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Biology

Imagerie à cellules vivantes de réseaux unicellulaires (LISCA) - une technique polyvalente pour quantifier la cinétique cellulaire

doi: 10.3791/62025 Published: March 18, 2021

Summary

Nous présentons une méthode pour l’acquisition des cours de temps de rapporteur de fluorescence à partir de cellules simples utilisant des réseaux micropatterned. Le protocole décrit la préparation de réseaux unicellulaires, la mise en place et le fonctionnement de la microscopie time-lapse à balayage de cellules vivantes et un outil d’analyse d’image open source pour la présélection automatisée, le contrôle visuel et le suivi des cours de temps de fluorescence intégrés aux cellules par site d’adhésion.

Abstract

L’imagerie par cellules vivantes de réseaux unicellulaires (LISCA) est une méthode polyvalente pour collecter des cours temporels de signaux de fluorescence à partir de cellules individuelles à haut débit. En général, l’acquisition de cours de temps unicellulaires à partir de cellules cultivées est entravée par la motilité cellulaire et la diversité des formes cellulaires. Les microréseaux adhésifs standardisent les conditions unicellulaires et facilitent l’analyse d’images. LISCA combine des puces à ADN unicellulaires avec une microscopie time-lapse à balayage et un traitement d’image automatisé. Ici, nous décrivons les étapes expérimentales de la prise de cours de temps de fluorescence unicellulaire dans un format LISCA. Nous transfectons les cellules adhérentes à un réseau micropatterned utilisant le codage d’ARNm pour la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) et surveillons la cinétique d’expression eGFP de centaines de cellules en parallèle via la microscopie time-lapse de balayage. Les piles de données d’image sont automatiquement traitées par un logiciel nouvellement développé qui intègre l’intensité de fluorescence sur les contours cellulaires sélectionnés pour générer des cours de temps de fluorescence unicellulaires. Nous démontrons que les cours de temps d’expression d’eGFP après transfection d’ADN messagère sont bien décrits par un modèle de traduction cinétique simple qui révèle des taux d’expression et de dégradation de l’ARNm. D’autres applications de LISCA pour des corrélations de temps d’événement des marqueurs multiples dans le cadre de l’apoptosis de signalisation sont discutées.

Introduction

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Ces dernières années, l’importance des expériences unicellulaires est devenue évidente. Les données des cellules individuelles permettent d’enquêter sur la variabilité de cellule à cellule, la résolution des corrélations de paramètres intracellulaires et la détection de la cinétique cellulaire qui reste cachée dans les mesures d’ensemble1,2,3. Afin d’étudier la cinétique cellulaire de milliers de cellules individuelles en parallèle, de nouvelles approches sont nécessaires qui permettent de surveiller les cellules dans des conditions normalisées sur une période de temps de plusieurs heures à plusieurs jours suivie d’une analyse quantitative des données 4. Ici, nous présentons l’imagerie à cellules vivantes de réseaux unicellulaires (LISCA), qui combine l’utilisation de réseaux microstructurés avec la microscopie time-lapse et l’analyse automatisée d’images.

Plusieurs méthodes de génération de réseaux unicellulaires microstructurés ont été établies et publiées dans la littérature5,6. Ici, nous décrivons brièvement le modelage des protéines initiées par plasma à micro-échelle (μPIPP). Un protocole détaillé de la fabrication de réseaux unicellulaires à l’aide de μPIPP se trouve également dans la référence7. L’utilisation de réseaux unicellulaires permet l’alignement de milliers de cellules sur des points d’adhésion standardisés présentant des microenvironnements définis pour chaque cellule et réduit ainsi une source de variabilité expérimentale (Figure 1A). Les réseaux unicellulaires sont utilisés pour surveiller les cours de temps des marqueurs fluorescents destinés à indiquer une variété de processus cellulaires. La microscopie à long terme en mode time-lapse à balayage permet de surveiller une grande partie des réseaux unicellulaires et donc d’échantillonner des données unicellulaires à haut débit sur un temps d’observation de plusieurs heures, voire plusieurs jours. Cela génère des piles de lignes de temps d’images à partir de chaque position du tableau(Figure 1B). Afin de réduire la grande quantité de données d’image et d’extraire les cours de temps de fluorescence unicellulaire souhaités de manière efficace, un traitement d’image automatisé est nécessaire qui tire parti du positionnement des cellules(Figure 1C).

Le défi de LISCA est d’adapter les protocoles expérimentaux et les outils de calcul pour former un test à haut débit qui génère des données quantitatives et reproductibles de la cinétique cellulaire. Dans cet article, nous fournissons une description étape par étape des méthodes individuelles et de la façon dont elles sont combinées dans un test LISCA. À titre d’exemple, nous discutons le cours de temps de l’expression verte augmentée de la protéine fluorescente (eGFP) après la livraison artificielle d’ADN messagère. L’expression de l’eGFP après l’administration de l’ARNm est décrite par des équations de vitesse de réaction modélisant la traduction et la dégradation de l’ARNm. L’ajustement de la fonction du modèle pour l’évolution dans le temps de la concentration eGFP à la lecture LISCA de l’intensité de fluorescence pour chaque cellule individuelle au fil du temps donne les meilleures estimations des paramètres du modèle tels que le taux de dégradation de l’ARNm. Comme résultat représentatif nous discutons l’efficacité de livraison d’ADN messagère de deux agents lipide-basés différents de transfection et comment leurs distributions de paramètre diffèrent.

