Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Sağlıklı ve Yaralı Fare Kalplerinde Üç Boyutlu Fibroblast Organizasyonu için Rafine CLARITY Tabanlı Doku Temizleme

doi: 10.3791/62023 Published: May 16, 2021

Summary

Rafine bir doku temizleme yöntemi geliştirildi ve yetişkin fare kalbine uygulandı. Bu yöntem, genetik bir muhabir stratejisine atfedilen etiketli fibroblast floresan korurken yoğun, otoflüoresan kalp dokusunu temizlemek için tasarlanmıştır.

Abstract

Kardiyovasküler hastalık dünya çapında en yaygın mortalite nedenidir ve genellikle değiştirilmiş kardiyak fonksiyon ile artmış ventrikül sertliğine yol açabilecek yüksek kardiyak fibrozis ile işaretlenir. Kardiyak ventrikül fibrozislerindeki bu artış, yerleşik fibroblastların aktivasyonundan kaynaklanmaktadır, ancak bu hücrelerin 3 boyutlu (3-B) kalp içinde, taban çizgisine veya aktivasyondan sonra nasıl çalıştığı iyi anlaşılamamıştır. Fibroblastların kalp hastalıklarına ve 3 boyutlu kalpteki dinamiklerine nasıl katkıda bulunduğunu incelemek için, tüm fare kalbinde floresan etiketli kardiyak fibroblastları gösteren rafine clarity tabanlı bir doku temizleme ve görüntüleme yöntemi geliştirilmiştir. Doku yerleşik fibroblastlar genetik olarak Rosa26-loxP-eGFP floresan muhabir fareleri tcf21-MerCreMer knock-in hattını ifade eden kardiyak fibroblast ile geçti kullanılarak etiketlendi. Bu teknik, sağlıklı farelerde ve kalp hastalığının fibrotik fare modellerinde tüm yetişkin sol ventrikül boyunca fibroblast lokalizasyon dinamiklerini gözlemlemek için kullanılmıştır. İlginçtir ki, bir yaralanma modelinde, kasnak yönünde sarılmış lif bantlarını takip eden yaralı fare kalbinde benzersiz kardiyak fibroblast desenleri gözlenmiştir. İskemik yaralanma modellerinde fibroblast ölümü meydana geldi, ardından enfarktüs sınır bölgesinden repopülasyon yapıldı. Toplu olarak, bu rafine kardiyak doku netleştirme tekniği ve dijitalleştirilmiş görüntüleme sistemi, antikor penetrasyon yetmezliği veya doku işleme nedeniyle kaybedilen floresan ile ilgili önceki sorunlar sınırlamaları olmadan kalpteki kardiyak fibroblastların 3 boyutlu görselleştirilmesine izin verir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kardiyomiyositler kalpteki en büyük hacim fraksiyonunu oluşturmasına rağmen, kardiyak fibroblastlar daha boldur ve bu organın temel yapısal ve onarıcı özelliklerinin düzenlenmesinde kritik olarak yer almaktadır. Kardiyak fibroblastlar, aktivasyonlarının kapsamına bağlı olarak son derece hareketli, mekanik olarak duyarlı ve fenotipik olarak değişir. Kardiyak fibroblastlar normal hücre dışı matris (ECM) seviyelerini korumak için gereklidir ve bu hücreler tarafından çok az veya çok fazla ECM üretimi hastalığa yol açabilir1,2,3. Hastalıktaki önemleri göz önüne alındığında, kardiyak fibroblastlar, özellikle aşırı fibrozis 4 ,5, 6,7'yi sınırlamaya çalışırken, yeni tedavi stratejilerini belirlemeye yönelik giderek daha önemli bir araştırma konusuhalinegelmiştir. Yaralanma üzerine fibroblastlar, ventriküllerin yeniden şekillendirilmesine yardımcı olan kasılma aktivitesinin yanı sıra proliferatif ve bol ECM salgılaabilen miofibroblast olarak bilinen daha sentetik bir hücre tipini aktive eder ve farklılaşır.

Kardiyak fibroblastlar 2-B kültürleri 6 ,8,9,10'daki özellikleri için kapsamlı bir şekilde değerlendirilirken, 3-B canlı kalpteki özellikleri ve dinamikleri, taban çizgisi veya hastalık stimülasyonu ile çok daha az anlaşılmaktadır. Burada, Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer genetik muhabir sistemi ile etiketlenmiş fibroblastların floresanını korurken yetişkin fare kalbini temizlemek için rafine bir yöntem tanımlanmıştır. Kalp içinde, Tcf21 sessiz fibroblastların nispeten spesifik bir belirtecidir4. Tamoksifen indüklenen MerCreMer proteinini aktive etmek için verildikten sonra, esasen tüm sessiz fibroblastlar Rosa26 lokusundan gelişmiş yeşil floresan proteini (eGFP) kalıcı olarak ifade edecektir, bu da vivo olarak izlenmesini sağlar.

Bazıları kalbe uygulanan çok sayıda köklü doku temizleme protokolü vardır11 , 12,13,14,15,16,17. Bununla birlikte, farklı doku temizleme protokollerinde kullanılan reaktiflerin çoğunun endojen floresan sinyallerini söndürdür olduğu bulunmuştur18. Ek olarak, yetişkin kalbinin otofluoresans üreten bol miktarda heme grubu içeren proteinler nedeniyle temizlenmesi zordur19. Bu nedenle, bu protokolün amacı, in vivo 12 , 13,14,16,17,20'deoptimal3-B görselleştirme için yaralı yetişkin kalbinde heme otofluoresansının eşzamanlı inhibisyonu ile fibroblast belirteç floresanını korumaktı.

Kardiyak fibroblast in vivo'yu incelemeye çalışan önceki çalışmalar, bu hücreleri etiketlemek için perfüzyonlu antikorlar istihdam etti, ancak bu çalışmalar antikor penetrasyonu ve kardiyak vasküler yapı ile sınırlıydı14,16,17,20. Salamon ve arkadaşları yenidoğan kalbinde topikal nöronal floresan bakımı ile doku temizleme göstermiş olsalar da ve Nehrhoff ve diğerleri miyeloid hücreleri işaretleyen floresanların bakımını göstermiş olsalar da, yetişkin kardiyak fibroblastların taban çizgisine görselleştirilmesi veya yaralanmanın ardından13,20. Bu doku temizleme protokolü, CLARITY yöntemine (berrak lipid ile değiş tokuş edilen akrilamid-hibrid sert Görüntüleme/immünostaining/in situ-hibridizasyon uyumlu doku hidrojel) ve PEGASOS (polietilen glikol (PEG) ilişkili çözücü sistemi) temel alınarak önceki protokollerin bir karışımını rafine eder. Bu rafine protokol, fare kalbindeki kardiyak fibroblastların taban çizgisine ve farklı yaralanma türlerine nasıl tepki verdiklerine dair daha sağlam bir incelemeye izin verdi. Protokol basit ve tekrarlanabilir ve in vivo kardiyak fibroblastların davranışını karakterize etmenize yardımcı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi'nde fareleri içeren tüm deneyler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Kurum aynı zamanda AAALAC (Amerikan Laboratuvar Hayvanları Bakımı Akreditasyon Derneği) sertifikalıdır. Fareler servikal çıkık yoluyla ötenaziye tabi tökezlendi ve sağkalım cerrahi prosedürlerinden geçen farelere ağrı kesici verildi (aşağıya bakınız). Ağrı yönetimi ve ötenazi için kullanılan tüm yöntemler, Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği Ötanazi Paneli'nin önerilerine dayanmaktadır. Tüm fareler, her zaman su ve yiyecek içeren mısır koçani yatak ünitelerinde barındırıldı. Fareler aynı cinsiyete sahip bir kafese 4'e yerleştirildi. Ameliyat veya yaralanmamış doku temizleme için eşit sayıda 6-8 haftalık erkek ve dişi fareler kullanıldı.

