Summary
마이크로패턴 어레이를 사용하여 단일 세포로부터 형광 리포터 타임 코스를 취득하는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 단일 셀 어레이의 준비, 라이브 셀 스캐닝 시간 경과 현미경 검사법의 설정 및 작동 및 접착 부위당 세포 통합 형광 시간 과정의 자동화된 사전 선택, 시각적 제어 및 추적을 위한 오픈 소스 이미지 분석 도구에 대해 설명합니다.
Abstract
단일 세포 배열의 라이브 셀 이미징 (LISCA)는 높은 처리량의 개별 세포로부터 형광 신호의 시간 과정을 수집하는 다양한 방법입니다. 일반적으로, 배양 된 세포에서 단세포 시간 과정의 취득은 세포 운동성 및 세포 모양의 다양성에 의해 방해된다. 접착제 마이크로 어레이는 단일 셀 조건을 표준화하고 이미지 분석을 용이하게 합니다. LISCA는 단일 셀 마이크로어레이와 스캔 시간 경과 현미경 검사및 자동화된 이미지 처리를 결합합니다. 여기서는 LISCA 형식으로 단일 세포 형광 시간 과정을 취하는 실험 단계를 설명합니다. 당사는 향상된 녹색 형광 단백질(eGFP)을 위해 mRNA 인코딩을 사용하여 마이크로패턴 어레이에 부착된 세포를 트랜스펙트하고 스캔 시간 경과 현미경 검사를 통해 수백 개의 세포의 eGFP 발현 운동을 병렬로 모니터링합니다. 이미지 데이터 스택은 선택한 셀 윤곽에 형광 강도를 통합하여 단일 세포 형광 시간 과정을 생성하는 새로 개발된 소프트웨어에 의해 자동으로 처리됩니다. 우리는 mRNA 이식 후 eGFP 발현 시간 과정이 mRNA의 발현 및 저하 율을 드러내는 간단한 운동 번역 모델에 의해 잘 설명된다는 것을 보여줍니다. 사멸 신호의 맥락에서 여러 마커의 이벤트 시간 상관 관계에 대한 LISCA의 추가 응용 프로그램에 대해 설명합니다.
Introduction
최근 몇 년 동안, 단세포 실험의 중요성이 명백해지고 있다. 단일 세포로부터의 데이터는 세포 대 세포 가변성, 세포 내 파라미터 상관관계의 해상도 및 앙상블 측정1,2,3에숨겨져 있는 세포 역학의 검출을 조사할 수 있다. 수천 개의 단일 세포의 세포 역학을 병렬로 조사하기 위해서는 수 시간까지 며칠 동안 표준화된 조건하에서 세포를 모니터링할 수 있도록 하는 새로운 접근법이 필요하며, 이어서 정량적 데이터 분석 4. 여기서는 미세구조화 어레이의 사용과 시간 경과 현미경 검사및 자동화된 이미지 분석을 결합한 단일 셀 어레이(LISCA)의 라이브 셀 이미징을 소개합니다.
미세 구조화 된 단세포 어레이를 생성하기위한 몇 가지 방법이 수립되어 문헌5,6에출판되었다. 여기에서, 우리는 마이크로 스케일 플라즈마 개시 단백질 패턴화 (μPIPP)를 간단히 설명합니다. μPIPP를 이용한 단일 세포 어레이 제조의 상세한 프로토콜도 참조7에서발견된다. 단일 세포 어레이의 사용은 표준화된 접착 반점에 수천 개의 셀의 정렬을 가능하게 하여 각 세포에 대해 정의된 마이크로환경을 제시하여 실험적 가변성의 근원을 감소시킵니다(그림1A). 단일 세포 배열은 다양한 세포 과정을 나타내기 위해 목적으로 사용되는 형광 마커의 시간 과정을 모니터링하는 데 사용됩니다. 스캔 시간 경과 모드에서 장기 현미경 검사는 단일 셀 어레이의 넓은 영역을 모니터링하고 따라서 몇 시간 또는 며칠의 관측 시간에 걸쳐 높은 처리량의 단일 세포 데이터를 샘플링 할 수 있습니다. 이렇게 하면 배열의 각 위치에서 이미지의 시간 줄스택(그림 1B)이생성됩니다. 다량의 영상 데이터를 줄이고 원하는 단일 세포 형광 시간 과정을 효율적인 방법으로 추출하기 위해서는 셀의 위치지정(도 1C)을활용하는 자동화된 이미지 처리가 요구된다.
LISCA의 과제는 실험 프로토콜과 계산 도구를 조정하여 세포 역학의 정량적이고 재현 가능한 데이터를 생성하는 높은 처리량 분석기를 형성하는 것입니다. 이 문서에서는 개별 메서드와 LISCA 분석기에서 결합하는 방법에 대한 단계별 설명을 제공합니다. 예를 들어, 인공 mRNA 전달 후 향상된 녹색 형광 단백질(eGFP) 발현의 시간 과정에 대해 논의합니다. mRNA 전달 에 따른 eGFP 발현은 mRNA의 번역 및 분해를 모델링하는 반응 속도 방정식에 의해 설명된다. 시간이 지남에 따라 각 개별 셀에 대한 형광 강도의 LISCA 판독값에 eGFP 농도의 시간 과정에 대한 모델 기능을 피팅하면 mRNA 분해 속도와 같은 모델 파라미터의 가장 좋은 추정치를 산출합니다. 대표적인 결과로 우리는 두 개의 다른 지질 계 형 경화 에이전트의 mRNA 전달 효율과 매개 변수 분포가 어떻게 다른지에 대해 논의합니다.