Figure 1
Figure 1: Représentation du flux de travail LISCA combinant (A) des réseaux unicellulaires micro-modelés (B) une microscopie time-lapse à balayage et (C) une analyse d’image automatisée de séries d’images enregistrées. Les réseaux unicellulaires sont constitués d’un motif bidimensionnel de carrés adhésifs cellulaires avec un interespace répulsif pour les cellules conduisant à un arrangement des cellules sur le micropattern, comme on peut le voir dans l’image à contraste de phase ainsi que l’image de fluorescence des cellules exprimant l’eGFP (A). L’ensemble de la zone microstructurée est entité en mode time-lapse de numérisation à plusieurs reprises en prenant des images à une séquence de positions(B). Les séries d’images enregistrées sont traitées pour lire l’intensité de fluorescence par cellule au fil du temps (C). Barres d’échelle: 500 μm(A),200 μm (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Protocol

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Figure 2
Figure 2: Acquisition de données combinant des puces à ADN unicellulaires (A) avec une microscopie time-lapse à balayage (B). Dans le cadre de la préparation de l’expérience time-lapse, un réseau unicellulaire avec un micropattern 2D de carrés d’adhésion est préparé (1), suivi de l’ensemencement cellulaire et de l’alignement des cellules sur le micropattern (2) ainsi que de la connexion d’un système de perfusion à la lame à six canaux, ce qui permet la manipulation du liquide lors de la mesure time-lapse (3). Une expérience time-lapse à balayage est mise en place (4) et les cellules sont transfectées au microscope en injectant une solution lipoplexe d’ARNm à travers le système de perfusion pendant l’expérience time-lapse (5). Barres d’échelle: 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Fabrication de réseaux unicellulaires microstructurés (Figure 2A)

  1. Préparer les matériaux nécessaires à la fabrication des matrices μPIPP.
    1. Préparer une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) à un pH de 7,4.
    2. Préparer de l’eau ultrapure stérile avec une résistivité d’au moins 18 MΩcm à 25 °C.
    3. Préparer la solution de travail PLL(20 kDa)-g[3.5] PEG(2 kDa) (PLL-PEG) avec une concentration de 2 mg/mL de PLL-PEG dans de l’eau ultrapure contenant 150 mM de NaCl et 10 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES).
    4. Préparer une solution de protéines à matrice extracellulaire pour le revêtement de surface : 1 mg/mL de fibronectine (FN) dans du PBS.
    5. Préparez une plaquette de silicium avec un micropattern fabriqué par photolithographie8 qui fonctionne comme un maître réutilisable. Le micropattern se compose de carrés d’une longueur de bord de 30 μm, d’une profondeur de 12 μm et d’une distance inter-carrée de 60 μm, disposés en six bandes ayant chacune une largeur de 6 mm et une hauteur de 18 mm.
  2. Mélanger un monomère de polydiméthylsiloxane (PDMS) avec un réticulation à 9% (masse %) à l’aide d’un kit d’élastomère en silicone et dégazez-le pendant environ 30 min jusqu’à ce qu’il soit sans bulles à l’aide d’un dessécateur. Faites couler la plaquette de silicium avec une couche PDMS d’environ 3 à 5 mm d’épaisseur et dégazez-la à nouveau pendant environ 30 minutes jusqu’à ce qu’elle soit sans bulles.
    1. Mettez la plaquette de silicium avec le PDMS dans un four à cuisson à 50 °C pour durcir le PDMS pendant au moins 4 h.
  3. Coupez les tampons PDMS.
    1. Utilisez un scalpel et découpez dans la couche PDMS un chef-d’œuvre PDMS qui contient les six bandes micropattern.
    2. Placez le chef-d’œuvre PDMS sur un banc avec le micropattern tourné vers le haut.
    3. Coupez chacune des six bandes micropattern du chef-d’œuvre PDMS avec une lame de rasoir dans un timbre PDMS. Veillez à ce que les bords des tampons PDMS soient ouverts en coupant une partie de la zone à motifs.
  4. Placez les tampons PDMS sur une lame de couverture d’une glissière à six canaux(Figure 3-1).
    1. Utilisez une lame de couverture non revêtue et marquez les positions des canaux de la glissière à six canaux en rayant soigneusement la feuille de protection de la lame de couverture. Ensuite, placez la lamelle sur le banc avec la feuille de protection orientée vers le bas.
    2. Placez les tampons PDMS avec le micropattern orienté vers le bas sur la lamelle de couverture aux positions de canal marquées à l’aide d’une pince à épiler.
    3. Vérifiez la fixation des tampons PDMS au microscope. Si un tampon PDMS est entièrement attaché à la lamelle de couverture, les carrés en contact apparaissent plus sombres que l’interespace. La fixation du tampon PDMS à la lamelle de couverture est cruciale pour la qualité du micropattern.
  5. Placez la lamelle de couverture avec les six tampons PDMS dessus dans un nettoyant au plasma et traitez-la avec du plasma d’oxygène (pression de 0,2 mbar, ~ 40 W pendant 3 min) pour rendre les surfaces entre les tampons PDMS et la lamelle hydrophile(Figure3-2).
  6. Effectuez toutes les étapes ultérieures de la fabrication du micropattern dans une armoire de biosécurité. Utilisez 15 μL de la solution PLL-PEG et pipettez-en une goutte à côté de chaque tampon PDMS afin que la solution PLL-PEG soit absorbée dans le motif hydrophile du tampon PDMS(Figure3-3). Laisser incuber le PLL-PEG pendant 20 min à température ambiante.
  7. Rincez 1 mL d’eau ultrapure sur la lamelle de couverture avec les tampons PDMS dessus et retirez les tampons PDMS à l’aide d’une pince à épiler(Figure3-4). Rincez ensuite la lame de couverture une deuxième fois avec 1 mL d’eau ultrapure et laissez sécher.
  8. Lorsque la lame de couverture a complètement séché, collez une glissière collante à six canaux sur la lame de couverture(Figure 3-4). Veillez à ce que les zones micropatternées s’alignent sur le bas des canaux.
  9. Fonctionnaliser les carrés d’adhésion avec FN.
    1. Remplissez 40 μL de PBS dans chaque canal.
    2. Préparer une solution FN de 100 μg/mL dans du PBS.
    3. Ajouter 40 μL de la solution FN à chaque canal(Figure 3-5). Mélanger soigneusement la solution FN avec le PBS dans le canal en enlevant 40 μL d’un réservoir et en l’ajoutant au réservoir opposé du même canal pendant 3 fois pour générer une solution homogène. Incuber la solution FN pendant 45 min à température ambiante.
    4. Laver chaque canal trois fois avec 120 μL de PBS(figure3-6).
  10. Afin de vérifier la qualité du motif, utilisez un FN marqué par fluorescence à l’étape 9.2. (Figure 4A).
    REMARQUE: Nous recommandons de préparer le réseau de μPIPP pas plus d’un jour avant l’ensemencement cellulaire, car le PLL-PEG et le FN ne sont pas liés de manière covalente au substrat et la qualité du motif peut diminuer avec le temps. Conservez le réseau de μPIPP préparé au réfrigérateur.

