Summary
Qui, presentiamo un modello di endotossina riproducibile orientato all'unità di terapia intensiva nei ratti.
Abstract
La sepsi e lo shock settico rimangono la principale causa di morte nelle unità di terapia intensiva. Nonostante i significativi miglioramenti nella gestione della sepsi, la mortalità varia ancora tra il 20 e il 30%. Sono urgentemente necessari nuovi approcci terapeutici al fine di ridurre il fallimento multiorgano correlato alla sepsi e la morte. Modelli animali robusti consentono uno o più approcci terapeutici e di testare il loro effetto sui parametri fisiologici e molecolari. In questo articolo viene presentato un semplice modello animale.
In primo luogo, l'anestesia generale è indotta negli animali con l'uso di volatili o mediante anestesia intraperitoneale. Dopo il posizionamento di un catetere endovenoso (vena della coda), la tracheostomia e l'inserimento di un catetere intraarterio (arteria della coda), viene avviata la ventilazione meccanica. Vengono registrati valori basali della pressione arteriosa media, della saturazione di ossigeno nel sangue arterioso e della frequenza cardiaca.
L'iniezione di lipopolisaccaridi (1 milligrammo/chilogrammo di peso corporeo) disciolti in soluzione salina tamponata con fosfato induce una risposta infiammatoria forte e riproducibile attraverso il recettore toll-like 4. Le correzioni dei fluidi e l'applicazione della noradrenalina vengono eseguite sulla base di protocolli consolidati.
Il modello animale presentato in questo articolo è facile da imparare e fortemente orientato al trattamento clinico della sepsi in un'unità di terapia intensiva con sedazione, ventilazione meccanica, monitoraggio continuo della pressione sanguigna e prelievo di sangue ripetitivo. Inoltre, il modello è affidabile, consentendo dati riproducibili con un numero limitato di animali in conformità con i principi 3R (ridurre, sostituire, perfezionare) della ricerca sugli animali. Mentre gli esperimenti sugli animali nella ricerca sulla sepsi non possono essere facilmente sostituiti, le misurazioni ripetitive consentono una riduzione degli animali e mantenere gli animali settici anestetizzati diminuisce la sofferenza.
Introduction
La sepsi e la sua forma più grave, lo shock settico, sono sindromi sul terreno di un'infezione, con conseguente reazione infiammatoria di overshooting con il rilascio di citochine, che porta a cambiamenti fisiologici e biochimici con una difesa immunitaria soppressa e risultati fatali 1,2. Questa reazione infiammatoria squilibrata provoca disfunzione d'organo e insufficienza d'organo in vari organi vitali come polmone, rene e fegato. Con il 37%3, la sepsi è uno dei motivi più comuni per cui un paziente deve essere ricoverato in un'unità di terapia intensiva (ICU). La mortalità per sepsi attualmente varia intorno al 20-30%4. Un trattamento antibiotico precoce ed efficace è della massima importanza5. La rianimazione di liquidi e vasopressori deve essere installata precocemente, a parte questo, il trattamento è puramente di supporto6.
La sepsi è definita come un'infezione comprovata o sospetta con batteri, funghi, virus o parassiti, che è accompagnata da disfunzione d'organo. I criteri di shock settico sono soddisfatti quando un ulteriore collasso cardiovascolare non risponde al solo trattamento con fluidi e un livello di lattato superiore a 2 millimole / litro è presente2. L'insufficienza d'organo correlata alla sepsi può verificarsi in qualsiasi organo, ma è molto comune nel sistema cardiovascolare, nel cervello, nei reni, nel fegato e nel polmone. La maggior parte dei pazienti affetti da sepsi richiede l'intubazione endotracheale per proteggere le vie aeree del paziente, per proteggere dall'aspirazione e per applicare una ventilazione espiratoria positiva con un'alta frazione di ossigeno inspirato per prevenire o superare l'ipossia. Al fine di tollerare un tubo tracheale e ventilazione meccanica, i pazienti di solito richiedono sedazione.
Le endotossine, come i lipopolisaccaridi (LPS) come componente della membrana dei batteri gram negativi, inducono una forte reazione infiammatoria attraverso il recettore toll-like (TLR) 47. L'attivazione di un percorso definito assicura una reazione infiammatoria stabile. Citochine come la proteina 1 chemioattrattante dei neutrofili indotta da citochine (CINC-1), la proteina 1 chemioattrattante monocitaria (MCP-1) e l'interleuchina 6 (IL-6) sono note come fattori prognostici per gravità ed esito in questo modello8. L'applicazione di LPS per via endovenosa è stata utilizzata con successo per studiare vari aspetti della sepsi nei ratti 8,9.