NOT: Tüm ameliyatlarda steril cerrahi durumlar sürdürülmektedir. Cerrah temiz önlük ve steril bir gece elbisesi ve sonra donned ayakkabı örtüleri ve bir saç teli haline döndü. Cerrah daha sonra ellerini klorheksidin ile temizledi ve steril cerrahi eldivenler giydi. Cerraha, kesi bölgesini her biri 3 kez sakinleştirici, tıraş eden ve ovarak% 2 klorohexidin glukokonat ve% 70 izopropanol arasında değişen bir teknisyen yardımcı oldu. Fareler daha sonra cerraha getirildi ve ameliyat yapıldı. Hayvanlar arasında, aletler boncuk sterilizatörde sterilize edildi.

1. Cre rekombinasyonu

  1. Çapraz Rosa26-loxP-eGFP fareler (Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]) tcf21-MerCreMer fareleri ile (Şekil 1A)6,21.
  2. Bu haçın yavruları 6 haftalık olduğunda, mısır yağında çözünmüş 75 mg / kg tamoksifen intraperitoneal enjeksiyonu uygular. 22 Bu tamoksifen'i iki kez, 48 saat arayla yönetin (Şekil 1B).
  3. Tamoksifen enjeksiyonlarından sonra, fareleri bir hafta boyunca tamoksifen gıda (~0.4 g / kg tamoksifen sitrat) diyetine koyun. Bir haftalık tamoksifen chow'dan sonra, fareleri ameliyat yapmadan önce bir hafta boyunca normal bir otoklavlı yemek diyetinedöndürün (Şekil 1B). Yaralanmamış kontroller için uygun sayıda fare (cerrahi durum başına 3) belirleyin. Bu fareleri kurban edin ve bir haftalık normal yemek diyetini takiben aşağıda açıklanmış temizleme işlemine devam edin.
  4. Tamoksifen rejimi ve rekombinasyonu takiben ameliyat yapın.

2. Cerrahi modeller

  1. İskemi/reperfüzyon (I/R)23,24
    1. Havalandırılan bir kutuda oda havasında% 1,5 izofluran gazı ile fareleri uyuşturmak; göğüslerini ve boyunlarını elektrikli makaslarla tıraş edin ve tıraş edilen bölgeleri% 2 klorheksidin glukozat ıslatılmış bir çubukla ovalayın.
    2. Yatıştırıcı farelerin gözlerine merhem koyarak ameliyat sırasında kuruluğu önlemek için yapay gözyaşı merhem kullanın.
    3. Trakeanın görselleştirilmesini sağlamak için cerrahi makas kullanarak orta boyunlu bir kesim gerçekleştirin. Entübasyon tüpünü nefes borusuna yerleştirerek 20 gr kateter ile entübe edin ve trakeal kateteri orta boyun kesiğinden görselleştirin. Fareleri izofluran gazı ile sakinleştirilirken bir ventilatöre yerleştirin (%1,5) oda havasında.
    4. Cerrahi makasla sol ön uzvun altından bir kesi yapın ve kaburgalar arasındaki interkostal kasları 3 ile 4 arasında kesin. Kaburgaları bir retraktör kullanarak açın.
    5. Akciğerin zarar görmesini önlemek için akciğer ve kalp arasına tuzlu suya batırılmış küçük bir sünger yerleştirin.
    6. Balık kancası iğnesi (6,5 mm, 3/8 c) kullanarak, sol koroner arteri 8-0 kullanarak serbest bırakılabilir bir kayma düğümü ile bağlayın eğilimli.
    7. Süngeri eleps kullanarak çıkarın.
    8. 4-0 örgülü ipek ve sürekli bir dikiş kullanılarak kapatılan interkostal kasları dikerken, 8-0'ın sonunu da dışladı prolene kayma düğümü.
    9. Tıkayıcı kayma düğümü çıkıntısının ucuyla topikal doku yapıştırıcısı kullanarak cilt kesilerini kapatın.
    10. Bir saatlik tıkanıklık sonrası, koroner arter tıkanıklığını dahili olarak serbest bırakmak için kayma düğümün dış ucunu çekin, iskemiyi hafifletin ve reperfüzyona neden olabilir.
    11. Ağrı kesici olarak subdermal enjeksiyon (72 h salınım) yoluyla 1 mg / mL genişletilmiş salınım buprenorfin 0.02 mL'yi verin ve fareleri diğer hayvanlardan ayrı olarak 37 ° C'de oksijenli bir inkübasyon odasına yerleştirin. Fareleri anesteziden kurtulana ve sternal veya oturma pozisyonunu koruyabilene kadar en az 15 dakikada bir izleyin. Fareleri normal konutlarına geri döndürün.
    12. Ameliyattan sonra hayvanları 48 saat boyunca ağrı ve sıkıntı açısından değerlendirin ve kesi bölgesini tamamen iyileşene kadar günlük olarak izleyin.
    13. Kurban edilene kadar ameliyattan sonra hidrasyon, beslenme ve genel refah için fareleri gözlemleyin.
  2. Miyokard enfarktüsü (MI)25,26,27
    1. 2.1.1–2.1.7 adımlarını gerçekleştirin.
    2. 4-0 örgülü ipek kullanarak interkostal kasları kapatmak için sürekli bir dikiş kullanın.
    3. Topikal doku yapıştırıcısı kullanarak cilt kesisini kapatın.
    4. 2.1.11–2.1.13 adımlarını gerçekleştirin.
  3. Anjiyotensin II/fenilefrin mikro-ozmotik pompa infüzyonu
    1. Hazırlanın Steril koşullar altında 10 μg/μL anjiyotensin II ve fenilefrin 500 μg/μL çalışma çözeltisi hazırlayın (yani, laminer akış davlumbazında) 100 μL'ye 100 μL steril fosfat tamponlu salin (PBS) ve 500 μL PBS'ye 250 mg fenilefrin hidroklorür ekleyerek.
    2. Fare ağırlığına göre mikro ozmotik pompaya dağıtmak için her çalışma çözeltisinin seyreltilmesini ve son hacmini hesaplayın.
      NOT: Örneğin, 20 g fare 20 g x 14 gün x 1,5 μg/gün = 420 μg anjiyotensin veya 42 μL çalışma çözeltisinin yanı sıra 20 g x 14 gün x 50 μg/gün = 14000 μg fenilefrin hidroklorür veya 28 μL çalışma çözeltisi gerektirir.
    3. Her farenin ağırlığı için, ilacın çalışma stoğunu steril PBS'de seyreltin ve mikro ozmotik pompaları (0,25 μL / s, 14 gün, yaklaşık 100 μL) 27 G iğne ve 1 mL şırınga kullanarak doldurun.
      NOT: Bu, farelere yerleştirildikten sonra 1,5 μg⭐g-1⭐gün-1 anjiyotensin II ve 50 μg⭐g-1⭐gün-1 fenilenfrin hidroklorür akış hızı üretecektir.
    4. Fareleri oda havası içeren havalandırılmış bir odada% 1.5 izofluran inhalasyonu (etkili olmak için) ile uyuşturun.
    5. Uyuşturuldu fareleri opine pozisyonunda steril bir cerrahi masaya yerleştirin ve izofluran gazı soluma ile anesteziyi koruyun (%1,5) burun konisi yoluyla.
    6. Ameliyat sırasında kuruluğu önlemek için hayvanın gözlerinde yapay gözyaşı merhem kullanın.
    7. Kürkü implantasyon bölgesinin üzerinde elektrikli saç kesme makası ile tıraş edin ve etanol ve steril bir bez kullanarak kesilecek alanı sterilize edin. Arkanın sağ yan tarafında, omuz bıçağının altında fare derisinin epidermal tabakasında cerrahi makasla küçük bir kesi (yaklaşık 1 cm) yapın. Minipump'ı yerleştirmek için cildi implantasyon alanına ve çevresine hafifçe germek için bir çift cerrahi makasın donuk taraflarını kullanın.
    8. Mikro ozmotik pompayı kesi içine yerleştirin ve pompayı cildin altına manuel olarak masaj yaparak farenin dorsal orta çizgisinin soluna fiziksel olarak manevra yapın.
    9. Konik nokta iğnesi ile 4-0 ipek kullanarak sürekli dikiş ile kesiği kapatın.
    10. Pompa implantasyonundan sonra, analjezi için subdermal enjeksiyon (72-h yavaş salınım) yoluyla 0,1 mg/kg vücut ağırlığı dozda yavaş salınım buprenorfin sürün. Fareleri diğer hayvanlardan ayrı olarak 37 ° C'de oksijenli bir kuluçka odasına yerleştirin. Fareleri anesteziden iyileşene kadar en az 15 dakikada bir izleyin ve sternal veya oturma pozisyonunu koruyabilir.
    11. 37 °C ısınma odasında anesteziden iyileştikten sonra, fareleri standart muhafaza birimlerine geri yerleştirin.
    12. Ameliyattan sonra fareleri 48 saat boyunca ağrı ve sıkıntı açısından izleyin ve kesi bölgesini tamamen iyileşene kadar günlük olarak izleyin.
    13. Kurban edilene kadar ameliyattan sonra hidrasyon, beslenme ve genel refah için fareleri gözlemleyin.