그림 1: LISCA 워크플로우의 표현 (A) 마이크로 패턴 단일 셀 어레이 (B) 스캔 시간 경과 현미경 및 (C) 기록 된 이미지 시리즈의 자동화 된 이미지 분석. 단세포 어레이는 세포-발충제 간 공간을 가진 세포-접착제 사각형의 2차원 패턴으로 구성되어 마이크로패턴상에 있는 세포의 배열로 이어지는데, 이는 상 대비 영상뿐만 아니라 eGFP 발현 세포의 형광 이미지에서 볼 수있다(A). 전체 미세 구조화 영역은 반복적으로 위치의 시퀀스에서 이미지를 촬영 스캔 시간 경과 모드에서 이미지(B). 기록된 이미지 시리즈는 시간이 지남에 따라 세포당 형광 강도를판독하기 위해 처리된다(C). 스케일 바: 500 μm(A),200 μm(C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Protocol
그림 2: 단일 세포 마이크로 어레이 (A)와 스캔 시간 경과 현미경 검사 (B)를 결합한 데이터 수집. 시간 경과 실험의 준비로서, 접착 사각형의 2D 마이크로패턴을 가진 단일 세포 어레이가 제조(1), 세포 파종 및 마이크로패턴(2)에 세포의 정렬뿐만 아니라 6채널 슬라이드에 관류 시스템의 연결, 이는 시간 경과 측정(3) 동안 액체 처리를 가능하게 한다. 스캐닝 타임랩스 실험이 설정되고(4) 세포는 시간 경과 실험(5) 동안 관류 시스템을 통해 mRNA 리포플렉스 용액을 주입하여 현미경에 전염된다. 스케일 바: 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
1. 미세 구조화 된 단세포 배열 제작(그림 2A)
- μPIPP 어레이 제작에 필요한 재료를 준비합니다.
- 멸균 인산염 완충식식염(PBS)을 pH 7.4에서 준비한다.
- 25°C에서 최소 18MΩcm의 저항력으로 멸균 초순수수를 준비한다.
- PLL(20kDa)-g[3.5] PEG(2kDa) (PLL-PEG) 작업 용액은 150mM NaCl 및 10mM 4-(2-하이드록세틸)-1-1-피프라진(HE산)을 함유한 초순수수에 PLL-PEG 의 2mg/mL 농도를 갖는다.
- 표면 코팅을 위한 세포외 매트릭스 단백질 용액을 준비하십시오: PBS에 있는 1 mg/mL 섬유네틴 (FN) .
- 재사용 가능한 마스터로 작동하는 포토리소그래피8에 의해 제작된 마이크로패턴으로 실리콘 웨이퍼를 준비합니다. 마이크로패턴은 가장자리 길이 30μm, 깊이 12μm, 60 μm의 사각 거리, 6개의 줄무늬로 배열된 사각형으로 구성되어 있으며, 각각 6mm, 높이는 18mm입니다.
- 폴리디메틸실록산(PDMS) 단조머를 9% 크로스링커(질량%)와 혼합합니다. 실리콘 엘라스토머 키트를 사용하여 건조기를 사용하여 거품이 없는 때까지 약 30분 동안 탈가스를 드립니다. 실리콘 웨이퍼를 약 3-5mm 두께의 PDMS 층으로 캐스팅하고 거품이 없는 때까지 약 30분 동안 다시 데가스를 드립니다.
- 50°C의 베이킹 오븐에 PDMS를 장착한 실리콘 웨이퍼를 50°C에서 넣어 PDMS를 최소 4시간 동안 치료한다.
- PDMS 스탬프를 잘라.
- 메스를 사용하고 6 개의 마이크로 패턴 줄무늬가 들어있는 PDMS 걸작 1 개의 PDMS 층에서 잘라냅니다.
- 마이크 패턴이 위쪽으로 향하는 벤치에 PDMS 걸작을 놓습니다.
- PDMS 걸작의 6개의 마이크로패턴 스트라이프를 각각 면도날로 PDMS 스탬프로 잘라냅니다. 패턴 영역의 일부를 차단하여 PDMS 스탬프의 가장자리가 열려 있는지 주의하십시오.
- 6채널슬라이드(그림3-1)의커버슬립에 PDMS 스탬프를 놓습니다.
- 코팅되지 않은 커버슬립을 사용하고 커버슬립의 보호 포일을 조심스럽게 긁어6채널 슬라이드의 채널 위치를 표시합니다. 그런 다음 보호 호일을 아래쪽으로 향하여 벤치에 커버슬립을 놓습니다.
- 핀셋을 사용하여 표시된 채널 위치에 표지 슬립에 아래쪽으로 향하는 마이크로 패턴이 있는 PDMS 스탬프를 배치합니다.
- 현미경으로 PDMS 스탬프의 부착을 확인합니다. PDMS 스탬프가 커버슬립에 완전히 부착된 경우 접촉하는 사각형이 인터스페이스보다 어둡게 나타납니다. 커버슬립에 PDMS 스탬프를 부착하는 것은 마이크로패턴 품질에 매우 중요합니다.
- 6개의 PDMS 스탬프를 플라즈마 클리너에 넣고 산소 플라즈마(압력 0.2mbar, ~40 W~3분 동안~40W)로 처리하여 PDMS 우표와 커버슬립 친수성(그림3-2)을만듭니다.
- 생물 안전 캐비닛에서 마이크로 패턴 제조의 모든 추가 단계를 수행합니다. PLL-PEG 용액의 15 μL을 사용하고 PLL-PEG 용액이 PDMS 스탬프의 친수성 패턴으로 흡수되도록 각 PDMS 스탬프 옆에 1방울을 사용하십시오(그림3-3). 실온에서 20분 동안 PLL-PEG 인큐베이션을 허용하십시오.
