Summary
نحن نقدم طريقة للحصول على دورات زمنية لمراسل مضان من خلايا واحدة باستخدام صفائف micropatterned. ويصف البروتوكول إعداد صفائف أحادية الخلية، وإعداد وتشغيل المجهر الفاصل الزمني لمسح الخلايا الحية، وأداة تحليل الصور مفتوحة المصدر للاختيار المسبق الآلي، والتحكم البصري وتتبع دورات زمنية مضانة متكاملة للخلايا لكل موقع التصاق.
Abstract
تصوير الخلايا الحية للصفائف أحادية الخلية (LISCA) هو طريقة متعددة الاستخدامات لجمع الدورات الزمنية للإشارات الفلورية من الخلايا الفردية في الإنتاجية العالية. بشكل عام، يعوق الحصول على دورات الوقت خلية واحدة من الخلايا المستزرعة من قبل حركة الخلية وتنوع أشكال الخلايا. صفائف صغيرة لاصقة توحيد ظروف خلية واحدة وتسهيل تحليل الصورة. تجمع LISCA بين الميكروبات أحادية الخلية مع الفحص المجهري الفاصل زمنيا ومعالجة الصور الآلية. هنا، نقوم بوصف الخطوات التجريبية لأخذ دورات زمنية للفلورسينس أحادية الخلية في شكل LISCA. نحن خلايا العدوى المنضمة إلى صفيف micropatterned باستخدام ترميز مرنا لتعزيز البروتين الفلوري الأخضر (eGFP) ورصد الحركية التعبير eGFP من مئات الخلايا بالتوازي عن طريق المسح الضوئي المجهر الفاصل الزمني. تتم معالجة مداخن بيانات الصورة تلقائيا بواسطة برامج مطورة حديثا تدمج كثافة الفلورسينس على معالم الخلايا المحددة لإنشاء دورات زمنية للفلورسينس أحادية الخلية. نحن نثبت أن دورات وقت التعبير eGFP بعد نقل الحمض النووي الريبي موصوفة بشكل جيد من خلال نموذج ترجمة حركي بسيط يكشف عن معدلات التعبير والتدهور في الحمض النووي الريبي. تتم مناقشة تطبيقات أخرى من LISCA لارتباطات وقت الحدث من علامات متعددة في سياق الإشارة إلى موت الخلايا المبرمج.
Introduction
في السنوات الأخيرة، أصبحت أهمية التجارب ذات الخلية الواحدة واضحة. تسمح البيانات من خلايا واحدة بالتحقيق في تقلب الخلية إلى الخلية ، وحل الارتباطات المعلمة داخل الخلية والكشف عن الحركية الخلوية التي لا تزال مخفية فيقياسات الفرقة 1و2و3. من أجل التحقيق في الحركية الخلوية لآلاف الخلايا المفردة بالتوازي ، هناك حاجة إلى نهج جديدة تمكن من مراقبة الخلايا في ظل ظروف موحدة على مدى فترة زمنية تصل إلى عدة ساعات إلى عدة أيام تليها تحليل البيانات الكمية 4. هنا ، نقدم تصوير الخلايا الحية للصفائف أحادية الخلية (LISCA) ، والذي يجمع بين استخدام الصفائف المجهرية مع المجهر الفاصل الزمني وتحليل الصور الآلي.
وقد تم إنشاء عدة طرق لتوليد صفائف الخلية الواحدة microstructured ونشرت في الأدب5،6. هنا، ونحن نصف بإيجاز Microscale البلازما التي بدأت نمط البروتين (μPIPP). كما تم العثور على بروتوكول مفصل لتصنيع صفيف خلية واحدة باستخدام μPIPP في المرجع7. استخدام صفائف وحيدة الخلية تمكن من محاذاة الآلاف من الخلايا على بقع التصاق موحدة تقديم البيئات الدقيقة المحددة لكل خلية، وبالتالي يقلل من مصدر للتغير التجريبي(الشكل 1A). وتستخدم صفائف أحادية الخلية لرصد المسارات الزمنية للعلامات الفلورية التي تهدف إلى الإشارة إلى مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية. يسمح الفحص المجهري طويل الأجل في وضع الفاصل الزمني المسح الضوئي بمراقبة مساحة كبيرة من صفائف الخلية الواحدة وبالتالي أخذ عينات من بيانات الخلية الواحدة في إنتاجية عالية على مدى عدة ساعات أو حتى أيام. وهذا يولد مداخن خط الوقت من الصور من كل موقف من الصفيف (الشكل 1B). من أجل تقليل كمية كبيرة من بيانات الصورة واستخراج المقررات الزمنية ذات الخلية الواحدة المطلوبة بطريقة فعالة ، يلزم معالجة الصور الآلية التي تستفيد من تحديد مواقع الخلايا(الشكل 1C).
ويتمثل التحدي الذي تواجهه اللجنة في تكييف البروتوكولات التجريبية والأدوات الحاسوبية لتشكيل تقييم عالي الإنتاجية يولد بيانات كمية وقابلة للاستنساخ من الحركية الخلوية. في هذه المقالة نقدم وصفا خطوة بخطوة للأساليب الفردية وكيفية دمجها في اختبار LISCA. على سبيل المثال، نناقش المسار الزمني للتعبير المحسن عن البروتين الفلوري الأخضر (eGFP) بعد تسليم الحمض النووي الريبي الاصطناعي. يوصف التعبير eGFP بعد تسليم مرنا من قبل معادلات معدل رد الفعل النمذجة الترجمة وتدهور مرنا. إن تركيب وظيفة النموذج للمسار الزمني لتركيز eGFP مع قراءات LISCA لشدة الفلورسينس لكل خلية على حدة بمرور الوقت يؤدي إلى أفضل تقديرات لمعلمات النموذج مثل معدل تدهور الحمض النووي الريبي. ونتيجة لذلك، نناقش كفاءة تسليم الحمض النووي الريبي (mRNA) لاثنين من عوامل العدوى المختلفة القائمة على الدهون وكيف تختلف توزيعات المعلمات الخاصة بها.