Il trattamento della sepsi è ancora una sfida, in particolare a causa della mancanza di modelli animali predittivi. Se l'endotossiemia con attivazione dell'infiammazione sistemica sia un modello adeguato per lo sviluppo di terapie farmacologiche è discutibile. Tuttavia, con il noto percorso TLR 4 indotto da LPS è possibile acquisire importanti conoscenze.
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Protocol
Tutti gli esperimenti presentati in questo protocollo sono stati approvati dalle autorità veterinarie del Cantone di Zurigo, Svizzera (numeri di approvazione 134/2014 e ZH088/19). Inoltre, tutte le fasi eseguite in questo esperimento sono state conformi alle Linee guida sugli esperimenti con gli animali dell'Accademia svizzera delle scienze medie (SAMS) e alle Linee guida della Federazione delle associazioni europee di scienza degli animali da laboratorio (FELASA).
1. Induzione dell'anestesia e monitoraggio degli animali
- Tenere ratti Wistar maschi con un peso di 250-300 grammi (g) in gabbie ventilate in condizioni prive di agenti patogeni. Fornire un ciclo luce/buio di 12-12 ore a una temperatura ambiente di 22 ± 1 °C e libero accesso a cibo e acqua.
- Indurre l'anestesia generale per induzione volatile con isoflurano (concentrazione del 3-5%) in una scatola di induzione dell'anestesia per 30 secondi (Figura 1A) o, in alternativa, indurre l'anestesia con un'iniezione a colpo singolo di ketamina/xilazina (10/1 milligrammo (mg) per 100 g di peso corporeo).
- Trasferire l'animale in un luogo di lavoro e posare l'animale su un tappetino riscaldante durante l'intero esperimento. Mantenere la temperatura corporea tra 36,5 e 37 °C.
- Utilizzare un naso per fornire ossigeno (600 ml / minuto). Aggiungere isoflurano 2-3% se l'anestesia volatile è stata scelta per il mantenimento dell'anestesia. Assicurati che l'animale stia respirando spontaneamente.
- Confermare il livello di anestesia dall'assenza del riflesso del pizzicamento delle dita dei piedi prima dell'installazione della tracheostomia e dei cateteri arteriosi e venosi.
- Verificare una sufficiente ossigenazione mediante monitoraggio della saturazione periferica di ossigeno (saturazione di ossigeno normale 98 - 100%).
- Utilizzare un unguento (unguento alla vitamina A) per proteggere gli occhi.
- Preparare strumenti chirurgici sterili e cateteri su un tavolino come mostrato nella Figura 1B.
- Inoltre, preparare il monitoraggio della pressione e della saturazione di ossigeno come mostrato nella Figura 1C.
2. Accesso endovenoso
- Applicare un laccio emostatico sulla coda prossimale del ratto per facilitare l'accesso venoso (Figura 2A).
- Disinfettare la coda 3 volte con alcool.
- Indurre un catetere endovenoso G26 in una delle due vene laterali della coda.
NOTA: Dalla nostra esperienza è più facile posizionare l'accesso endovenoso nella parte distale della coda del ratto, perché la vena qui si trova più vicino alla pelle. Inoltre, in caso di cannulazione fallita, c'è abbastanza spazio per muoversi prossimalmente. - Evitare rigorosamente l'iniezione d'aria.
- Sciogliere il laccio emostatico dopo aver posizionato il catetere endovenoso.
- Fissare il catetere endovenoso in posizione con nastro adesivo (Figura 2B).
- Collegare le pompe a siringa all'accesso endovenoso per l'applicazione continua di liquidi e farmaci.
- Utilizzare rubinetti a 3 vie per il liquido in bolo, l'applicazione di farmaci e il prelievo di sangue venoso.
3. Tracheostomia
- Radere l'area anteriore del collo dell'animale.
- Disinfettare la pelle rasata 3 volte con la soluzione di providone-iodio.
- Eseguire un'incisione longitudinale di circa 2 cm utilizzando un bisturi (con una lama numero 10).
- Ritrarre la pelle con 2-0 suture di seta.
- Preparare senza mezzi termini la laringe e la trachea con le forbici chirurgiche (Figura 3A).
- Assicurati di aprire la trachea con micro forbici chirurgiche alla3-5a fibbia tracheale.
