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Biology

सिंगल-सेल सरेर (LISCA) की लाइव-सेल इमेजिंग - सेलुलर काइनेटिक्स की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक बहुमुखी तकनीक

Published: March 18, 2021 doi: 10.3791/62025
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Faculty of Physics and Center for NanoScience (CeNS), Ludwig-Maximilians-Universität München, Geschwister-Scholl-Platz 1, 80539 München, Germany

Summary

हम माइक्रोपैटर्न्ड सरणी का उपयोग करके एकल कोशिकाओं से फ्लोरेसेंस रिपोर्टर टाइम कोर्सेज के अधिग्रहण के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। प्रोटोकॉल एकल सेल सरणी की तैयारी, लाइव-सेल स्कैनिंग टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी के सेटअप और संचालन और स्वचालित चयन के लिए एक ओपन-सोर्स इमेज एनालिसिस टूल, ऑडनेस साइट के अनुसार सेल-एकीकृत फ्लोरेसेंस टाइम कोर्सेज की ट्रैकिंग का वर्णन करता है।

Abstract

सिंगल-सेल ऐरे (एलएससीए) का लाइव-सेल इमेजिंग उच्च थ्रूपुट में व्यक्तिगत कोशिकाओं से फ्लोरेसेंस संकेतों के समय पाठ्यक्रम एकत्र करने के लिए एक बहुमुखी विधि है। सामान्य तौर पर, सुसंस्कृत कोशिकाओं से एकल कोशिका समय पाठ्यक्रमों का अधिग्रहण सेल गतिशीलता और कोशिका आकार की विविधता से बाधित होता है। चिपकने वाले माइक्रो-सरणी एकल-कोशिका स्थितियों को मानकीकृत करते हैं और छवि विश्लेषण की सुविधा प्रदान करते हैं। LISCA स्कैनिंग समय-चूक माइक्रोस्कोपी और स्वचालित छवि प्रसंस्करण के साथ एकल सेल microarrays को जोड़ती है । यहां, हम एलएससीए प्रारूप में एकल-कोशिका फ्लोरेसेंस टाइम कोर्स लेने के प्रयोगात्मक चरणों का वर्णन करते हैं। हम उन्नत हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) के लिए एमआरएनए एन्कोडिंग का उपयोग करके एक माइक्रोपैटर्न्ड सरणी के अनुयायी कोशिकाओं को स्थानांतरित करते हैं और स्कैनिंग टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी के माध्यम से समानांतर में सैकड़ों कोशिकाओं के eGFP अभिव्यक्ति गतिज की निगरानी करते हैं। छवि डेटा स्टैक स्वचालित रूप से नए विकसित सॉफ्टवेयर द्वारा संसाधित किए जाते हैं जो एकल-सेल फ्लोरेसेंस टाइम कोर्स उत्पन्न करने के लिए चयनित सेल आकृति पर फ्लोरेसेंस तीव्रता को एकीकृत करते हैं। हम प्रदर्शित करते हैं कि एमआरएनए ट्रांसफैक्शन के बाद ईजीएफपी अभिव्यक्ति समय पाठ्यक्रमों को एक साधारण गतिज अनुवाद मॉडल द्वारा अच्छी तरह से वर्णित किया गया है जो एमआरएनए की अभिव्यक्ति और गिरावट दरों को प्रकट करता है। एपोप्टोसिस के संकेत के संदर्भ में कई मार्कर के इवेंट टाइम सहसंबंधों के लिए LISCA के आगे के अनुप्रयोगों पर चर्चा की जाती है।

Introduction

हाल के वर्षों में, एकल कोशिका प्रयोगों का महत्व स्पष्ट हो गया है । एकल कोशिकाओं के डेटा सेल-टू-सेल परिवर्तनशीलता की जांच, इंट्रासेलुलर पैरामीटर सहसंबंधों के संकल्प और सेलुलर काइनेटिक्स का पता लगाने की अनुमति देते हैं जो कलाकारों की टुकड़ी माप1,2,3में छिपे रहते हैं। समानांतर में हजारों एकल कोशिकाओं के सेलुलर काइनेटिक्स की जांच करने के लिए, नए दृष्टिकोणों की आवश्यकता होती है जो कई दिनों तक कई घंटों की समय अवधि में मानकीकृत परिस्थितियों में कोशिकाओं की निगरानी करने में सक्षम होते हैं और इसके बाद मात्रात्मक डेटा विश्लेषण 4होता है। यहां, हम सिंगल-सेल ऐरे (LISCA) की लाइव-सेल इमेजिंग पेश करते हैं, जो समय-चूक माइक्रोस्कोपी और स्वचालित छवि विश्लेषण के साथ माइक्रोस्ट्रक्चर्ड सरणी के उपयोग को जोड़ती है।

माइक्रोस्ट्रक्चर्ड एकल-कोशिका सरणी उत्पन्न करने के लिए कई तरीके स्थापित किए गए हैं और साहित्य5,6में प्रकाशित किए गए हैं। यहां, हम संक्षेप में माइक्रोस्केल प्लाज्मा-शुरू प्रोटीन पैटर्निंग (μPIPP) का वर्णन करते हैं। μPIPP का उपयोग करके एकल-सेल सरणी निर्माण का एक विस्तृत प्रोटोकॉल भी संदर्भ7में पाया गया है। एकल-कोशिका सरणी का उपयोग प्रत्येक कोशिका के लिए परिभाषित माइक्रोएनवायरमेंट्स को प्रस्तुत करने वाले मानकीकृत आसंजन स्थानों पर हजारों कोशिकाओं के संरेखण को सक्षम बनाता है और इस प्रकार प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता(चित्र 1 ए)के स्रोत को कम कर देता है। विभिन्न प्रकार की सेलुलर प्रक्रियाओं को इंगित करने के उद्देश्य से फ्लोरोसेंट मार्कर के समय पाठ्यक्रमों की निगरानी के लिए एकल-सेल सरणी का उपयोग किया जाता है। स्कैनिंग टाइम-लैप्स मोड में दीर्घकालिक माइक्रोस्कोपी एकल-सेल सरणी के एक बड़े क्षेत्र की निगरानी के लिए अनुमति देती है और इसलिए कई घंटों या दिनों के अवलोकन समय पर उच्च-थ्रूपुट में एकल-सेल डेटा का नमूना लेते हैं। यह सरणी(चित्रा 1B)की प्रत्येक स्थिति से छवियों के समय-रेखा ढेर उत्पन्न करता है। बड़ी मात्रा में छवि डेटा को कम करने और वांछित एकल-कोशिका फ्लोरेसेंस टाइम पाठ्यक्रमों को कुशल तरीके से निकालने के लिए, स्वचालित छवि प्रसंस्करण की आवश्यकता होती है जो कोशिकाओं की स्थिति(चित्रा 1 सी)का लाभ उठाती है।

LISCA की चुनौती एक उच्च थ्रूपुट परख बनाने के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल और कम्प्यूटेशनल उपकरणों को अनुकूलित करना है जो सेलुलर काइनेटिक्स के मात्रात्मक और प्रजनन योग्य डेटा उत्पन्न करता है। इस लेख में हम व्यक्तिगत तरीकों का एक कदम-दर-कदम विवरण प्रदान करते हैं और उन्हें LISCA परख में कैसे जोड़ा जाता है। एक उदाहरण के रूप में, हम कृत्रिम एमआरएनए डिलीवरी के बाद उन्नत हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) अभिव्यक्ति के समय पाठ्यक्रम पर चर्चा करते हैं। एमआरएनए डिलीवरी के बाद ईजीएफपी अभिव्यक्ति को प्रतिक्रिया दर समीकरणों मॉडलिंग अनुवाद और एमआरएनए के क्षरण द्वारा वर्णित किया गया है। समय के साथ प्रत्येक व्यक्ति कोशिका के लिए फ्लोरेसेंस तीव्रता के LISCA readout के लिए LISFP एकाग्रता के समय पाठ्यक्रम के लिए मॉडल समारोह फिटिंग ऐसे mRNA गिरावट दर के रूप में मॉडल मापदंडों का सबसे अच्छा अनुमान पैदावार । एक प्रतिनिधि परिणाम के रूप में हम दो अलग-अलग लिपिड-आधारित ट्रांसफैक्शन एजेंटों की एमआरएनए वितरण दक्षता पर चर्चा करते हैं और उनके पैरामीटर वितरण कैसे भिन्न होते हैं।