3. Değiştirilmiş bir aktif CLARITY protokolü kullanarak yetişkin fare kalplerini temizleme

  1. Ameliyat yüzeyini ve tüm cerrahi aletleri %70 etanol ile sterilize derek temiz bir cerrahi alan hazırlayın. PBS'de (her biri 100 mL) soğuk 1x PBS ve %4 paraformaldehit (PFA) çözeltisi hazırlayın. Eldiven, laboratuvar önlüğü, yüz maskesi ve göz koruması giyin.
  2. 10 ünite heparini %0,9 w/v sodyum klorür çözeltisinde seyrelterek heparin tamponu hazırlayın. Her fareye 1 mL şırınga ve 27 G iğne kullanarak 60 μL heparin-NaCl ile intraperitoneally enjekte edin.
  3. Heparin-NaCl çözeltisinin enjeksiyonundan beş dakika sonra, oda havası içeren havalandırılmış bir odada% 1.5 izofluran inhalasyonu (etkili olmak için) kullanarak fareleri uyuşturun.
  4. Fareleri servikal çıkık ile ötenazi, burada başın arkası düz, kapalı uçlu bir şekilde tutulur, omurilik sütunu ise kuyruğu çekerek çıkar.
  5. Farenin ventral yüzeyini pamuklu çubuk üzerinde% 70 etanol ile temizleyin. Cerrahi makas kullanarak xiphoid işleminin yaklaşık 3 cm altında 3 cm enine kesi yapın.
  6. Karnı xiphoid işlemine kadar degloving yaparak cildi alttaki karın duvarı dokusundan ayırın (kuyruğun en yakın derisini tutun ve başa en yakın cildi göğüs kafesine doğru çekin). Cerrahi makas kullanarak xiphoid işleminin 3 cm altında deri altı karın duvarı dokusunda 2 cm enine kesi yapın. Bu enine kesiden, orta çizgiden ve göğüs kafesinden dikey bir kesim yapın. Göğüs kafesini geriye sabitleyerek kalbi açığa çıkardı.
  7. Kalpteki kanı temizlemek için üstün vena kava ve aort içine soğuk PBS enjekte etmek için 27 G iğne ve 10 mL şırınga kullanın (kalbin herhangi bir pozisyonel manipülasyonu delinmeyi önlemek için künt tokalarla dikkatlice yapılmalıdır).
    NOT: Kuyruk seğirmesi ve akciğerlerin renk değişikliği ile yeterli perfüzyona dikkat edilebilir.
  8. Sabitleme işlemine başlamak için üstün vena kava ve aort içine soğuk% 4 PFA enjekte etmek için 27 G iğne ve 10 mL şırınga kullanın.
  9. Kalpleri genişletin. Atria, sağ ventrikül ve septum ve sol ventrikül düz bıçaklı neşter kullanılarak ayrılmalıdır. Bu dokuyu soğuk % 4 PFA ile dolu 15 mL santrifüj tüpüne yerleştirin ve bir gecede 4 ° C'de bir somun makinesine yerleştirin.
  10. Fazla PFA'yı çıkarmak için kalbi her biri 1 saat boyunca soğuk 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
  11. Aşağıdaki kimyasalları 15 mL santrifüj tüpünde karıştırarak hidrojel (göreceli akrilamid/poliakrilamid bileşimi için A4P0 olarak ad verilen) hazırlayın: %40 akrilamid, %10 1x PBS, %80 damıtılmış suyun %10'u.
  12. Fotoinitiatörin %0,25'lik çözeltisini (2,2-Azobis[2-(2-imidazolin-2yl)propan)dihidroklorür) hidrojel çözeltisine kalbi hidrojene batırmaya hemen önce ekleyin.
  13. Kalbi hidrojel içeren konik bir tüpe yerleştirin. Konik tüpü folyoya sarın ve fiziksel rahatsızlık vermeden 4 °C'de gece boyunca kuluçkaya yatırın.
  14. 4 °C'de yaklaşık 14 saat sonra, kalbi içeren konik tüpü 37 °C boncuk banyosuna taşıyın.
  15. Boncuk banyosunda 2,5 saat sonra, kalbi hidrojelden dikkatliceps ile çıkarın.
  16. Kalpleri bir besleyici üzerinde 37 °C'de 1x PBS içeren 15 mL konik tüpte her biri 1 saat boyunca 3 kez yıkayın.
  17. Kalpleri, prosptikler kullanarak aktif elektroforezi makinesinin sepetine yerleştirin ve kapağı sepete yerleştirin. Kapağın güvenli bir şekilde yerinde olduğundan emin olun.
  18. Aktif elektroforezi odası haznesini, çözeltiyi odaya dökerek elektroforetik temizleme çözeltisi ile doldurun.
  19. Oda elektroforetik temizleme çözeltisi ile dolduğunda, kalbi içeren sepet suya batırılabilir. Kapağı elektroforezi makinesine güvenli bir şekilde yerleştirin.
  20. Elektroforezi makinesini 1,5 saat boyunca 1,5 A, 37 °C'de çalıştırın.
  21. 1,5 saat elektroforezi takiben, opak doku kalmadığından emin olmak için kalpleri görsel olarak kontrol edin. Dokunun bölgeleri hala opaksa, kalbi elektroforetik odadaki elektroforez çözeltisine yeniden batırın ve elektroforezise bir seferde 0,5 saat devam edin.
    NOT: Elektroforezi doku hasarının ilk belirtilerinde (doku yıpranması gibi) kesilmelidir.
  22. Kalpleri 1x PBS içeren 15 mL konik tüpte 1 saat boyunca, her biri 3 kez, bir besleyici üzerinde 37 °C'de yıkayın.
  23. Kalpleri N, N,N′,N′- Tetrakis(2-Hydroxypropyl)etilenediamin içeren 15 mL konik bir tüpe batırın- heme otoflorooresansını azaltan bir renksizleştirici ajan.
    NOT: Bu çözüm, kalpler tamamen temizleninceye kadar (yaklaşık 2 gün) her 24 saatte bir değiştirilmelidir.
  24. Fazla renksizleştirici maddeyi çıkarmak için kalpleri 1x PBS ile 15 mL konik bir tüpte 1 saat boyunca 3 kez yıkayın.
  25. 30 mL 0,02 M fosfat tamponu, 40 g 5-(N-2, 3-dihidroksipropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihidroksipropil) karıştırmalı izoftalamid (tamamen çözülmelidir— bu bir saate kadar sürebilir), 5 mg sodyum azide, 50 μL Tween20 ve 1 g 1,4-diazabicyclo[2.2.2]oktan ve pH'ı 7.5'e ayarlayın.
  26. Görüntülemeden önce 48 saat boyunca RIMS'de kalpleri aşındırın.