- Inserire una cannula tracheale sterile nella trachea. Fare attenzione, non inserire la cannula troppo in profondità per evitare la ventilazione unilaterale.
- Fissare la cannula in posizione utilizzando una sutura di seta 2-0.
- Collegare la cannula a un ventilatore per la ventilazione controllata dalla pressione o dal volume (Figura 3B).
4. Accesso arterioso
- Disinfettare la coda del ratto 3 volte con la soluzione di povidone-iodio.
- Tagliare la pelle usando un bisturi (con una lama numero 10) circa 1 cm longitudinalmente sul lato ventrale.
- Fare attenzione, non tagliare troppo profondamente per evitare una lesione dell'arteria della coda.
- Utilizzare un microscopio chirurgico per esporre l'arteria con attenzione. Tagliare la fascia che circonda l'arteria con micro forbici chirurgiche.
- Ligate la parte distale dell'arteria usando una sutura di seta 6-0.
- Preparare una sutura di seta prossimale 6-0 ma non stringere la seta (Figura 4A).
- Introdurre un catetere G-26 nell'arteria tra la sutura di seta distale e prossimale.
- Una volta che il catetere è nell'arteria, stringere la sutura di seta prossimale e fissare il catetere in posizione (Figura 4B).
- Collegare il catetere a un trasduttore di pressione per fornire una misurazione continua della pressione arteriosa (pressione arteriosa media normale: 60 - 100 mmHg) (Figura 4C).
- Inoltre, posizionare un rubinetto a 3 vie tra il catetere collegato al trasduttore di pressione e il catetere G-26 per il prelievo di sangue arterioso.
5. Misurazione di base, induzione della sepsi e misurazioni di follow-up
- Dopo che l'animale ha raggiunto uno stato stazionario, iniettare l'LPS.
- Raccogliere campioni di sangue quando viene raggiunto uno stato stazionario (di solito dopo 15-30 minuti).
- Sostituire la perdita di liquidi da campioni di sangue con la soluzione di Ringer in un rapporto di 1:4.
- Per indurre la sepsi, iniettare l'LPS come bolo o come applicazione LPS continua.
- Per l'applicazione in bolo, iniettare 1 mg di LPS/chilogrammo di peso corporeo (kg) disciolto in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) ad una concentrazione di 1 mg/ml.
- Per l'applicazione continua, iniettare 300 μg di LPS/kg/ora durante l'intero esperimento utilizzando una pompa a siringa (soluzione madre di LPS: 1 mg/mL in PBS).
- Evitare l'iniezione d'aria in ogni momento al fine di prevenire l'embolia atmosferica.
- Definire protocolli di sostituzione dei fluidi, protocolli di applicazione vasocostrittori e criteri di aborto (ad esempio ipotensione definita come una pressione arteriosa media inferiore a 50 mmHg per più di 30 minuti nonostante la sostituzione del fluido) prima di impostare l'esperimento.
NOTA: Si consiglia un'infusione continua della soluzione di Ringer ad una velocità di 10 ml/kg/ora. - Sottrarre qualsiasi somministrazione continua di fluidi (ad esempio, per l'applicazione LPS continua) dalla quantità infusa in modo che i risultati siano comparabili con quelli dei gruppi di controllo.
NOTA: Alla fine dell'esperimento, e prima di prelevare qualsiasi organo come fegato, rene o milza per ulteriori analisi come l'esame istologico o biochimico, gli animali possono essere eutanasizzati da un'incisione della vena cava inferiore. Il metodo raccomandato di eutanasia è quello di portare gli animali su un piano chirurgico di anestesia prima dell'incisione della vena cava inferiore e dell'iniezione di soluzione salina ghiacciata nel cuore sinistro, specialmente se devono essere valutati marcatori infiammatori negli organi. Assicurarsi di rispettare i requisiti legali e le linee guida locali. Per verificare l'insufficienza d'organo correlata alla sepsi, è possibile analizzare il marcatore pro-apoptosi come la caspasi-3 e l'α1-microglobulina per verificare il danno tubulare nei reni. L'analisi specifica per organo di marcatori come CINC-1, MCP-1 e IL-6 può anche fornire informazioni sulla risposta infiammatoria specifica dell'organo.