- PDMS 스탬프를 사용하여 커버슬립 위에 초순수 1mL을 헹구고 핀셋(그림3-4)을사용하여 PDMS 우표를 제거합니다. 그런 다음 뚜껑을 초순수 1mL로 두 번째로 헹구고 건조시키십시오.
- 커버슬립이 완전히 건조되면 6채널 스티커 슬라이드를 커버슬립(그림3-4)에붙입니다. 마이크로 패턴 영역이 채널의 바닥과 정렬되는 것을 주의하십시오.
- FN을 통해 접착 사각형을 기능화합니다.
- PBS의 40 μL을 각 채널에 채웁니다.
- PBS에서 100 μg/mL FN 솔루션을 준비합니다.
- 각 채널에 FN 용액의 40 μL을 추가합니다(그림3-5). FN 용액을 한 저장소에서 40 μL을 제거하고 동일한 채널의 반대 저장소에 추가하여 채널내 PBS와 완전히 혼합하여 동질적인 용액을 생성합니다. 실온에서 45분 동안 FN 용액을 배양합니다.
- PBS의 120 μL로 각 채널을 세 번 세척합니다(그림3-6).
- 패턴 품질을 확인하려면 9.2 단계에서 형광으로 표시된 FN을 사용하십시오. (그림4A).
참고: PLL-PEG 및 FN이 기판에 동갈이 되어 있지 않고 시간이 지남에 따라 패턴의 품질이 저하될 수 있으므로 세포 파종 하루 전에 μPIPP 어레이를 준비하는 것이 좋습니다. 준비된 μPIPP 어레이를 냉장고에 보관합니다.
도 3: μPIPP에 의한 단세포 마이크로어레이 제작. (1) 표면에 3차원 마이크로패턴 구조를 가진 PDMS 우표는 6채널 슬라이드의 커버슬립에 배치된다. (2) PDMS 우표가 있는 커버슬립은 표면을 친성화시키기 위해 산소 플라즈마로 처리된다. (3) PLL-PEG가 추가됩니다. 모세관 력에 의해 미세 구조로 흡수되고 표면을 PDMS 우표 세포 구충제에 의해 커버되지 않습니다. (4) 커버슬립은 남은 PLL-PEG를 제거하기 위해 물로 헹구었다. 그런 다음 PDMS 스탬프가 제거되고 6 채널 끈적 끈적한 슬라이드가 커버 슬립에 붙어 있습니다. (5) 세포외 매트릭스의 단백질인 섬유네틴이 첨가되어 PLL-PEG 세포 접착제가 없는 부위를 만듭니다. (6) 6채널 슬라이드는 인산염 완충식식염으로 세척된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 셀 파종(그림 2A)
참고: 다음 세척 단계의 경우 각 액체를 하나의 저장소에 추가한 다음 채널의 반대 저장소에서 동일한 양의 액체를 제거합니다.
- 37°C의 120 μL로 각 채널을 세척하여 완전히 보충된 세포 성장 배지를 세척합니다. 셀 서스펜션을 추가하기 전에 채널만 중간 크기로 채워지지만 저장소가 아닌지 확인합니다.
- 세포 패혈을 위한 표준 프로토콜에 따라 세포 배양 플라스크에서 HuH7 세포를 분리하고 세포 현탁액 농도를 4 x 105 세포/mL로 조정합니다.
- 세포 현탁액의 40 μL을 추가하고 한 저수지에서 40 μL을 제거하고 동질 세포분포(도 4B)에도달하기 위해 동일한 채널의 반대 저장소에 추가하여 세포 현탁액과 세포 성장 배지를 혼합한다.
- 채널만 셀 서스펜션으로 채워지되도록 채널에서 40 μL의 서스펜션을 제거합니다.
- 단계 대비 현미경을 사용하여 시드 후 인큐베이터에 슬라이드를 넣고 세포 접착 1h를 확인합니다.
- 37°C의 따뜻한 세포 성장 배지의 120 μL을 추가합니다.
- 그러나 마이크로패턴(도4C)에세포 자체 조직을 가능하게 하기 위해 3h를 더 위한 인큐베이터내슬라이드.
도 4: μPIPP 어레이의 세포 자체 조직 및 품질 관리. (A)미세 구조화 표면은 세포 구충제 폴리머에 둘러싸인 적색으로 표시된 제곱 FN 코팅 접착 반점으로 구성된다. (B)세포 파종 후, HuH7 세포는 무작위로 분포되고(C)는4h의 기간 동안 주로 접착 반점에 부착된다. 권한 7으로다시 인쇄 . 스케일 바: 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 관류 시스템(그림 2A)
참고: 타임랩스 측정 과정에서 시약 또는 형광 마커를 추가해야 하는 경우에만 계류 시스템의 사용이 필요합니다. 필요에 따라 각 채널을 별도의 관류 시스템에 연결하거나 여러 채널을 동일한 관류 시스템에 연결할 수 있습니다. 관류 시스템의 수는 독립적인 실험 조건의 수에 해당합니다. 생물 안전 캐비닛의 멸균 조건하에서 튜브를 연결하고 관류 시스템에 기포가 포함되는 것을 피하십시오. 관류 시스템이 사용되지 않으면 시간 경과 측정 전에 생체 안전 캐비닛에 시약/마커를 추가합니다. 관류 시스템은 사내에서 제작되고, 사용된 재료는 재료의 표에나열됩니다. 관류 시스템의 어셈블리는 이전에 설명되었다9.
- 1 mL 주사기를 사용하여 (대체 sporn) 37 °C 세포 성장 배지의 1 mL로 주사기를 채웁니다.
- 밸브를 사용하여 주사기를 입구 튜브에 연결하고 튜브를 매체로 채웁니다.
- 입구 튜브를 채널의 저장소에 연결하고 기포가 갇혀 있지 않은지 확인합니다.
- 이 관류 시스템에 일련의 다른 채널을 연결하려면 직렬 커넥터를 현재 채널의 입구 튜브 반대의 저장소에 연결합니다. 다음 채널로 이동하여 직렬 커넥터의 자유 끝을 저장소 중 하나에 연결합니다.
- 필요한 수의 채널이 연이어 연결될 때까지 이전 단계를 반복합니다.
- 콘센트 튜브를 현재 채널의 프리 저장소에 직접 연결합니다. 관류 시스템이 누출되지 않는지 확인하기 위해 연결된 튜브를 매체로 채웁니다.
- 슬라이드의 6개 채널이 모두 관류 시스템에 연결될 때까지 이전 단계를 반복합니다.
- 추가 사용이 가능한 범위의 가열 챔버에 직접 배치하거나 시간 경과 측정을 위해 37°C로 미리 데운 현미경의 가열 챔버에 직접 배치할 때까지 커넥티드 관류 시스템(들)을 다시 인큐베이터에 배치합니다.
4. 시간 경과 현미경 검사법(그림 2B)
참고: 장기 측정의 경우 안정적인 온도인 37°C와 안정적인 CO2 레벨을 유지합니다. CO2-종속세포 성장 매체의 대안으로, 가스 인큐베이션 시스템이 필요하지 않은 L15 배지를 사용합니다.
참고: 정량적 이미징의 경우 타임랩스 측정 중에 페놀 레드가 없는 세포 성장 배지를 사용하여 배경 형광을 줄이고 기술 복제를 위해 동일한 시간 경과 프로토콜의 동일한 설정과 동일한 현미경을 사용합니다.
- 위상 대비 영상과 750ms(카메라에 따라 다름) 노출 시간, 위치 목록을 통한 연속 루프 사이의 10분 시간 간격 및 30h의 관측 시간을 10배 의 목표및 적절한 형광 필터를 사용하여 기록하기 위한 타임랩스 프로토콜을 설정합니다.
- 37°C 따뜻한 가열 챔버의 샘플 홀더에 단일 셀 어레이에 셀과 함께 6 채널 슬라이드를 놓습니다. 관류 시스템이 6채널 슬라이드에 연결되어 있는 경우 일부 테이프를 사용하여 튜브를 스테이지로 고정하여 액체 교환 중에 6채널 슬라이드가 이동되지 않도록 합니다. 15mL 반응 튜브의 구멍을 통해 출구 튜브의 자유 끝을 삽입하여 액체 폐기물을 수거합니다.
- 스캔 시간 경과 측정의 위치 목록을 설정합니다. 위치 목록을 통해 연속 루프 사이의 정의된 시간 간격 내에서 위치 수를 스캔할 수 있는지 확인합니다. 10배 의 목표를 통해 채널당 10-30개의 위치를 설정하여 카메라 칩 크기에 따라 총 마이크로패턴 영역을 스캔할 수 있습니다.
- 시간 경과 측정을 시작합니다. 장기 측정의 이미지 품질을 높이기 위해 자동화된 초점 보정 시스템을 사용하십시오.
5. 형광 마커 - mRNA 경질(도 2B)
참고: 튜브 시스템으로 연결된 두 채널의 전환의 경우 총 600μL 형질 전환 믹스가 필요합니다(한 채널의 경우 300 μL). 표시된 볼륨은 연결된 두 채널의 형질 전환을 나타냅니다.
- 혈청 감소 배지의 200 μL에 1 μL의 형질 전환제를 희석하고 실온에서 5 분 동안 용액을 인큐베이션하도록하여 경피제 용액용액을 준비합니다.
- 혈청 감소 배지의 150 μL에서 eGFP를 위한 mRNA 인코딩 의 300 ng를 희석하여 mRNA 용액을 준비한다.
- mRNA 용액에 150 μL의 형질응고액을 추가하여 투명 혼합물을 준비하고 잘 혼합한다. 실온에서 20분 동안 배양하여 트랜스페션 믹스를 합시다.
- 배양 믹스의 인큐베이션 시 주사기를 사용하여 37°C의 따뜻한 PBS1mL로 튜브 시스템을 플러시한다. 튜브를 플러시 할 때 현미경 단계가 움직이지 않도록하십시오. 필요한 경우 시간 경과 측정을 일시 중지합니다.
- 300 μL 혈청 감소 배지를 추가하여 0.5 ng/μL의 최종 mRNA 농도로 전환 믹스를 희석시.
- 주사기를 사용하여 배혈 믹스로 튜브 시스템을 플러시하고 mRNA 리포플렉스가 1h에 대한 배양하도록 하십시오(필요한 경우 시간 경과 측정을 일시 중지).
- 배양을 중지하고 37°C의 1mL로 세척하여 불바운드 mRNA 리포플렉스를 주사기를 사용하여 완전히 보충된 세포 성장 배지를 세척하여 씻어내십시오(필요한 경우 시간 경과 측정을 일시 중지).
6. 이미지 분석 및 형광 판독
- 처음으로 이미지 분석을 실행하는 경우, 제공된 지침에 따라 인용된위치(10)에서 오픈 소스 소프트웨어 "파이썬의 자동화된 미세 구조 분석"(PyAMA)의 버전 0.1.6을 설치한다.
- 이미지 채널(위상 대비 및 형광)을 다중 이미지 16비트 TIFF 파일로 사용할 수 있는지 확인합니다. 필요한 경우 그에 따라 변환합니다.
- PyAMA를 시작하고 열기 스택을 클릭하여 분석을 위해 이미지를 엽니다.
- 각 다중 이미지 TIFF 파일이 열리려면 열기를 클릭하고 파일이 대화 상자의 왼쪽에 로드된 파일 목록에 표시되도록 선택합니다(그림5-1).
- 분석에 포함할 채널을 표시합니다. 각 채널에 대해 다음 단계를 수행합니다.
- 로드된 파일 목록에서 채널을 포함하는 TIFF 파일을 선택합니다.
- 섹션에서 새 채널 추가를TIFF 파일에서 채널 의 인덱스를 선택합니다. 인덱싱은 0기반입니다. 첫 번째 채널에는 인덱스 0이 있고 두 번째 채널에는 인덱스 1 등이 있습니다.
- 채널 유형을 선택합니다. 셀 윤곽을 나타내는 이진 채널에 대해 해당 이미지 채널 및 세분화에 대해 위상 대비 또는 형광을 선택합니다.
- 선택적으로 eGFP 및 DAPI라는 다양한 형광 채널을 구별하기 위해 채널의 레이블을 입력합니다.
- 채널을 구성한 후 를 클릭합니다.
- 추가된 모든 채널이 대화 상자의 오른쪽에 있는 채널 목록에 표시되면 확인을 클릭하여 스택을 로드합니다.
- 위상 대비이미지(그림5-2)를기반으로 세포 인식을 위한 PyAMA의 기본 제공 세분화 알고리즘을 사용하여 세분화를 수행하려면 도구 | 바이아리즈... 비너리채널이 있는 NumPy 파일의 파일 이름을 입력합니다.
참고: 현재 버전에서는 비나화된 채널을 로드하려면 모든 채널을 다시 로드해야 합니다. - 형광채널(도 5-3)에서배경보정(11)을 수행하려면 형광 채널및 세분화 채널이 로드되었는지 확인합니다. 세분화 채널이 로드되지 않으면 자동 세분화를 위해 위상 대비 채널이 로드되었는지 확인합니다. "도구 > 배경 수정..."으로 이동합니다. 수정된 형광 채널이 있는 결과 TIFF 파일에 대한 파일 이름을 선택합니다.
참고: 현재 버전에서는 백그라운드에서 수정된 채널을 로드하려면 모든 채널을 다시 로드해야 합니다. - 미리 선택된셀(도5-4)과통합형형광신호(도5-5)를검사하여 시간프레임을 스크롤하고, 왼쪽채널 메뉴에 나열된 채널을 보고, 세포를 클릭하여 형광 시간 과정(도1C)을강조한다. 세포 선택을 사용하여 사용 가능하지 않은 세포를 제외하거나 접착 지점에 국한되지 않거나 추가 분석에서 다른 셀에 부착되지 않습니다. 시프트를 누르고 셀을 클릭하거나 셀을 강조 표시하고 Enter를 눌러 판독을 위해 셀 선택을 전환합니다.
- 파일을 클릭하여 세포 영역 및 통합 형광(도5-6)에대한 단일 셀 타임 코스를 저장| 저장하고 저장할 디렉토리를 선택합니다.
그림 5: PyAMA를 사용하여 타임랩스 이미지 시리즈의 자동 이미지 처리. (1) 각 이미징 위치에 대한 위상 대비 및 형광 이미지 계열이 수입된다. (2) 셀 윤곽선은 위상 대비 이미지 스택의 세분화에 의해 결정됩니다. (3) 형광 이미지에 배경 보정이 적용됩니다. (4) 셀 윤곽선은 시간이 지남에 따라 추적되고 내보내기를 위해 미리 선택됩니다. (5) 형광 강도는 추적된 세포 윤곽을 기반으로 통합된다. (6) 단일 세포 영역 및 통합 형광 강도가 평가되고 각 셀에 대한 시간 과정이 내수출된다. 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- mRNA 경질 후 번역 역학을 분석하려면, Reiser 외12에의해 이전에 설명된 바와 같이 각 단일 세포 시간 과정에 생화학 적 속도 방정식을 기반으로 번역 모델을 맞춥시다. 해당 스터디에 사용된 데이터와 코드는 공개적으로 사용할 수 있습니다13.
- 각 단일 셀 시간 과정에 대해 mRNA 분해 속도와 번역 개시 시점을 나타내는 번역 모델의 예상 피팅 매개 변수를 검색합니다. 대표적인 결과 섹션에서 예제 데이터 집합에 대해 설명합니다.
- 세포 집단 내의 세포 대 세포 가변성을 조사하기 위해 다양한 실험 조건에 대한 매개 변수의 최상의 추정 분포에 대한 추가 분석을 수행합니다.
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Representative Results
LISCA 접근 은 단일 세포에서 형광 시간 과정을 효율적으로 수집 할 수 있습니다. 대표적인 예로, LISCA 메서드가 트랜스펙트 후 단일 셀 eGFP 식을 측정하기 위해 어떻게 적용되는지 설명합니다. LISCA 실험의 데이터는 효율적인 mRNA 약물의 발달에 중요한 mRNA 전달 운동학을 평가하기 위해 사용됩니다.
특히 우리는 단일 세포 수준에서 번역 개시 및 발현 속도에 대하여 2개의 지질 계 mRNA 전달 시스템의 상이한 충격을 보여줍니다. 우리는 세포를 배양하고 배치를 두 집단으로 나누었습니다. 하나의 하위 인구는 프로토콜 섹션에 설명된 바와 같이 lipoplexes로 전감염되었다. 다른 하위 인구는 동일한 최종 mRNA 농도를 가진 동일한 mRNA를 사용하여 전염되었지만, 지질 나노입자(LNP)를 전달 시스템으로, 미세유체혼합(12)을사용하여 생산되었다. lipoplexes 및 LNPs의 mRNA 전달 시스템의 다른 지질 조성 및 상이한 제조로 인해 우리는 uptake 운동학이 영향을 받아야하기 때문에 번역 운동학에 영향을 미칠 것으로 기대합니다. LISCA 방법을 사용하여 우리는 트랜스페션 후 번역 개시의 시간 점 t0을 정량화하고 세포가 eGFP를 발현하는 방법, 이는 전염된 mRNA 분자 m0 및 번역 속도 kTL의제품에 의존한다. 이 두 매개 변수를 얻으려면 그림 6A에스케치된 대로 3단계 번역 모델에 적합합니다. 시토솔에서 mRNA 분자 m의 성공적인 방출 후 시토솔에서 t0, mRNA는 비형광인 미혼 eGFP G*로속도 kTL로 변환된다. 미혼 G*는속도 k M에서 eGFP G까지성숙하며, 이는 시간 경과 측정 중에 측정되는 형광 강도입니다. mRNA뿐만 아니라 (매트화 및 maturated) eGFP는 각각의 저하 속도와 함께 시간이 지남에 따라 저하 δ 및 γ. 이 모델은 일반 차동 방정식에 의해 설명되고 G용 분석 솔루션은 파라미터 추정을 위한 모델 함수로 사용된다. 모델 함수는 그림 6B에 도시된 바와 같이 각 단일 셀 시간 코스에 예시 시간 과정(회색) 및 각각의 적합성(녹색)을 입력합니다. 도 6C에서 우리는 리포플렉스 전멸 세포의 번역 개시 및 발현 속도 m0kTL의 시간점 t0의 히스토그램을 나타낸다. 두 매개 변수가 각 세포에 대해 추정되기 때문에, 이러한 파라미터의 상관관계는 산란플롯(도6D,청색 데이터)에 도시된 바와 같이 분석될 수 있으며, LP(red)로 전염되는 세포와 비교할 수 있다. 도 6D에도시된 바와 같이, LP와 함께 감염된 세포는 lipoplexes와 전염되는 세포에 비해 세포 간 가변성이 적고 인구 평균은 더 빠른 발현 속도(검은 윤곽을 가진 두꺼운 점)뿐만 아니라 번역의 빠른 발병을 나타낸다.
이 두 데이터 세트는 LISCA가 mRNA 전환 후 번역을 학습하는 데 사용할 수 있는 한 가지 예에 불과합니다. 추가 조사는 예를 들어 mRNA 서열 수정에 의존하는 mRNA 안정성(14,다양한 기자 단백질 성능력(15)또는 siRNA 매개 mRNA 분해(16)에관한 것으로 이루어질 수 있다.
도 6: 단일 세포 eGFP 번역 역학의 데이터 분석. (A)mRNA 전달 후 기자 단백질 eGFP의 번역 역학은 각각의 매개 변수를 가진 3단계 반응 속도 방정식에 의해 설명될 수 있다. (B)모델은 각 단일 셀 eGFP 발현 타임 코스(gray traces)에 장착되어 경질 개시 및 발현 속도(m0kTL)의시점(t0)과같은 모델 파라미터를 추정하고, mRNA 전달 효능을 정량화하는 두 가지 파라미터. (C)형질 전환 개시 시간 및 발현 속도에 대한 파라미터 분포의 히스토그램. (D)매개 변수가 각 셀에 대해 추정되기 때문에 이러한 매개 변수의 분산 플롯은 매개 변수 상관 관계를 나타낸다. 작은 점은 단일 셀의 매개 변수를 나타냅니다. 플롯은 mRNA LP (빨강) 및 mRNA lipoplexes (파란색)로 전염된 세포를 보여줍니다. 검은 윤곽선이 있는 두꺼운 점은 각 인구 평균에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서 우리는 LISCA를 단세포 수준에서 세포내 형광 라벨의 세포 역학을 따르는 다목적 기술로 기술했습니다. 성공적인 LISCA 실험을 수행하려면 프로토콜 섹션의 각 설명된 단계를 개별적으로 수립해야 하며 모든 단계를 결합해야 합니다. LISCA의 세 가지 주요 측면은 각각 중요한 단계를 특징으로합니다.
단세포 마이크로어레이 제작
마이크로어레이의 셀룰러 정렬은 모든 추가 실험 단계에 중요할 뿐만 아니라 데이터 품질에도 영향을 미치기 때문에 마이크로어레이의 품질이 중요합니다. 이러한 이유로 패턴 및 제조 방법의 형상은 사용된 셀에 대해 조정되어야 합니다. 본 문서에서 논의된 대표적인 결과는 (30 μm) 2제곱패턴에 정렬된 간 암종 세포주 HuH7로 생성되었다. 이 패턴 지오메트리는 A549 또는 HEK293과 같은 다른 세포주에도 적합합니다. BEAS-2B와 같은 더 큰 셀의 경우 35 μm 가장자리 길이와 80 μm의 사각 거리와 더 큰 사각형 패턴을 사용할 수 있습니다. 설명된 파종 절차는 HuH7 세포에 최적화되어 있지만 다른 많은 부착셀(17)에적응할 수 있다. 예를 들면, 몇몇 세포주는 접착 반점의 다른 크기를 필요로 하거나 길쭉한 세포를 통해 세포 접촉을 피하기 위하여 접착 반점 사이 더 큰 간격이 필요합니다.
미세입자는 접착 부위가 표준 배양 접시에서 세포의 평균 면적을 대략 충족시키는 방식으로 조정되어야 한다. 형상은 둥글거나 제곱할 수 있으며 셀 생존가능성의 측정 가능한 효과가 없습니다. 세포 운동은 세포가 회전하는 것을 수시로 볼 수 있는 둥근 패턴에 비해 제곱된 패턴에 더 제한되는 것처럼 보입니다. 새로운 세포주를 처음 사용할 때 별도의 생존 성 테스트를 권장합니다. 파종 밀도는 접착 반점의 높은 점유에 도달하고 동시에 접착 반점의 이중 점유율을 최소화하기 위해 특정 세포주를 조정해야합니다. 전형적으로, 접착 부위당 셀 수의 결과 점유율은 푸아송 통계를 따르며 0, 하나 또는 두 개 중 하나입니다. 따라서 총 점유율은 60 %에서 80 %로 이중 점유율17을피하기 위해 목표로해야합니다. 시드 프로토콜은 시드 셀의 수와 시드 와 첫 번째 세척 단계 사이의 시간 기간에 대해 적응해야 할 수 있습니다. 예를 들어, 1시간 대신 시드 후 30분(프로토콜 섹션 2 세포 파종의 단계 5 및 6단계 참조)은 이중 점유 접착 반점의 수를 감소시키지만 HuH7 세포에 대한 점유 접착 지점의 총 수를 낮출 것이다.
튜브 시스템의 채널 슬라이드 연결은 필수가 아니기 때문에 튜브 시스템을 사용하지 않고 시약 또는 형광 마커의 사용을 확립하는 것이 가장 적합한 농도 및 배양 시간을 확인하는 것이 더 쉽습니다. 관심있는 시약 / 마커에 적합한 프로토콜이 설정된 후 튜빙 시스템을 워크플로우에 포함 시킬 수 있습니다.
시간 경과 현미경 검사법
또 다른 중요한 단계는 시간 경과 측정의 설정입니다. 예를 들어, 형광 마커에 대한 노출 시간은 형광및 광독성 효과의 광표백을 피하기 위해 신중하게 선택되어야하지만 여전히 좋은 형광 신호를 보장해야합니다. 시간 경과 설정의 또 다른 중요한 매개 변수는 관찰된 세포 역학에 크게 의존하는 공간 및 측두해상도의 가장 적합한 조합입니다. 높은 시간적 분해능이 필요한 경우 마이크로어레이의 위치 수가 적은 두 시간 지점 사이에서만 스캔하여 스캔된 관찰 영역을 감소시키고 통계도 줄어듭니다. 관측 영역은 스캔된 위치의 수뿐만 아니라 카메라의 한 시야의 목표와 크기에도 따라 달라집니다. 주어진 예에서 10분의 시간 해상도는 10배 의 목표를 사용하여 번역 역학을 관찰하기에 충분합니다. 이러한 조합을 통해 카메라 칩의 크기, 현미경 단계의 속도 및 이미징 채널 의 수(예: 위상 대비 및 eGFP 형광)에 따라 시간당 70-100 개의 위치를 스캔할 수 있습니다.
이미지 처리
세포가 어레이에 위치함에 따라 셀당 총 형광의 분석이 촉진된다. 그러나, 단일 세포 형광 시간 과정의 품질, 특히 신호 대 잡음 비율 (SNR)은 이미지 시리즈에서 세포 형광 강도의 통합에 사용되는 알고리즘에 따라 달라집니다. 소프트웨어 도구 PyAMA의 이미지 처리 단계는 그림 5에표시됩니다. 살아있는 세포의 세포 윤곽이 시간에 따라 다르기 때문에 단세포 형광 판독값에 대한 통합 영역의 결정은 특히 중요합니다. PyAMA는 내장 된 세분화 알고리즘에 의해 결정 될 수있는 세포 윤곽을 통해 형광 강도를 통합합니다. 대안은 마이크로패턴형상(12,16)을기반으로 고정된 경계 위에 통합하는 것입니다. PyAMA의 현재 버전은 위상 대비 이미지 채널의 픽셀 영역의 표준 편차에 대한 임계값을 기반으로 이미지 세분화를 수행합니다. 세분화 결과 뿐만 아니라 외부 소프트웨어에서 가져올 수 있습니다. 향후 버전의 경우 기계 학습및 고정 경계에 대한 통합을 기반으로 세분화에 대한 기본 지원이 계획되어 있습니다.
PyAMA는 형광 영상뿐만 아니라 선택된 세포의 형광 시간과정(도 1C)을육안검사할 수 있는 인터페이스를 사용하여 이상치 세포 또는 비정상적인 시간 과정을 필터링할 것을 제공한다. 분석에서 제외될 수 있는 세포의 예는 분할 또는 세포멸증을 겪거나 접착 부위 외부에 있는 세포입니다. 추적 알고리즘에서 단일 셀로 잘못 인식되는 여러 셀의 집계도 시간 과정이 단일 셀에서 시작되도록 필터링해야 합니다. PyAMA는 비정상적인 세포를 필터링하는 데 필요한 수동 상호 작용의 양을 줄이기 위해 셀의 사전 선택을 수행합니다. 사전 선택은 사전 선택의 부정확성을 보상하기 위해 선택한 셀의 시간 과정을 내보내기 전에 손으로 검사하고 수정할 수 있습니다. PyAMA의 현재 버전의 사전 선택은 셀 집계를 선택 해제하는 셀 크기에 대한 임계값을 기반으로 합니다. 향후 버전의 경우, 위에서 설명한 비정상적인 셀에 대한 예제를 포함하여 추가 기준을 고려할 수 있는 추가 기계 학습 기반 사전 선택이 계획되어 있습니다.
요약하면 LISCA 접근 방식은 단일 셀 어레이를 사용하여 단일 세포 형광 시간 과정을 효율적으로 수집합니다. 세포를 미세 가공 된 접착 부위에 국한하면 추적 및 이미지 분석이 용이합니다. 더욱이, 세포는 표준화된 국소 마이크로환경에서 배양되고, 따라서, 트랜스페션을 위한 지질 나노입자 같이 에이전트에 드러나면 균일한 표면적을 제시한다. 이 양상은 인구 내의 세포 이질성을 조사할 때 특히 유익합니다. 여기에 설명된 μPIPP 기술은 단백질 패턴의 정규 마이크로어레이귀착되는 많은 미세 제조 기술 중 하나입니다. 독자는 마이크로 접촉 인쇄, 포토 리소그래피 접근 및 소프트 리소그래피를 대체 제조 공정6으로검토하는 문헌을 지칭한다. 세포주에 따라, 하나 또는 다른 패터닝 기술이 바람직할 수 있다. 우리의 실험에서, μPIPP 기술은 세포자가 정렬때문에 세포의 파종 후에 잘 배치된 세포를 보여주었습니다, 세포가 임의의 이주에서 검색하고 분화로 더 큰 접착제를 가진 단백질 표적 어레이에 퍼질 수 있도록 PEGylated 지역에 잔류 세포 접착제에 의존하는17.
LISCA는 임의형 광질 마커의 많은 수의 단일 세포 시간 과정을 취득할 수 있게 합니다. 단일 세포 수준에서 형광 신호의 분석, 대량 실험과는 대조적으로, 깨끗한 단세포 시간 과정을 산출하고 세포 대 세포 가변성을 밝혀. 세포 이질성은 세포 운명 결정에서 탁월한 역할을 한다18,19,20. 이러한 맥락에서, 우리는 최근에 세포 사멸 신호캐스케이드(19)내에서 특정 단계를 나타내는 한 번에 두 개의 세포 이벤트의 시간적 상관관계를 분석할 수 있도록 두 개의 형광 채널을 사용하여 LISCA 접근법을 확장했다. 이 연구 분야에서 LISCA는 세포 측정 을 유동하는 대안으로 제시합니다. 흐름 세포 측정은 부인할 수 없이 더 빠른 워크플로우를 제공하고 일반적으로 더 큰 통계를 산출하지만 데이터는 특정 시점에 획득됩니다. 풀 타임 종속성은 운동 매개 변수의 추정을 산출하고 그렇지 않으면 액세스하기 어려운 다른 형광 신호 사이의 시간적 상관 관계를 드러냅니다. 여러 형광 채널을 사용하려면 자동 필터 휠 또는 여러 카메라가 필요합니다. 이 경우 단세포 FRET 분석은 가능해야 하며 형광으로 표지된 분자 간의 근접성의 시간 해결 연구를 가능하게 해야 합니다. LISCA와 같은 이미지 기반 분석의 한 가지 단점은 시각적 컨트롤 및 이상값 감지와 연결된 노동입니다. 여기서 기계 학습 도구는 데이터 처리를 용이하게하고 완전히 자동화 된 데이터 분석을 허용할 수 있습니다. 미래에는 자동화된 현미경 플랫폼, 신속한 어레이 미세 제조 및 인공 지능을 사용하여 LISCA의 처리량과 적용 가능성이 크게 증가할 수 있습니다. 더욱이, 미세유체 추출(21)과단세포 유전체학을 이용한 비정상적인 형광 반응을 나타내는 세포의 후속 분석은 제약 산업에서 빈번한 요구 사항이다. 이 문서에 제시된 프로토콜은 단세포 해상도및 적당한 통계로 세포 프로세스의 운동학을 공부하기 위한 수요에 적합합니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 독일 과학 재단 (DFG)에서 공동 연구 센터 (SFB) 1032에 보조금에 의해 지원되었다. 독일 연방 교육기술부(BMBF)의 협력 프로젝트 05K2018-06716 메디소프와 바이에리슈 포르스스티퉁의 보조금에 감사하게 인정받고 있다. 아니타 라이저는 정량적 생물 과학 뮌헨 (QBM)의 대학원을 통해 DFG 펠로우십에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adtech Polymer Engineering PTFE Microtubing | Fisher Scientific | 10178071 | |
| baking oven | Binder | 9010-0190 | |
| CFI Plan Fluor DL 10x | Nikon | MRH20100 | |
| Desiccator | Roth | NX07.1 | |
| Eclipse Ti-E | Nikon | ||
| eGFP mRNA | Trilink | L-7601 | |
| Female Luer to Tube Connector | MEDNET | FTL210-6005 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Fibronectin | Yo Proteins | 663 | |
| Filter set eGFP | AHF | F46-002 | |
| Fisherbrand Translucent Platinum-Cured Silicone Tubing | Fisher Scientific | 11768088 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Incubation Box | Okolab | OKO-H201 | |
| incubator | Binder | 9040-0012 | |
| L-15 without phenol red | Thermo Fisher | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668027 | |
| Male Luer | in-house fabricated consisting of teflon | ||
| Male Luer to Tube Connector | MEDNET | MTLS210-6005 | alternative to in-house fabricated male luers |
| NaCl (5 M) | Thermo Fisher | AM9760G | |
| Needleless Valve to Male Luer Connector | MEDNET | NVFMLLPC | |
| NIS Elements | Nikon | Imaging software Version 5.02.00 | |
| NOA81 | Thorlabs | NOA81 | Fast Curing Optical Adhesive for tube system assembly |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| PCO edge 4.2 M-USB-HQ-PCO | pco | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | in-house prepared | ||
| Plasma Cleaner | Diener Femto | Pico-BRS | |
| PLL(20 kDa)-g[3.5]-PEG(2 kDa) | SuSoS AG | ||
| silicon wafer mit mircorstructures | in-house fabricated | ||
| Sola Light Engine | Lumencor | ||
| sticky slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 1673921 | |
| Tango 2 | Märzhäuser | 00-24-626-0000 | |
| Ultrapure water | in-house prepared | ||
| uncoated coverslips | ibidi | 10813 | |
| Injekt-F Solo, 1 mL | Omilab | 9166017V | with replacement sporn |
References
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