4. Dik tek foton konfokal mikroskop kullanarak kalpleri görüntüleme

NOT: Görüntüleme aparatı, 10 cm'lik cam Petri kabının alt yarısından, 3D baskılı alt hazneden, yuvarlak cam kapaklıktan ve 3D baskılı üst hazneden(Şekil 1C–E)oluşur. Cincinnati Çocuk Hastanesi Klinik Mühendisliği Bölümü tarafından şirket içinde 3D baskılı malzemeler yapılmıştır.

  1. 3D baskılı parçanın altına ince bir vakum gresi tabakası koyarak 3D baskılı alt hazneyi cam petri kabına kapatmak için vakum gresi kullanın (Şekil 1C).
    NOT: Rezervuar, görüntülenen numuneyle aynı yükseklikte olmalıdır (yani, numune üzerine yerleştirilen cam kapak kapağı tarafından sıkıştırılmamalı ve numune ayrıca rezervuar içinde yüzdürülemez ve hareket ettirememelidir).
  2. Rezervuarı RIMS ile doldurun ve tüm kabarcıkları bir pipet ucuyla çıkarın. Sol ventrikül duvarı yukarı bakacak şekilde kalbi RIMS'e dikkatlice yerleştirin ve çözeltiye kabarcık sokulmamasını sağlayın.
  3. Vakum gresi kullanarak 3D baskılı üst rezervuar parçasının(Ek Şekil 1A)alt yüzeyine bir cam kapak kapağı yapıştırın (yine 3D baskılı parçanın üzerine ince bir vakum gresi tabakası yerleştirerek ve kapak kaymasına yerleştirerek) (Şekil 1D).
  4. Cam kapak ve üst rezervuarı, kapak tarafını aşağı, kabarcıkların sokulması olmadan alt rezervuarın üzerine(Ek Şekil 1B)yerleştirin. RIMS ve kapak kayması arasındaki yapıştırma, üst ve alt rezervuar parçaları arasında bir sızdırmazlık sağlayacaktır (Şekil 1E).
  5. 10x gliserol daldırma hedefi ile kullanmak için üst rezervuarı gliserol ile doldurun.
  6. Temizlenmiş kalpleri görüntülemek için multifon konfokal tarama kafası ile donatılmış tek bir foton mikroskobu kullanın.
  7. Tek foton mikroskopunun aşamasını kıtır ve numuneyi içeren Petri kabını sahnenin ortasına yerleştirin. Sahneyi kaldırın ve 10x gliserol daldırma hedefini numune aparatının üst rezervuarındaki gliserol içine diriltin. Göz merceği kullanarak numunenin kenarına bakarak numunenin odakta olduğundan emin olun.
  8. Canlı düğmeye tıklayarak göz merceği görünümünden bilgisayardaki kamera görünümüne geçin.
    1. Önce Petri kabının dibinde olması gereken doku örneğinin en geniş kısmını bularak X ve Y parametrelerini ayarlayın.
    2. ND Edinme ve özel çok nokta 'yatıklayın. Önce doku örneğinin ortasını bularak, joystick'i kullanarak soldan sağa ve yukarıdan aşağıya doğru süpürerek çok nokta oluşturun.
    3. Daha sonra, dokunun boyutuna bağlı olarak, gereken döşeme boyutunu belirleyin (tipik olarak 6-8 haftalık bir fare kalbi için 6 x 5). Bunu, dokunun tüm uzunluğunun ve genişliğinin yakalanıp yakalanmadığını kontrol etmek için yalnızca X ve Y parametrelerini (ND Edinme sekmesialtındaki z işaretini kaldırın) yakalayarak test görüntülemesini çalıştırarak yapın.
  9. z parametrelerini ayarlamak için XYZ gezintisiniaçın ve örneğin üst ve alt kısmını bulana kadar yukarı ve aşağı simgelerini tıklatın.
    1. Z yoğunluğu düzeltme panelini açın ve her z noktasında lazer gücünü artırarak veya azaltarak doku yoğunluğunu düzeltmek için dokunun üst, orta ve alt kısmındaki floresanları ayarlayın. Bunları, Z Yoğunluğu Düzeltme panelinin sağındaki ayarlanan oka tıklayarak ayarlayın.
    2. ND Edinme panelinde Z adım boyutunu 5 μm olarak ayarlayın.
  10. Kalbin X, Y ve Z parametreleri belirlendikten ve z-yoğunluk düzeltmesi ayarlandıktan sonra, temizlenmiş kalpleri görüntülemek için rezonans tarayıcı ve galyum arsenit fosfit fotomultiplier tüpler (GaAsP PMT' ler) ile 10x gliserol daldırma hedefine sahip otomatik dik mikroskobu kullanın. XY ve Z sekmelerinin ND alımıaltında işaretli olduğundan emin olun ve Z Düzeltmeyi Çalıştır 'abasın.
  11. İşleme yazılımındaki çok noktalı görüntüyü açarak ve dikiş düğmesine tıklayarak elde edilen görüntüleri dikin, karıştırın ve denoize edin. Resimaltında, kör karıştırma, 2 kanalve sonra bulunüzerine tıklayın. ve Resimaltında, denoise.aitıklayın, ardından floresan tercih kanalına (örneğin, GFP)tıklayın.
    NOT: Bu işlem, sol ventrikülde GFP pozitif fibroblastların 3D görüntüsüyle sonuçlanır.
  12. Kardiyak fibroblastların dağılımındaki kalıpları ve eğilimleri daha fazla tanımlamak için ikincil analiz yazılımını kullanın. Noktalar sihirbazı programını çalıştırarak Noktalar işlevini kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kardiyak fibroblastlar kalbin temel fonksiyonu ve kalp hasarına yanıt için gereklidir. Bu hücrelerin düzenini ve morfolojisini anlamaya yönelik önceki girişimler büyük ölçüde 2-B ortamlarda gerçeklenmiştir. Bununla birlikte, kardiyak fibroblastların ileri, daha ayrıntılı görselleştirilmesini sağlayan rafine bir kardiyak doku temizleme (Şekil 2) ve 3-B görüntüleme tekniği yayınlanmıştır. Bu görüntüleme tekniği ile fibroblastların yoğun olarak paketlenmiş ve yaralanmamış kalplerde iğdelenmiş morfolojiye sahip olduğu bulunmuştur(Şekil 3, Ek Videolar S1–4).