Figure 3
Figure 3: Fabrication de microréseaux unicellulaires par μPIPP. (1) Les tampons PDMS avec une structure micropattern tridimensionnelle à la surface sont disposés sur une lame de couverture d’une lame à six canaux. (2) La lamelle de couverture avec les tampons PDMS dessus est traitée avec du plasma d’oxygène pour rendre les surfaces hydrophiles. (3) Pll-PEG est ajouté. Il est absorbé dans la microstructure par des forces capillaires et rend les surfaces non couvertes par le répulsif cellulaire d’estampille PDMS. (4) La lamelle est rincée à l’eau pour éliminer le PLL-PEG restant. Ensuite, les tampons PDMS sont retirés et une glissière collante à six canaux est collée à la lame de couverture. (5) La fibronectine, une protéine de la matrice extracellulaire, est ajoutée pour rendre les zones sans adhésif cellulaire PLL-PEG. (6) La lame à six canaux est lavée avec une solution saline tamponnée au phosphate. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

2. Ensemencement cellulaire( Figure 2A)

REMARQUE: Pour les étapes de lavage suivantes, ajoutez le liquide respectif à un réservoir, puis retirez un volume égal de liquide du réservoir opposé d’un canal.

  1. Laver chaque canal avec 120 μL de milieu de croissance cellulaire entièrement complété à 37 °C. Avant d’ajouter la suspension cellulaire, assurez-vous que seuls les canaux sont remplis de milieu, mais pas les réservoirs.
  2. Détachez les cellules HuH7 d’une fiole de culture cellulaire en suivant votre protocole standard pour le passaging cellulaire et ajustez la concentration de la suspension cellulaire à 4 x 105 cellules/mL.
  3. Ajouter 40 μL de suspension cellulaire et mélanger le milieu de croissance cellulaire avec la suspension cellulaire en retirant 40 μL d’un réservoir et en l’ajoutant au réservoir opposé du même canal pendant 3 fois pour atteindre une distribution cellulaire homogène(figure 4B).
  4. Retirez 40 μL de suspension du canal afin que seul le canal soit rempli de suspension cellulaire.
  5. Mettez la lame dans un incubateur et vérifiez l’adhérence cellulaire 1 h après l’ensemencement à l’aide d’un microscope à contraste de phase.
  6. Ajouter 120 μL de milieu de croissance des cellules chaudes à 37 °C.
  7. Mais la glissade dans l’incubateur pour encore 3 h pour permettre l’auto-organisation cellulaire sur le micropattern (Figure 4C).

Figure 4
Figure 4: Auto-organisation cellulaire et contrôle de la qualité du réseau μPIPP. (A) La surface microstructurée est constituée de taches d’adhérence carrées revêtues de FN représentées en rouge entourées d’un polymère anticellulaire. (B) Après l’ensemencement cellulaire, les cellules HuH7 sont distribuées aléatoirement et (C) adhèrent principalement sur les taches d’adhésion sur une période de temps de 4 h. Réimprimé avec permission 7. Barres d’échelle: 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Système de perfusion (Figure 2A)

REMARQUE: L’utilisation d’un système de perfusion n’est requise que si des réactifs ou des marqueurs fluorescents doivent être ajoutés au cours de la mesure du laps de temps. Selon vos besoins, vous pouvez connecter chaque canal à un système de perfusion séparé ou connecter plusieurs canaux en série au même système de perfusion. Le nombre de systèmes de perfusion correspond au nombre de conditions expérimentales indépendantes. Connectez les tubes dans des conditions stériles dans une armoire de biosécurité et évitez l’inclusion de bulles d’air dans le système de perfusion. Si aucun système de perfusion n’est utilisé, ajouter les réactifs/marqueurs dans une armoire de biosécurité avant la mesure du time-lapse. Le système de perfusion est fabriqué en interne, le matériau utilisé est répertorié dans la table des matériaux. L’assemblage du système de perfusion a été décrit précédemment9.