الشكل 1:تمثيل سير عمل LISCA الذي يجمع (أ) صفائف أحادية الخلية صغيرة النمط (B) المسح الضوئي الفاصل الزمني وتحليل الصورة الآلي (C) لسلسلة الصور المسجلة. تتكون صفائف الخلية الواحدة من نمط ثنائي الأبعاد من المربعات اللاصقة للخلايا مع مساحة مشتركة طاردة للخلايا تؤدي إلى ترتيب الخلايا على الميكروبيترن ، كما يمكن رؤيته في صورة تباين المرحلة وكذلك صورة الفلورية لخلايا التعبير عن eGFP (A). يتم تصوير المنطقة المجهرية بأكملها في وضع الفاصل الزمني المسح الضوئي التقاط الصور مرارا وتكرارا في سلسلة من المواقف(B). تتم معالجة سلسلة الصور المسجلة لقراءة كثافة الفلورسينس لكل خلية مع مرور الوقت (C). أشرطة المقياس: 500 ميكرومتر (A)، 200 ميكرومتر (C). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الشكل 2:الحصول على البيانات التي تجمع بين الخلايا المفردة المجهرية (A) مع المسح الضوئي الفاصل الزمني (B). 11- واستعدادا لتجربة الفاصل الزمني، يتم إعداد صفيف أحادي الخلية يحتوي على جزء صغير ثلاثي الأبعاد من مربعات التصاق (1)، يليه بذر الخلايا ومحاذاة الخلايا على الميكروبيترن (2) وكذلك توصيل نظام التشوه بالشريحة ذات القنوات الست، مما يتيح المناولة السائلة أثناء قياس الفاصل الزمني (3). يتم إعداد تجربة المسح الضوئي الفاصل الزمني (4) ويتم إصابة الخلايا على المجهر عن طريق حقن محلول ليبوبلكليكس مرنا من خلال نظام التشوه أثناء تجربة الفاصل الزمني (5). أشرطة المقياس: 200 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
1. Microstructured تصنيع صفيف وحيد الخلية (الشكل 2A)
- إعداد المواد اللازمة لتصنيع صفيف μPIPP.
- إعداد المحلول الملحي المعقم العازل بالفوسفات (PBS) عند درجة الحموضة 7.4.
- إعداد المياه فائقة النحافة مع مقاومة لا تقل عن 18 MΩcm في 25 درجة مئوية.
- إعداد PLL (20 kDa) - ز [3.5] PEG (2 كيلو دا) (PLL-PEG) حل العمل مع تركيز 2 ملغم / مل من PLL-PEG في المياه فائقة الشراء التي تحتوي على 150 مليون م م NaCl و 10 مللي متر 4-(2-هيدروكسي إيثيل)-1-حمض بيبرازينيثانسولفونيك (HEPES).
- إعداد محلول بروتين مصفوفة خارج الخلية لطلاء السطح: 1 ملغم / مل فيبروكتين (FN) في برنامج تلفزيوني.
- إعداد رقاقة السيليكون مع micropattern ملفقة من قبل التصوير الضوئي8 الذي يعمل سيد قابلة لإعادة الاستخدام. يتكون المايكروباترن من مربعات بطول حافة 30 ميكرومتر وعمق 12 ميكرومتر ومسافة بين مربعين تبلغ 60 ميكرومتر، مرتبة بستة خطوط يبلغ عرض كل منها 6 مم وارتفاع 18 ملم.
- مزيج بوليديمثيلسيلوكسينا (PDMS) مونومر مع 9٪ وصلة متقاطعة (كتلة ٪) باستخدام مجموعة elastomer السيليكون وdgas لحوالي 30 دقيقة حتى أنها فقاعة خالية باستخدام desiccator. يلقي رقاقة السيليكون مع ما يقرب من 3-5 ملم طبقة PDMS سميكة وdgas مرة أخرى لمدة 30 دقيقة حتى يكون خاليا من فقاعة.
- وضع رقاقة السيليكون مع PDMS في فرن الخبز في 50 درجة مئوية لعلاج PDMS لمدة 4 ساعة على الأقل.
- قص طوابع PDMS.
- استخدام مشرط وقطع من طبقة PDMS تحفة واحدة PDMS التي تحتوي على ستة خطوط micropattern.
- ضع تحفة PDMS على مقعد مع micropattern التي تواجه صعودا.
- قطع كل من المشارب micropattern ستة من تحفة PDMS مع شفرة حلاقة في طابع PDMS. الحرص على أن حواف الطوابع PDMS مفتوحة عن طريق قطع بعض من منطقة منقوشة.
- ضع طوابع PDMS على غطاء من شريحة من ست قنوات (الشكل 3-1).
- استخدام غطاء غير مطلي ووضع علامة على مواقف القناة من الشريحة ست قنوات عن طريق خدش بعناية احباط حماية من coverslip. ثم ضع غطاء على مقاعد البدلاء مع احباط الحماية التي تواجه لأسفل.
- ضع طوابع PDMS مع الميكروبيترن المواجه لأسفل على غطاء الغطاء في موضع القناة المميز باستخدام ملاقط.
- تحقق من مرفق طوابع PDMS تحت المجهر. إذا تم إرفاق طابع PDMS بالكامل إلى coverlip، المربعات في الاتصال تظهر أغمق من interspace. إن إرفاق ختم PDMS بالقطعة الأغطية أمر بالغ الأهمية لجودة الميكروباترن.
- ضع غطاء مع ستة طوابع PDMS على ذلك في منظف البلازما وعلاجه مع البلازما الأكسجين (ضغط 0.2 mbar، ~ 40 W لمدة 3 دقائق) لجعل السطوح بين الطوابع PDMS والهيدروفيليا coverslip (الشكل 3-2).
- تنفيذ جميع الخطوات الأخرى لتصنيع micropattern في خزانة السلامة البيولوجية. استخدام 15 ميكرولتر من محلول PLL-PEG وماصة قطرة واحدة منه بجانب كل ختم PDMS بحيث يتم امتصاص حل PLL-PEG في النمط المائي لختم PDMS (الشكل 3-3). دع PLL-PEG يحتضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- شطف 1 مل من المياه فائقة الشراء على غطاء مع الطوابع PDMS على ذلك وإزالة الطوابع PDMS باستخدام ملاقط (الشكل 3-4). ثم شطف coverslip للمرة الثانية مع 1 مل من المياه فائقة البور والسماح لها الجافة.
- عندما يجف غطاء تماما، عصا شريحة لزجة ست قنوات إلى coverlip (الشكل 3-4). الحرص على أن المناطق micropatterned تتماشى مع الجزء السفلي من القنوات.
- إضفاء الطابع الوظيفي على مربعات التصاق مع FN.
- ملء 40 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في كل قناة.
- إعداد حل 100 ميكروغرام /مل FN في برنامج تلفزيوني.
- إضافة 40 ميكرولتر من حل FN لكل قناة (الشكل 3-5). امزج محلول FN مع برنامج تلفزيوني في القناة جيدا عن طريق إزالة 40 ميكرولتر من خزان واحد وإضافته إلى الخزان المقابل لنفس القناة لمدة 3 مرات لتوليد حل متجانس. احتضان حل FN لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل كل قناة ثلاث مرات مع 120 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني (الشكل 3-6).