Figure 1
चित्रा 1:LISCA कार्यप्रवाह संयोजन का प्रतिनिधित्व (ए) सूक्ष्म पैटर्न वाले एकल-सेल सरणी (बी) स्कैनिंग टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी और (सी) रिकॉर्ड की गई छवि श्रृंखला का स्वचालित छवि विश्लेषण। एकल-कोशिका सरणी में सेल-प्रतिरोधी इंटरस्पेस के साथ सेल-चिपकने वाले वर्गों का दो-आयामी पैटर्न होता है जिससे माइक्रोपैटर्न पर कोशिकाओं की व्यवस्था होती है, जैसा कि चरण-विपरीत छवि के साथ-साथ ईजीएफपी एक्सप्रेसिंग कोशिकाओं(ए)की फ्लोरेसेंस छवि में देखा जा सकता है। पूरे माइक्रोस्ट्रक्चर्ड क्षेत्र को स्कैनिंग टाइम-लैप्स मोड में चित्रित किया जाता है जो बार-बार स्थिति(बी)के अनुक्रम पर छवियों को ले जाता है। रिकॉर्ड की गई छवि श्रृंखला को समय के साथ प्रति सेल फ्लोरेसेंस तीव्रता (सी) को पढ़ने के लिए संसाधित कियाजाता है। स्केल बार: 500 माइक्रोन(ए),200 माइक्रोन(सी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Protocol

Figure 2
चित्रा 2:स्कैनिंग टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी (बी) के साथ एकल-सेल माइक्रोएरे (ए) के संयोजन से डेटा अधिग्रहण। समय-चूक प्रयोग की तैयारी के रूप में, आसंजन वर्गों के 2D माइक्रोपैटर्न के साथ एक एकल-सेल सरणी तैयार की जाती है (1), इसके बाद सेल सीडिंग और माइक्रोपैटर्न (2) पर कोशिकाओं के संरेखण के साथ-साथ छह-चैनल स्लाइड में एक पर्फ्यूजन सिस्टम का कनेक्शन, जो समय-चूक माप (3) के दौरान तरल हैंडलिंग को सक्षम बनाता है। एक स्कैनिंग समय-चूक प्रयोग (4) स्थापित किया जाता है और कोशिकाओं को समय-चूक प्रयोग (5) के दौरान परफ्यूजन सिस्टम के माध्यम से एक एमआरएनए लिपोप्लेक्स समाधान इंजेक्शन द्वारा माइक्रोस्कोप पर संक्रमित किया जाता है। स्केल बार: 200 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

1. माइक्रोस्ट्रक्चर्ड सिंगल-सेल सरणी फैब्रिकेशन(चित्रा 2A)

  1. μPIPP सरणी निर्माण के लिए आवश्यक सामग्री तैयार करें।
    1. पीएच 7.4 पर बाँझ फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) तैयार करें।
    2. 25 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 18 MΩcm की प्रतिरोधकता के साथ बाँझ अल्ट्रापुरे पानी तैयार करें।
    3. पीएलएल (20-हाइड्रोक्सीथिल) -1-पाइपरेजिएथाइल- 1-पाइपरेजिएथाइल- 1-पाइपरेजिएथिल-1-पाइपरेजिएथान्सुल्फ एसिडोनिक (एचईपीई) वाले अल्ट्रापुरे पानी में पीएलएल-खूंटी की 2 मिलीग्राम/एमएल सांद्रता के साथ काम करने वाले समाधान तैयार करें ।
    4. सतह कोटिंग के लिए एक बाह्राश मैट्रिक्स प्रोटीन समाधान तैयार करें: पीबीएस में 1 मिलीग्राम/एमएल फाइब्रोनेक्टिन (एफएन)।
    5. फोटोलिथोग्राफी8 द्वारा निर्मित माइक्रोपैटर्न के साथ एक सिलिकॉन वेफर तैयार करें जो एक पुन: प्रयोज्य मास्टर के रूप में कार्य करता है। माइक्रोपैटर्न में 30 माइक्रोन की बढ़त की लंबाई, 12 माइक्रोन की गहराई और 60 माइक्रोन की अंतर-वर्ग दूरी वाले वर्ग होते हैं, जो छह धारियों में व्यवस्थित होते हैं जिनकी चौड़ाई 6 मिमी और 18 मिमी की ऊंचाई होती है।
  2. 9% क्रॉसलिंकर (मास%) के साथ एक पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) मोनोमर मिलाएं एक सिलिकॉन इलास्टोमर किट का उपयोग करना और इसे लगभग 30 मिनट तक डीगैस करें जब तक कि यह एक डिसिकेटर का उपयोग करके बुलबुला मुक्त न हो। सिलिकॉन वेफर को लगभग 3-5 मिमी मोटी पीडीएमएस परत के साथ कास्ट करें और इसे फिर से लगभग 30 मिनट तक डीगैस करें जब तक कि यह बुलबुला मुक्त न हो जाए।
    1. पीडीएमएस के साथ सिलिकॉन वेफर को 50 डिग्री सेल्सियस पर बेकिंग ओवन में रखें ताकि पीडीएमएस को कम से कम 4 घंटे तक ठीक किया जा सके।
  3. पीडीएमएस के टिकट काटे।
    1. एक स्केलपेल का उपयोग करें और पीडीएमएस परत से बाहर काटें एक पीडीएमएस कृति जिसमें छह माइक्रोपैटर्न स्ट्राइप्स शामिल हैं।
    2. पीडीएमएस कृति को ऊपर की ओर सामना करने वाले माइक्रोपैटर्न के साथ एक बेंच पर रखें।
    3. पीडीएमएस कृति की छह माइक्रोपैटर्न धारियों में से प्रत्येक को पीडीएमएस स्टैंप में रेजरब्लेड के साथ काटें। ध्यान रखें कि कुछ पैटर्न वाले क्षेत्र को काटकर पीडीएमएस टिकटों के किनारे खुले हों।
  4. पीडीएमएस टिकटों को छह-चैनल स्लाइड(चित्रा 3-1)के कवरलिप पर रखें।
    1. एक अनकोटेड कवरस्लिप का उपयोग करें और कवरस्लिप की सुरक्षा पन्नी को ध्यान से खरोंच करके छह-चैनल स्लाइड के चैनल पदों को चिह्नित करें। फिर कवरस्लिप को पीठ पर नीचे की ओर सुरक्षा पन्नी के साथ रखें।
    2. चिमटी का उपयोग कर चिह्नित चैनल पदों पर कवरस्लिप पर नीचे का सामना करना पड़ माइक्रोपैटर्न के साथ PDMS टिकटों रखें ।
    3. एक माइक्रोस्कोप के तहत पीडीएमएस टिकटों की कुर्की की जांच करें। यदि एक पीडीएमएस स्टांप पूरी तरह से कवरस्लिप से जुड़ा हुआ है, तो संपर्क में वर्ग इंटरस्पेस की तुलना में गहरे दिखाई देते हैं। कवरस्लिप के लिए पीडीएमएस स्टांप का लगाव माइक्रोपैटर्न गुणवत्ता के लिए महत्वपूर्ण है।
  5. एक प्लाज्मा क्लीनर में उस पर छह PDMS टिकटों के साथ कवरलिप प्लेस और यह ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ इलाज (दबाव ०.२ mbar, ~४० डब्ल्यू 3 मिनट के लिए) के लिए PDMS टिकटों और कवरस्लिप हाइड्रोफिलिक(चित्रा 3-2)के बीच सतहों बनाने के लिए ।
  6. जैव सुरक्षा कैबिनेट में माइक्रोपैटर्न निर्माण के सभी आगे के चरणों को पूरा करें। पीएलएल-खूंटी समाधान के 15 माइक्रोन का उपयोग करें और प्रत्येक पीडीएमएस स्टांप के बगल में इसकी एक बूंद का उपयोग करें ताकि पीएलएल-खूंटी समाधान पीडीएमएस स्टैंप(चित्र 3 -3)के हाइड्रोफिलिक पैटर्न में अवशोषित हो जाए। कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए पीएलएल-खूंटी इनक्यूबेट करते हैं।
  7. उस पर पीडीएमएस टिकटों के साथ कवरस्लिप पर अल्ट्रापुरे पानी की 1 एमएल कुल्ला और चिमटी(चित्रा 3-4)का उपयोग कर पीडीएमएस टिकटों को हटा दें । फिर कवरलिप को दूसरी बार अल्ट्रापुरे पानी के 1 एमएल के साथ कुल्ला करें और इसे सूखने दें।
  8. जब कवरलिप पूरी तरह से सूख गया है, तो कवरस्लिप(चित्रा 3-4)के लिए एक छह चैनल चिपचिपा स्लाइड छड़ी । ध्यान रखें कि माइक्रोपैटर्न क्षेत्र चैनलों के नीचे के साथ संरेखित हों।
  9. एफएन के साथ आसंजन वर्गों को कार्यात्मक करें।
    1. प्रत्येक चैनल में पीबीएस के 40 μL भरें।
    2. पीबीएस में 100 μg/mL FN समाधान तैयार करें।
    3. प्रत्येक चैनल(चित्रा 3-5)में एफएन समाधान के 40 μL जोड़ें। चैनल में पीबीएस के साथ एफएन समाधान को अच्छी तरह से एक जलाशय से 40 माइक्रोन निकालकर मिलाएं और एक सजातीय समाधान उत्पन्न करने के लिए इसे 3 बार के लिए एक ही चैनल के विपरीत जलाशय में जोड़ दें। कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए एफएन समाधान को इनक्यूबेट करें।
    4. प्रत्येक चैनल को पीबीएस(चित्रा 3-6)के 120 माइक्रोन के साथ तीन बार धोएं।
  10. पैटर्न की गुणवत्ता की जांच करने के लिए, चरण 9.2 में फ्लोरोसेंटली लेबल एफएन का उपयोग करें। (चित्रा 4A)।
    नोट: हम सेल सीडिंग से एक दिन पहले μPIPP सरणी तैयार करने की सलाह देते हैं क्योंकि पीएलएल-खूंटी और एफएन सब्सट्रेट से बंधे नहीं हैं और पैटर्न की गुणवत्ता समय के साथ कम हो सकती है। तैयार μPIPP सरणी फ्रिज में स्टोर करें।