Yaralanmamış bir kalpte sol ventrikül doku temizleme işlemi yapıldıktan sonra, bu temizleme protokolünün yaralı kalp dokusunu incelerken nasıl performans göstereceğini incelemek için birkaç yaralanma modeline protokol uygulandı. Fareler, sol koroner arterin (LCA) 1 saat boyunca geçici olarak kapatılması ve ardından 3, 7, 14 veya 28 gün süren reperfüzyon ile I/R yaralanmasına maruz kaldı. Bu deneyler, I/R yaralanmasından hemen sonra iskemik bölgede kardiyak fibroblast kaybı olduğunu, ancak 7. ve 14. 28. güne gelindiğinde, kalbin yaralı bölgelerini çevreleyen kardiyak fibroblast popülasyonu en büyük yoğunluktaydı (Şekil 4, Ek Videolar S5–8).

MI yaralanması kalıcı LCA ligasyonundan kaynaklanan cerrahi bir modeldir (reperfüzyon yoktur). MI ameliyatı geçiren kalpler, fiksasyon, temizleme ve analiz için ameliyattan 1,5 ve 3 gün sonra çıkarıldı. Ameliyattan sonraki 1,5 günde yaralı sol ventrikülde çok az fibroblast kalmıştı (Şekil 5A, Ek Video S9). Bununla birlikte, 3. güne gelindiğinde, fibroblastlar genişledi ve muhtemelen sınır bölgesindeki bir popülasyona göç eden ve / veya çoğalan küçük bir bölge dışında sol ventrikülün çoğunda mevcuttu (Şekil 5B, Ek Video S10). Yine fibroblast lokalizasyonunu daha iyi görselleştirmek için analiz yazılımı kullanılmış ve kardiyak fibroblast kaybı alanları turuncu olarak özetlenmiştir (Şekil 5). Bu analiz, MI'yi takip eden 1.5. günde ilk hücre kaybını ve fibroblastların bölgeyi görünürde onarmak ve bir yara izi oluşturmak için 3.

İskemik yaralanmaya ek olarak, kardiyak fibroblastların yüksek tansiyona reaksiyonu iyi anlaşılamamıştır. Bu hücrelerin yüksek tansiyona yanıtını keşfetmek için anjiyotensin II ve fenilefrin uygulandı. Anjiyotensin II ve fenilefrin (Ang/PE), bu doku temizleme protokolünün ang/PE ile tedavi edilen kalplere uygulanmasıyla doğrulanan interstisyel fibrozis bölgeleriyle kalıcı yüksek tansiyon ve kardiyak fibroblast aktivasyonuna neden olan ilaçlardır (Şekil 6A)5,28. İskemik cerrahinin aksine, birkaç hafta boyunca Ang / PE infüzyonu kalp dokusu kaybına ve duvar incelmesine neden olmaz. Bunun yerine, bu yaralanmanın ardından fibroblast davranışında farklı bir sonuç gözlenmiştir.

Kalp pompalanırken, miyokard bükülür, sağ el sarmaldeseni 29,30,31. Yaralanmanın Ang/PE modelinde fibroblastlar, rafine doku temizleme protokolünü kullanarak bu sağ el sarmal kasılma deseninin ekseni boyunca hizalanır (Şekil 6B). Bu davranışı açıklayan hipotez, kardiyak fibroblastların ventrikül duvar suşu yönünü algılayıp, acılar infüzyonu sırasında akut olarak ortaya çıkan fibrotik yanıt olarak ECM içinde en büyük desteği sağlamak için miyoberler içinde hizalandığıdır (Şekil 7). Bir başka ilginç bulgu, fibroblastların I/R ve MI yaralanması modellerinde görülen mil şeklinin aksine küçük ve yuvarlak görünmesiydi(Şekil 6, Ek Video S11).