- للتحقق من جودة النمط، استخدم FN المسمى fluorescently في الخطوة 9.2. (الشكل 4A).
ملاحظة: نوصي إعداد صفيف μPIPP لا يزيد عن يوم واحد قبل البذر الخلية كما PLL-PEG و FN غير مرتبطة بشكل مكافئ إلى الركيزة ونوعية النمط قد إنقاص بمرور الوقت. تخزين صفيف μPIPP المعدة في الثلاجة.
الشكل 3:يتم ترتيبتصنيع microarray أحادي الخلية بواسطة μPIPP. (1) طوابع PDMS ذات بنية micropattern ثلاثية الأبعاد على السطح على غطاء من شريحة من ست قنوات. (2) يتم التعامل مع coverlip مع الطوابع PDMS على ذلك مع البلازما الأكسجين لجعل الأسطح hydrophilic. (3) يتم إضافة PLL-PEG. يتم امتصاصه في البنية المجهرية من قبل القوى الشعرية ويجعل الأسطح غير مغطاة بختم PDMS طارد الخلية. (4) يتم شطف غطاء مع الماء لإزالة PLL-PEG المتبقية. ثم تتم إزالة طوابع PDMS ولصق شريحة لزجة من ست قنوات إلى غطاء الغطاء. (5) فيبروكتين، وهو بروتين من مصفوفة خارج الخلية، يضاف إلى جعل المناطق دون PLL-PEG الخلية لاصقة. (6) يتم غسل الشريحة ذات الست قنوات بمحلول ملحي عازل للفوسفات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
2. زرع الخلايا (الشكل 2A)
ملاحظة: بالنسبة لخطوات الغسيل التالية، أضف السائل المعني إلى خزان واحد ثم قم بإزالة كمية متساوية من السائل من الخزان المقابل للقناة.
- غسل كل قناة مع 120 ميكرولتر من 37 درجة مئوية تكملها تماما نمو الخلايا المتوسطة. قبل إضافة تعليق الخلية، تأكد من أن القنوات فقط مليئة بالمواس المتوسطة ولكن ليس الخزانات.
- فصل خلايا HuH7 من قارورة ثقافة الخلية باتباع البروتوكول القياسي الخاص بك لتمرير الخلية وضبط تركيز تعليق الخلية إلى 4 × 105 خلايا / مل.
- إضافة 40 ميكرولتر من تعليق الخلية وخلط متوسط نمو الخلية مع تعليق الخلية عن طريق إزالة 40 ميكرولتر من خزان واحد وإضافته إلى الخزان المقابل للقناة نفسها لمدة 3 مرات للوصول إلى توزيع الخلايا المتجانسة(الشكل 4B).
- إزالة 40 ميكرولتر من التعليق من القناة بحيث يتم تعبئة القناة فقط مع تعليق الخلية.
- وضع الشريحة في حاضنة والتحقق من الالتصاق الخلية 1 ساعة بعد البذر باستخدام المجهر المرحلة التباين.
- إضافة 120 ميكرولتر من 37 درجة مئوية متوسط نمو الخلايا الدافئة.
- ولكن الشريحة مرة أخرى في الحاضنة لمزيد من 3 ساعة لتمكين الخلوية التنظيم الذاتي على micropattern(الشكل 4C).
الشكل 4:التنظيم الذاتي الخلوي ومراقبة الجودة لمجموعة μPIPP. (A)يتكون السطح المجهري من بقع التصاق مغلفة ب FN مربعة تظهر باللون الأحمر محاطة بوليمر طارد للخلايا. (ب) بعد بذر الخلايا، يتم توزيع خلايا HuH7 بشكل عشوائي و (C) تلتزم أساسا على بقع التصاق على مدى فترة زمنية من 4 ساعة. أعيد طبعها بإذن 7. أشرطة المقياس: 200 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
3. نظام التغلغل (الشكل 2A)
ملاحظة: لا يلزم استخدام نظام التشوه إلا إذا كانت هناك حاجة إلى إضافة الكواشف أو العلامات الفلورية أثناء قياس الفاصل الزمني. اعتمادا على احتياجاتك، يمكنك توصيل كل قناة بنظام بث منفصل أو توصيل عدة قنوات في سلسلة إلى نفس نظام التغلغل. ويتوافق عدد نظم التشويش مع عدد الحالات التجريبية المستقلة. ربط الأنابيب في ظل ظروف معقمة في خزانة السلامة البيولوجية وتجنب إدراج فقاعات الهواء في نظام التشوه. إذا لم يتم استخدام نظام التشويش، أضف الكواشف/العلامات في خزانة السلامة الحيوية قبل قياس الفاصل الزمني. نظام التشويش هو في المنزل ملفقة، يتم سرد المواد المستخدمة في جدول المواد. وقد وصفت تجميع نظام التغلغل سابقا9.
- استخدام حقنة 1 مل (مع استبدال سبورن) وملء حقنة مع 1 مل من 37 °C نمو الخلايا المتوسطة.
- قم بتوصيل المحاقن بأنبوب المدخل باستخدام الصمام وملء الأنبوب بالمتوسط.
- قم بتوصيل أنبوب المدخل بخزان قناة وتأكد من عدم وجود فقاعات هوائية محاصرة.
- لتوصيل قناة أخرى في السلسلة بنظام التشوه هذا، قم بتوصيل موصل تسلسلي بالمخزان المقابل للأنبوب المدخل للقناة الحالية. انتقل إلى القناة التالية ثم قم بتوصيل الطرف الحر من الموصل التسلسلي بأحد خزاناته.
- كرر الخطوات السابقة حتى يتم توصيل العدد المطلوب من القنوات في السلسلة.
- قم بتوصيل أنبوب المنفذ مباشرة بخزان القناة الحالية المجاني. ملء أنبوب متصل مع المتوسطة من أجل التحقق من أن نظام التسريب لا تسرب.
- كرر الخطوات السابقة حتى يتم توصيل كافة القنوات الستة للشريحة بنظام perfusion.
- ضع الشريحة مع نظام (أجهزة) التشوه المتصلة في الحاضنة حتى يتم استخدامها أو وضعها مباشرة في غرفة التدفئة بالمجهر التي تم تسخينها مسبقا إلى 37 درجة مئوية لقياس الفاصل الزمني.
4. الوقت الفاصل المجهري (الشكل 2B)
ملاحظة: للقياسات طويلة الأجل، حافظ على درجة حرارة مستقرة تبلغ 37 درجة مئوية ومستوىمستقر من ثاني أكسيد الكربون. كبديل لثانيأكسيد الكربون تعتمد على الخلايا المتوسطة النمو، استخدم L15 المتوسطة التي لا يلزم نظام حضانة الغاز.