  1. Utilisez une seringue de 1 mL (avec sporn de remplacement) et remplissez la seringue avec 1 mL de milieu de croissance cellulaire à 37 °C.
  2. Connectez la seringue au tube d’entrée à l’aide de la valve et remplissez le tube de milieu.
  3. Connectez le tube d’entrée à un réservoir d’un canal et assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est piégée.
  4. Pour connecter un autre canal en série à ce système de perfusion, connectez un connecteur série au réservoir opposé au tube d’entrée du canal de courant. Passez au canal suivant et connectez l’extrémité libre du connecteur série à l’un de ses réservoirs.
  5. Répétez les étapes précédentes jusqu’à ce que le nombre requis de canaux soit connecté en série.
  6. Connectez le tube de sortie directement au réservoir libre du canal de courant. Remplissez le tube connecté avec un milieu afin de vérifier que le système de perfusion ne fuit pas.
  7. Répétez les étapes précédentes jusqu’à ce que les six canaux de la lame soient connectés à un système de perfusion.
  8. Replacez la lame avec le ou les systèmes de perfusion connectés dans l’incubateur jusqu’à ce qu’elle soit utilisée ou placez-la directement dans la chambre chauffante du microscope préchauffé à 37 °C pour la mesure du time-lapse.

4. Microscopie time-lapse (Figure 2B)

NOTA : Pour les mesures à long terme, maintenir une température stable de 37 °C et un niveau stable de CO2. Comme alternative au milieu de croissance cellulaire dépendant du CO2,utilisez le milieu L15 pour lequel aucun système d’incubation de gaz n’est requis.

REMARQUE: Pour l’imagerie quantitative, utilisez un milieu de croissance cellulaire sans rouge de phénol pendant la mesure time-lapse pour réduire la fluorescence de fond et utilisez les mêmes paramètres du protocole time-lapse ainsi que le même microscope pour les répétitions techniques.

  1. Mettre en place un protocole time-lapse pour enregistrer une image à contraste de phase et une image de fluorescence avec des temps d’exposition de 750 ms (selon la caméra), un intervalle de temps de 10 minutes entre les boucles consécutives à travers la liste de positions et un temps d’observation de 30 h, en utilisant un objectif 10x et des filtres de fluorescence appropriés.
  2. Placez la lame à six canaux avec les cellules sur les réseaux unicellulaires dans le porte-échantillon de la chambre chauffante chaude à 37 °C. Si les systèmes de perfusion sont connectés à la lame à six canaux, fixez les tubes à la scène à l’aide de ruban adhésif pour vous assurer que la lame à six canaux n’est pas déplacée pendant l’échange de liquide. Insérer les extrémités libres des tubes de sortie à travers un trou d’un tube de réaction de 15 mL pour recueillir les déchets liquides.
  3. Définissez la liste de positions pour la mesure time-lapse d’analyse. Assurez-vous que le nombre de positions peut être analysé dans l’intervalle de temps défini entre les boucles consécutives via la liste des positions. Avec un objectif 10x, 10-30 positions par canal peuvent être réglées pour scanner la surface totale du micropattern en fonction de la taille de la puce de la caméra.
  4. Démarrez la mesure time-lapse. Pour une meilleure qualité d’image des mesures à long terme, utilisez un système automatisé de correction de la mise au point.

5. Marqueur fluorescent - transfection de l’ARNm (Figure 2B)

REMARQUE: Pour une transfection dans deux canaux reliés par un système de tubes, un volume total de 600 μL de mélange de transfection est nécessaire (300 μL pour un canal). Les volumes indiqués se réfèrent à une transfection en deux canaux connectés.

  1. Préparer une solution d’agent de transfection en diluant 1 μL d’agent de transfection dans 200 μL de milieu sérique réduit et laisser la solution incuber pendant 5 min à température ambiante.
  2. Préparer une solution d’ARNm en diluant 300 ng d’ARNm codant pour l’eGFP dans 150 μL de milieu sérique réduit.
  3. Préparer le mélange de transfection en ajoutant 150 μL de la solution d’agent de transfection à la solution d’ARNm et bien le mélanger. Laisser le mélange de transfection incuber pendant 20 min à température ambiante.
  4. Rincer le système de tubes avec 1 mL de PBS chaud à 37 °C à l’aide d’une seringue pendant l’incubation du mélange de transfection. Lorsque vous rincez les tubes, assurez-vous que l’étage du microscope ne bouge pas. Suspendez la mesure time-lapse si nécessaire.
  5. Diluer le mélange de transfection à la concentration finale d’ARNm de 0,5 ng/μL en ajoutant 300 μL de milieu sérique réduit.
  6. Rincer le système de tubes avec le mélange de transfection à l’aide d’une seringue et laisser les lipoplexes à ARNm incuber pendant 1 h (suspendre la mesure du time-lapse si nécessaire).
  7. Arrêtez l’incubation de la transfection et éliminez les lipoplexes d’ARNm non liés en les lavant avec 1 mL de milieu de croissance cellulaire chaud entièrement complété à 37 °C à l’aide d’une seringue (suspendez la mesure du time-lapse si nécessaire).