Figure 1
Şekil 1: Doku temizleme kalpleri için kullanılan fareler ve malzemeler.
(A) Doku temizleme için kullanılan Tcf21-MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP fareler için üreme stratejisinin şeması. (B) Farelerde yapılan tamoksifen tedavisi ve ameliyatının zaman çizelgesi. Yaralanmamış fareler 14. (C) 3-B vakum gres ile cam Petri kabına mühürlenmiş kalp dokusu tutmak için iyi basılmıştır. (D)Alt kuyunun üzerine iyi ayarlanmış 3-B baskılı kuyunun üstüne kapatılmış yuvarlak bir kapak vakum yağı ilavesi. (E) Doku, Refraktif İndeks Eşleştirme Çözeltisi (RIMS) ile dolu doku tutma aparatındaki kalbi temizledi. Kapaklı (D'deolduğu gibi) ve üst 3-B baskılı kuyu parçası, temizlenmiş kalp dokusu içeren alt 3-B baskılı rezervuar bileşeninin üzerine serilir. Gliserol daldırma mikroskopisi için üst rezervuara gliserol eklenir. Ölçek çubukları = 1 cm. Rezervuar planları Ek Şekil 1'debulunabilir. Kısaltma: eGFP = gelişmiş yeşil floresan protein. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Kalp dokusu temizleme evrelerinin görsel görünümü.
(A) Soldan sağa: belirsiz sol ventrikül, elektroforlu sol ventrikül, çapraz bağlantı ile tedavi edilen elektroforlu sol ventrikül, çaprazlayıcı ile tedavi edilen elektroforlu sol ventrikül ve RIMS'de inkübe edildi. (B) Belirsiz ve temizlenmiş tüm fare kalbi. (C) Sol: yaralanmamış, belirsiz sol ventrikül. Sağ: yaralanmamış, sol ventrikül temizlenmiş. (D) Sol: Belirsiz MI yaralı sol ventrikül. Sağ: Mi yaralı sol ventrikül temizlendi. Ölçek çubukları = 0,5 cm. Kısaltma: MI = miyokard enfarktüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Yaralanmamış ve sahte temizlenmiş kalpler için yeni takas yönteminin etkinliği.
Tcf21mcm x Rosa26eGFP fibroblastları (yeşil) ve fibroblast lokalizasyonu gösteren artmış floresan (mor) psödocolored alanları ile temizlenmiş(A)yaralanmamış (ölçek çubuğu = 400 μm) ve(B)sahte kalpler (ölçek çubuğu = 500 μm). Fibroblast videolarını gösteren eşlik eden videolar Ek Videolar S1–2. Durağan görüntüler, fibroblast-endojen floresan (yeşil) arka plan temizleme ve bakımını göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: İskemi/reperfüzyondan yaralanan kalplerde fibroblast kaybının zamanla zayıflaması.
Belirtilen I/R zaman noktalarından tcf21MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP fibroblastlar (yeşil), fibroblast lokalizasyonunu gösteren floresan (mor) artmış sözde renklendirilmiş alanlar ve fibroblastlardan yoksun turuncu anahat alanları ile temizlenmiş kardiyak doku. Üst sıra: I/R-yaralı kalplerden sol ventriküllerin hareketsiz görüntüleri temizlendi. Alt sıra: Tüm sol ventrikülde fibroblast desenlerini daha kolay görmek için kullanılan imaris lekeleri fonksiyonu ile I/R-yaralı temizlenmiş kalplerden sol ventriküllerin hareketsiz görüntüleri. I/R-yaralı temizlenmiş kalplerin videoları sadece fibroblastların brüt desenini değil, aynı zamanda bireysel fibroblastların ve morfolojilerinin net görüntülerini de Ek Videolar S5-8'de bulabilirsiniz. Ölçek çubukları = 500 μm. Kısaltma: I/R = iskemi/reperfüzyon. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Miyokard enfarktüsü-yaralanmalı kalplerde yaralanma sonrası kardiyak fibroblast kaybının zayıflaması zamanla temizlendi.
TCf21MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP fibroblastlar (yeşil), fibroblast lokalizasyonu gösteren artan floresan (mor) psödocolored alanları ve fibroblastlardan yoksun turuncu anahat alanları ile MI kalplerinden temizlenmiş kalp dokusu. Üst sıra: Mi-yaralı kalplerden (yeşil) sol ventrikülleri temizlenen dokunun hala görüntüleri. Alt sıra: Mi-yaralı kalplerden (yeşil) sol ventrikülleri temizlenen doku görüntüleri, brüt fibroblast dağılımını göstermek için Imaris lekeleri işlevi (mor) ile kaplanmıştır. MI-yaralı kalplerden sol ventrikülleri temizlenen doku videoları, kalpte brüt fibroblast düzenlemesinin yanı sıra bu 3D in vivo modelde bireysel fibroblastların konumlandırılmasını ve morfolojisini göstermektedir(Ek videolar S7-8). Ölçek çubukları: 1,5 gün = 1000 μm, 3 gün = 700 μm. Kısaltma: MI = miyokard enfarktüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Anjiyotensin/Fenilefrin ile tedavi edilen kalplerden temizlenmiş doku.
(A) Anjiyotensin/Fenilefrin pompalarının Tcf21MCM x eGFP'nin tamoksifen aktivasyonunu takiben iki haftalık bir süre boyunca ilaçları uygulamak için nasıl kullanıldığını gösteren şematik. (B) Ang / PE ile tedavi edilen kalplerde fibroblast organizasyonu ve morfolojiyi gösteren hareketsiz görüntü, hareketsiz görüntü + İmaris lekeleri ve video (Ek Video S11) Ölçek çubukları = 500 μm. Kısaltmalar: Ang/PE = anjiyotensin II/fenilenfrin; eGFP = gelişmiş yeşil floresan protein. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Anjiyotensin/Fenilefrin ile tedavi edilen kalplerde gözlenen fibroblast deseninin temsili görüntüleri.