ملاحظة: للتصوير الكمي، استخدم وسيط نمو الخلية بدون فينول أحمر أثناء قياس الفاصل الزمني لتقليل مضان الخلفية واستخدام نفس إعدادات بروتوكول الفاصل الزمني وكذلك المجهر نفسه للنسخ المتماثلة التقنية.
- إعداد بروتوكول الفاصل الزمني لتسجيل صورة التباين المرحلي وصورة مضانة مع أوقات التعرض من 750 مللي ثانية (اعتمادا على الكاميرا)، 10 دقيقة الفاصل الزمني بين حلقات متتالية من خلال قائمة الموقف، ووقت المراقبة من 30 ساعة، وذلك باستخدام هدف 10x والمرشحات الفلورية المناسبة.
- ضع الشريحة ذات الست قنوات مع الخلايا الموجودة على صفائف الخلية الواحدة في حامل العينة لغرفة التدفئة الدافئة التي يبلغ ارتفاعها 37 درجة مئوية. إذا كانت أنظمة التشويش متصلة بالشريحة ذات الست قنوات، قم بإصلاح الأنابيب إلى المرحلة باستخدام بعض الأشرطة لضمان عدم نقل الشريحة ذات الست قنوات أثناء التبادل السائل. أدخل النهايات الحرة لأنابيب المنفذ من خلال ثقب أنبوب تفاعل سعة 15 مل لجمع النفايات السائلة.
- تعيين قائمة الموضع لقياس الفاصل الزمني للمسح الضوئي. تأكد من إمكانية مسح عدد المواضع ضوئيا ضمن الفاصل الزمني المحدد بين الحلقات المتتالية عبر قائمة المواضع. مع هدف 10x ، يمكن تعيين 10-30 موقعا لكل قناة لمسح إجمالي منطقة micropattern اعتمادا على حجم رقاقة الكاميرا.
- بدء قياس الفاصل الزمني. للحصول على جودة صورة أفضل للقياسات طويلة الأجل، استخدم نظام تصحيح التركيز التلقائي.
5. علامة الفلورسنت - مرنا transfection (الشكل 2B)
ملاحظة: بالنسبة لإصابة في قناتين متصلتين بنظام أنابيب، يلزم وجود حجم إجمالي قدره 600 ميكرولتر من خليط العدوى (300 ميكرولتر لقناة واحدة). تشير وحدات التخزين المشار إليها إلى إصابة في قناتين متصلتين.
- إعداد محلول عامل العدوى عن طريق تخفيف 1 ميكرولتر من عامل العدوى في 200 ميكرولتر من المتوسطة انخفاض المصل والسماح للحل احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد محلول مرنا عن طريق تخفيف 300 نانوغرام من ترميز مرنا لeGFP في 150 ميكرولتر من المتوسطة انخفاض المصل.
- إعداد مزيج العدوى عن طريق إضافة 150 ميكرولتر من محلول عامل العدوى إلى محلول مرنا ومزجها بشكل جيد. دع مزيج العدوى يحتضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- تدفق نظام أنابيب مع 1 مل من 37 درجة مئوية برنامج تلفزيوني دافئ باستخدام حقنة أثناء حضانة مزيج transfection. عند تنظيف الأنابيب، تأكد من أن مرحلة المجهر لا تتحرك. إيقاف قياس الفاصل الزمني مؤقتا إذا لزم الأمر.
- تمييع مزيج العدوى إلى تركيز الحمض النووي الريبي النهائي من 0.5 نانوغرام / ميكرولتر عن طريق إضافة 300 ميكرولتر متوسطة انخفاض المصل.
- قم بغسل نظام الأنابيب بمزيج العدوى باستخدام حقنة والسماح لضفيرات الدهون من الحمض النووي الريبي بالحضانة لمدة ساعة واحدة (أوقف قياس الفاصل الزمني إذا لزم الأمر).
- وقف حضانة العدوى وطرد lipoplexes مرنا غير منضم عن طريق غسل مع 1 مل من 37 درجة مئوية دافئة تكملها تماما وسيلة نمو الخلية باستخدام حقنة (وقفة قياس الفاصل الزمني إذا لزم الأمر).
6. تحليل الصور وقراءة مضان
- عند تشغيل تحليل الصورة لأول مرة، قم بتثبيت الإصدار 0.1.6 من برنامج مفتوح المصدر "تحليل البنية المجهرية الآلي في بيثون" (PyAMA) من الموقع المذكور10 وفقا للتعليمات المقدمة هناك.
- تأكد من توفر قنوات الصور (تباين المرحلة والفلورسينس) كملفات TIFF متعددة الصور 16 بت. إذا لزم الأمر، تحويلها وفقا لذلك.
- ابدأ PyAMA وانقر على فتح المكدس... لفتح الصور للتحليل.
- لفتح ملف TIFF متعدد الصور، انقر فوق فتح وحدد الملف بحيث يتم عرضه في قائمة الملفات المحملة على الجانب الأيسر من مربع الحوار (الشكل 5-1).
- ضع علامة على القنوات التي يجب تضمينها في التحليل. لكل قناة، قم بتنفيذ الخطوات التالية.
- حدد في قائمة الملفات المحملة ملف TIFF الذي يحتوي على القناة.
- في المقطع إضافة قناة جديدة، حدد فهرس القناة في ملف TIFF. الفهرسة هي صفرية؛ القناة الأولى لديها مؤشر 0، والقناة الثانية لديها مؤشر 1 وهلم جرا.
- حدد نوع القناة. حدد تباين المرحلة أو الفلورسينس لقنوات الصور المناظرة والتجزئة لقناة ثنائية تشير إلى ملامح الخلية.
- اختياريا، أدخل ملصق القناة لتمييز قنوات الفلورسينس المختلفة: eGFP و DAPI.
- بعد تكوين القناة، انقر فوق إضافة.
- عند عرض كافة القنوات المضافة في قائمة القنوات على الجانب الأيمن من مربع الحوار، انقر فوق موافق لتحميل المكدس.
- لإجراء التقسيم باستخدام خوارزمية التقسيم المضمنة في PyAMA للتعرف على الخلايا استنادا إلى صور تباين الطور(الشكل 5-2)، انتقل إلى Tools | بينارز... وأدخل اسم ملف لملف NumPy مع القناة الثنائية.
ملاحظة: في الإصدار الحالي، يتطلب تحميل القناة الثنائية إعادة تحميل كافة القنوات. - لإجراء تصحيح الخلفية11 على قناة مضان (الشكل 5-3)، تأكد من تحميل قناة مضان وقناة تجزئة. إذا لم يتم تحميل قناة تجزئة، تأكد من تحميل قناة تباين المرحلة للتجزئة التلقائية. انتقل إلى "أدوات > تصحيح الخلفية..." وحدد اسم ملف لملف TIFF الناتج مع قناة الفلورسينس المصححة.
ملاحظة: في الإصدار الحالي، يتطلب تحميل القناة تصحيح الخلفية إعادة تحميل كافة القنوات. - تفقد الخلايا المختارة مسبقا(الشكل 5-4)وإشاراتها الفلورية المتكاملة(الشكل 5-5)من خلال التمرير عبر الأطر الزمنية، وعرض القنوات المدرجة في قائمة القناة على الجانب الأيسر والنقر على الخلايا لتسليط الضوء على دوراتها الزمنية الفلورية(الشكل 1C). استخدم تحديد الخلية لاستبعاد الخلايا غير القابلة للتطبيق، أو غير المحصورة في بقعة التصاق أو المرفقة بخلية أخرى من التحليل الإضافي. تبديل اختيار الخلايا للقراءة عن طريق الضغط على Shift والنقر على الخلية، أو عن طريق تمييز الخلية والضغط على Enter.
- حفظ الدورات الزمنية وحيدة الخلية لمنطقة الخلية والمضان المتكامل(الشكل 5-6)عن طريق النقر على ملف | حفظ دليل وتحديده لحفظه.
الشكل 5: يتم استيرادمعالجة الصور الآلية لسلسلة الصور الفاصلة زمنيا باستخدام PyAMA. (1) سلسلة صور التباين التدريجي والفلورسينس لكل موضع تصوير. (2) يتم تحديد معالم الخلية عن طريق التقسيم على كومة صورة التباين المرحلي. (3) يتم تطبيق تصحيح الخلفية على الصور الفلورية. (4) يتم تعقب ملامح الخلية مع مرور الوقت ويتم اختيارها مسبقا للتصدير. (5) يتم دمج كثافة الفلورسينس على أساس ملامح الخلية المتعقبة. (6) يتم تقييم مناطق الخلية الواحدة وكثافات الفلورسينس المتكاملة وتصدير دورات زمنية لكل خلية. أشرطة المقياس: 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- لتحليل حركية الترجمة بعد نقل الحمض النووي الريبي ، تناسب نموذج الترجمة على أساس معادلات معدل البيوكيميائية لكل دورة زمنية من خلية واحدة كما وصفها سابقا ريزر وآخرون12. البيانات والرمز المستخدم في تلك الدراسة متاحة للجمهور13.
- لكل دورة زمنية من خلية واحدة، استرجع المعلمات المناسبة المقدرة لنموذج الترجمة التي تمثل معدل تدهور الحمض النووي الريبي والنقطة الزمنية لبداية الترجمة. تتم مناقشة مجموعة بيانات مثال في قسم النتائج التمثيلية.
- إجراء مزيد من التحليل على توزيع أفضل تقديرات المعلمات لظروف تجريبية متنوعة للتحقيق في التباين بين الخلايا داخل مجموعات الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويمكن نهج LISCA من جمع دورات زمنية للفلورسين بكفاءة من خلايا واحدة. وكمثال تمثيلي، نوضح كيفية تطبيق أسلوب LISCA لقياس تعبير eGFP أحادي الخلية بعد العدوى. وتستخدم بيانات تجربة LISCA لتقييم الحركية تسليم مرنا، وهو أمر مهم لتطوير الأدوية مرنا كفاءة.
ونبين على وجه الخصوص التأثير المختلف لنظم تسليم الحمض النووي الريبي القائمة على الدهون فيما يتعلق بالنقطة الزمنية لبدء الترجمة ومعدل التعبير على مستوى الخلية الواحدة. قمنا باستزراع الخلايا وقسمنا الدفعة إلى مجموعتين سكانيتين. وقد تم نقل شريحة فرعية واحدة مع lipoplexes كما هو موضح في قسم البروتوكول. تم تحويل السكان الفرعيين الآخرين باستخدام نفس الحمض النووي الريبي مع نفس تركيز مرنا النهائي ، ولكن مع الجسيمات النانوية الدهنية (LNP) كنظام توصيل ، والتي تم إنتاجها باستخدام خلط microfluidic12. نظرا لتكوين الدهون المختلفة والتصنيع المختلفة لأنظمة تسليم مرنا من lipoplexes وLNPs نتوقع أن يكون لها تأثير على الحركية الترجمة كما ينبغي أن تتأثر الحركية امتصاص. باستخدام طريقة LISCA نقوم بتحديد النقطة الزمنية t0 من بداية الترجمة بعد العدوى ومدى قوة الخلايا التي تعبر عن eGFP ، والتي تعتمد على نتاج جزيئات مرنا المصابة م0 ومعدل الترجمة كTL. للحصول على هذه المعلمات اثنين ونحن تناسب نموذج الترجمة من ثلاث مراحل كما رسمت في الشكل 6A. بعد الافراج الناجح عن جزيئات مرنا م في الوقت نقطة ر0 في السيتوسول، تتم ترجمة مرنا مع معدل كTL إلى g Gg غير المشبعة، وهو غير الفلورسنت. Gغير المشبعة * ينضج مع معدل KM إلى eGFP G، يتم قياس كثافة الفلورسينس خلال قياس الفاصل الزمني. وتحلل الرنا وكذلك النسبة (غير المشبعة والمنضجة) من النسبة إلى نسبة التدهور بمرور الوقت مع δ ومعدلات التدهور γ. ويرد وصف النموذج بواسطة المعادلات التفاضلية العادية ويستخدم الحل التحليلي ل G كدالة نموذجية لتقدير المعلمة. تم تركيب وظيفة النموذج لكل دورة من دورات الوقت ذات الخلية الواحدة كما هو موضح في الشكل 6B مع دورات زمنية نموذجية (رمادية) والنوبات ذات الصلة (خضراء). في الشكل 6C نعرض المدرجات التكرارية للنقطة الزمنية t0 من بداية الترجمة ومعدل التعبير m0kTL من الخلايا المصابة بالدهون. كما يتم تقدير المعلمات لكل خلية، يمكن تحليل ارتباط هذه المعلمات كما هو موضح في مبعثر(الشكل 6D،بيانات زرقاء) ويمكن مقارنتها بالخلايا التي تم تحويلها مع LNPs (أحمر). كما هو مبين في الشكل 6D، تظهر الخلايا المصابة بال LNPs تباينا أقل من خلية إلى خلية مقارنة بالخلايا المصابة بالليبوبلس ويظهر متوسط السكان بداية أسرع للترجمة بالإضافة إلى معدل تعبير أعلى (نقاط سميكة مع مخطط أسود).
هذه المجموعتين من البيانات ليست سوى مثال واحد كيف يمكن استخدام LISCA لدراسة الترجمة بعد نقل الحمض النووي الريبي. ويمكن إجراء مزيد من التحقيقات على سبيل المثال فيما يتعلق استقرار مرنا تعتمد على تعديلات تسلسل مرنا 14, تباين استقرار البروتين مراسل 15, أو siRNA بوساطة تدهور مرنا 16.
الشكل 6:تحليل البيانات من حركية الترجمة eGFP أحادية الخلية. (أ) يمكن وصف حركية الترجمة ل eGFP بروتين المراسل بعد تسليم الحمض النووي الريبي من خلال معادلة معدل رد الفعل من ثلاث مراحل مع المعلمات ذات الصلة. (ب)تم تركيب النموذج (آثار خضراء) لكل مسار وقت التعبير eGFP خلية واحدة (آثار رمادية) لتقدير المعلمات نموذج مثل النقطة الزمنية (ر0) من بداية العدوى ومعدل التعبير (م0كTL)، معلمتين لقياس فعالية تسليم مرنا. (ج) المدرجات التكرارية لتوزيع المعلمة لوقت بدء العدوى ومعدل التعبير. (D) كما يتم تقدير المعلمات لكل خلية، يظهر مخطط مبعثر من هذه المعلمات ارتباط المعلمة. تمثل النقاط الصغيرة معلمات خلية واحدة. تظهر المؤامرة خلايا مصابة ب LNPs مرنا (أحمر) وضروبض شفاه مرنا (أزرق). النقاط السميكة ذات المخطط الأسود تتوافق مع متوسط عدد السكان المعني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا وصفنا LISCA بأنها تقنية متعددة الاستخدامات لمتابعة الحركية الخلوية للتسميات الفلورية داخل الخلايا على مستوى الخلية الواحدة. من أجل إجراء تجربة LISCA ناجحة، يجب تأسيس كل خطوة من الخطوات الموضحة من مقطع البروتوكول بشكل فردي ومن ثم يجب دمج كافة الخطوات. كل واحد من الجوانب الرئيسية الثلاثة لل LISCA يتميز بخطوات حاسمة.
تصنيع ميكرواراي أحادي الخلية
نوعية microarray أمر بالغ الأهمية كما المحاذاة الخلوية على microarray ليست مهمة فقط لجميع الخطوات التجريبية الأخرى ولكن أيضا لها تأثير على جودة البيانات. ولهذا السبب، يجب تكييف هندسة النمط وطريقة التصنيع فيما يتعلق بالخلايا المستعملة. تم إنشاء النتائج التمثيلية التي تمت مناقشتها في هذه المقالة مع خط خلايا سرطان الكبد HuH7 المنحاز على نمط مربع (30 ميكرومتر). هندسة النمط هذه مناسبة أيضا لخطوط الخلايا الأخرى مثل A549 أو HEK293. بالنسبة للخلايا الكبيرة مثل BEAS-2B، يمكن استخدام نمط مربع أكبر بطول حافة 35 ميكرومتر ومسافة بين مربعة تبلغ 80 ميكرومتر. تم تحسين إجراء البذر الموصوف لخلايا HuH7 ولكن يمكن تكييفه مع العديد من الخلايا الملتصقة الأخرى17. على سبيل المثال، تحتاج بعض خطوط الخلايا إلى أحجام مختلفة من بقع التصاق أو تحتاج إلى تباعد أكبر بين بقع التصاق لتجنب اتصالات الخلية الخلية من خلال الخلايا الممدودة.
يجب تعديل الميكروبيترن بحيث تلبي منطقة موقع التصاق تقريبا متوسط مساحة الخلية في أطباق الثقافة القياسية. يمكن أن تكون الهندسة مستديرة أو تربيعية وليس لها تأثير قابل للقياس على صلاحية الخلية. يبدو أن حركات الخلية أكثر تقييدا على نمط مربع مقارنة بالنمط المستدير ، حيث غالبا ما ينظر إلى الخلايا على أنها تدور. يوصى باختبار قابلية البقاء المنفصل عند استخدام خطوط الخلايا الجديدة لأول مرة. وينبغي تعديل كثافة البذر لخطوط خلايا محددة للوصول إلى إشغالات عالية لأماكن التصاق وللتقليل إلى أدنى حد من الإشغال المزدوج لأماكن الالتصاق في نفس الوقت. عادة، الإشغال الناتج لعدد الخلايا لكل موقع التصاق يتبع إحصاءات بواسون وإما صفر أو واحد أو اثنين. وبالتالي يجب أن يكون إجمالي الإشغال بين 60٪ و 80٪ يهدف إلى تجنب الإشغال المزدوج17. قد يحتاج بروتوكول البذر إلى تكييفه فيما يتعلق بعدد الخلايا المصنفة والمدة الزمنية بين البذر وخطوة الغسيل الأولى. على سبيل المثال، خطوة الغسيل 30 دقيقة بعد البذر بدلا من 1 ساعة (انظر الخطوتين 5 و 6 من البروتوكول القسم 2 البذر الخلية) سوف يقلل من عدد من البقع التصاق المحتلة مزدوجة ولكن أيضا خفض العدد الإجمالي للبقع الالتصاق المحتلة لخلايا HuH7.
وبما أن توصيل نظام الأنابيب بشرائح القناة ليس إلزاميا، فمن الأسهل إثبات استخدام كاشف أو علامة فلورية دون استخدام نظام أنابيب للتحقق من أفضل وقت مناسب للتركيز والحضانة. بعد إنشاء بروتوكول مناسب للكواشف / علامة الاهتمام ، يمكن تضمين نظام الأنابيب في سير العمل.
المجهر الفاصل الزمني
وثمة خطوة حاسمة أخرى هي إعدادات قياس الفاصل الزمني. على سبيل المثال، يجب اختيار وقت التعرض لعلامة الفلورسينس بعناية لتجنب اللؤم الضوئي لآثار الفلوروفور والسمية الضوئية ولكن مع ضمان إشارة مضان جيدة. معلمة هامة أخرى لإعداد الفاصل الزمني هي أفضل مزيج مناسب من الدقة المكانية والزمنية ، والتي تعتمد بشكل كبير على الحركية الخلوية الملاحظة. وإذا كانت هناك حاجة إلى دقة زمنية عالية، فلا يمكن مسح سوى عدد أقل من المواقع في المجهري بين نقطتين زمنيتين، مما يقلل من منطقة المراقبة الممسوحة ضوئيا، وبالتالي يقلل أيضا من الإحصاءات. وعلاوة على ذلك، لا يتوقف مجال المراقبة على عدد المواقع الممسوحة ضوئيا فحسب، بل يعتمد أيضا على هدف وحجم مجال واحد من مجالات رؤية الكاميرا. في المثال المعطى، يكون الدقة الزمنية 10 دقائق كافية باستخدام هدف 10x لمراقبة حركية الترجمة. يسمح هذا المزيج بمسح 70-100 موضع لكل نقطة زمنية اعتمادا على حجم رقاقة الكاميرا وسرعة مرحلة المجهر وعدد قنوات التصوير (على سبيل المثال ، تباين المرحلة وفلورسينس eGFP).
معالجة الصور
يتم تسهيل تحليل الفلورسينس الكلي لكل خلية حيث يتم وضع الخلايا في صفيف. ومع ذلك، تعتمد جودة دورات الوقت الفلوري أحادي الخلية، ولا سيما نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR)، على الخوارزمية المستخدمة لدمج كثافة تفلور الخلية من سلسلة الصور. تظهر خطوات معالجة الصور الخاصة ب الأداة البرمجية PyAMA في الشكل 5. تحديد مناطق التكامل للقراءة الفلورية ذات الخلية الواحدة مهم بشكل خاص لأن محيط الخلية للخلايا الحية يختلف مع مرور الوقت. تدمج PyAMA كثافة الفلورسينس على محيط الخلية ، والتي يمكن تحديدها من خلال خوارزمية تجزئة مدمجة. والبديل هو أن تدمج على حدود ثابتة على أساس هندسة micropattern12،16. يقوم الإصدار الحالي من PyAMA بتقسيم الصورة استنادا إلى عتبة الانحراف المعياري لأحياء البكسل في قناة صورة التباين المرحلي. ويمكن استيراد نتائج التقسيم من البرامج الخارجية أيضا. وبالنسبة للإصدارات المستقبلية، من المخطط تقديم الدعم الأصلي للتجزئة على أساس التعلم الآلي والتكامل عبر الحدود الثابتة.
PyAMA عروض لتصفية الخلايا المتطرفة أو الدورات الزمنية الشاذة باستخدام واجهة تسمح للتفتيش البصري على حد سواء صورة مضان وكذلك دورات الوقت الفلوري من الخلايا المختارة (الشكل 1C). أمثلة الخلايا التي قد يتم استبعادها من التحليل هي الخلايا التي تخضع للتقسيم أو موت الخلايا المبرمج أو التي تقع خارج موقع التصاق. كما يجب تصفية تجميعات خلايا متعددة تم التعرف عليها خطأ من قبل خوارزمية التتبع كخلية واحدة لضمان أن الدورات الزمنية تنشأ من خلايا واحدة. تقوم PyAMA بإجراء مجموعة مسبقة من الخلايا لتقليل مقدار التفاعل اليدوي المطلوب لتصفية الخلايا الشاذة. يمكن فحص الاختيار المسبق وتصحيحه باليد قبل تصدير الدورات الزمنية للخلايا المختارة للتعويض عن عدم الدقة في الاختيار المسبق. يستند التحديد المسبق للإصدار الحالي من PyAMA إلى عتبة لحجم الخلية لإلغاء تحديد تجميعات الخلايا. وبالنسبة للإصدارات المستقبلية، من المقرر إجراء اختيار مسبق إضافي قائم على التعلم الآلي، مما يسمح بحساب معايير أخرى بما في ذلك الأمثلة على الخلايا الشاذة الموصوفة أعلاه.
وباختصار، يستخدم نهج LISCA صفائف أحادية الخلية لجمع دورات زمنية للفلورسين أحادي الخلية بكفاءة. إن حصر الخلايا في مواقع التصاقات المصنعة الدقيقة يسهل التتبع وتحليل الصور. وعلاوة على ذلك، يتم استزراع الخلايا في بيئة محلية دقيقة موحدة، وبالتالي، يتم تقديمها مع مساحة سطح موحدة عندما تتعرض لعوامل مثل الجسيمات النانوية الدهنية للإصابة. هذا الجانب مفيد بشكل خاص عندما يتم التحقيق في عدم التجانس الخلوي داخل السكان. تقنية μPIPP الموصوفة هنا هي واحدة من العديد من تقنيات التصنيع الدقيق التي تؤدي إلى microarrays العادية لأنماط البروتين. يشار القارئ إلى الأدب استعراض الطباعة microcontact، والنهج الضوئي والطباعة الحجرية الناعمة وعمليات التصنيعالبديلة 6. اعتمادا على خط الخلية، قد يكون الأسلوب واحد أو أسلوب النقش الأخرى الأفضل. في تجاربنا ، أظهرت تقنية μPIPP خلايا في وضع جيد بعد بذر الخلايا بسبب الفرز الذاتي الخلوي ، والذي يعتمد على لاصقة الخلية المتبقية على منطقة PEGylated بحيث تكون الخلايا قادرة على البحث في هجرة عشوائية وتنتشر على صفائف البروتين المستهدفة مع لاصق أكبر بشكل تفاضلي17.
LISCA يسمح للحصول على أعداد كبيرة من الدورات الزمنية خلية واحدة من علامات الفلورسينس التعسفي. تحليل إشارات الفلورسينس على مستوى الخلية الواحدة، على النقيض من التجارب السائبة، يعطي دورات زمنية نقية من خلية واحدة ويكشف عن تقلب الخلايا إلى الخلايا. التغايرية الخلوية يلعب دورا بارزا في القرارات مصير الخلية مثل موت الخلايا المبرمج18,19,20. وفي هذا السياق، قمنا مؤخرا بتوسيع نهج LISCA باستخدام قناتين مضانتين تسمحان بتحليل الارتباطات الزمنية حدثين خلويين في أي وقت يشير إلى مراحل معينة داخل سلسلة إشارات موت الخلية19. في هذا المجال من البحوث، LISCA يقدم نفسه كبديل لتدفق قياسات قياس الخلايا. في حين أن قياس التدفق الخلوي يوفر بشكل لا يمكن إنكاره سير عمل أسرع وعادة ما ينتج إحصاءات أكبر ، يتم الحصول على البيانات في نقطة معينة من الزمن. وتسفر الاعتمادات بدوام كامل عن تقديرات لمعلمات الحركية وتكشف عن الارتباطات الزمنية بين إشارات الفلورية المختلفة، التي يصعب الوصول إليها لولا ذلك. من أجل استخدام قنوات متعددة مضان، يتطلب الإعداد عجلات تصفية الآلي أو كاميرات متعددة. في هذه الحالة أيضا ينبغي أن يكون تحليل FRET أحادي الخلية ممكنا ويمكن من إجراء دراسات زمنية للقرب بين الجزيئات المسماة بالفلورسنت. عيب واحد من التحليل القائم على الصورة مثل LISCA هو العمل المرتبط بالضوابط البصرية والكشف عن أبعد الحدود. هنا أدوات التعلم الآلي يمكن أن تسهل معالجة البيانات والسماح تحليل البيانات مؤتمتة بالكامل. وفي المستقبل، وباستخدام منصات المجهر الآلي، وا التجهيز الدقيق السريع للصفيف، والذكاء الاصطناعي، يمكن زيادة إنتاجية وانطباق LISCA زيادة كبيرة. وعلاوة على ذلك، فإن التحليل اللاحق للخلايا التي تظهر استجابات مضانة غير عادية باستخدام استخراج microfluidic 21وعلم الجينوم خلية واحدة هو شرط متكرر في صناعة الأدوية. البروتوكول المعروض في هذه المادة يناسب الطلب على دراسة الحركية من العمليات الخلوية مع قرار خلية واحدة والإحصاءات الكافية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من المؤسسة الألمانية للعلوم (DFG) إلى مركز البحوث التعاونية (SFB) 1032. يتم الاعتراف بامتنان بدعم وزارة التعليم والبحوث والتكنولوجيا الاتحادية الألمانية (BMBF) في إطار المشروع التعاوني 05K2018-2017-06716 Medisoft بالإضافة إلى منحة من بايريشفورشونجستفتونغ. تم دعم أنيتا رايزر من خلال زمالة DFG من خلال كلية الدراسات العليا للعلوم الحيوية الكمية في ميونيخ (QBM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adtech Polymer Engineering PTFE Microtubing | Fisher Scientific | 10178071 | |
| baking oven | Binder | 9010-0190 | |
| CFI Plan Fluor DL 10x | Nikon | MRH20100 | |
| Desiccator | Roth | NX07.1 | |
| Eclipse Ti-E | Nikon | ||
| eGFP mRNA | Trilink | L-7601 | |
| Female Luer to Tube Connector | MEDNET | FTL210-6005 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Fibronectin | Yo Proteins | 663 | |
| Filter set eGFP | AHF | F46-002 | |
| Fisherbrand Translucent Platinum-Cured Silicone Tubing | Fisher Scientific | 11768088 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Incubation Box | Okolab | OKO-H201 | |
| incubator | Binder | 9040-0012 | |
| L-15 without phenol red | Thermo Fisher | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668027 | |
| Male Luer | in-house fabricated consisting of teflon | ||
| Male Luer to Tube Connector | MEDNET | MTLS210-6005 | alternative to in-house fabricated male luers |
| NaCl (5 M) | Thermo Fisher | AM9760G | |
| Needleless Valve to Male Luer Connector | MEDNET | NVFMLLPC | |
| NIS Elements | Nikon | Imaging software Version 5.02.00 | |
| NOA81 | Thorlabs | NOA81 | Fast Curing Optical Adhesive for tube system assembly |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| PCO edge 4.2 M-USB-HQ-PCO | pco | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | in-house prepared | ||
| Plasma Cleaner | Diener Femto | Pico-BRS | |
| PLL(20 kDa)-g[3.5]-PEG(2 kDa) | SuSoS AG | ||
| silicon wafer mit mircorstructures | in-house fabricated | ||
| Sola Light Engine | Lumencor | ||
| sticky slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 1673921 | |
| Tango 2 | Märzhäuser | 00-24-626-0000 | |
| Ultrapure water | in-house prepared | ||
| uncoated coverslips | ibidi | 10813 | |
| Injekt-F Solo, 1 mL | Omilab | 9166017V | with replacement sporn |
References
- Altschuler, S. J., Wu, L. F. Cellular heterogeneity: do differences make a difference. Cell. 141 (4), 559-563 (2010).
- Locke, J. C., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).
- Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
- El-Ali, J., Sorger, P. K., Jensen, K. F. Cells on chips. Nature. 442 (7101), 403-411 (2006).
- Segerer, F. J., et al. Versatile method to generate multiple types of micropatterns. Biointerphases. 11 (1), 011005 (2016).
- Piel, M., Théry, M. Micropatterning in cell biology, part A/B/C. , Elsevier. (2014).
- Reiser, A., Zorn, M. L., Murschhauser, A., Rädler, J. O. Cell-Based Microarrays: Methods and Protocols. Ertl, P., Rothbauer, M. , Springer. New York. 41-54 (2018).
- Picone, R., Baum, B., McKendry, R. Methods in cell biology. 119, Elsevier. 73-90 (2014).
- Reiser, A. Single-cell time courses of mRNA transport and translation kinetics. , Ludwig-Maximilians University. PhD thesis (2019).
- Woschée, D. Softmatter LMU-Raedler Group. , Available from: https://github.com/SoftmatterLMU-RaedlerGroup/pyama (2020).
- Schwarzfischer, M., et al. MIAAB, 29262. , Available from: https://push-zb.helmholtz-muenchen.de/frontdoor.php?source_opus=6773 (2020).
- Reiser, A., et al. Correlation of mRNA delivery timing and protein expression in lipid-based transfection. Integrative Biology. 11 (9), 362-371 (2019).
- Reiser, A., Woschée, D., Mehrotra, N., Krzysztoń, R. S., Strey, H. H., Rädler, J. O. Supplementing data and code for: "Correlation of mRNA delivery timing and protein expression in lipid-based transfection". Zenodo. , Version 1.0 (2019).
- Ferizi, M., et al. Stability analysis of chemically modified mRNA using micropattern-based single-cell arrays. Lab on a Chip. 15 (17), 3561-3571 (2015).
- Fröhlich, F., et al. Multi-experiment nonlinear mixed effect modeling of single-cell translation kinetics after transfection. NPJ systems biology and applications. 4 (1), 1-12 (2018).
- Krzysztoń, R., et al. Single-cell kinetics of siRNA-mediated mRNA degradation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 21, 102077 (2019).
- Röttgermann, P. J., Alberola, A. P., Rädler, J. O. Cellular self-organization on micro-structured surfaces. Soft Matter. 10 (14), 2397-2404 (2014).
- Röttgermann, P. J., Dawson, K. A., Rädler, J. O. Time-resolved study of nanoparticle induced apoptosis using microfabricated single cell arrays. Microarrays. 5 (2), 8 (2016).
- Murschhauser, A., et al. A high-throughput microscopy method for single-cell analysis of event-time correlations in nanoparticle-induced cell death. Communications Biology. 2 (1), 1-11 (2019).
- Chatzopoulou, E. I., et al. Chip-based platform for dynamic analysis of NK cell cytolysis mediated by a triplebody. Analyst. 141 (7), 2284-2295 (2016).
- Sztilkovics, M., et al. Single-cell adhesion force kinetics of cell populations from combined label-free optical biosensor and robotic fluidic force microscopy. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