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Representative Results
Il sistema presentato consente l'endotossiemia con animali emodinamicamente stabili come riportato in precedenza9. Mentre la pressione arteriosa media rimane stabile negli animali con e senza stimolazione LPS gli animali trattati con LPS sviluppano caratteristiche di sepsi come un eccesso di base negativo e una forte reazione infiammatoria misurata dalle citochine plasmatiche (6 ore dopo l'applicazione) come CINC-1 (867 ng / mL), MCP-1 (5027 ng / mL) e IL-6 (867 ng / mL) 8, Figura 5.
Figura 1: Preparazione dell'attrezzatura: scatola di induzione dell'anestesia e naso per l'applicazione di anestesia / ossigeno (A). Materiale sterile da preparare prima dell'intervento chirurgico: cateteri per via endovenosa 26G, un bisturi con lama numero 10, pinza curva, pinza diritta, 1 portaago, fascette da seta 2-0 e 6-0, punte q, forbici chirurgiche, microscisori chirurgici (B). Apparecchiature di monitoraggio: monitoraggio dell'anestesia con trasduttore di pressione e sensore di saturazione dell'ossigenazione periferica (SpO2) per il monitoraggio continuo (C). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Accesso venoso: un laccio emostatico viene applicato alla coda del ratto prossimale (A). L'accesso venoso deve essere introdotto nella parte distale della coda e fissato in posizione (B). L'embolia aerea dovrebbe essere rigorosamente evitata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Tracheostomia: la laringe e la trachea sono preparate senza mezzi termini usando forbici chirurgiche ed esposte usando suture di seta 2-0 (A). Dopo aver aperto la trachea utilizzando micro forbici chirurgiche alla 3-5achiusura tracheale, viene introdotta una cannula tracheale, fissata in posizione e collegata a un ventilatore (B) Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Accesso arterioso: dopo l'esposizione chirurgica dell'arteria della coda utilizzando un bisturi e micro forbici chirurgiche, viene stretta una legatura distale di seta 6-0 e viene preparata una legatura prossimale (A). Dopo l'inserimento del catetere G-26 nell'arteria, viene fissato in posizione (B). Il catetere arterioso consente il prelievo ripetitivo di sangue e il monitoraggio continuo della pressione sanguigna (C). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Risultati rappresentativi: Mentre gli animali rimangono emodinamicamente stabili nell'LPS e nel gruppo sham (A), sviluppano caratteristiche di endotossiemia come un eccesso di base negativo (B) e un aumento dei mediatori infiammatori come la proteina 1 chemioattrattante neutrofila indotta da citochine (CINC-1) (C), la proteina chemioattrattante monocitaria 1 (MCP-1) (D) e l'interleuchina 6 (IL-6) (E). La figura è riprodotta con il permesso di Wolters Kluwer Health Inc., Beck-Schimmer et al, Eur J Anesthesiol 2017; 34:764-7759. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo qui descritto consente un modello di sepsi altamente riproducibile, ma semplice da imparare, che può essere adattato in base alla domanda di ricerca. I dati essenziali in vivo che si riferiscono alla funzione degli organi come la frequenza cardiaca, la pressione sanguigna e la saturazione di ossigeno arterioso periferico possono essere raccolti continuamente e il prelievo di sangue può essere eseguito ripetutamente durante l'esperimento. Inoltre, è possibile installare modifiche relative ai protocolli di sostituzione dei fluidi e al supporto del vasopressore. Data la stabilità emodinamica degli animali, gli esperimenti possono essere effettuati nell'arco di diverse ore, come riportato in precedenza8.
Va sottolineato che deve essere scelto un modello di sepsi appropriato per rispondere a una domanda di ricerca specifica10,11. Tutti i modelli di sepsi hanno i loro vantaggi, ma anche i loro svantaggi. Nel presente articolo viene presentato un modello di endotossiemia, che induce un'infiammazione forte, ma sterile. Sono presenti caratteristiche chiave della sepsi, come lo sviluppo di una forte risposta infiammatoria12, disfunzione endoteliale e danno13 e insufficienza multiorgano14. Pertanto, il modello presentato è conforme alla definizione precedentemente pubblicata di modelli di sepsi negli animali dal "International Expert Consensus for Pre-Clinical Sepsis Studies"15. Altri elementi chiave possono essere diversi rispetto alla sepsi batterica. L'applicazione in bolo LPS, ad esempio, induce una risposta cardiovascolare ipodinamica16, che non corrisponde alla risposta iperdinamica osservata nella sepsi umana. Quest'ultimo, tuttavia, può essere indotto da un'infusione continua di LPS come suggerito anche nell'attuale articolo16. Va considerato che LPS rappresenta solo una tossina e può essere eccessivamente semplificato per alcune domande di ricerca - d'altra parte, la semplificazione aumenta la riproducibilità dei dati. Un'altra caratteristica dei modelli di endotossiemia è una diversa risposta delle citochine rispetto ai modelli batterici - l'endotossiemia induce aumenti delle citochine più elevati, ma più brevi10. Sebbene il modello consenta misurazioni ripetitive per diverse ore, la tracheostomia non è ideale per gli esperimenti di sopravvivenza. In caso di esperimenti di sopravvivenza, può essere preferita l'intubazione tracheale o la respirazione spontanea tramite maschera.