(A, Cve D): Ventrikül dışından fibroblastların sağ el sarma büküm deseninin görüntüleri. (B) Ventrikül iç perspektifinden fibroblast desenleme görüntüsü. Oklar, büküm desenini oluşturan doğrusal fibroblast gruplarını vurgular. Ölçek çubukları = 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Görüntüleme rezervuarı aparatının 2D renderları. (A) Görüntüleme rezervuarının alt yarısının 2B oluşturulması. Bu rezervuar Petri kabına vakum yağı ile kapatılmış. Kalp merkez açıklığa yerleştirilir ve RIMS'e batırılır. (B) Görüntüleme rezervuarının üst yarısının 2D işlenmesi. Cam kapak kapağı, vakum yağı ile bu parçanın düz tabanına yapışır. Bu, alt rezervuarın üstüne hafifçe yerleştirilir. Üst rezervuar daha sonra görüntüleme için gliserol ile doldurulabilir. Birimler mm cinsinden. Kısaltmalar: 2D = iki boyutlu; RIMS: Kırılma İndeksi Eşleştirme Çözümü. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Video S1: Yaralanmamış doku kalbi temizledi. Yaralanmamış bir sol ventriküldeki kardiyak fibroblastlar (yeşil) küçüktü ve birçoğu ikiden fazla hücresel projeksiyonla yuvarlandı. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Video S2: Sham dokusu kalbi temizledi. Sahte bir fare kalbinin sol karıncığındaki kardiyak fibroblastlar (yeşil), yaralanmamış kalplerde görülene benzer şekilde küçük ve çoğunlukla birkaç projeksiyonla yuvarlaktı. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Video S3: Yaralanmamış bir kalbin ventrikül duvarından ayrıntılı fibroblast görünümü. Bu video iç ventrikül duvarında başlar ve kalbin dış kısmına doğru yakınlaşır. Kardiyak fibroblastlar (yeşil) ayrıntılı olarak gösterildi ve ikiden fazla hücresel projeksiyonu olmayan yuvarlak veya hafif uzun hücre gövdeleri olduğu gözlendi. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Video S4: Yaralanmamış kalbin sol ventrikül duvarının bölümünün ayrıntılı görünümü. Temizlenmemiş fare kalbinin bu ~300-μm genişliğindeki bölümü, kardiyak fibroblastların (yeşil) 3 boyutlu düzenini ve morfolojilerini ayrıntılı olarak gösterir. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Video S5: 3 günlük G/Ç'nin sol ventrikülü temizlendi. Sol ventrikül ayrıntılı görünümü, I/R yaralanmasından sonra kardiyak fibroblast kaybı olduğunu göstermiştir. Fibroblastların (yeşil) yaralanmamış ve sahte kalplerde görülen daha yuvarlak morfolojilere kıyasla bu yaralı durumda çok daha uzun bir şekil geliştirdiği de belirgindi. Kısaltma: I/R = iskemi/reperfüzyon. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Video S6: 7 günlük G/Ç'nin sol ventrikülü temizlendi. Sol ventrikülün ayrıntılı görünümü, I/R yaralanmasından sonraki 7 gün içinde fibroblast eksikliği olan bölgenin, I/R yaralanmasından sonra 3. Daha fazla fibroblast (yeşil) mevcuttu ve ilginç bir şekilde yeni hücre morfolojileri mevcuttu. Özellikle, bazı fibroblastlar, bu ortamda fibroblastların yeni veya gelişmiş bir rolünü gösteren birden fazla çıkıntıya sahip yuvarlak hücre gövdelerine sahipti. Kısaltma: I/R = iskemi/reperfüzyon. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Video S7: 14 günlük G/Ç'nin sol ventrikülü temizlendi. Sol ventrikülün ayrıntılı görünümü, ventrikül duvarının merkezinde hala çok az fibroblast bulunan bir alan olduğunu, ancak bu boşluğun çevresinde fibroblastların (yeşil) 7. İlginçtir ki, yaralı bölgede bulunan birkaç fibroblast, yaralanmamış kalplerde böyle bir morfolojiye sahipti - küçük ve yuvarlak. Kısaltma: I/R = iskemi/reperfüzyon. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Video S8: 28 günlük G/Ç'nin sol ventrikülü temizlendi. I/R yaralanmasını takiben 28. günde kardiyak fibroblastların (yeşil) ayrıntılı görünümü, yaralı bölgede fibroblast eksikliği olan küçük bir alan olduğunu göstermiştir. Ayrıca bu bölgeyi çevreleyen yüksek fibroblast yoğunluğuna sahip bir bölge olduğu ve bu yoğun bölgedeki morfolojilerin oldukça uzadığı gözlenmiştir. Kısaltma: I/R = iskemi/reperfüzyon. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Video S9: 1,5 günlük MI sol ventrikül temizlendi. Mi'den 1,5 gün sonra yaralı sol ventrikülde çok az kardiyak fibroblast (yeşil) kaldı, ventrikül bu bölgesinde kardiyak fibroblast ölümü. Kısaltma: MI = miyokard enfarktüsü. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Video S10: 3 günlük MI'nin sol ventrikülü temizlendi. MI'den 3 gün sonra kardiyak fibroblastlardan yoksun geniş bir alan vardı, ancak 1,5 günlük MI'den sonra bulunan sonuçların aksine, ventrikülde bazı kardiyak fibroblastlar (yeşil) yeniden ortaya çıktı. Ayrıca kardiyak fibroblast morfoloji profilleri I/R yaralı kalplerde görülenlerden farklıydı. Burada fibroblastlar uzatıldı, ancak yuvarlatılmış hücre gövdeleri (yaralanmamış kalplerde görülenlerden daha büyük) olan diğerleri vardı ve bunların bir alt nüfusunun birçok hücre projeksiyonu vardı. Kısaltmalar: MI = miyokard enfarktüsü; I/R = iskemi/reperfüzyon. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Video S11: Ang/PE ile tedavi edilen farelerin sol karıncığı temizlendi. Ang/PE tedavisinden sonra belirgin bir kardiyak fibroblast (yeşil) kaybı olmadı. Bununla birlikte, kardiyak fibroblastlar çoğunlukla küçük ve yuvarlak veya küçük ve uzundu ve kalbin kontrtil desenleriyle uyumlu görünüyordu. Kısaltma: Ang/PE = anjiyotensin II/fenilenfrin. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu makale, fare kalbindeki fibroblastları karakterize etmek ve daha iyi anlamak için hem taban çizgisi hem de yaralanmayı takiben in vivo kardiyak fibroblastların görselleştirilmesine izin veren doku temizleme için rafine bir yöntem sunmaktadır. Bu gelişmiş protokol, yetişkin veya yenidoğan kalbindeki belirli hücre tiplerini tanımlamaya çalışan mevcut doku temizleme protokollerindeki sınırlamaları ele12 , 13,14,16,17,20. Fare kalbini temizlemeye yönelik ilk girişimlerde, pasif CLARITY tekniği kullanıldı, burada kalp, tamponun doku boyunca pasif dağılımına izin vermek için yaklaşık 1 hafta boyunca bir besleyici üzerinde bir temizleme tamponunda bırakıldı15,18. Bu işlem sadece dokuya yaklaşık 80 μm derinlikte temizleme üretti (veriler gösterilmedi), bu da 1 günlük yenidoğan fare kalbini temizlemek için birkaç haftaya ihtiyaç duyulan önceki gözlemlerle tutarlı13. Aktif bir elektroforezis sistemi kullanılarak aktif CLARITY, yaklaşık 700 μm-1 mm derinliğinde, daha kısa bir zaman diliminde12,18.