Figure 3
चित्र 3:μPIPP द्वारा एकल सेल माइक्रोएरे निर्माण। (1) सतह पर एक त्रि-आयामी माइक्रोपैटर्न संरचना के साथ पीडीएमएस टिकटों को छह-चैनल स्लाइड के कवरलिप पर व्यवस्थित किया जाता है। (2) उस पर पीडीएमएस टिकटों के साथ कवरलिप सतहों को हाइड्रोफिलिक बनाने के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ इलाज किया जाता है । (3) पीएलएल-खूंटी जोड़ा जाता है। यह केशिका बलों द्वारा माइक्रोस्ट्रक्चर में अवशोषित होता है और सतहों को पीडीएमएस स्टांप सेल-विकर्षक द्वारा कवर नहीं करता है। 4 शेष पीएलएल-खूंटी को निकालने के लिए कवरलिप को पानी से धोया जाता है। फिर, पीडीएमएस टिकटों को हटा दिया जाता है और एक छह चैनल चिपचिपा स्लाइड कवरस्लिप के लिए अटक जाता है। (5) फाइब्रोनेक्टिन, एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स का प्रोटीन, पीएलएल-खूंटी सेल-चिपकने वाले क्षेत्रों को बनाने के लिए जोड़ा जाता है। (6) छह चैनल स्लाइड फॉस्फेट-बफर खारा के साथ धोया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

2. सेल सीडिंग(चित्रा 2A)

नोट: निम्नलिखित धोने के चरणों के लिए, संबंधित तरल को एक जलाशय में जोड़ें और फिर किसी चैनल के विपरीत जलाशय से तरल की बराबर मात्रा को हटा दें।

  1. प्रत्येक चैनल को 37 डिग्री सेल्सियस के 120 माइक्रोन के साथ पूरी तरह से पूरक सेल विकास माध्यम से धोएं। सेल निलंबन जोड़ने से पहले, यह सुनिश्चित करें कि केवल चैनल मध्यम से भरे हुए हैं लेकिन जलाशयों से नहीं।
  2. सेल पासेजिंग के लिए अपने मानक प्रोटोकॉल के बाद सेल कल्चर फ्लास्क से अलग HuH7 कोशिकाओं और 4 x 105 कोशिकाओं/
  3. सेल सस्पेंशन के 40 माइक्रोन जोड़ें और एक जलाशय से 40 माइक्रोन को हटाकर सेल सस्पेंशन के साथ सेल ग्रोथ मीडियम मिलाएं और इसे एक सजातीय सेल डिस्ट्रीब्यूशन(चित्रा 4B)तक पहुंचने के लिए 3 बार एक ही चैनल के विपरीत जलाशय में जोड़ दें।
  4. चैनल से निलंबन के 40 μL निकालें ताकि केवल चैनल सेल निलंबन से भरा हो।
  5. स्लाइड को एक इनक्यूबेटर में रखें और चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सीडिंग के बाद सेल आसंजन 1 एच की जांच करें।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस गर्म सेल वृद्धि माध्यम के 120 माइक्रोन जोड़ें।
  7. लेकिन आगे 3 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में वापस स्लाइड माइक्रोपैटर्न(चित्रा 4C)पर सेलुलर आत्म संगठन सक्षम करने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4:सेलुलर स्व-संगठन और μPIPP सरणी का गुणवत्ता नियंत्रण। (A)माइक्रोस्ट्रक्चर्ड सतह में सेल-प्रतिरोधी बहुलक से घिरे लाल रंग में दिखाए गए चुकता एफएन-लेपित आसंजन धब्बे होते हैं। (ख)कोशिका सीडिंग के बाद, HuH7 कोशिकाओं को बेतरतीब ढंग से वितरित किया जाता है और(ग)मुख्य रूप से 4 घंटे की समय अवधि में आसंजन स्थानों पर पालन करते हैं । अनुमति 7के साथ फिर से मुद्रित । स्केल बार: 200 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

3. परफ्यूजन सिस्टम(चित्रा 2A)

नोट: एक पर्फ्यूजन प्रणाली का उपयोग केवल तभी आवश्यक है जब समय-चूक माप के दौरान अभिकर्मक या फ्लोरोसेंट मार्कर को जोड़ने की आवश्यकता हो। अपनी आवश्यकताओं के आधार पर, आप प्रत्येक चैनल को एक अलग परफ्यूजन सिस्टम से कनेक्ट कर सकते हैं या श्रृंखला में कई चैनलों को एक ही परफ्यूजन सिस्टम से कनेक्ट कर सकते हैं। पर्फ्यूजन सिस्टम की संख्या स्वतंत्र प्रायोगिक स्थितियों की संख्या से मेल खाती है। बायोसेफ्टी कैबिनेट में बाँझ परिस्थितियों में ट्यूबों को कनेक्ट करें और परफ्यूजन सिस्टम में हवा के बुलबुले को शामिल करने से बचें। यदि कोई परफ्यूजन प्रणाली का उपयोग नहीं किया जाता है, तो समय-चूक माप से पहले बायोसेफ्टी कैबिनेट में अभिकर्मक/मार्कर जोड़ें । परफ्यूजन सिस्टम इन-हाउस फैब्रिकेटेड है, उपयोग की गई सामग्री सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध है। परफ्यूजन प्रणाली की असेंबली को पहले9वर्णित किया गया है ।

  1. 1 एमएल सिरिंज (रिप्लेसमेंट स्पॉन के साथ) का इस्तेमाल करें और सिरिंज को 37 डिग्री सेल्सियस सेल ग्रोथ मीडियम के 1 एमएल से भरें।
  2. वाल्व का उपयोग कर इनलेट ट्यूब से सिरिंज कनेक्ट करें और ट्यूब को माध्यम से भरें।
  3. इनलेट ट्यूब को एक चैनल के जलाशय से कनेक्ट करें और सुनिश्चित करें कि कोई हवा के बुलबुले फंस न जाएं।
  4. इस पर्फ्यूजन सिस्टम से श्रृंखला में एक और चैनल को जोड़ने के लिए, वर्तमान चैनल के इनलेट ट्यूब के विपरीत जलाशय से एक सीरियल कनेक्टर कनेक्ट करें। अगले चैनल पर आगे बढ़ें और सीरियल कनेक्टर के मुक्त अंत को अपने जलाशयों में से एक से जोड़ें।
  5. पिछले चरणों को तब तक दोहराएं जब तक कि आवश्यक संख्या में चैनल श्रृंखला में नहीं जुड़े हों।
  6. आउटलेट ट्यूब को सीधे वर्तमान चैनल के मुक्त जलाशय से कनेक्ट करें। कनेक्टेड ट्यूब को माध्यम से भरें ताकि यह जांचा जा सके कि परफ्यूजन सिस्टम लीक नहीं होता है।
  7. पिछले चरणों को तब तक दोहराएं जब तक कि स्लाइड के सभी छह चैनल एक परफ्यूजन सिस्टम से जुड़े न हों।
  8. आगे के उपयोग तक इनक्यूबेटर में कनेक्टेड परफ्यूजन सिस्टम (ओं) के साथ स्लाइड रखें या इसे सीधे माइक्रोस्कोप के हीटिंग चैंबर में रखें समय-चूक माप के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।

4. समय-चूक माइक्रोस्कोपी(चित्रा 2B)

नोट: दीर्घकालिक माप के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस और एक स्थिर सीओ2 स्तर का स्थिर तापमान बनाए रखें। सीओ2-निर्भरसेल ग्रोथ मीडियम के विकल्प के तौर पर एल15 मीडियम का इस्तेमाल करें, जिसके लिए किसी गैस इनक्यूबेशन सिस्टम की जरूरत नहीं है ।

नोट: मात्रात्मक इमेजिंग के लिए, पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस को कम करने के लिए समय-चूक माप के दौरान फिनॉल लाल के बिना सेल विकास माध्यम का उपयोग करें और समय-चूक प्रोटोकॉल की एक ही सेटिंग्स के साथ-साथ तकनीकी प्रतिकृति के लिए एक ही माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।

  1. एक चरण के विपरीत छवि और 750 एमएस के जोखिम समय के साथ एक फ्लोरेसेंस छवि रिकॉर्ड करने के लिए एक समय-चूक प्रोटोकॉल सेट करें (कैमरे के आधार पर), स्थिति सूची के माध्यम से लगातार छोरों के बीच 10 मिनट का समय अंतराल, और 30 घंटे का अवलोकन समय, 10x उद्देश्य और उचित फ्लोरेसेंस फिल्टर का उपयोग करके।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस गर्म हीटिंग कक्ष के नमूना धारक में एकल सेल सरणी पर कोशिकाओं के साथ छह चैनल स्लाइड रखो। यदि परफ्यूजन सिस्टम छह चैनल स्लाइड से जुड़े हुए हैं, तो यह सुनिश्चित करने के लिए कुछ टेप का उपयोग करके ट्यूबों को चरण में ठीक करें कि तरल विनिमय के दौरान छह-चैनल स्लाइड को स्थानांतरित न किया जाए। तरल अपशिष्ट एकत्र करने के लिए 15 एमएल रिएक्शन ट्यूब के छेद के माध्यम से आउटलेट ट्यूबों के मुक्त सिरों को डालें।
  3. स्कैनिंग समय-चूक माप के लिए स्थिति सूची निर्धारित करें। सुनिश्चित करें कि स्थिति सूची के माध्यम से लगातार छोरों के बीच निर्धारित समय अंतराल के भीतर पदों की संख्या स्कैन किया जा सकता है। 10x उद्देश्य के साथ, कैमरा चिप आकार के आधार पर कुल माइक्रोपैटर्न क्षेत्र को स्कैन करने के लिए प्रति चैनल 10-30 पदों को सेट किया जा सकता है।
  4. समय-चूक माप शुरू करें। दीर्घकालिक माप की बेहतर छवि गुणवत्ता के लिए, एक स्वचालित फोकस सुधार प्रणाली का उपयोग करें।

5. फ्लोरोसेंट मार्कर - एमआरएनए ट्रांसफैक्शन(चित्रा 2B)

नोट: एक ट्यूबिंग सिस्टम से जुड़े दो चैनलों में एक ट्रांसफैक्शन के लिए, कुल मात्रा में 600 माइक्रोल ट्रांसफैक्शन मिश्रण (एक चैनल के लिए 300 माइक्रोन) की आवश्यकता होती है। इंगित वॉल्यूम दो कनेक्टेड चैनलों में एक ट्रांसफैक्शन को संदर्भित करते हैं।

  1. सीरम-कम माध्यम के 200 माइक्रोन में ट्रांसफैक्शन एजेंट के 1 माइक्रोन को कमजोर करके एक ट्रांसफैक्शन एजेंट समाधान तैयार करें और समाधान को कमरे के तापमान पर 5 मिनट तक इनक्यूबेट करें।
  2. सीरम-कम माध्यम के 150 माइक्रोन में ईजीएफपी के लिए एमआरएनए एन्कोडिंग के 300 एनजी को कमजोर करके एक एमआरएनए समाधान तैयार करें।
  3. एमआरएनए समाधान में ट्रांसफैक्शन एजेंट समाधान के 150 माइक्रोल जोड़कर ट्रांसफैक्शन मिश्रण तैयार करें और इसे अच्छी तरह से मिलाएं। ट्रांसफैक्शन को कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट मिलाएं।
  4. ट्रांसफेक्शन मिक्स के इनक्यूबेशन के दौरान एक सिरिंज का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस गर्म पीबीएस के 1 एमसीएल के साथ ट्यूबिंग सिस्टम फ्लश करें। ट्यूबों को फ्लश करते समय, सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप चरण आगे नहीं बढ़ता है। यदि आवश्यक हो तो समय-चूक माप को रोकें।
  5. 300 माइक्रोन सीरम-कम माध्यम जोड़कर 0.5 एनजी/μL के अंतिम mRNA एकाग्रता के लिए ट्रांसफेक्शन मिश्रण पतला।
  6. एक सिरिंज का उपयोग कर ट्रांसफैक्शन मिश्रण के साथ ट्यूबिंग सिस्टम फ्लश करें और एमआरएनए लिपोप्लेक्स को 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करते हैं (यदि आवश्यक हो तो समय-चूक माप को रोकें)।
  7. ट्रांसफैक्शन इनक्यूबेशन बंद करो और एक सिरिंज का उपयोग कर 37 डिग्री सेल्सियस गर्म पूरी तरह से पूरक सेल विकास माध्यम के 1 मिलील के साथ धोने के द्वारा अनबाउंड एमआरएनए लिपोप्लेक्स को बाहर निकालें (यदि आवश्यक हो तो समय-चूक माप को रोकें)।