Tre classi fondamentalmente diverse di modelli di sepsi sono attualmente applicate nella ricerca di laboratorio sulla sepsi: modelli di tossiemia (ad esempio, LPS), modelli di infezione batterica (ad esempio, Escherichia coli per via endovenosa) e modelli di interruzione della barriera dell'ospite (ad esempio, legatura cecale e puntura, CLP)17. Anche se i modelli di tossiemia con LPS sono stati proposti come modello inappropriato per una replicazione della sepsi umana15, va sottolineato che le caratteristiche di queste classi fondamentali di modelli di sepsi sono state descritte in dettaglio 8,12,13,14 e sono state riviste criticamente in un recente articolo 17.
Non esiste una risposta definitiva su cosa siano gli esperimenti sugli animali umani, ma il senso più comune è il principio delle 3R, per loro definizione, gli esperimenti sugli animali dovrebbero essere ridotti, sostituiti e raffinati18. Mentre nella ricerca sulla sepsi la sostituzione degli esperimenti sugli animali è difficile, il campionamento ripetitivo del sangue e le misurazioni continue dei dati vitali possono ridurre il numero di animali necessari. Inoltre, mantenere anestetizzati gli animali settici affina l'impostazione sperimentale man mano che la sofferenza degli animali diminuisce.
In sintesi, presentiamo un modello di endotossiemia ben caratterizzato e riproducibile, un setting simile a quello di un'unità di terapia intensiva con la possibilità di generare un'alta densità di dati, e allo stesso tempo limitare il carico animale. Inoltre, questo modello può essere facilmente modificato a seconda della domanda di ricerca a cui è necessario rispondere.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse per quanto riguarda lo studio presentato. Martin Schläpfer ha presentato un brevetto per mitigare gli effetti negativi della chirurgia e/o dell'anestesia per i pazienti che utilizzano gas medicali, in particolare ossigeno (O2) e anidride carbonica (CO2). Ha ricevuto sovvenzioni di ricerca illimitate da Sedana Medical, Svezia, e da Roche, Svizzera, non correlate a questo lavoro.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Beatrice Beck-Schimmer (MD) ed Erik Schadde (MD) per il loro esame critico e il loro prezioso contributo per questo manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-0 silk sutures | Ethicon, Sommerville, NJ | K833 | Standard surgical |
| 26 intravenous catheter | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 391349 | Standard anesthesia equipment |
| 6-0 LOOK black braided silk | Surgical Specalities Corporation, Wyomissing, PA | SP114 | Standard surgical |
| Alaris Syringe Pump | Bencton Dickinson | ||
| Betadine | Mundipharma, Basel, Switzerland | 7.68034E+12 | GTIN-number |
| Curved fine tips microforceps | World precision instruments (WPI), Sarasota, FL | 504513 | Facilitates vascular preparation |
| Fine tips microforceps | World precision instruments (WPI), Sarasota, FL | 501976 | Tips need to be polished regularly |
| Infinity Delta XL Anesthesia monitoring | Draeger, Lübeck, Germany | ||
| Isoflurane, 250 mL bottles | Attane, Piramal, Mumbai, India | LDNI 22098 | Standard vet. equipment |
| Ketamine (Ketalar) | Pfitzer, New York, NY | ||
| Lipopolysaccharide (LPS) from Escherichia coli, serotype 055:B5 | Sigma, Buchs, Switzerland | ||
| Q-tips small | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | EH11.1 | Standard surgical |
| Ringerfundin | Bbraun, Melsungen, Germany | ||
| Tec-3 Isofluorane Vaporizer | Ohmeda, GE-Healthcare, Chicago, IL | not available anymore | Standard vet. equipment |
| Xylazine (Xylazin Streuli) | Streuli AG, Uznach, Switzerland |
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