6. Analyse d’image et lecture de fluorescence

  1. Lors de la première exécution de l’analyse d’image, installez la version 0.1.6 du logiciel open source « Automated Microstructure Analysis in Python » (PyAMA) à partir de l’emplacementcité 10 selon les instructions qui y sont fournies.
  2. Assurez-vous que les canaux d’image (contraste de phase et fluorescence) sont disponibles sous forme de fichiers TIFF 16 bits multi-images. Si nécessaire, convertissez-les en conséquence.
  3. Démarrez PyAMA et cliquez sur Ouvrir la pile ... pour ouvrir les images pour l’analyse.
  4. Pour chaque fichier TIFF multi-image à ouvrir, cliquez sur Ouvrir et sélectionnez le fichier afin qu’il s’affiche dans la liste des fichiers chargés sur le côté gauche de la boîte de dialogue (Figure 5-1).
  5. Marquez les canaux à inclure dans l’analyse. Pour chaque canal, procédez comme suit.
    1. Sélectionnez dans la liste des fichiers chargés le fichier TIFF contenant le canal.
    2. Dans la section Ajouter un nouveau canal, sélectionnez l’index du canal dans le fichier TIFF. L’indexation est de base zéro ; le premier canal a l’index 0, le deuxième canal a l’index 1 et ainsi de suite.
    3. Sélectionnez le type de canal. Sélectionnez Contraste de phase ou Fluorescence pour les canaux d’image correspondants et Segmentation pour un canal binaire indiquant les contours de cellule.
    4. Éventuellement, entrez une étiquette du canal pour distinguer les différents canaux de fluorescence: eGFP et DAPI.
    5. Après avoir configuré le canal, cliquez sur Ajouter.
  6. Lorsque tous les canaux ajoutés sont affichés dans la liste des canaux sur le côté droit de la boîte de dialogue, cliquez sur OK pour charger la pile.
  7. Pour effectuer une segmentation à l’aide de l’algorithme de segmentation intégré de PyAMA pour la reconnaissance de cellules basée sur les images à contraste de phase(Figure 5-2),accédez à Outils | Binariser... et entrez un nom de fichier pour le fichier NumPy avec le canal binarisé.
    Remarque : dans la version actuelle, le chargement du canal binarisé nécessite le rechargement de tous les canaux.
  8. Pour effectuer une correction de fond11 sur un canal de fluorescence(figure 5-3), assurez-vousque le canal de fluorescence et un canal de segmentation sont chargés. Si aucun canal de segmentation n’est chargé, assurez-vous qu’un canal à contraste de phase est chargé pour la segmentation automatique. Allez dans « Outils > correction d’arrière-plan... » et sélectionnez un nom de fichier pour le fichier TIFF résultant avec le canal de fluorescence corrigé.
    Remarque : dans la version actuelle, le chargement du canal corrigé en arrière-plan nécessite le rechargement de tous les canaux.
  9. Inspectez les cellules présélectionnées(Figure 5-4)et leur signal de fluorescence intégré(Figure 5-5)en faisant défiler les délais, en affichant les canaux répertoriés dans le menu des canaux sur le côté gauche et en cliquant sur les cellules pour mettre en évidence leurs cours de temps de fluorescence(Figure 1C). Utilisez la sélection cellulaire pour exclure de l’analyse ultérieure les cellules qui ne sont pas viables, qui ne sont pas confinées à un point d’adhésion ou qui ne sont pas attachées à une autre cellule. Basculez la sélection des cellules pour la lecture en appuyant sur Maj et en cliquant sur la cellule, ou en mettant la cellule en surbrillance et en appuyant sur Entrée.
  10. Enregistrez les cours de temps unicellulaires pour la zone cellulaire et la fluorescence intégrée (Figure 5-6) en cliquant sur Fichier | Enregistrez et sélectionnez un répertoire dans lequel enregistrer.

Figure 5
Figure 5: Traitement automatisé des images en accéléré à l’aide de PyAMA. (1) Des séries d’images à contraste de phase et à fluorescence sont importées pour chaque position d’imagerie. (2) Les contours des cellules sont déterminés par segmentation sur la pile d’images à contraste de phase. (3) Une correction de fond est appliquée aux images de fluorescence. (4) Les contours des cellules sont suivis au fil du temps et présélectionnés pour l’exportation. (5) L’intensité de fluorescence est intégrée en fonction des contours des cellules suivies. (6) Les zones cellulaires unicellulaires et les intensités de fluorescence intégrées sont évaluées et les cours de temps pour chaque cellule sont exportés. Barres d’échelle: 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

  1. Pour analyser la cinétique de traduction après transfection d’ARNm, ajuster un modèle de translation basé sur des équations de taux biochimiques à chaque cours de temps unicellulaire comme décrit précédemment par Reiser et al.12. Les données et le code utilisés dans cette étude sont accessibles au public13.
  2. Pour chaque cours de temps unicellulaire, récupérez les paramètres d’ajustement estimés du modèle de translation qui représentent le taux de dégradation de l’ARNm et le point temporel du début de la translation. Un exemple d’ensemble de données est abordé dans la section des résultats représentatifs.
  3. Effectuer une analyse plus approfondie des distributions des meilleures estimations des paramètres pour diverses conditions expérimentales afin d’étudier la variabilité de cellule à cellule au sein des populations cellulaires.

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Representative Results

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L’approche LISCA permet de collecter efficacement les cours de temps de fluorescence à partir de cellules individuelles. À titre d’exemple représentatif, nous décrivons comment la méthode LISCA est appliquée pour mesurer l’expression eGFP unicellulaire après transfection. Les données de l’expérience LISCA sont utilisées pour évaluer la cinétique d’administration de l’ARNm, ce qui est important pour le développement de médicaments à ARNm efficaces.

En particulier, nous démontrons l’impact différent de deux systèmes d’administration d’ARNm à base de lipides en ce qui concerne le point temporel du début de la traduction et le taux d’expression au niveau unicellulaire. Nous avons cultivé des cellules et divisé le lot en deux populations. Une sous-population a été transfectée avec des lipoplexes comme décrit dans la section de protocole. L’autre sous-population a été transfectée en utilisant le même ARNm avec la même concentration finale d’ARNm, mais avec des nanoparticules lipidiques (LNP) comme système d’administration, qui ont été produites en utilisant le mélange microfluidique12. En raison d’une composition lipidique différente et de la fabrication différente des systèmes d’administration d’ARNm des lipoplexes et des LNPs, nous nous attendons à un impact sur la cinétique de traduction car la cinétique d’absorption devrait être influencée. En utilisant la méthode LISCA, nous quantifions le point de temps t0 de l’apparition de la traduction après la transfection et la force à laquelle les cellules expriment l’eGFP, qui dépend du produit des molécules d’ARNm transfectées m0 et du taux de traduction kTL. Pour obtenir ces deux paramètres, nous avons ajusté un modèle de traduction en trois étapes tel qu’esquissé à la figure 6A. Après libération réussie des molécules d’ARNm m au point de temps t0 dans le cytosol, l’ARNm est traduit avec le taux kTL en eGFP G*non saturé, qui est non fluorescent. L’insaturé G*mûrit avec le taux kM à eGFP G,dont l’intensité de fluorescence est mesurée lors de la mesure time-lapse. L’ARNm ainsi que l’eGFP (non saturé et maturé) se dégradent au fil du temps avec des taux de dégradation respectifs δ et γ. Le modèle est décrit par des équations différentielles ordinaires et la solution analytique pour G est utilisée comme fonction de modèle pour l’estimation des paramètres. La fonction de modèle est ajustée à chacun des cours de temps à cellule unique, comme illustré à la figure 6B avec des exemples de cours de temps (gris) et les ajustements respectifs (vert). Sur la figure 6C, nous montrons les histogrammes du point temporel t0 d’apparition de la traduction et le taux d’expression m0kTL des cellules transfectées lipoplexes. Comme les deux paramètres sont estimés pour chaque cellule, la corrélation de ces paramètres peut être analysée comme indiqué dans le nuage de points(Figure 6D,données bleues) et peut être comparée aux cellules transfectées avec des LNPs (rouge). Comme le montre la figure 6D,les cellules transfectées par des LNPs montrent moins de variabilité de cellule à cellule par rapport aux cellules transfectées avec des lipoplexes et la moyenne de la population montre un début de traduction plus rapide ainsi qu’un taux d’expression plus élevé (points épais avec un contour noir).

Ces deux ensembles de données ne sont qu’un exemple de la façon dont LISCA peut être utilisé pour étudier la traduction après la transfection de l’ARNm. Des investigations complémentaires peuvent être effectuées par exemple en ce qui concerne la stabilité de l’ARNm dépendante des modifications de séquence de l’ARNm 14,des stabilités des protéines reporters variées 15,ou de la dégradation de l’ARNm médiée par l’ARNm 16.

Figure 6
Figure 6: Analyse des données de la cinétique de traduction de l’eGFP unicellulaire. (A) La cinétique de translation de la protéine rapporteure eGFP après l’administration de l’ARNm peut être décrite par une équation de vitesse de réaction en trois étapes avec les paramètres respectifs. (B) Le modèle est ajusté (traces vertes) à chaque cours temporel d’expression eGFP unicellulaire (traces grises) pour estimer les paramètres du modèle tels que le point temporel(t0)du début de la transfection et le taux d’expression(m0kTL),deux paramètres permettant de quantifier l’efficacité de l’administration de l’ARNm. (C) Histogrammes de la distribution des paramètres pour le temps d’apparition de la transfection et le taux d’expression. (D) Comme les paramètres sont estimés pour chaque cellule, un nuage de points de ces paramètres montre la corrélation des paramètres. Les petits points représentent les paramètres d’une seule cellule. Le graphique montre des cellules transfectées avec des LNPs ARNm (rouge) et des lipoplexes d’ARNm (bleu). Les points épais avec un contour noir correspondent à la moyenne de la population respective. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

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Ici nous avons décrit LISCA comme technique polyvalente pour suivre la cinétique cellulaire des étiquettes fluorescentes intracellulaires au niveau unicellulaire. Afin d’effectuer une expérience LISCA réussie, chacune des étapes décrites de la section de protocole doit être établie individuellement, puis toutes les étapes doivent être combinées. Chacun des trois aspects majeurs de LISCA comporte des étapes cruciales.

Fabrication de puces à ADN unicellulaires
La qualité du microréseau est cruciale car l’alignement cellulaire sur le microréseau est non seulement important pour toutes les étapes expérimentales ultérieures, mais a également une influence sur la qualité des données. Pour cette raison, la géométrie du motif et la méthode de fabrication doivent être adaptées par rapport aux cellules utilisées. Les résultats représentatifs discutés dans cet article ont été générés avec la lignée cellulaire du carcinome hépatique HuH7 alignée sur un motif carré (30 μm)2. Cette géométrie de motif convient également à d’autres lignées cellulaires telles que A549 ou HEK293. Pour les cellules plus grandes telles que le BEAS-2B, un motif carré plus grand avec une longueur de bord de 35 μm et une distance inter-carrés de 80 μm peut être utilisé. La procédure d’ensemencement décrite est optimisée pour les cellules HuH7 mais elle peut être adaptée à de nombreuses autres cellules adhérentes17. Par exemple, certaines lignées cellulaires ont besoin de différentes tailles de taches d’adhésion ou ont besoin d’un espacement plus grand entre les taches d’adhésion pour éviter les contacts cellule-cellule à travers des cellules allongées.

Le micropattern doit être ajusté de manière à ce que la surface du site d’adhésion corresponde approximativement à la surface moyenne d’une cellule dans les plats de culture standard. La géométrie peut être ronde ou carrée et n’a aucun effet mesurable sur la viabilité cellulaire. Les mouvements des cellules semblent être plus restreints sur un motif au carré par rapport au motif rond, où les cellules sont souvent vues tourner. Des tests de viabilité distincts sont recommandés lorsque de nouvelles lignées cellulaires sont utilisées pour la première fois. La densité d’ensemencement doit être ajustée pour des lignées cellulaires spécifiques afin d’atteindre une occupation élevée des points d’adhésion et de minimiser les doubles occupations des points d’adhésion en même temps. Typiquement, l’occupation résultante du nombre de cellules par site d’adhésion suit les statistiques de Poisson et est soit zéro, un ou deux. Par conséquent, l’occupation totale entre 60% et 80% devrait être visée à éviter les doubles occupations17. Le protocole d’ensemencement peut devoir être adapté en ce qui concerne le nombre de cellules ensemencées et la durée entre l’ensemencement et la première étape de lavage. Par exemple, une étape de lavage 30 min après l’ensemencement au lieu de 1 h (voir les étapes 5 et 6 de la section 2 du protocole Ensemencement cellulaire) réduira le nombre de points d’adhésion à double occupation mais réduira également le nombre total de points d’adhésion occupés pour les cellules HuH7.

Comme la connexion d’un système de tubes aux glissières de canal n’est pas obligatoire, il est plus facile d’établir l’utilisation d’un réactif ou d’un marqueur fluorescent sans utiliser un système de tubes pour vérifier la meilleure concentration et le meilleur temps d’incubation appropriés. Une fois qu’un protocole approprié est établi pour le réactif/marqueur d’intérêt, le système de tubes peut être inclus dans le flux de travail.

Microscopie time-lapse
Une autre étape cruciale sont les paramètres de la mesure time-lapse. Par exemple, le temps d’exposition du marqueur de fluorescence doit être choisi avec soin pour éviter le photobleaching des effets de fluorophore et de phototoxicité tout en assurant un bon signal de fluorescence. Un autre paramètre important de la configuration time-lapse est la meilleure combinaison appropriée de résolution spatiale et temporelle, qui dépend fortement de la cinétique cellulaire observée. Si une résolution temporelle élevée est nécessaire, seul un plus petit nombre de positions dans le microréseau peut être analysé entre deux points temporels, ce qui réduit la zone d’observation numérisée et, par conséquent, réduit également les statistiques. La zone d’observation dépend en outre non seulement du nombre de positions scannées, mais aussi de l’objectif et de la taille d’un champ de vision de la caméra. Dans l’exemple donné, une résolution temporelle de 10 min est suffisante en utilisant un objectif 10x pour observer la cinétique de translation. Cette combinaison permet de scanner 70 à 100 positions par point temporel en fonction de la taille de la puce de la caméra, de la vitesse de l’étage du microscope et du nombre de canaux d’imagerie (par exemple, contraste de phase et fluorescence eGFP).

traitement d'images
L’analyse de la fluorescence totale par cellule est facilitée car les cellules sont positionnées dans un réseau. Pourtant, la qualité des cours de temps de fluorescence unicellulaire, en particulier le rapport signal/bruit (SNR), dépend de l’algorithme utilisé pour l’intégration des intensités de fluorescence cellulaire de la série d’images. Les étapes de traitement d’image de l’outil logiciel PyAMA sont illustrées à la figure 5. La détermination des zones d’intégration pour la lecture de la fluorescence unicellulaire est particulièrement importante car le contour cellulaire des cellules vivantes varie avec le temps. PyAMA intègre l’intensité de fluorescence sur un contour cellulaire, qui peut être déterminé par un algorithme de segmentation intégré. Une alternative serait d’intégrer au-dessus des limites fixes basées sur la géométrie du micropattern12,16. La version actuelle de PyAMA effectue une segmentation d’image basée sur un seuil sur l’écart type des voisinages de pixels du canal d’image à contraste de phase. Les résultats de segmentation peuvent également être importés à partir de logiciels externes. Pour les versions futures, la prise en charge native de la segmentation basée sur l’apprentissage automatique et de l’intégration au-delà de limites fixes est prévue.

PyAMA propose de filtrer les cellules aberrantes ou les cours de temps anormaux à l’aide d’une interface qui permet une inspection visuelle de l’image de fluorescence ainsi que des cours de temps de fluorescence des cellules sélectionnées(Figure 1C). Des exemples de cellules qui peuvent être exclues de l’analyse sont les cellules qui subissent une division ou une apoptose ou qui sont situées à l’extérieur d’un site d’adhésion. Les agrégations de plusieurs cellules reconnues à tort par l’algorithme de suivi comme une seule cellule doivent également être filtrées pour s’assurer que les cours de temps proviennent de cellules uniques. PyAMA effectue une présélection des cellules pour réduire la quantité d’interaction manuelle requise pour filtrer les cellules anormales. La présélection peut être inspectée et corrigée à la main avant d’exporter les cours de temps des cellules sélectionnées pour compenser les inexactitudes de la présélection. La présélection de la version actuelle de PyAMA est basée sur un seuil pour la taille de cellule pour désélectionner les agrégations de cellules. Pour les versions futures, une présélection supplémentaire basée sur l’apprentissage automatique est prévue, ce qui permet de prendre en compte d’autres critères, y compris les exemples de cellules anormales décrits ci-dessus.

En résumé, l’approche LISCA utilise des réseaux unicellulaires pour collecter efficacement les cours de temps de fluorescence unicellulaire. Confiner les cellules sur des sites d’adhésion microfabriqués facilite le suivi et l’analyse d’images. En outre, les cellules sont cultivées dans des microenvironnements locaux normalisés et, par conséquent, sont présentées avec une surface uniforme lorsqu’elles sont exposées à des agents tels que des nanoparticules lipidiques pour la transfection. Cet aspect est particulièrement bénéfique lorsque l’hétérogénéité cellulaire au sein d’une population est étudiée. La technique μPIPP décrite ici est l’une des nombreuses techniques de microfabrication qui aboutissent à des microréseaux réguliers de profils protéiques. Le lecteur est renvoyé à la littérature passant en revue l’impression par microcontact, les approches photolithographiques et la lithographie douce en tant que procédés de fabrication alternatifs6. Selon la lignée cellulaire, l’une ou l’autre technique de modelage peut être préférable. Dans nos expériences, la technique μPIPP a montré des cellules bien positionnées après l’ensemencement des cellules en raison de l’auto-tri cellulaire, qui repose sur l’adhésivité cellulaire résiduelle sur la zone PEGylated afin que les cellules puissent rechercher dans la migration aléatoire et se propager sur les réseaux cibles de protéines avec une adhésivité différentiellement plus grande17.

LISCA permet l’acquisition d’un grand nombre de cours de temps unicellulaires de marqueurs de fluorescence arbitraires. L’analyse des signaux de fluorescence au niveau unicellulaire, contrairement aux expériences en vrac, donne des cours de temps unicellulaires immaculés et révèle la variabilité de cellule à cellule. L’hétérogénéité cellulaire joue un rôle éminent dans les décisions de destin cellulaire telles que l’apoptose18,19,20. Dans ce contexte, nous avons récemment étendu l’approche LISCA en utilisant deux canaux de fluorescence permettant l’analyse des corrélations temporelles de deux événements cellulaires à tout moment indiquant des étapes particulières dans la cascade de signalisation de mort cellulaire19. Dans ce domaine de recherche, LISCA se présente comme une alternative aux mesures de cytométrie de flux. Alors que la cytométrie de flux fournit indéniablement un flux de travail plus rapide et produit généralement des statistiques plus volumineuses, les données sont acquises à un moment donné dans le temps. Les dépendances à temps plein donnent des estimations des paramètres de cinétique et révèlent des corrélations temporelles entre différents signaux de fluorescence, qui sont autrement difficiles d’accès. Afin d’utiliser plusieurs canaux de fluorescence, la configuration nécessite des roues de filtre automatisées ou plusieurs caméras. Dans ce cas également l’analyse de FRET unicellulaire devrait être faisable et permettre des études de proximité résolues dans le temps entre les molécules fluorescentes marqués. L’un des inconvénients de l’analyse basée sur l’image comme LISCA est le travail lié aux contrôles visuels et à la détection des valeurs aberrantes. Ici, les outils d’apprentissage automatique pourraient faciliter le traitement des données et permettre une analyse de données entièrement automatisée. À l’avenir, en utilisant des plateformes de microscopie automatisée, la microfabrication à réseau rapide et l’intelligence artificielle, le débit et l’applicabilité de LISCA pourraient être considérablement augmentés. En outre, l’analyse ultérieure des cellules qui présentent des réponses de fluorescence inhabituelles à l’aide de l’extraction microfluidique 21et de la génomique unicellulaire est une exigence fréquente dans l’industrie pharmaceutique. Le protocole présenté dans cet article convient à la demande d’étude de la cinétique des processus cellulaires avec une résolution unicellulaire et des statistiques adéquates.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation allemande pour la science (DFG) au Centre de recherche collaborative (SFB) 1032. Le soutien du ministère fédéral allemand de l’Éducation, de la Recherche et de la Technologie (BMBF) dans le cadre du projet coopératif 05K2018-2017-06716 Medisoft ainsi qu’une subvention de la Bayerische Forschungsstiftung sont vivement appréciés. Anita Reiser a été soutenue par une bourse DFG de la Graduate School of Quantitative Biosciences Munich (QBM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adtech Polymer Engineering PTFE Microtubing  Fisher Scientific 10178071
baking oven Binder 9010-0190
CFI Plan Fluor DL 10x Nikon MRH20100
Desiccator Roth NX07.1
Eclipse Ti-E Nikon
eGFP mRNA Trilink L-7601
Female Luer to Tube Connector MEDNET FTL210-6005
Fetal bovine serum Thermo Fisher 10270106
Fibronectin Yo Proteins 663
Filter set eGFP AHF F46-002
Fisherbrand Translucent Platinum-Cured Silicone Tubing Fisher Scientific 11768088
HEPES (1 M) Thermo Fisher 15630080
Incubation Box Okolab OKO-H201
incubator Binder 9040-0012
L-15 without phenol red Thermo Fisher 21083027
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher 11668027
Male Luer in-house fabricated consisting of teflon
Male Luer to Tube Connector MEDNET MTLS210-6005 alternative to in-house fabricated male luers
NaCl (5 M) Thermo Fisher AM9760G
Needleless Valve to Male Luer Connector MEDNET NVFMLLPC
NIS Elements Nikon Imaging software Version 5.02.00
NOA81 Thorlabs NOA81 Fast Curing Optical Adhesive for tube system assembly
Opti-MEM Thermo Fisher 31985062
PCO edge 4.2 M-USB-HQ-PCO pco
Phosphate buffered saline (PBS) in-house prepared
Plasma Cleaner Diener Femto Pico-BRS
PLL(20 kDa)-g[3.5]-PEG(2 kDa) SuSoS AG
silicon wafer mit mircorstructures in-house fabricated
Sola Light Engine Lumencor
sticky slide VI 0.4  ibidi 80608
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 1673921
Tango 2 Märzhäuser 00-24-626-0000
Ultrapure water in-house prepared
uncoated coverslips ibidi 10813
Injekt-F Solo, 1 mL Omilab 9166017V with replacement sporn

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References

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Imagerie à cellules vivantes de réseaux unicellulaires (LISCA) - une technique polyvalente pour quantifier la cinétique cellulaire
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Reiser, A., Woschée, D., Kempe, S. M., Rädler, J. O. Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - a Versatile Technique to Quantify Cellular Kinetics. J. Vis. Exp. (169), e62025, doi:10.3791/62025 (2021).More

Reiser, A., Woschée, D., Kempe, S. M., Rädler, J. O. Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - a Versatile Technique to Quantify Cellular Kinetics. J. Vis. Exp. (169), e62025, doi:10.3791/62025 (2021).

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