6. छवि विश्लेषण और फ्लोरेसेंस रीडआउट

  1. पहली बार छवि विश्लेषण चलाते समय, वहां दिए गए निर्देशों के अनुसार उद्धृत स्थान 10 से ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर "ऑटोमेटेड माइक्रोस्ट्रक्चर एनालिसिस इन पायथन" (PyAMA) के संस्करण0.1.6 स्थापित करें।
  2. सुनिश्चित करें कि छवि चैनल (चरण-विपरीत और फ्लोरेसेंस) बहु-छवि 16-बिट झगड़ा फ़ाइलों के रूप में उपलब्ध हैं। यदि आवश्यक हो, तो उन्हें तदनुसार परिवर्तित करें।
  3. PyAMA शुरू करें और ओपन स्टैक पर क्लिक करें ...
  4. प्रत्येक बहु-छवि टिफ फ़ाइल को खोलने के लिए, ओपन पर क्लिक करें और फ़ाइल का चयन करें ताकि यह संवाद के बाईं ओर लोडेड फ़ाइलों की सूची में प्रदर्शित हो(चित्रा 5-1)।
  5. विश्लेषण में शामिल करने के लिए चैनलों को चिह्नित करें। प्रत्येक चैनल के लिए, निम्नलिखित चरणों को करें।
    1. लोडेड फाइलों की सूची में चुनें चैनल युक्त झगड़ा फ़ाइल।
    2. सेक्शन में नए चैनल जोड़ें,झगड़ा फ़ाइल में चैनल के इंडेक्स का चयन करें। इंडेक्सिंग शून्य-आधारित है; पहले चैनल में इंडेक्स 0 है, दूसरे चैनल में इंडेक्स 1 और इसी तरह है।
    3. चैनल प्रकार का चयन करें। सेल की रूपरेखा का संकेत देने वाले बाइनरी चैनल के लिए संबंधित छवि चैनलों और विभाजन के लिए चरण विपरीत या फ्लोरेसेंस का चयन करें।
    4. वैकल्पिक रूप से, विभिन्न फ्लोरेसेंस चैनलों को अलग करने के लिए चैनल का लेबल दर्ज करें: ईजीएफपी और डीएपीआई।
    5. चैनल को कॉन्फ़िगर करने के बाद, ऐडपर क्लिक करें।
  6. जब सभी जोड़े गए चैनल संवाद के दाईं ओर चैनल सूची में प्रदर्शित होते हैं, तो स्टैक लोड करने के लिए ओके पर क्लिक करें।
  7. चरण-विपरीत छवियों(चित्रा 5-2)के आधार पर सेल मान्यता के लिए PyAMA के अंतर्निहित विभाजन एल्गोरिदम का उपयोग करके विभाजन करने के लिए, टूल्स | पर जाएं बिनायराइज... और बिनारिज्ड चैनल के साथ NumPy फ़ाइल के लिए एक फ़ाइल नाम दर्ज करें।
    नोट: वर्तमान संस्करण में, बिनारिज्ड चैनल को लोड करने के लिए सभी चैनलों को फिर से लोड करने की आवश्यकता होती है।
  8. फ्लोरेसेंस चैनल(चित्रा 5-3)पर पृष्ठभूमि सुधार11 करने के लिए, यह सुनिश्चित करें कि फ्लोरेसेंस चैनल और एक विभाजन चैनल लोड किया जाता है। यदि कोई सेगमेंटेशन चैनल लोड नहीं है, तो सुनिश्चित करें कि स्वचालित विभाजन के लिए एक चरण-विपरीत चैनल लोड किया गया है। "बैकग्राउंड सुधार > उपकरण..." और सही फ्लोरेसेंस चैनल के साथ परिणामी झगड़ा फ़ाइल के लिए एक फ़ाइल नाम का चयन करें।
    नोट: वर्तमान संस्करण में, पृष्ठभूमि-सही चैनल लोड करने के लिए सभी चैनलों को फिर से लोड करने की आवश्यकता होती है।
  9. पूर्व चयनित कोशिकाओं(चित्रा 5-4)और उनके एकीकृत फ्लोरेसेंस सिग्नल(चित्रा 5-5)का समय फ्रेम के माध्यम से स्क्रॉल करके, बाईं ओर चैनल मेनू में सूचीबद्ध चैनलों को देखने और कोशिकाओं पर क्लिक करने के लिए उनके फ्लोरेसेंस समय पाठ्यक्रम(चित्रा 1C)को उजागर करने का निरीक्षण करें । कोशिका चयन का उपयोग उन कोशिकाओं को बाहर करने के लिए करें जो व्यवहार्य नहीं हैं, एक आसंजन स्थान तक सीमित नहीं हैं या आगे के विश्लेषण से किसी अन्य कोशिका से जुड़ी हैं। शिफ्ट दबाकर और सेल पर क्लिक करके रीडआउट के लिए कोशिकाओं के चयन को टॉगल करें, या सेल को हाइलाइट करके और एंटर दबाकर।
  10. सेल क्षेत्र और एकीकृत फ्लोरेसेंस(चित्रा 5-6)के लिए सिंगल-सेल टाइम कोर्सेज को फाइल | पर क्लिक करके सहेजें बचाने के लिए और एक निर्देशिका का चयन करने के लिए बचाने के लिए।

Figure 5
चित्रा 5:PyAMA का उपयोग करके समय-चूक छवि श्रृंखला की स्वचालित छवि प्रसंस्करण। (1) प्रत्येक इमेजिंग स्थिति के लिए चरण-विपरीत और फ्लोरेसेंस इमेज श्रृंखला आयात की जाती है। (2) सेल आकृति चरण-विपरीत छवि स्टैक पर विभाजन द्वारा निर्धारित की जाती है। (3) फ्लोरेसेंस छवियों पर पृष्ठभूमि सुधार लागू किया जाता है। (4) समय के साथ सेल की रूपरेखा को ट्रैक किया जाता है और निर्यात के लिए पूर्व-चयनित किया जाता है। (5) फ्लोरेसेंस तीव्रता को ट्रैक किए गए सेल आकृति के आधार पर एकीकृत किया जाता है। (6) एकल कोशिका कोशिका क्षेत्रों और एकीकृत फ्लोरेसेंस तीव्रता का मूल्यांकन किया जाता है और प्रत्येक सेल के लिए समय पाठ्यक्रमों का निर्यात किया जाता है । स्केल बार: 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. एमआरएनए ट्रांसफैक्शन के बाद अनुवाद काइनेटिक्स का विश्लेषण करने के लिए, प्रत्येक एकल-सेल समय पाठ्यक्रम के लिए जैव रासायनिक दर समीकरणों के आधार पर एक अनुवाद मॉडल फिट करें जैसा कि पहले रीसर एट अल12द्वारा वर्णित है। उस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले आंकड़े और कोड सार्वजनिक रूप से उपलब्ध हैं.
  2. प्रत्येक एकल-सेल समय पाठ्यक्रम के लिए, अनुवाद मॉडल के अनुमानित फिटिंग मापदंडों को पुनः प्राप्त करें जो एमआरएनए क्षरण दर और अनुवाद शुरुआत के समय बिंदु का प्रतिनिधित्व करते हैं। प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में एक उदाहरण डेटा सेट पर चर्चा की जाती है।
  3. सेल आबादी के भीतर सेल-टू-सेल परिवर्तनशीलता की जांच करने के लिए विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए मापदंडों के सर्वोत्तम अनुमानों के वितरण पर आगे विश्लेषण करें।

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Representative Results

LISCA दृष्टिकोण एकल कोशिकाओं से फ्लोरेसेंस टाइम कोर्स को कुशलतापूर्वक एकत्र करने में सक्षम बनाता है। एक प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में हम रेखांकित करते हैं कि ट्रांसफैक्शन के बाद एकल-सेल eGFP अभिव्यक्ति को मापने के लिए LISCA विधि को कैसे लागू किया जाता है। LISCA प्रयोग के डेटा का उपयोग एमआरएनए डिलीवरी काइनेटिक्स का आकलन करने के लिए किया जाता है, जो कुशल एमआरएनए दवाओं के विकास के लिए महत्वपूर्ण है।

विशेष रूप से हम अनुवाद की शुरुआत के समय बिंदु और एकल सेल स्तर पर अभिव्यक्ति दर के संबंध में दो लिपिड आधारित एमआरएनए डिलीवरी सिस्टम के विभिन्न प्रभावों को प्रदर्शित करते हैं। हमने कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया और बैच को दो आबादी में विभाजित किया। एक उप-जनसंख्या प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित लिपोपेक्स से संक्रमित थी। अन्य उप-जनसंख्या को एक ही अंतिम एमआरएनए एकाग्रता के साथ एक ही एमआरएनए का उपयोग करके संक्रमित किया गया था, लेकिन लिपिड नैनोकणों (एलएनपी) के साथ वितरण प्रणाली के रूप में, जो माइक्रोफ्लुइडिक मिश्रण12का उपयोग करके उत्पादित किए गए थे। एक अलग लिपिड संरचना और लिपोपेक्स और एलएनपी के एमआरएनए डिलीवरी सिस्टम के विभिन्न निर्माण के कारण हम अनुवाद काइनेटिक्स पर प्रभाव की उम्मीद करते हैं क्योंकि तेज काइनेटिक्स को प्रभावित किया जाना चाहिए। LISCA विधि का उपयोग करके हम ट्रांसफैक्शन के बाद अनुवाद शुरुआत के समय बिंदु टी0 की मात्रा निर्धारित करते हैं और कोशिकाएं eGFP को कितनी मजबूत व्यक्त करती हैं, जो संक्रमित एमआरएनए अणुओं एम0 और अनुवाद दर के टीएलकेउत्पाद पर निर्भर करती है। इन दो मापदंडों को प्राप्त करने के लिए हम चित्र 6एमें स्केच के रूप में तीन चरण के अनुवाद मॉडल फिट करते हैं । साइटोसोल में समय बिंदु टी0 पर एमआरएनए अणुओं एम की सफल रिलीज के बाद, एमआरएनए को दर केटीएल के साथ अनमैचुरेटेड ईजीएफपी जी* में अनुवादित किया जाता है, जो गैर-फ्लोरोसेंट है। असंतृप्त जी* ईजीएफपी जीके लिए दर केएम के साथ परिपक्व होता है, जिसकी फ्लोरेसेंस तीव्रता को समय-चूक माप के दौरान मापा जाता है। एमआरएनए के साथ-साथ (असांृप्त और परिपक्व) eGFP δ और γ संबंधित गिरावट दरों के साथ समय के साथ नीचा । मॉडल साधारण अंतर समीकरणों द्वारा वर्णित है और जी के लिए विश्लेषणात्मक समाधान पैरामीटर अनुमान के लिए एक मॉडल समारोह के रूप में प्रयोग किया जाता है। मॉडल फ़ंक्शन को प्रत्येक एकल-सेल समय पाठ्यक्रमों में फिट किया गया है जैसा कि चित्रा 6B में उदाहरण समय पाठ्यक्रम (ग्रे) और संबंधित फिट (हरे) के साथ दिखाया गया है। चित्रा 6C में हम अनुवाद की शुरुआत के टाइम पॉइंट टी0 के हिस्टोग्राम और लिपोपेक्स ट्रांस संक्रमित कोशिकाओं के अभिव्यक्ति दर एम0kटीएल दिखाते हैं। चूंकि प्रत्येक कोशिका के लिए दोनों पैरामीटर अनुमानित हैं, इसलिए इन मापदंडों के सहसंबंध का विश्लेषण किया जा सकता है जैसा कि स्कैटरप्लॉट(चित्रा 6 डी,ब्लू डेटा) में दिखाया गया है और इसकी तुलना एलएनपी (लाल) से संक्रमित कोशिकाओं से की जा सकती है। जैसा कि चित्रा 6 डीमें दिखाया गया है, एलएनपी से संक्रमित कोशिकाएं लिपोपेक्स से संक्रमित कोशिकाओं की तुलना में कम सेल-टू-सेल परिवर्तनशीलता दिखाती हैं और जनसंख्या औसत अनुवाद की तेजी से शुरुआत के साथ-साथ उच्च अभिव्यक्ति दर (काले रूपरेखा के साथ मोटी डॉट्स) दिखाता है।

ये दो डेटा सेट सिर्फ एक उदाहरण हैं कि एमआरएनए ट्रांसफैक्शन के बाद अनुवाद का अध्ययन करने के लिए LISCA का उपयोग कैसे किया जा सकता है। इसके अलावा जांच उदाहरण के लिए एमआरएनए अनुक्रम संशोधनों पर निर्भर एमआरएनए स्थिरता के संबंध में की जा सकती है 14, विभिन्न रिपोर्टर प्रोटीन स्टेबिलिटी 15, या सिरएनए मध्यस्थता MRNA क्षरण 16.

Figure 6
चित्र 6:एकल सेल eGFP अनुवाद काइनेटिक्स का डेटा विश्लेषण। (A)एमआरएनए डिलीवरी के बाद रिपोर्टर प्रोटीन ईजीएफपी के अनुवाद काइनेटिक्स को संबंधित मापदंडों के साथ तीन चरण की प्रतिक्रिया दर समीकरण द्वारा वर्णित किया जा सकता है। (ख)मॉडल को प्रत्येक एकल-सेल ईजीएफपी अभिव्यक्ति समय पाठ्यक्रम (ग्रे निशान) में फिट किया जाता है ताकि ट्रांसफेक्शन शुरुआत के टाइम पॉइंट(टी0)और अभिव्यक्ति दर(एम0kटीएल)जैसे मॉडल मापदंडों का अनुमान लगाया जा सके, एमआरएनए डिलीवरी प्रभावकारिता की मात्रा निर्धारित करने के लिए दो पैरामीटर हैं । (ग)ट्रांसफेक्शन शुरुआत समय और अभिव्यक्ति दर के लिए पैरामीटर वितरण के हिस्टोग्राम । (घ)चूंकि प्रत्येक सेल के लिए मापदंडों का अनुमान लगाया जाता है, इसलिए इन मापदंडों का एक बिखराव भूखंड पैरामीटर सहसंबंध को दर्शाता है । छोटे बिंदु एक ही कोशिका के मापदंडों का प्रतिनिधित्व करते हैं। साजिश mRNA LNPs (लाल) और mRNA lipoplexes (नीला) के साथ संक्रमित कोशिकाओं से पता चलता है । काले रूपरेखा के साथ मोटी डॉट्स संबंधित जनसंख्या औसत के अनुरूप है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां हमने एल्ससीए को एकल-कोशिका स्तर पर इंट्रासेलुलर फ्लोरोसेंट लेबल के सेलुलर काइनेटिक्स का पालन करने के लिए एक बहुमुखी तकनीक के रूप में वर्णित किया। एक सफल LISCA प्रयोग करने के लिए, प्रोटोकॉल अनुभाग के वर्णित चरणों में से प्रत्येक को व्यक्तिगत रूप से स्थापित किया जाना चाहिए और फिर सभी चरणों को संयुक्त किया जाना चाहिए। LISCA के तीन प्रमुख पहलुओं में से प्रत्येक महत्वपूर्ण कदम की सुविधा ।

एकल सेल माइक्रोएरे निर्माण
माइक्रोएरे की गुणवत्ता महत्वपूर्ण है क्योंकि माइक्रोएरे पर सेलुलर संरेखण न केवल सभी आगे के प्रयोगात्मक चरणों के लिए महत्वपूर्ण है बल्कि डेटा की गुणवत्ता पर भी प्रभाव डालता है। इस कारण से, पैटर्न की ज्यामिति और निर्माण विधि को उपयोग की गई कोशिकाओं के संबंध में अनुकूलित किया जाना चाहिए। इस लेख में चर्चा किए गए प्रतिनिधि परिणाम यकृत कार्सिनोमा सेल लाइन HuH7 के साथ उत्पन्न हुए हैं जो (30 माइक्रोन)2 वर्ग पैटर्न पर गठबंधन किया गया है। यह पैटर्न ज्यामिति अन्य सेल लाइनों जैसे A549 या HEK293 के लिए भी उपयुक्त है। बीईएएस-2 बी जैसी बड़ी कोशिकाओं के लिए, 35 माइक्रोन एज लंबाई के साथ एक बड़ा वर्ग पैटर्न और 80 माइक्रोन की अंतर-वर्ग दूरी का उपयोग किया जा सकता है। वर्णित सीडिंग प्रक्रिया HuH7 कोशिकाओं के लिए अनुकूलित है, लेकिन यह कई अन्य अनुयायी कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है17. उदाहरण के लिए, कुछ सेल लाइनों को आसंजन स्थानों के विभिन्न आकारों की आवश्यकता होती है या विस्तारित कोशिकाओं के माध्यम से सेल-सेल संपर्कों से बचने के लिए आसंजन स्थानों के बीच बड़े अंतर की आवश्यकता होती है।

माइक्रोपैटर्न को इस तरह समायोजित किया जाना चाहिए कि आसंजन साइट क्षेत्र मानक संस्कृति व्यंजनों में सेल के लगभग औसत क्षेत्र को पूरा करता है। ज्यामिति गोल या चुकता हो सकती है और सेल व्यवहार्यता का कोई औसत दर्जे का प्रभाव नहीं है। कोशिका गति गोल पैटर्न की तुलना में एक चुकता पैटर्न पर अधिक प्रतिबंधित लगती है, जहां कोशिकाओं को अक्सर घुमाने के लिए देखा जाता है। जब पहली बार नई सेल लाइनों का उपयोग किया जाता है तो अलग व्यवहार्यता परीक्षण की सिफारिश की जाती है। आसंजन स्थानों की उच्च अधिभोग तक पहुंचने और एक ही समय में आसंजन स्थानों की दोहरी अधिभोग को कम करने के लिए विशिष्ट सेल लाइनों के लिए सीडिंग घनत्व को समायोजित करने की आवश्यकता है। आमतौर पर, आसंजन साइट प्रति कोशिकाओं की संख्या के परिणामस्वरूप अधिभोग Poisson आंकड़ों का पालन करता है और या तो शूंय, एक या दो है । इसलिए कुल अधिभोग 60% और 80% के बीच है , जिसका उद्देश्य डबल अधिभोग से बचना चाहिए17. सीडिंग प्रोटोकॉल को वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या और सीडिंग और पहले धोने के कदम के बीच की समय अवधि के बारे में अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, 1 घंटे के बजाय सीडिंग के बाद एक वाशिंग स्टेप 30 मिनट (प्रोटोकॉल सेक्शन 2 सेल सीडिंग के चरण 5 और 6 देखें) डबल कब्जे वाले आसंजन स्थानों की संख्या को कम करेगा लेकिन हुएच 7 कोशिकाओं के लिए कब्जे वाले आसंजन स्थानों की कुल संख्या को भी कम करेगा।

चूंकि चैनल स्लाइड्स के लिए ट्यूबिंग सिस्टम का कनेक्शन अनिवार्य नहीं है, इसलिए सबसे अच्छी उपयुक्त एकाग्रता और इनक्यूबेशन समय की जांच करने के लिए ट्यूबिंग सिस्टम का उपयोग किए बिना एक रिएजेंट या फ्लोरोसेंट मार्कर का उपयोग स्थापित करना आसान है। ब्याज के अभिकर्ता/मार्कर के लिए उपयुक्त प्रोटोकॉल स्थापित होने के बाद, ट्यूबिंग प्रणाली को वर्कफ्लो में शामिल किया जा सकता है ।

समय-चूक माइक्रोस्कोपी
एक और महत्वपूर्ण कदम समय-चूक माप की सेटिंग्स हैं। उदाहरण के लिए, फ्लोरोफोरफोर और फोटोटॉक्सिसिटी प्रभावों के फोटोब्लैचिंग से बचने के लिए फ्लोरेसेंस मार्कर के लिए एक्सपोजर समय सावधानी से चुना जाना चाहिए लेकिन फिर भी एक अच्छा फ्लोरेसेंस सिग्नल सुनिश्चित करता है। समय-चूक सेटअप का एक और महत्वपूर्ण पैरामीटर स्थानिक और लौकिक संकल्प का सबसे अच्छा उपयुक्त संयोजन है, जो भारी रूप से मनाया गया सेलुलर काइनेटिक्स पर निर्भर करता है। यदि एक उच्च लौकिक संकल्प की आवश्यकता है, तो माइक्रोएरे में केवल थोड़ी संख्या में पदों को दो समय बिंदुओं के बीच स्कैन किया जा सकता है, जो स्कैन किए गए अवलोकन क्षेत्र को कम करता है और इस प्रकार, आंकड़े भी कम कर देता है। अवलोकन क्षेत्र इसके अलावा न केवल स्कैन पदों की संख्या पर निर्भर है, लेकिन यह भी उद्देश्य और कैमरे के देखने के एक क्षेत्र के आकार पर । दिए गए उदाहरण में, अनुवाद गतिज का निरीक्षण करने के लिए 10x उद्देश्य का उपयोग करके 10 मिनट का एक समय संकल्प पर्याप्त है। यह संयोजन कैमरा चिप के आकार, माइक्रोस्कोप चरण की गति, और इमेजिंग चैनलों की संख्या (जैसे, चरण-विपरीत और ईजीएफपी फ्लोरेसेंस) के आधार पर प्रति टाइम पॉइंट 70-100 पदों को स्कैन करने की अनुमति देता है।

इमेज प्रोसेसिंग
कोशिका प्रति कुल फ्लोरेसेंस का विश्लेषण सुविधाजनक है क्योंकि कोशिकाएं एक सरणी में तैनात हैं। फिर भी, एकल-सेल फ्लोरेसेंस टाइम कोर्सेज की गुणवत्ता, विशेष रूप से सिग्नल-टू-शोर अनुपात (एसएनआर) छवि श्रृंखला से सेल फ्लोरेसेंस तीव्रता के एकीकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले एल्गोरिदम पर निर्भर करता है। सॉफ्टवेयर टूल पायमा के इमेज प्रोसेसिंग स्टेप्स को फिगर 5में दिखाया गया है । एकल कोशिका फ्लोरेसेंस रीडआउट के लिए एकीकरण क्षेत्रों का निर्धारण विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि जीवित कोशिकाओं का सेल समोच्च समय के साथ भिन्न होता है। PyAMA एक सेल समोच्च पर फ्लोरेसेंस तीव्रता को एकीकृत करता है, जिसे एक अंतर्निहित विभाजन एल्गोरिदम द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। एक विकल्प यह होगा कि माइक्रोपैटर्न ज्यामिति12,16के आधार पर निश्चित सीमाओं पर एकीकृत किया जाए . PyAMA का वर्तमान संस्करण चरण-विपरीत छवि चैनल के पिक्सेल पड़ोस के मानक विचलन पर एक सीमा के आधार पर छवि विभाजन करता है। विभाजन परिणाम बाहरी सॉफ्टवेयर से भी आयात किया जा सकता है। भविष्य के संस्करणों के लिए, मशीन लर्निंग के आधार पर विभाजन के लिए और निश्चित सीमाओं पर एकीकरण के लिए देशी समर्थन की योजना बनाई है ।

PyAMA एक इंटरफ़ेस का उपयोग करके आउटलियर कोशिकाओं या असंगत समय पाठ्यक्रमों को फ़िल्टर करने की पेशकश करता है जो फ्लोरेसेंस छवि के साथ-साथ चयनित कोशिकाओं के फ्लोरेसेंस समय पाठ्यक्रमों(चित्रा 1C)के दृश्य निरीक्षण की अनुमति देता है। विश्लेषण से बाहर की जा सकने वाली कोशिकाओं के उदाहरण ऐसी कोशिकाएं हैं जो विभाजन या एपोप्टोसिस से गुजरती हैं या जो आसंजन साइट के बाहर स्थित होती हैं। ट्रैकिंग एल्गोरिदम द्वारा गलती से पहचाने गए कई कोशिकाओं के एकत्रीकरण को एक कोशिका के रूप में भी फ़िल्टर करने की आवश्यकता होती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि समय पाठ्यक्रम एकल कोशिकाओं से उत्पन्न होते हैं। PyAMA असंगत कोशिकाओं को छानने के लिए आवश्यक मैनुअल इंटरैक्शन की मात्रा को कम करने के लिए कोशिकाओं का पूर्व-चयन करता है। पूर्व चयन पूर्व चयन की अशुद्धियों की भरपाई के लिए चयनित कोशिकाओं के समय पाठ्यक्रमों का निर्यात करने से पहले हाथ से निरीक्षण और सही किया जा सकता है। PyAMA के वर्तमान संस्करण का पूर्व चयन सेल एकत्रीकरण को कम करने के लिए सेल आकार के लिए एक सीमा पर आधारित है। भविष्य के संस्करणों के लिए, एक अतिरिक्त मशीन-लर्निंग आधारित पूर्व-चयन की योजना बनाई गई है, जो ऊपर वर्णित असंगत कोशिकाओं के लिए उदाहरण सहित आगे के मानदंडों के लिए खाते की अनुमति देता है।

संक्षेप में, LISCA दृष्टिकोण एकल सेल फ्लोरेसेंस समय पाठ्यक्रमों को कुशलतापूर्वक एकत्र करने के लिए एकल-सेल सरणी को नियोजित करता है। कोशिकाओं को माइक्रोफैब्रिकेटेड आसंजन साइटों तक सीमित करना ट्रैकिंग और छवि विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है। इसके अलावा, कोशिकाओं को मानकीकृत स्थानीय माइक्रोएनवायरमेंट में सुसंस्कृत किया जाता है और इसलिए, ट्रांसफेक्शन के लिए लिपिड नैनोकणों जैसे एजेंटों के संपर्क में आने पर एक समान सतह क्षेत्र के साथ प्रस्तुत किया जाता है। यह पहलू विशेष रूप से फायदेमंद है जब जनसंख्या के भीतर सेलुलर विषमता की जांच की जाती है। यहां वर्णित μPIPP तकनीक कई माइक्रोफैब्रिकेशन तकनीकों में से एक है जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीन पैटर्न के नियमित माइक्रोएरे होते हैं। पाठक को वैकल्पिक निर्माण प्रक्रियाओं के रूप में माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग, फोटोलिथोग्राफिक दृष्टिकोण और नरम लिथोग्राफी की समीक्षा करने वाले साहित्य को संदर्भित किया जाता है6। सेल लाइन के आधार पर, एक या अन्य पैटर्निंग तकनीक बेहतर हो सकती है। हमारे प्रयोगों में, μPIPP तकनीक ने सेलुलर सेल्फ-सॉर्टिंग के कारण कोशिकाओं के बोने के बाद अच्छी तरह से तैनात कोशिकाओं को दिखाया, जो पेग्यालेटेड क्षेत्र पर अवशिष्ट कोशिका चिपकने पर निर्भर करता है ताकि कोशिकाएं यादृच्छिक प्रवास में खोज कर सकें और प्रोटीन लक्ष्य सरणी पर फैलसकें।

LISCA मनमाने ढंग से फ्लोरेसेंस मार्कर के एकल सेल समय पाठ्यक्रमों की बड़ी संख्या के अधिग्रहण के लिए अनुमति देता है । एकल सेल स्तर पर फ्लोरेसेंस संकेतों का विश्लेषण, थोक प्रयोगों के विपरीत, प्राचीन एकल-सेल समय पाठ्यक्रमों की पैदावार करता है और सेल-टू-सेल परिवर्तनशीलता का पता चलता है। सेलुलर विषमता18 , 19,20जैसे सेल भाग्य निर्णयों में एक प्रख्यात भूमिका निभाती है । इस संदर्भ में, हमने हाल ही में दो फ्लोरेसेंस चैनलों का उपयोग करके LISCA दृष्टिकोण को बढ़ाया है जो किसी भी एक समय में दो सेलुलर घटनाओं के लौकिक सहसंबंधों के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है जो सेल-डेथ सिग्नलिंग झरना19के भीतर विशेष चरणों का संकेत देता है। अनुसंधान के इस क्षेत्र में, LISCA खुद को साइटोमेट्री माप प्रवाह के लिए एक विकल्प के रूप में प्रस्तुत करता है । जबकि प्रवाह साइटोमेट्री निर्विवाद रूप से एक तेज कार्यप्रवाह प्रदान करता है और आम तौर पर बड़े आंकड़े पैदा करता है, डेटा समय में एक विशेष बिंदु पर प्राप्त कर रहे हैं । फुल टाइम निर्भरता काइनेटिक्स मापदंडों का अनुमान देती है और विभिन्न फ्लोरेसेंस संकेतों के बीच अस्थायी सहसंबंधों को प्रकट करती है, जिन्हें अन्यथा एक्सेस करना मुश्किल होता है। कई फ्लोरेसेंस चैनलों का उपयोग करने के लिए, सेटअप को स्वचालित फ़िल्टर पहियों या कई कैमरों की आवश्यकता होती है। इस मामले में भी एकल सेल FRET विश्लेषण व्यवहार्य होना चाहिए और फ्लोरोसेंटी लेबल अणुओं के बीच निकटता के समय हल अध्ययन सक्षम । LISCA की तरह छवि आधारित विश्लेषण की एक खामी दृश्य नियंत्रण और ग़ैर का पता लगाने से जुड़ा श्रम है । यहां मशीन लर्निंग टूल डेटा प्रोसेसिंग को कम कर सकता है और पूरी तरह से स्वचालित डेटा विश्लेषण की अनुमति दे सकता है। भविष्य में, स्वचालित माइक्रोस्कोपी प्लेटफार्मों, रैपिड सरणी माइक्रोफैब्रिकेशन और आर्टिफिशियल इंटेलिजेंस का उपयोग करके, एलआईएससीए के थ्रूपुट और प्रयोज्यता में काफी वृद्धि की जा सकती है। इसके अलावा, माइक्रोफ्लुइडिक निष्कर्षण 21और एकल सेल जीनोमिक्स का उपयोग करके असामान्य फ्लोरेसेंस प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन करने वाली कोशिकाओं के बाद विश्लेषण दवा उद्योग में लगातार आवश्यकता है। इस लेख में प्रस्तुत प्रोटोकॉल एकल सेल संकल्प और पर्याप्त आंकड़ों के साथ सेलुलर प्रक्रियाओं की काइनेटिक्स का अध्ययन करने की मांग के अनुरूप है।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस काम को जर्मन साइंस फाउंडेशन (डीएफजी) से सहयोगी अनुसंधान केंद्र (एसएफबी) 1032 तक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। सहकारी परियोजना 05K2018-2017-06716 मेडिसॉफ्ट के साथ-साथ बेयरिश फोर्स्टस्ट से अनुदान के साथ-साथ बेएरिसचे फोर्स्टिफांग से अनुदान के तहत जर्मन संघीय शिक्षा, अनुसंधान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (बीएमबीएफ) द्वारा समर्थन को कृतज्ञता से स्वीकार किया जाता है । अनीता रीसर को ग्रेजुएट स्कूल ऑफ क्वांटिटेटिव बायोसाइंसेज म्यूनिख (क्यूबीएम) के माध्यम से डीएफजी फेलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adtech Polymer Engineering PTFE Microtubing  Fisher Scientific 10178071
baking oven Binder 9010-0190
CFI Plan Fluor DL 10x Nikon MRH20100
Desiccator Roth NX07.1
Eclipse Ti-E Nikon
eGFP mRNA Trilink L-7601
Female Luer to Tube Connector MEDNET FTL210-6005
Fetal bovine serum Thermo Fisher 10270106
Fibronectin Yo Proteins 663
Filter set eGFP AHF F46-002
Fisherbrand Translucent Platinum-Cured Silicone Tubing Fisher Scientific 11768088
HEPES (1 M) Thermo Fisher 15630080
Incubation Box Okolab OKO-H201
incubator Binder 9040-0012
L-15 without phenol red Thermo Fisher 21083027
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher 11668027
Male Luer in-house fabricated consisting of teflon
Male Luer to Tube Connector MEDNET MTLS210-6005 alternative to in-house fabricated male luers
NaCl (5 M) Thermo Fisher AM9760G
Needleless Valve to Male Luer Connector MEDNET NVFMLLPC
NIS Elements Nikon Imaging software Version 5.02.00
NOA81 Thorlabs NOA81 Fast Curing Optical Adhesive for tube system assembly
Opti-MEM Thermo Fisher 31985062
PCO edge 4.2 M-USB-HQ-PCO pco
Phosphate buffered saline (PBS) in-house prepared
Plasma Cleaner Diener Femto Pico-BRS
PLL(20 kDa)-g[3.5]-PEG(2 kDa) SuSoS AG
silicon wafer mit mircorstructures in-house fabricated
Sola Light Engine Lumencor
sticky slide VI 0.4  ibidi 80608
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 1673921
Tango 2 Märzhäuser 00-24-626-0000
Ultrapure water in-house prepared
uncoated coverslips ibidi 10813
Injekt-F Solo, 1 mL Omilab 9166017V with replacement sporn

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Reiser, A., Woschée, D., Kempe, S. M., Rädler, J. O. Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - a Versatile Technique to Quantify Cellular Kinetics. J. Vis. Exp. (169), e62025, doi:10.3791/62025 (2021).

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