Bununla birlikte, daha önce yayınlanan bu aktif CLARITY protokolünü kullanmak, daha önce Kolesova ve ark.12tarafından aktif CLARITY'de meydana geldiği belirtilen yüksek doku otoflüoresansı seviyeleri ile fibroblast floresan kaybına yol açtı. Fibroblast floresanının korunmasına izin vermek için, uygun fiksasyon protokolünün son derece önemli olduğu bulunmuştur. Bir fiksasyon sürecinin çok kısası elektroforezi sırasında floresan kaybına neden oldu. Bir fiksasyon sürecinin çok uzun sürmesi floresan kaybına neden oldu. Bu nedenle, %4 PFA'da 4 °C'de gece fiksasyonu en uygun bulunmuştur. Arka plan floresan sorununu iyileştirmek için, miyoglobin içindeki heme bağlamayı azaltmak ve bu nedenle bu kromofor18'inneden olduğu otofluoresansı azaltmak için bir renksizleştirme ıslatma (CUBIC temizleme yönteminden ödünç alınan bir ilke) kullanıldı. Dekolorizasyon tedavisi, etiketli fibroblastların daha belirgin olması için muhabir floresanının bakımı ile arka plan floresanının daha sağlam temizlenmesine neden oldu (Şekil 2A).

Son olarak, tam optik saydamlığa izin vermek için doku Kırılma İndeksi Eşleştirme Çözümünde (RIMS) dengelendi (Şekil 2B–D). Dokunun kırılma indeksini çevresiyle eşleştirerek, bu, dokunun optik şeffaflığını artırarak daha derin görüntülemeye izin verir. Daha sonra galvanometrik taramadan daha hızlı olduğu için görüntü dokusuna yüksek hızlı rezonans taraması kullanılmıştır. Fare kalpleri biraz farklı boyutlarda olduğundan, bireysel XY görüntüleme parametreleri ve Z yoğunluğu düzeltmeleri ayarlanmıştır. Bu parametrelerle, floresan fibroblastları yaklaşık 4 saat(Şekil 3)olarak görselleştirmek için yaralanmamış kalpten görüntü almak mümkündü. Görüntüde bulunan floresanları netleştirmek ve arka planı azaltmak için karıştırma ve denoising analiz yazılımı kullanılarak görüntüleme sonrası işlemede görüntü kalitesi artırıldı. Ek olarak, floresan fibroblastların lokalizasyonunu vurgulamak için ikincil analiz yazılımı kullanılmıştır. Bu post-görüntüleme analizi, arka plan voksel-by-voxel ortadan kaldırılarak kardiyak fibroblastlara açıkça açıklama eklemek için kullanılmıştır (Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5, Şekil 6).

Bu optimize clarity protokolü, hem yaralı hem de yaralanmamış kalpleri optik olarak temizlemek için uygulanmıştır. Bu, kardiyak fibroblastların yaralanmaya tepkisinin daha iyi anlaşılmasını sağlar. Bu yaralanmalar arasında MI ve I/R'nin yanı sıra Ang/PE dosing'in bir zaman dilimi de vardı. İskemik yaralanma kalp dokusunu zayıflattıkça, doku bütünlüğünü korumak için elektroforezi sırasında daha fazla özen edilmesi kritik öneme sahiptir. Gerçekten de hem I/R hem de MI yaralanması için daha kısa bir elektroforezi süresi (≤1,5 saat)gereklidir 32. Önceki çalışmalar, yaralanmanın doku temizleme işlemi üzerindeki etkilerini dikkate almamaktadır. Burada sunulan yeni optimize edilmiş protokol, doku daha fazla tahrip olmadan temizlenebilmesini sağlayan yaralanmayı barındırır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların bu makalenin içeriği ile ilgili herhangi bir açıklaması bulunmamaktadır.

Acknowledgments

Yazarlar, bu modelin geliştirilmesinde yardımları ve rehberlikleri için CCHMC Confocal Imaging Core'un yanı sıra tüm 3D baskılı parçaların tasarımı için Klinik Mühendislik'ten Matt Batie'yi kabul etmek istiyor. Demetria Fischesser Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (NHLBI, T32 HL125204) ve Jeffery D. Molkentin Howard Hughes Tıp Enstitüsü tarafından desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-0 braided silk Ethicon K871H
8-0 prolene Ethicon 8730H
40% Acrylamide Solution Bio-Rad 1610140
Angiotensin II Sigma A9525-50G
Artificial Tear Ointment Covetrus 048272
DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane) Millipore Sigma D27802-25G
GLUture topical tissue adhesive World Precision Instruments 503763
Heparin Sigma H0777
Imaris Start Analysis Software Oxford Instruments N/A
Micro-osmotic pumps Alzet Model 1002
Nikon Elements Analysis Software Nikon N/A
Nikon A1R HD upright microscope Nikon N/A
Normal autoclaved chow Labdiet 5010
Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N,
N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide
CosmoBio AXS-1002424
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Phenylephrine Hydrochloride Sigma P6126-10G
Photoinitiator Wako Chemicals VA-044
Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] Jackson Laboratories Jax Stock No:012429
Sodium Azide Sigma Aldrich S2002-5G
Sodium Chloride solution Hospira, Inc. NDC 0409-4888-10
Tamoxifen Sigma Aldrich T5648
Tamoxifen food Envigo TD.130860
Tween-20 Thermo Fisher Scientific BP337-500
Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent Millipore Sigma 122262-1L
X-Clarity electrophoretic clearing chamber Logos Biosystems C30001
X-Clarity electrophoretic clearing solution Logos Biosystems C13001
X-Clarity electrophoresis tissue basket Logos Biosystems C12001
X-Clarity electrophoresis tissue basket holder Logos Biosystems C12002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagaraju, C. K., et al. Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure. Journal of the American College of Cardiology. 73, (18), 2267-2282 (2019).
  2. Yoon, S., Eom, G. H. Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions. Experimental and Molecular Medicine. 51, (12), 1-9 (2019).
  3. Borlaug, B. A., Redfield, M. M. Diastolic and systolic heart failure are distinct phenotypes within the heart failure spectrum. Circulation. 123, 2006-2014 (2011).
  4. Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the cardiac fibroblast. Circulation Journal. 80, (11), 2269-2276 (2016).
  5. Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigation. 128, (5), 2127-2143 (2018).
  6. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
  7. Sadeghi, A. H., et al. Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling. Advanced Healthcare Materials. 6, (11), 1601434 (2017).
  8. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141, (22), 4267-4278 (2014).
  9. Bruns, D. R., et al. The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation. PLoS One. 14, (8), 0220573 (2019).
  10. Skiöldebrand, E., et al. Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion. Heliyon. 3, (10), 00406 (2017).
  11. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method. Cell Research. 28, 803-818 (2018).
  12. Kolesová, H., Čapek, M., Radochová, B., Janáček, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146, (2), 141-152 (2016).
  13. Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. Capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging. Journal of Visualized Experiments. (157), (2020).
  14. Wang, Z., et al. Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution. Biomedical Optics Express. 9, (2), 423-436 (2018).
  15. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, (4), 945-958 (2014).
  16. Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12, (7), 0182072 (2017).
  17. Perbellini, F., et al. Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue. Scientific Reports. 7, 5188 (2017).
  18. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
  19. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  20. Nehrhoff, I., et al. 3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper. Biomedical Optics Express. 7, (9), 3716-3720 (2016).
  21. Yamamoto, M., et al. A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis. Genesis. 47, (2), 107-114 (2009).
  22. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50, (5), 600-613 (2011).
  23. Means, C. K., et al. Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 292, (6), 2944-2951 (2007).
  24. Michael, L. H., et al. Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 269, (6), 2147-2154 (1995).
  25. Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286, (3), 1201-1207 (2004).
  26. Patten, R. D., et al. Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 274, (5), 1812-1820 (1998).
  27. Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 45, (2), 330-338 (2000).
  28. Vagnozzi, R. J., et al. An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy. Nature. 577, 405-409 (2020).
  29. Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1, (3), 366-376 (2008).
  30. Arts, T., et al. Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle. Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).
  31. Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. P. The muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars. American Journal of Pathology. 145, (4), 868-875 (1994).
  32. Hashmi, S., Al-Salam, S. Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: A comparison. International Journal of Clinical Experimental Pathology. 8, 8786-8796 (2015).
Sağlıklı ve Yaralı Fare Kalplerinde Üç Boyutlu Fibroblast Organizasyonu için Rafine CLARITY Tabanlı Doku Temizleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fischesser, D. M., Meyer, E. C., Sargent, M., Molkentin, J. D. Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts. J. Vis. Exp. (171), e62023, doi:10.3791/62023 (2021).More

Fischesser, D. M., Meyer, E. C., Sargent, M., Molkentin, J. D. Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts. J. Vis. Exp. (171), e62023, doi:10.3791/62023 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter