos se entiende de sus propiedades y dinámica en el corazón vivo 3-D, en la línea de fondo o con el estímulo de la enfermedad. Aquí, un método refinado se ha descrito para despejar el tejido del corazón adulto del ratón mientras que mantiene la fluorescencia de fibroblastos etiquetados con un sistema genético del reportero de Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer. Dentro del corazón, Tcf21 es un marcador relativamente específico de fibroblastos quietos4. Después de que el tamoxifeno se administra para activar la proteína MerCreMer inducible, esencialmente todos los fibroblastos quietos expresarán permanentemente la proteína fluorescente verde mejorada (eGFP) del locus Rosa26, lo que permite su seguimiento in vivo.

Existen numerosos protocolos de limpieza de tejidos bien establecidos, algunos de los cuales se han aplicado alcorazón 11,12,13,14,15,16,17. Sin embargo, se ha encontrado que muchos de los reactivos utilizados en diferentes protocolos de limpieza de tejidos apagan las señales endógenas de fluorescencia18. Además, el corazón adulto es difícil de despejar debido a las abundantes proteínas que contienen el grupo heme que generan autofluorescencia19. Por lo tanto, la meta de este protocolo era preservar fluorescencia del marcador del fibroblasto con la inhibición simultánea del autofluorescence del heme en el corazón adulto dañado para la visualización óptima 3-D in vivo12,13,14,16,17,20.

Estudios previos que intentaban examinar el fibroblasto cardíaco in vivo emplearon anticuerpos perfundidos para etiquetar estas células, aunque tales estudios estuvieron limitados por la penetración de anticuerpos y la estructura vascular cardíaca14,16,17,20. Aunque Salamon et al. han demostrado un claro tisular con mantenimiento de la fluorescencia neuronal tópica en el corazón neonatal, y Nehrhoff et al. han demostrado mantenimiento de las células mieloides que marcan la fluorescencia, aún no se ha demostrado el mantenimiento de la fluorescencia endógena a través de toda la pared ventricular, incluida la visualización de fibroblastos cardíacos adultos al inicio o después de una lesión13,20. Este protocolo de limpieza de tejidos refina una mezcla de protocolos anteriores basados en el método CLARITY (hidrgel tisular rígido de acrilamida hibridada por lípidos claros) y PEGASOS (polietilenglicol (PEG)-sistema de disolvente asociado). Este protocolo refinado permitió una examinación más robusta de fibroblastos cardiacos en el corazón del ratón en la línea de fondo y de cómo responden a diversos tipos de lesión. El protocolo es sencillo y reproducible y ayudará a caracterizar el comportamiento de los fibroblastos cardíacos in vivo.

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Protocol

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Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Cincinnati Children's Hospital Medical Center. La institución también cuenta con la certificación AAALAC (American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care). Los ratones fueron eutanasiados a través de la dislocación cervical, y los ratones sometidos a procedimientos quirúrgicos de supervivencia recibieron alivio del dolor (ver más abajo). Todos los métodos utilizados para el manejo del dolor y la eutanasia se basan en las recomendaciones del Panel sobre Eutanasia de la Asociación Médica Veterinaria Americana. Todos los ratones fueron alojados en unidades de ropa de cama de mazorca de maíz con agua y alimentos disponibles en todo momento. Los ratones fueron alojados 4 en una jaula con el mismo sexo. Para la cirugía o la limpieza de tejidos no lesionados, se utilizó un número igual de ratones machos y hembras de 6 a 8 semanas de edad.

NOTA: Las condiciones quirúrgicas estériles fueron mantenidas en todas las cirugías. El cirujano se cambió a exfoliantes limpios y una bata estéril y luego se ró fundas de zapatos y una red para el cabello. Luego, el cirujano se frotó las manos con clorhexidina y se ció guantes quirúrgicos estériles. El cirujano fue asistido por un técnico que sedado, afeitado, y fregado el sitio de la incisión 3 veces cada uno, alternando entre el gluconato del chlorohexidine del 2% y el isopropanol del 70%. Los ratones entonces fueron llevados al cirujano, y la cirugía fue realizada. Entre los animales, los instrumentos fueron esterilizados en un esterilizador de cuentas.

1. Recombinación de Cre

  1. Cruz Rosa26-loxP-eGFP ratones (Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]) con ratones Tcf21-MerCreMer(Figura 1A)6,21.
  2. Cuando la descendencia de este cruce alcance las 6 semanas de edad, administrar una inyección intraperitoneal de 75 mg/kg de tamoxifeno disuelto en aceite de maíz. 22 Administrar este tamoxifeno dos veces, separadas 48 h (Figura 1B).
  3. Después de las inyecciones de tamoxifeno, ponga a los ratones en una dieta de alimentos de tamoxifeno (~ 0,4 g / kg de citrato de tamoxifeno) durante una semana. Después de una semana de tamoxifeno chow, devolver los ratones a una dieta normal de chow en autoclave durante una semana antes de realizar la cirugía (Figura 1B). Designe un número apropiado de ratones (3 por condición quirúrgica) para que sean controles ilesos. Sacrifique estos ratones y proceda al proceso de limpieza delineado a continuación después de la semana de dieta normal de chow.
  4. Después del régimen de tamoxifeno y recombinación, realice la cirugía.

2. Modelos quirúrgicos

  1. Isquemia/reperfusión (I/R)23,24
    1. Anestesiar ratones con gas isoflurano al 1,5% en aire ambiente en una caja ventilada; afeitarse el pecho y el cuello con cortadoras eléctricas, y luego frotar las áreas afeitadas con un hisopo empapado en gluconato de clorhexidina al 2%.
    2. Use ungüento lagrimal artificial para prevenir la sequedad durante la cirugía colocando ungüento en los ojos de los ratones sedados.
    3. Realice un corte de la mitad del cuello usando tijeras quirúrgicas para permitir la visualización de la tráquea. Intubar con un catéter de 20 G colocando el tubo de intubación en la tráquea y visualizar el catéter traqueal a través de la incisión de la mitad del cuello. Coloque los ratones en un ventilador mientras están sedados con gas isoflurano (1,5%) en el aire de la habitación.
    4. Haga una incisión debajo de la extremidad delantera izquierda con tijeras quirúrgicas y corte los músculos intercostales entre las costillas 3 y 4. Extienda las costillas abiertas usando un retractor.
    5. Coloque una pequeña esponja empapada en solución salina entre el pulmón y el corazón para evitar daños en el pulmón.
    6. Usando una aguja anzuelo (6.5 mm, 3/8 c), ate la arteria coronaria izquierda con un nudo de deslizamiento liberable usando 8-0 prolene.
    7. Retire la esponja con el tórceps.
    8. Suturar los músculos intercostales cerrados usando seda trenzada 4-0 y una sutura continua mientras que también exterioriza el final del 8-0 nudo de deslizamiento de prolene.
    9. Cierre las incisiones de la piel usando adhesivo de tejido tópico con el extremo del nudo de deslizamiento ocluyendo que sobresale.
    10. Después de una hora de oclusión, tire del extremo exterior del nudo de deslizamiento para liberar internamente la oclusión de la arteria coronaria, aliviando la isquemia y causando reperfusión.
    11. Administrar 0,02 mL de buprenorfina de liberación prolongada de 1 mg/mL mediante inyección subdérmica (liberación de 72 h) como analgésico, y colocar los ratones en una cámara de incubación oxigenada a 37 °C, separada de otros animales. Monitoree a los ratones al menos cada 15 minutos hasta que se hayan recuperado de la anestesia y puedan mantener una posición esternal o sentada. Devolver los ratones a su alojamiento regular.
    12. Evalúe a los animales para el dolor y la señal de socorro por 48 h después de cirugía, y monitoree el sitio de la incisión diariamente hasta que esté completamente curado.
    13. Observe a los ratones para la hidratación, la nutrición y el bienestar general después de la cirugía hasta el sacrificio.
  2. Infarto de miocardio (IM)25,26,27
    1. Realice los pasos 2.1.1–2.1.7.
    2. Use una sutura continua para cerrar los músculos intercostales usando seda trenzada 4-0.
    3. Cierre la incisión de la piel usando adhesivo de tejido tópico.
    4. Realice los pasos 2.1.11–2.1.13.
  3. Infusión de bomba micro-osmótica de angiotensina II/fenilefrina
    1. Preparar Preparar preparar una solución de trabajo de 10 μg/μL de angiotensina II y 500 μg/μL de solución de trabajo de fenilefrina en condiciones estériles (es decir, en una campana de flujo laminar) añadiendo 1 mg de angiotensina II a 100 μL de solución salina tamponada de fosfato estéril (PBS) y 250 mg de clorhidrato de fenilefrina en 500 μL de PBS.
    2. Calcular la dilución de cada solución de trabajo y el volumen final a dispensar a la bomba micro-osmótica en función del peso del ratón.
      NOTA: Por ejemplo, un ratón de 20 g requiere 20 g x 14 días x 1,5 μg/día = 420 μg de angiotensina, o 42 μL de solución de trabajo, así como 20 g x 14 días x 50 μg/día = 14000 μg de clorhidrato de fenilefrina, o 28 μL de solución de trabajo.
    3. Para el peso de cada ratón, diluya el stock de trabajo de la droga en PBS estéril y llene las bombas micro-osmóticas (0.25 μL/h, 14 días, aproximadamente 100 μL) usando una aguja de 27 G y una jeringa de 1 mL.
      NOTA: Esto generará un caudal de 1,5 μg∙g-1∙día-1 de angiotensina II y 50 μg∙g-1∙día-1 de clorhidrato de fenilefrina una vez colocado en los ratones.
    4. Anestesiar los ratones con inhalación de isoflurano al 1,5% (a efecto) en una cámara ventilada que contiene aire ambiente.
    5. Coloque los ratones anestesiados en una mesa quirúrgica estéril en posición de opina, y mantenga la anestesia con inhalación de gas isoflurano (1,5%) a través de un cono de la nariz.
    6. Use ungüento lagrimal artificial en los ojos del animal para prevenir la sequedad durante la cirugía.
    7. Afeitar el pelaje sobre el área de implantación con cortadoras de pelo eléctricas, y esterilizar el área a cortar usando etanol y un hisopo estéril. Haga una pequeña incisión (aproximadamente 1 cm) con tijeras quirúrgicas en la capa epidérmica de la piel del ratón en el lado lateral derecho de la espalda, debajo del omóplato. Use los lados apagados de un par de tijeras quirúrgicas para estirar suavemente la piel dentro y alrededor del área de implantación para insertar la minibomp.
    8. Coloque la bomba micro-osmótica dentro de la incisión y manioble físicamente a la izquierda de la línea media dorsal del ratón masajeando manualmente la bomba debajo de la piel.
    9. Cierre la incisión a través de la sutura continua usando seda 4-0 con una aguja de punto cónico.
    10. Después de la implantación de la bomba, administre buprenorfina de liberación lenta a una dosis de 0,1 mg/kg de peso corporal mediante inyección subdérmica para la analgesia (liberación lenta de 72 h). Coloque los ratones en una cámara de incubación oxigenada a 37 °C, separada de otros animales. Monitoree a los ratones al menos cada 15 minutos hasta que se recuperen de la anestesia y puedan mantener una posición esternal o sentada.
    11. Tras la recuperación de la anestesia en la cámara de calentamiento de 37 °C, coloque los ratones de nuevo en sus unidades de alojamiento estándar.
    12. Monitoree los ratones para el dolor y la señal de socorro por 48 h después de cirugía, y monitoree el sitio de la incisión diariamente hasta que esté completamente curado.
    13. Observe a los ratones para la hidratación, la nutrición y el bienestar general después de la cirugía hasta el sacrificio.

3. Limpieza de corazones de ratón adultos utilizando un protocolo CLARITY activo modificado

  1. Prepare un área quirúrgica limpia esterilizando la superficie de la cirugía y todas las herramientas quirúrgicas con etanol al 70%. Preparar una solución de PBS frío 1x y paraformadehído al 4% (PFA) en PBS (100 mL cada uno). Use guantes, bata de laboratorio, máscara facial y protección para los ojos.
  2. Prepare el almacenador intermediario de la heparina diluyendo 10 unidades de heparina en la solución del cloruro de sodio del 0,9% w/v. Inyecte a cada ratón por vía intraperitoneal 60 μL de heparina-NaCl usando una jeringa de 1 mL y una aguja de 27 G.
  3. Cinco minutos después de la inyección de heparina-NaCl solución, anestesiar los ratones utilizando 1.5% isoflurano inhalación (a efecto) en una cámara ventilada que contiene aire ambiente.
  4. Eutanasiar a los ratones por dislocación cervical, en la que la parte posterior de la cabeza se sostiene con el extremo plano y cerrado de las medidas de sudadera, mientras que la columna vertebral se disloca tirando de la cola.
  5. Limpie la superficie ventral del ratón con etanol al 70% en un hisopo de algodón. Haga una incisión transversal de 3 cm aproximadamente 3 cm por debajo del proceso xifoideo usando tijeras quirúrgicas.
  6. Separe la piel del tejido subyacente de la pared abdominal desgastando el abdomen hasta el proceso xifoides (sostenga la piel más cercana a la cola y tire de la piel más cercana a la cabeza hacia arriba hacia la caja torácica). Haga una incisión transversal de 2 cm en el tejido subcutáneo de la pared abdominal 3 cm por debajo del proceso xifoideo usando tijeras quirúrgicas. Haga un corte vertical de esta incisión transversal, hasta la línea media y a través de la caja torácica. Fije la caja torácica hacia atrás, exponiendo el corazón.
  7. Use una aguja de 27 G y una jeringa de 10 ml para inyectar PBS frío en la vena cava superior y la aorta (cualquier manipulación posicional del corazón debe hacerse cuidadosamente con fórceps contundentes para evitar la punción) para eliminar la sangre del corazón.
    NOTA: La perfusión suficiente se puede observar por la contracción de la cola y la decoloración de los pulmones.
  8. Use una aguja de 27 G y una jeringa de 10 ml para inyectar PFA fría al 4% en la vena cava superior y la aorta para comenzar el proceso de fijación.
  9. Extirpar los corazones. Las aurículas, el ventrículo derecho y el tabique, y el ventrículo izquierdo deben separarse usando un bisturí de hoja recta. Coloque este tejido en un tubo centrífugo de 15 mL lleno de PFA frío al 4%, y colóquelo en un nutator a 4 °C durante la noche.
  10. Lave el corazón 3 veces durante 1 h cada una con 1x PBS frío para eliminar el exceso de PFA.
  11. Prepare el hidrogel (denominado A4P0 para la composición relativa de acrilamida / poliacrilamida) mezclando los siguientes productos químicos en un tubo de centrífuga de 15 mL: 10% de acrilamida al 40%, 10% 1x PBS, 80% de agua destilada.
  12. Añadir la solución al 0,25% del fotoiniciador (2,2-Azobis[2-(2-imidazolina-2il)propano)dihidrocloruro) a la solución de hidrogel justo antes de sumergir el corazón en el hidrogel.
  13. Coloque el corazón en un tubo cónico que contenga el hidrogel. Envuelva el tubo cónico en papel de aluminio e incube durante la noche a 4 °C sin molestias físicas.
  14. Después de aproximadamente 14 h a 4 °C, mueva el tubo cónico que contiene el corazón a un baño de cuentas de 37 °C.
  15. Después de 2.5 h en el baño de cuentas, retire el corazón del hidrogel cuidadosamente con fórceps.
  16. Lave los corazones 3 veces durante 1 h cada uno en un tubo cónico de 15 mL que contenga 1x PBS a 37 °C en un nutator.
  17. Coloque los corazones en la cesta de la máquina de electroforesis activa usando pórceps, y coloque la tapa en la cesta. Asegúrese de que la tapa esté bien en su lugar.
  18. Llene el depósito de la cámara de electroforesis activa con una solución de limpieza electroforética vertiendo la solución en la cámara.
  19. Una vez que la cámara está llena de solución de limpieza electroforética, la cesta que contiene el corazón se puede sumergir. Coloque la tapa en la máquina de electroforesis de forma segura.
  20. Haga funcionar la máquina de electroforesis a 1,5 A, 37 °C durante 1,5 h.
  21. Después de 1,5 h de electroforesis, revise los corazones visualmente para asegurarse de que no queda tejido opaco. Si las regiones del tejido todavía son opacas, vuelva a sumergir el corazón en una solución de electroforesis en la cámara electroforética y continúe con la electroforesis durante 0,5 h a la vez.
    NOTA: La electroforesis debe interrumpirse ante los primeros signos de daño tisular (por ejemplo, deshilachamiento tisular).
  22. Lave los corazones en un tubo cónico de 15 mL que contenga 1x PBS durante 1 h, 3 veces cada uno, a 37 °C en un nutator.
  23. Sumerja los corazones en un tubo cónico de 15 mL que contenga N,N,N′, N′-Tetrakis(2-Hidroxipropil)etilendiamina, un agente decolorante que reduce la autofluorescencia del heme.
    NOTA: Esta solución debe cambiarse cada 24 h hasta que los corazones estén completamente claros (aproximadamente 2 días).
  24. Lave los corazones en un tubo cónico de 15 mL con 1x PBS 3 veces durante 1 h cada uno para eliminar el exceso de agente decolorante.
  25. Prepare la solución de emparejamiento del índice de refracción (RIMS) combinando 30 mL de tampón de fosfato de 0,02 M, 40 g de 5-(N-2, 3-dihidroxipropilacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N,N'-bis (2, 3 dihidroxipropil) isoftalamida con agitación (debe disolverse por completo, esto puede tardar hasta una hora), 5 mg de azida de sodio, 50 μL de Tween20 y 1 g de 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano, y ajuste el pH a 7.5.
  26. Equilibre los corazones en RIMS durante 48 h antes de la toma de imágenes.

4. Imágenes despejó los corazones usando un microscopio confocal de fotón único vertical

NOTA: El aparato de imágenes consiste en la mitad inferior de una placa de Petri de vidrio de 10 cm, un depósito inferior impreso en 3D, una cubierta de vidrio redonda y un depósito superior impreso en 3D(Figura 1C-E). Los materiales impresos en 3D fueron hechos internamente por el Departamento de Ingeniería Clínica del Hospital de Niños de Cincinnati.

  1. Utilice la grasa de vacío para sellar el depósito inferior impreso en 3D en una placa de Petri de vidrio colocando una capa delgada de grasa de vacío en la parte inferior de la pieza impresa en 3D (Figura 1C).
    NOTA: El depósito debe tener la misma altura que la muestra que se está tomando la imagen (es decir, la muestra no debe ser comprimida por la cubierta de vidrio colocada encima de ella, y la muestra tampoco debe ser capaz de flotar y moverse dentro del depósito).
  2. Llene el depósito con RIMS y retire todas las burbujas con una punta de pipeta. Coloque el corazón en el RIMS cuidadosamente con la pared ventricular izquierda hacia arriba, asegurándose de que no se introduzcan burbujas en la solución.
  3. Adhiera una tapa de vidrio a la superficie inferior de la pieza de depósito superior impresa en 3D(Figura suplementaria 1A)utilizando grasa de vacío (de nuevo colocando una capa delgada de grasa de vacío sobre la pieza impresa en 3D y colocándola en el resguardo de la cubierta) (Figura 1D).
  4. Coloque la tapa de vidrio y el depósito superior, el lado de la cubierta hacia abajo, sobre el depósito inferior(Figura suplementaria 1B),sin la introducción de burbujas. La adhesión entre las LLANTAS y el deslizamiento de la cubierta proporcionará un sello entre las piezas del depósito superior e inferior (Figura 1E).
  5. Llene el depósito superior con glicerol para su uso con un objetivo de inmersión de glicerol 10x.
  6. Utilice un solo microscopio de fotones equipado con un cabezal de exploración confocal multifotón para obtener imágenes de los corazones despejados.
  7. Baje la etapa del microscopio de fotón único y coloque la placa de Petri que contiene la muestra en el centro del escenario. Eleve el escenario y baje el objetivo de inmersión de glicerol 10x en el glicerol en el depósito superior del aparato de la muestra. Asegúrese de que la muestra esté enfocada mirando el borde de la muestra usando los oculares.
  8. Cambie de la vista del ocular a la vista de la cámara en la computadora haciendo clic en el botón en vivo.
    1. Establezca los parámetros X e Y localizando primero la parte más ancha de la muestra de tejido, que debe estar en la parte inferior de la placa de Petri.
    2. Haga clic en Adquisición de ND y multipunto personalizado. Cree multipuntos encontrando primero el centro de la muestra de tejido utilizando el joystick para barrer de izquierda a derecha y de arriba a abajo.
    3. Luego, según el tamaño del tejido, determine el tamaño de mosaico necesario (generalmente 6 x 5 para un corazón de ratón de 6 a 8 semanas de edad). Para ello, ejecute imágenes de prueba capturando solo los parámetros X e Y (desmarque z en la pestaña Adquisición de ND)para comprobar si se capturó toda la longitud y anchura del tejido.
  9. Para establecer los parámetros z, abra la navegación XYZy haga clic en los iconos arriba y abajo hasta encontrar la parte superior e inferior de la muestra.
    1. Abra el panel de corrección de intensidad Z y ajuste la fluorescencia en la parte superior, media e inferior del tejido para corregir la densidad del tejido aumentando o disminuyendo la potencia del láser en cada punto z. Configúrándolos haciendo clic en la flecha de conjunto a la derecha del panel Corrección de intensidad Z.
    2. Establezca el tamaño del paso Z en el panel Adquisición de ND en 5 μm.
  10. Después de que se delineen los parámetros X, Y y Z del corazón y se establezca la corrección de la intensidad z, utilice el microscopio vertical automatizado con un objetivo de inmersión de glicerol 10x con un escáner resonante y tubos fotomultiplicadores de fosfuro de arseniuro de galio (PMP GaAsP) para obtener imágenes de los corazones despejados. Asegúrese de que las fichas XY y Z estén marcadas en Adquisición de NDy pulse Ejecutar corrección Z.
  11. Cose, desenrede y denoise las imágenes resultantes abriendo la imagen multipunto en el software de procesamiento y haciendo clic en el botón de puntada. En imagen, haga clic en desmezclado ciego, 2 canales, y luego encontrar. y debajo de la imagen,haga clic en denoise.ai,luego haga clic en el canal fluorescente de elección (es decir, GFP).
    NOTA: Este proceso da como resultado una imagen 3D de fibroblastos GFP positivos en todo el ventrículo izquierdo.
  12. Utilice un software de análisis secundario para identificar aún más los patrones y tendencias en la dispersión de los fibroblastos cardíacos. Utilice la función Spots ejecutando el programa del asistente de spots.

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Representative Results

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Los fibroblastos cardiacos son esenciales para la función de la línea de fondo del corazón así como para la respuesta a lesión cardiaca. Las tentativas anteriores de entender el arreglo y la morfología de estas células se han conducido en gran parte en ajustes 2-D. Sin embargo, se ha publicado una técnica de limpieza de tejido cardíaco refinada(Figura 2)y de imagen 3-D, que permite la visualización avanzada y más detallada de los fibroblastos cardíacos. Con esta técnica de imagen, se encontró que los fibroblastos estaban densamente empaquetados y tenían una morfología con huso en corazones no lesionados(Figura 3, Videos Suplementarios S1-4).

Después de que el claro ventricular izquierdo del tejido hubiera sido logrado en un corazón ileso, el protocolo fue aplicado a varios modelos de lesión para examinar cómo este protocolo del claro realizaría al estudiar el tejido dañado del corazón. Los ratones fueron sujetados a lesión de I/R por el encierro temporal de la arteria coronaria izquierda (LCA) por 1 h seguido por la reperfusión que duraba 3, 7, 14, o 28 días. Estos experimentos mostraron que había una pérdida de fibroblastos cardiacos en la derecha isquémica de la región después de lesión de I/R, pero que por el día 7 y el día 14, los fibroblastos emigraron o proliferaron para repoblar esta área del corazón dañado. Para el día 28, la población de fibroblastos cardíacos que rodeaba las áreas lesionadas del corazón se encontraban en su mayor densidad(Figura 4, Videos Suplementarios S5-8).

La lesión por IM es un modelo quirúrgico resultante de la ligadura permanente de ACV (sin reperfusión). Los corazones que habían experimentado cirugía del MI fueron suprimidos en 1,5 y 3 días que seguían la cirugía para la fijación, el claro, y el análisis. Quedaban muy pocos fibroblastos en el ventrículo izquierdo lesionado a los 1,5 días de la cirugía(Figura 5A, Vídeo Suplementario S9). Sin embargo, para el día 3, los fibroblastos se expandieron y estaban presentes en la mayor parte del ventrículo izquierdo a excepción de una pequeña región, presumiblemente habiendo migrado y/o proliferado de una población en la zona fronteriza(Figura 5B, Video Suplementario S10). Una vez más, se utilizó un software de análisis para visualizar mejor la localización de fibroblastos, y las áreas de pérdida de fibroblastos cardíacos se delinearon en naranja(Figura 5). Este análisis mejor mostró la pérdida inicial de células en el día 1,5 que seguía el MI y cómo los fibroblastos proliferaron o emigraron en esa área dañada por el día 3 para reparar ostensible el área y para formar una cicatriz.

Además de lesión isquémica, la reacción de fibroblastos cardiacos a la tensión arterial alta no se entiende bien. Para descubrir la respuesta de estas células a la presión arterial alta, se administró angiotensina II y fenilefrina. La angiotensina II y la fenilefrina (Ang/PE) son fármacos que causan presión arterial alta persistente y activación de fibroblastos cardíacos con áreas de fibrosis intersticial, confirmada mediante la aplicación de este protocolo de despeje de tejidos a corazones tratados con ang/PE(Figura 6A)5,28. En contraste con la cirugía isquémica, la infusión de Ang/PE durante varias semanas no da lugar a la pérdida de tejido cardiaco y de adelgazamiento de la pared. En lugar, un diverso resultado fue observado en comportamiento del fibroblasto que seguía esta lesión.

A medida que el corazón bombea, el miocardio se retuerce, siguiendo un patrón de hélice diestra29,30,31. En el modelo Ang/PE de lesión, los fibroblastos se alinearon a lo largo del eje de este patrón de contracción de la hélice diestra utilizando el protocolo de limpieza de tejido refinado (Figura 6B). La hipótesis para explicar este comportamiento es que los fibroblastos cardíacos estaban detectando la dirección de la tensión de la pared ventricular y alineándose dentro de los miofiberos para proporcionar el mayor apoyo dentro de la ECM a medida que la respuesta fibrótica se desarrollaba agudamente durante la infusión de agonistas(Figura 7). Otro hallazgo interesante fue que los fibroblastos parecían pequeños y redondeados, a diferencia de la forma del huso observada en los modelos de lesión por I/R y MI(Figura 6, Video Suplementario S11).

Figure 1
Figura 1: Ratones y materiales utilizados para limpiar tejidos de corazones.
(A)Esquema de la estrategia de cría para Tcf21-MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP ratones utilizados para la limpieza de tejidos. (B)Cronología del tratamiento y cirugía de tamoxifeno realizada en ratones. Ratones ilesos sacrificados el día 14. (C)3-D bien impreso para sostener el tejido cardíaco sellado a una placa de Petri de vidrio con grasa al vacío. (D)Adición de una grasa de vacío de cubierta redonda sellada en la parte superior del pozo impreso en 3D situado en la parte superior del pozo inferior. (E)Tejido despejado del corazón en el pocillo inferior del aparato de retención de tejido, lleno de solución de coincidencia de índice de refracción (RIMS). Cubrebocas (como en D)y la parte superior 3-D impreso bien pieza colocada sobre la parte inferior 3-D impreso componente del depósito, que contiene tejido del corazón despejado. El glicerol se añade al depósito superior para la microscopía de inmersión en glicerol. Barras de escala = 1 cm. Los planos de los yacimientos se pueden encontrar en la Figura suplementaria 1. Abreviatura: eGFP = proteína fluorescente verde mejorada. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Apariencia visual de las etapas de limpieza del tejido cardíaco.
(A)De izquierda a derecha: ventrículo izquierdo no claro, ventrículo izquierdo electroforizado, ventrículo izquierdo electroforizado tratado con reticulador, ventrículo izquierdo electroforizado tratado con reticulador e incubado en RIMS. (B) Despejó y despejó todo el corazón del ratón. (C) Izquierda: ventrículo izquierdo ileso, desbastado. Derecha: ventrículo izquierdo ileso y despejado. (D) Izquierda: Mi no aclarada lesionó el ventrículo izquierdo. Derecha: Mi despejada lesionado ventrículo izquierdo. Barras de escala = 0,5 cm. Abreviatura: IM = infarto de miocardio. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Eficacia del nuevo método de limpieza para corazones despejados ilesos y operados por simulacros.
Despejados(A)no lesionados (barra de escala = 400 μm) y(B)corazones operados simuladamente (barra de escala = 500 μm) con fibroblastos Tcf21mcm x Rosa26eGFP (verde) y áreas pseudocoloradas de fluorescencia aumentada (púrpura) que muestran localización de fibroblastos. Los videos adjuntos que muestran videos de fibroblastos se pueden encontrar en Videos suplementarios S1-2. Las imágenes fijas muestran el claro de fondo y el mantenimiento de la fluorescencia fibroblasto-endógena (verde). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Atenuación de la pérdida de fibroblastos en la isquemia/reperfusión de los corazones despejados con el tiempo.
Tejido cardiaco despejado de los puntos de tiempo de I/R indicados con los fibroblastos de Tcf21MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP (verde), áreas pseudocolored de la fluorescencia creciente (púrpura) que muestran la localización del fibroblasto, y áreas delineación anaranjadas desprovistas de fibroblastos. Fila superior: imágenes fijas de ventrículos izquierdos de corazones despejados I/R-dañados. Fila inferior: imágenes fijas de ventrículos izquierdos de corazones despejados lesionados por I/R con manchas de Imaris función utilizada para ver los patrones de fibroblastos más fácilmente en todo el ventrículo izquierdo. Los videos de corazones despejados lesionados por I/R que muestran no solo patrones gruesos de fibroblastos, sino también imágenes claras de fibroblastos individuales y sus morfologías se pueden encontrar en videos suplementarios S5-8. Barras de escala = 500 μm. Abreviatura: I/R = isquemia/reperfusión. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Atenuación de la pérdida de fibroblastos cardíacos después de una lesión en los corazones despejados lesionados por infarto de miocardio con el tiempo.
Tejido cardiaco despejado de corazones del MI con Tcf21MerCreMer (mcm) x los fibroblastos de Rosa26eGFP (verde), áreas pseudocolored de la fluorescencia creciente (púrpura) que muestran la localización del fibroblasto, y áreas delineación anaranjadas desprovistas de fibroblastos. Fila superior: Imágenes fijas de ventrículos izquierdos despejados de tejido de corazones lesionados por MI (verde). Fila inferior: imágenes fijas de ventrículos izquierdos despejados de tejido de corazones lesionados por EL MI (verde) con la función de manchas de Imaris (púrpura) superpuestas para mostrar la distribución bruta de fibroblastos. Los videos de ventrículos izquierdos despejados de tejido de corazones lesionados por EL MI muestran la disposición gruesa de fibroblastos en el corazón, así como el posicionamiento y la morfología de fibroblastos individuales en este modelo 3D in vivo (Videos suplementarios S7-8). Barras de escala: 1,5 día = 1000 μm, 3 días = 700 μm. Abreviatura: IM = infarto de miocardio. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Tejido despejado de corazones tratados con angiotensina/fenilefrina.
(A)Esquema que muestra cómo se utilizan las bombas de angiotensina/fenilefrina para administrar fármacos durante un período de dos semanas después de la activación del tamoxifeno de Tcf21MCM x eGFP. (B)Imagen fija, imagen fija + manchas de Imaris y video que muestra la organización y morfología de fibroblastos en corazones tratados con Ang /PE(Video Suplementario S11)Barras de escala = 500 μm. Abreviaturas: Ang/PE = angiotensina II/fenilefrina; eGFP = proteína fluorescente verde mejorada. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Imágenes representativas del patrón de fibroblastos observado en corazones tratados con angiotensina/fenilefrina.
(A, C, y D): Imágenes de la hélice diestra torciendo el patrón de fibroblastos desde la perspectiva del exterior del ventrículo. (B) Imagen del patrón de fibroblastos desde la perspectiva del interior del ventrículo. Las flechas resaltan grupos lineales de fibroblastos que componen el patrón de torsión. Barras de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura suplementaria 1: Representaciones 2D de los aparatos de reservorio de imágenes. (A) Representación 2D de la mitad inferior del depósito de imágenes. Este depósito está sellado a la placa de Petri con grasa al vacío. El corazón se coloca en la abertura central y se sumerge en RIMS. (B) Representación 2D de la mitad superior del depósito de imágenes. La cubierta de vidrio se adhiere a la parte inferior plana de esta pieza con grasa al vacío. Esto se coloca suavemente en la parte superior del depósito inferior. El depósito superior se puede entonces llenar con glicerol para la proyección de imagen. Unidades en mm. Abreviaturas: 2D = bidimensional; RIMS: Solución de coincidencia de índice de refracción. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Video S1: Corazón despejó el tejido ileso. Los fibroblastos cardiacos (verdes) en un ventrículo izquierdo ileso eran pequeños, y muchos fueron redondeados con no más de dos proyecciones celulares. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.

Video S2: Corazón despejado de tejido simulado. Los fibroblastos cardiacos (verdes) en el ventrículo izquierdo de un corazón de ratón impostor-funcionado eran pequeños y sobre todo redondos con pocas proyecciones, similares a qué fue visto en corazones ilesos. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.

Video S3: Vista detallada de fibroblastos a través de la pared ventricular de un corazón ileso. Este video comienza en la pared ventricular interior y se acerca hacia el exterior del corazón. Los fibroblastos cardiacos (verdes) fueron demostrados detalladamente y observados para tener cuerpos celulares redondeados o levemente alargados con no más de dos proyecciones celulares. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.

Video S4: Vista detallada de la sección de la pared ventricular izquierda del corazón ileso. Esta sección de ~ 300 μm de ancho del corazón de ratón ileso despejado muestra la disposición 3-D de los fibroblastos cardíacos (verde) y sus morfologías en detalle. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.

Vídeo S5: Ventrículo izquierdo despejado de 3 días de I/R. La vista detallada del ventrículo izquierdo demostró que después de lesión de I/R, hay un área de la pérdida cardiaca del fibroblasto. Era también evidente que los fibroblastos (verdes) desarrollaron una forma mucho más alargada en esta condición lesionada en comparación con las morfologías más redondeadas consideradas en corazones no lesionados y falsos. Abreviatura: I/R = isquemia/reperfusión. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.

Vídeo S6: Ventrículo izquierdo despejado de 7 días de I/R. La vista detallada del ventrículo izquierdo demuestra que por 7 días que siguen lesión de I/R, el área que carece en fibroblastos era más pequeña que ésa considerada por el día 3 que seguía lesión de I/R. Había más fibroblastos (verdes) presentes, y curiosamente, las nuevas morfologías celulares estaban presentes. Específicamente, algunos fibroblastos tenían cuerpos celulares redondeados con múltiples salientes, potencialmente indicando un papel nuevo o desarrollado de los fibroblastos en este entorno. Abreviatura: I/R = isquemia/reperfusión. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.

Vídeo S7: Ventrículo izquierdo despejado de 14 días de I/R. La vista detallada del ventrículo izquierdo demostró que todavía había un área central a la pared ventricular que tenía muy pocos fibroblastos pero los fibroblastos (verdes) en la periferia de este vacío mantuvieron la morfología altamente alargada considerada en muestras poste-I/R del día 7. Curiosamente, los pocos fibroblastos que estaban presentes en la región lesionada tenían una morfología como la de los corazones no lesionados, pequeños y redondeados. Abreviatura: I/R = isquemia/reperfusión. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.

Vídeo S8: Ventrículo izquierdo despejado de 28 días de I/R. La vista detallada de los fibroblastos cardiacos (verde) el el día 28 que seguía lesión de I/R demostró que había una pequeña área en la región lesión que careció los fibroblastos. También se observó que había una región de alta densidad de fibroblastos que rodeaba esta región, y que las morfologías en esta área densa eran altamente alargadas. Abreviatura: I/R = isquemia/reperfusión. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.

Vídeo S9: Ventrículo izquierdo despejado de 1,5 días de MI. Había muy pocos fibroblastos cardiacos (verdes) restantes en el ventrículo izquierdo dañado en 1,5 días después del MI, muerte cardiaca del fibroblasto a través de esta región del ventrículo. Abreviatura: IM = infarto de miocardio. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.

Video S10: Ventrículo izquierdo despejado de 3 días de MI. Había un área grande desprovista de fibroblastos cardiacos 3 días después del MI, pero algunos fibroblastos cardiacos (verdes) reaparecieron en el ventrículo, desesejante de los resultados encontrados después de 1,5 días de MI. También, los perfiles cardiacos de la morfología del fibroblasto eran diferentes que ésos considerados en corazones dañados de I/R. Aquí los fibroblastos eran alargados pero había otros que tenían cuerpos celulares redondeados (más grandes que ésos vistos en corazones ilesos) y una subpoblación de éstos tenía muchas proyecciones de la célula. Abreviaturas: MI = infarto de miocardio; I/R = isquemia/reperfusión. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.

Video S11: Ventrículo izquierdo despejado de ratones tratados con Ang/PE. No había pérdida evidente de fibroblastos cardiacos (verde) después del tratamiento de Ang/PE. Sin embargo, los fibroblastos cardiacos eran sobre todo pequeños y redondeados o pequeños y alargados y parecían alinearse con los patrones contráctiles del corazón. Abreviatura: Ang/PE = angiotensina II/fenilefrina. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.

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Discussion

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Este artículo presenta un método refinado para el claro del tejido que permita la visualización de fibroblastos cardiacos in vivo, en la línea de fondo y lesión siguiente, para caracterizar y para entender mejor los fibroblastos en el corazón del ratón. Este protocolo mejorado aborda las limitaciones en los protocolos de limpieza de tejidos existentes que han intentado identificar tipos específicos de células en el corazón adulto o neonatal12,13,14,16,17,20. En los intentos iniciales de despejar el corazón del ratón, se utilizó la técnica pasiva CLARITY, en la que el corazón se dejó en un tampón de limpieza en un nutator durante aproximadamente 1 semana para permitir la distribución pasiva del tampón en todo el tejido15,18. Este proceso sólo produjo la limpieza de aproximadamente 80 μm de profundidad en el tejido (datos no mostrados), lo que es consistente con las observaciones anteriores por las que se necesitaron varias semanas para despejar un corazón de ratón neonatal de 1 día de edad13. Active CLARITY utilizando un sistema de electroforesis activa permitió un despeje más profundo a través de toda la pared ventricular, aproximadamente de 700 μm–1 mm de profundidad, en un marco de tiempo más corto12,18.

Sin embargo, el uso de este protocolo clarity activo previamente publicado llevó a una pérdida de fluorescencia de fibroblastos con altos niveles de autofluorescencia tisular, que previamente había sido observado para ocurrir en la CLARIDAD activa por Kolesova et al.12. Para permitir el mantenimiento de la fluorescencia del fibroblasto, el protocolo apropiado de la fijación fue encontrado para ser de suma importancia. Demasiado corto de un proceso de fijación causó pérdida de fluorescencia durante la electroforesis. Demasiado largo de un proceso de fijación causó la pérdida de fluorescencia sí mismo. Por lo tanto, la fijación durante la noche a 4 °C en PFA al 4% se encontró que era óptima. Para mejorar el problema de la fluorescencia de fondo, se empleó un remojo de decoloración (un principio tomado del método CÚBICO de limpieza) para reducir la unión de hemo dentro de la mioglobina, y por lo tanto reducir la autofluorescencia causada por este cromóforo18. El tratamiento de decoloración resultó en un despeje más robusto de la fluorescencia de fondo, con mantenimiento de la fluorescencia del reportero para que los fibroblastos etiquetados fueran más pronunciados (Figura 2A).

Finalmente, para permitir una transparencia óptica completa, el tejido se equilibró en la solución de emparejamiento de índice de refracción (RIMS) (Figura 2B-D). Al hacer coincidir el índice de refracción del tejido con sus alrededores, esto aumentó la transparencia óptica del tejido, lo que permite una imagen más profunda. La exploración resonante de alta velocidad entonces fue utilizada para el tejido de la imagen pues es más rápida que la exploración galvanométrica. Debido a que los corazones de ratón son de tamaños ligeramente diferentes, se establecieron parámetros de imágenes XY individuales y correcciones de intensidad Z. Con estos parámetros, fue posible obtener imágenes a través del corazón ileso para visualizar fibroblastos fluorescentes en aproximadamente 4 h (Figura 3). La calidad de la imagen se mejoró en el procesamiento posterior a la imagen mediante el uso del software de análisis de desmezclado y denoising para reducir el fondo y aclarar la fluorescencia presente en la imagen. Además, el software secundario del análisis fue utilizado para destacar la localización de fibroblastos fluorescentes. Este análisis post-imagen se utilizó para anotar claramente los fibroblastos cardíacos mediante la eliminación de voxel-por-voxel de fondo(Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6).

Este protocolo CLARITY optimizado se ha aplicado para limpiar ópticamente tanto los corazones lesionados como los no lesionados. Esto permite una mejor comprensión de la reacción de fibroblastos cardiacos a lesión. Estas lesiones incluyeron un curso del tiempo del MI y de I/R, así como la dosificación de Ang/PE. Pues lesión isquémica debilita el tejido cardiaco, es crítico que el mayor cuidado esté tomado durante electroforesis para mantener integridad del tejido. De hecho, tanto para la lesión por I/R como por la IM, se requiere un período más corto de electroforesis (≤1,5 h)32. Estudios anteriores no han considerado los efectos de la lesión en el proceso de limpieza de tejidos. El protocolo nuevamente optimizado presentado aquí acomoda para lesión, permitiendo el claro sin la destrucción adicional del tejido.

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Disclosures

Los autores no tienen revelaciones relacionadas con el contenido de este manuscrito.

Acknowledgments

A los autores les gustaría reconocer al CCHMC Confocal Imaging Core por su asistencia y orientación en el desarrollo de este modelo, así como a Matt Batie de Clinical Engineering por el diseño de todas las piezas impresas en 3D. Demetria Fischesser fue apoyada por una beca de capacitación de los Institutos Nacionales de Salud , (NHLBI, T32 HL125204) y Jeffery D. Molkentin fue apoyado por el Instituto Médico Howard Hughes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-0 braided silk Ethicon K871H
8-0 prolene Ethicon 8730H
40% Acrylamide Solution Bio-Rad 1610140
Angiotensin II Sigma A9525-50G
Artificial Tear Ointment Covetrus 048272
DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane) Millipore Sigma D27802-25G
GLUture topical tissue adhesive World Precision Instruments 503763
Heparin Sigma H0777
Imaris Start Analysis Software Oxford Instruments N/A
Micro-osmotic pumps Alzet Model 1002
Nikon Elements Analysis Software Nikon N/A
Nikon A1R HD upright microscope Nikon N/A
Normal autoclaved chow Labdiet 5010
Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N,
N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide
CosmoBio AXS-1002424
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Phenylephrine Hydrochloride Sigma P6126-10G
Photoinitiator Wako Chemicals VA-044
Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] Jackson Laboratories Jax Stock No:012429
Sodium Azide Sigma Aldrich S2002-5G
Sodium Chloride solution Hospira, Inc. NDC 0409-4888-10
Tamoxifen Sigma Aldrich T5648
Tamoxifen food Envigo TD.130860
Tween-20 Thermo Fisher Scientific BP337-500
Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent Millipore Sigma 122262-1L
X-Clarity electrophoretic clearing chamber Logos Biosystems C30001
X-Clarity electrophoretic clearing solution Logos Biosystems C13001
X-Clarity electrophoresis tissue basket Logos Biosystems C12001
X-Clarity electrophoresis tissue basket holder Logos Biosystems C12002

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References

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Refinado CLARIDAD Basada En La Limpieza De Tejidos Para La Organización De Fibroblastos TridimensionalEs En Corazones De Ratón Sanos Y Lesionados
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Fischesser, D. M., Meyer, E. C., Sargent, M., Molkentin, J. D. Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts. J. Vis. Exp. (171), e62023, doi:10.3791/62023 (2021).More

Fischesser, D. M., Meyer, E. C., Sargent, M., Molkentin, J. D. Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts. J. Vis. Exp. (171), e62023, doi:10.3791/62023 (2021).

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