Summary
Vi presenterar en metod för förvärv av fluorescens reporter tidskurser från enstaka celler med hjälp av mikropatterned arrays. Protokollet beskriver förberedelsen av encelliga matriser, installation och drift av live-cell scanning time-lapse mikroskopi och ett open source bild analys verktyg för automatiserad förval, visuell kontroll och spårning av cellintegrerade fluorescens tids kurser per vidhäftnings plats.
Abstract
Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) är en mångsidig metod för att samla tidskurser av fluorescenssignaler från enskilda celler i högt genomströmning. I allmänhet hämmas förvärvet av encelliga tidskurser från odlade celler av cellmotilitet och mångfald av cellformer. Självhäftande mikromatriser standardiserar encelliga förhållanden och underlättar bildanalys. LISCA kombinerar encelliga mikroarrayer med skanning av tidsfördröjningsmikroskopi och automatiserad bildbehandling. Här beskriver vi de experimentella stegen för att ta encelliga fluorescenstidskurser i LISCA-format. Vi transfect celler vidhäftande till en mikropatterned array med mRNA kodning för förbättrad grön fluorescerande protein (eGFP) och övervaka eGFP uttryck kinetik av hundratals celler parallellt via skanning tid-förfall mikroskopi. Bilddatastaplarna bearbetas automatiskt av nyutvecklad programvara som integrerar fluorescensintensitet över valda cellkonturer för att generera tidskurser för fluorescens i en cell. Vi visar att eGFP uttryck tid kurser efter mRNA transfection beskrivs väl av en enkel kinetisk översättning modell som avslöjar uttryck och nedbrytning priser av mRNA. Ytterligare tillämpningar av LISCA för händelse tid korrelationer av flera markörer i samband med signalering apoptos diskuteras.
Introduction
Under de senaste åren har vikten av encellsexperiment blivit uppenbar. Data från enstaka celler gör det möjligt att undersökning av cell-till-cell variabilitet, upplösningen av intracellulära parameterkorrelationer och detektion av cellulär kinetik som förblir dolda iensemblemätningar 1,2,3. För att undersöka cellulär kinetik för tusentals enstaka celler parallellt behövs nya metoder som gör det möjligt att övervaka cellerna under standardiserade förhållanden under en tidsperiod på flera timmar upp till flera dagar följt av en kvantitativ dataanalys 4. Här presenterar vi Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA), som kombinerar användningen av mikrostrukturerade matriser med timelapse-mikroskopi och automatiserad bildanalys.
Flera metoder för att generera mikrostrukturerade encelliga matriser har etablerats och publicerats i litteratur5,6. Här beskriver vi kortfattat Mikroskala Plasma-initierad proteinmönster (μPIPP). Ett detaljerat protokoll för encellsmatristillverkningen med μPIPP finns också i referens7. Användningen av encelliga matriser möjliggör justering av tusentals celler på standardiserade vidhäftningsfläckar som presenterar definierade mikromiljö för varje cell och minskar därmed en källa till experimentell variabilitet (figur 1A). Encelliga matriser används för att övervaka tidsförrättningar för fluorescerande markörer som är avsedda att indikera en mängd olika cellulära processer. Långsiktig mikroskopi i skanningstidsfördröjningsläge gör det möjligt att övervaka ett stort område av encellsmatriserna och därmed ta prov på encellsdata i hög genomströmning under en observationstid på flera timmar eller till och med dagar. Detta genererar tidsradsstaplar med bilder från varje position i matrisen (bild 1B). För att minska den stora mängden bilddata och extrahera önskade fluorescenstidskurser med en cell på ett effektivt sätt krävs automatiserad bildbehandling som utnyttjar cellernas placering (figur 1C).
Utmaningen med LISCA är att anpassa de experimentella protokollen och beräkningsverktygen för att bilda en höggenomströmningsanalys som genererar kvantitativa och reproducerbara data från cellulär kinetik. I den här artikeln ger vi en steg-för-steg-beskrivning av de enskilda metoderna och hur de kombineras i en LISCA-analys. Som ett exempel diskuterar vi tidsföringen för förbättrat grönt fluorescerande protein (eGFP) uttryck efter konstgjord mRNA leverans. eGFP uttryck efter mRNA leverans beskrivs av reaktionshastighet ekvationer modellering översättning och nedbrytning av mRNA. Att anpassa modellfunktionen för tidsförvröjningen av eGFP-koncentrationen till LISCA-avläsningen av fluorescensintensiteten för varje enskild cell över tiden ger bästa uppskattningar av modellparametrar som mRNA-nedbrytningshastigheten. Som ett representativt resultat diskuterar vi mRNA leverans effektivitet av två olika lipid-baserade transfection agenter och hur deras parameter distributioner skiljer sig åt.
Bild 1:Representation av LISCA-arbetsflödet som kombinerar (A) mikromönstrade encelliga matriser (B) som skannar tidsfördröjningsmikroskopi och (C) automatiserad bildanalys av inspelade bildserier. Encelliga matriser består av ett tvådimensionellt mönster av celllimrutor med ett cellavvisande interrymd som leder till ett arrangemang av cellerna på mikromönster, vilket kan ses i faskontrastbilden samt fluorescensbilden av eGFP-uttrycksceller (A). Hela det mikrostrukturerade området avbildas i ett skanningstidsfördröjningsläge och tar upprepade gånger bilder i en sekvens av positioner (B). Inspelade bildserier bearbetas för att läsa upp fluorescensintensiteten per cell över tid (C). Skalstänger: 500 μm (A), 200 μm (C). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figur 2:Datainsamling som kombinerar encelliga mikroarrayer (A) med skanningstidsfördröjningsmikroskopi (B). Som förberedelse av tidsfördröjningsexperimentet bereds en encellig matris med en 2D-mikromönster av vidhäftningsrutor (1), följt av cellfröning och justering av cellerna på mikromönster (2) samt anslutning av ett perfusionssystem till sexkanalsbilden, vilket möjliggör vätskehantering under tidsfördröjningsmätningen (3). Ett scanning time-lapse experiment är inrättat (4) och cellerna transfecteras på mikroskopet genom att injicera en mRNA lipoplex lösning genom perfusionssystemet under timelapse experimentet (5). Skalstänger: 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
1. Mikrostrukturerad encellig arraytillverkning(figur 2A)
- Förbered de material som behövs för μPIPP-matristillverkning.
- Bered steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid pH 7.4.
- Förbered sterilt ultrapurvatten med en resistivitet på minst 18 MΩcm vid 25 °C.
- Förbered PLL(20 kDa)-g[3.5] PEG(2 kDa) (PLL-PEG) arbetslösning med en 2 mg/ml koncentration av PLL-PEG i ultrapurvatten som innehåller 150 mM NaCl och 10 mM 4-(2-hydroxyetyl)-1-piperazineethanesulfonsyra (HEPES).
- Bered en extracellulär matrisproteinlösning för ytbeläggning: 1 mg/ml fibronektin (FN) i PBS.
- Förbered en kiselskiva med en mikromönster tillverkad av fotolitografi8 som fungerar som en återanvändbar mästare. Mikromönster består av rutor med en kantlängd på 30 μm, ett djup på 12 μm och ett mellan kvadratiskt avstånd på 60 μm, ordnat i sex ränder vardera med en bredd på 6 mm och en höjd av 18 mm.
- Blanda en polydimethylsiloxan (PDMS) monomer med 9% tvärlänk (massa %) använd en silikon elastomer kit och avgasa den i ca 30 min tills den är bubbelfri med en desiccator. Gjut silikonskivan med ett ungefär 3-5 mm tjockt PDMS-lager och avgasa det igen i ca 30 min tills det är bubbelfritt.
- Sätt kiselskivan med PDMS i en bakugn vid 50 °C för att härda PDMS i minst 4 timmar.
- Klipp ut PDMS-frimärkena.
- Använd en skalpell och klipp ut ur PDMS-lagret ett PDMS-mästerverk som innehåller de sex mikromönsterbanden.
- Placera PDMS mästerverk på en bänk med mikromönster vänd uppåt.
- Skär var och en av de sex mikromönsterbanden i PDMS-mästerverket med en rakblad i en PDMS-stämpel. Se till att kanterna på PDMS-stämplarna är öppna genom att skära av en del av det mönstrade området.
- Placera PDMS-stämplarna på ett omslag till en sexkanalig bild (bild 3-1).
- Använd ett obestruket täckglas och markera kanalpositionerna för sexkanalsglaset genom att försiktigt skrapa skyddsfolien på täcket. Placera sedan täcket på bänken med skyddsfolien vänd nedåt.
- Placera PDMS-stämplarna med mikromönster vänd nedåt på täcket i markerade kanallägen med pincett.
- Kontrollera fastsättningen av PDMS-stämplarna under ett mikroskop. Om en PDMS-stämpel är helt fäst vid täckglaset verkar rutorna i kontakt mörkare än interrymden. Fastsättningen av PDMS-stämpeln på täckglaset är avgörande för mikromönsterkvaliteten.
- Placera täckglaset med de sex PDMS-stämplarna på i en plasmarengöringsmedel och behandla det med syreplasma (tryck 0,2 mbar, ~40 W i 3 min) för att göra ytorna mellan PDMS-stämplarna och täckglaset hydrofilt (figur 3-2).
- Utför alla ytterligare steg i mikromönstertillverkningen i ett biosäkerhetsskåp. Använd 15 μL PLL-PEG-lösningen och pipetten en droppe av den bredvid varje PDMS-stämpel så att PLL-PEG-lösningen absorberas i pdms-stämpelns hydrofila mönster (figur 3-3). Låt PLL-PEG inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur.
- Skölj 1 ml ultrapurvatten över täcket med PDMS-stämplarna på och ta bort PDMS-stämplarna med pincett (figur 3-4). Skölj sedan täcket en andra gång med 1 ml ultrapurevatten och låt det torka.
- När täcket har torkat helt, stick en sexkanalig klibbig rutschkana på täckglaset (Bild 3-4). Se till att de mikropatternerade områdena överensstämmer med kanalns botten.
- Funktionalisera vidhäftningsrutorna med FN.
- Fyll 40 μL PBS i varje kanal.
- Förbered en 100 μg/ml FN-lösning i PBS.
- Tillsätt 40 μL FN-lösningen till varje kanal (figur 3-5). Blanda FN-lösningen med PBS i kanalen noggrant genom att ta bort 40 μL från en behållare och tillsätta den i den motsatta behållaren på samma kanal i 3 gånger för att generera en homogen lösning. Inkubera FN-lösningen i 45 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta varje kanal tre gånger med 120 μL PBS (Bild 3-6).
- För att kontrollera mönsterkvaliteten, använd en fluorescerande märkt FN i steg 9.2. (Figur 4A).
OBS: Vi rekommenderar att du förbereder μPIPP-matrisen högst en dag före cellfröing eftersom PLL-PEG och FN inte är kovavt bundna till substratet och mönstrets kvalitet kan minska med tiden. Förvara den beredda μPIPP-matrisen i kylskåpet.
Figur 3:Encellig mikroarraytillverkning med μPIPP. (1) PDMS-stämplar med en tredimensionell mikromönsterstruktur på ytan är ordnade på ett täckglas av en sexkanalig bild. (2) Täckslipet med PDMS-stämplarna på behandlas med syreplasma för att göra ytorna hydrofila. (3) PLL-PEG läggs till. Den absorberas i mikrostrukturen av kapillärkrafter och gör ytorna som inte täcks av PDMS-stämpelcellavstötande medel. (4) Täckslipet sköljs med vatten för att avlägsna den återstående PLL-PEG. Sedan tas PDMS-frimärkena bort och en sexkanalig klibbig bild fastnar på täcket. (5) Fibronectin, ett protein i den extracellulära matrisen, tillsätts för att göra områdena utan PLL-PEG-celllim. (6) Sexkanalsrutschbanan tvättas med fosfatbuffrad saltlösning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
2. Cellfröning(figur 2A)
OBS: För följande tvättsteg, tillsätt respektive vätska i en behållare och ta sedan bort en lika stor mängd vätska från den motsatta behållaren i en kanal.
- Tvätta varje kanal med 120 μL 37 °C fullt kompletterat celltillväxtmedium. Innan du lägger till cellupphängningen, se till att endast kanalerna är fyllda med medium men inte reservoarerna.
- Lossa HuH7-celler från en cellkulturkolv enligt standardprotokollet för celldelning och justera cellfjädringskoncentrationen till 4 x 105 celler/ml.
- Tillsätt 40 μL cellfjädring och blanda celltillväxtmediet med cellfjädringen genom att ta bort 40 μL från en behållare och tillsätta den i den motsatta behållaren i samma kanal i 3 gånger för att nå en homogen cellfördelning (figur 4B).
- Ta bort 40 μL fjädring från kanalen så att endast kanalen är fylld med cellfjädring.
- Sätt bilden i en inkubator och kontrollera cellens vidhäftning 1 timme efter sådd med ett faskontrastmikroskop.
- Tillsätt 120 μL 37 °C varmt celltillväxtmedium.
- Men glidningen tillbaka i inkubatorn för ytterligare 3 h för att möjliggöra cellulär självorganisation på mikropattern (Figur 4C).
Figur 4:Cellulär självorganisering och kvalitetskontroll av μPIPP-matrisen. (A) Den mikrostrukturerade ytan består av kvadratiska FN-belagda vidhäftningsfläckar som visas i rött omgiven av en cellavvisande polymer. B)Efter cellfröning fördelas HuH7-cellerna slumpmässigt och( C) fäster huvudsakligen på vidhäftningsfläckarna under en tidsperiod på 4 timmar. Tryckt med behörighet 7. Skalstänger: 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. Perfusionssystem (Figur 2A)
OBS: Användning av ett perfusionssystem krävs endast om reagenser eller fluorescerande markörer behöver tillsättas under tidsfördröjningsmätningen. Beroende på dina behov kan du ansluta varje kanal till ett separat perfusionssystem eller ansluta flera kanaler i serie till samma perfusionssystem. Antalet perfusionssystem motsvarar antalet oberoende försöksbetingade tillstånd. Anslut rören under sterila förhållanden i ett biosäkerhetsskåp och undvik att inkludera luftbubblor i perfusionssystemet. Om inget perfusionssystem används, tillsätt reagenserna/markörerna i ett biosäkerhetsskåp före tidsfördröjningsmätningen. Perfusionssystemet är egen fabricerat, det använda materialet listas i materialförteckningen. Monteringen av perfusionssystemet har beskrivits tidigare9.
- Använd en 1 ml spruta (med ersättningssporn) och fyll sprutan med 1 ml 37 °C celltillväxtmedium.
- Anslut sprutan till inloppsröret med hjälp av ventilen och fyll röret med medium.
- Anslut inloppsröret till en reservoar på en kanal och se till att inga luftbubblor fastnar.
- Om du vill ansluta en annan kanal i serie till detta perfusionssystem ansluter du en seriell kontakt till behållaren mittemot inloppsröret på den aktuella kanalen. Fortsätt till nästa kanal och anslut den fria änden av seriekontakten till en av dess behållare.
- Upprepa föregående steg tills det önskade antalet kanaler är anslutna i serie.
- Anslut utloppsröret direkt till den fria behållaren på strömkanalen. Fyll det anslutna röret med medium för att kontrollera att perfusionssystemet inte läcker.
- Upprepa föregående steg tills alla sex kanalerna i bilden är anslutna till ett perfusionssystem.
- Placera diabilden med de anslutna perfusionssystemen tillbaka i inkubatorn tills den används vidare eller placera den direkt i mikroskopets värmekammare förvärmd till 37 °C för tidsfördröjningsmätning.
4. Mikroskopi med tidsfördröjning(figur 2B)
OBS: För långtidsmätningar, håll en stabil temperatur på 37 °C och en stabil CO2-nivå. Som ett alternativ till CO2-beroendecelltillväxtmedium, använd L15 medium för vilket inget gasinkubationssystem krävs.
OBS: För kvantitativ avbildning, använd celltillväxtmedium utan fenolrött under tidsfördröjningsmätningen för att minska bakgrundsfluorescensen och använd samma inställningar i timelapse-protokollet samt samma mikroskop för tekniska replikat.
- Ställ in ett timelapse-protokoll för inspelning av en faskontrastbild och en fluorescensbild med exponeringstider på 750 ms (beroende på kameran), 10 minuters tidsintervall mellan på varandra följande slingor genom positionslistan och en observationstid på 30 timmar, med hjälp av ett 10x objektivt och lämpligt fluorescensfilter.
- Placera sexkanalsbilden med cellerna på encellsmatriserna i provhållaren i värmekammaren på 37 °C. Om perfusionssystem är anslutna till sexkanalsbilden, fäst rören på scenen med hjälp av något band för att säkerställa att sexkanalsbilden inte flyttas under vätskeutbytet. För in utloppsrörens fria ändar genom ett hål i ett 15 ml reaktionsrör för att samla upp det flytande avfallet.
- Ställ in positionslistan för mätningen av skanningstiden. Se till att antalet positioner kan skannas inom det definierade tidsintervallet mellan på varandra följande slingor genom positionslistan. Med ett 10x-mål kan 10-30 positioner per kanal ställas in för att skanna det totala mikromönsterområdet beroende på kamerans chipstorlek.
- Starta tidsfördröjningsmätningen. För en bättre bildkvalitet vid långtidsmätningar, använd ett automatiserat fokuskorrigeringssystem.
5. Fluorescerande markör - mRNA-transfection (Figur 2B)
OBS: För en transfekt i två kanaler som är anslutna med ett rörsystem behövs en total volym på 600 μL transfection mix (300 μL för en kanal). De angivna volymerna avser en transfection i två anslutna kanaler.
- Förbered en transfection agent lösning genom att späda 1 μL transfection agent i 200 μL serumreduktionsmedium och låt lösningen inkubera i 5 min vid rumstemperatur.
- Bered en mRNA-lösning genom att späda ut 300 ng mRNA-kodning för eGFP i 150 μL serumreminerat medium.
- Förbered transfectionblandningen genom att tillsätta 150 μL av transfection agentlösningen till mRNA-lösningen och blanda den väl. Låt transfectionblandningen inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur.
- Spola slangsystemet med 1 ml 37 °C varm PBS med en spruta under inkubationen av transfectionblandningen. När du spolar rören, se till att mikroskopsteget inte rör sig. Pausa tidsfördröjningsmätningen om det behövs.
- Späd transfectionblandningen till den slutliga mRNA-koncentrationen på 0,5 ng/μL genom att tillsätta 300 μL serumreduktionsmedium.
- Spola slangsystemet med transfektblandningen med en spruta och låt mRNA lipoplexerna inkubera i 1 timme (pausa tidsfördröjningsmätningen om det behövs).
- Stoppa transfection inkubationen och spola ut de obundna mRNA lipoplexes genom att tvätta med 1 ml 37 °C varmt fullt kompletterat celltillväxtmedium med en spruta (pausa tidsfördröjningsmätningen om det behövs).
6. Bildanalys och fluorescensavläsning
- När du kör bildanalysen för första gången installerar du version 0.1.6 av open source-programvaran "Automated Microstructure Analysis in Python" (PyAMA) från den citerade platsen10 enligt instruktionerna där.
- Se till att bildkanalerna (faskontrast och fluorescens) är tillgängliga som 16-bitars TIFF-filer med flera bilder. Konvertera dem vid behov i enlighet med detta.
- Starta PyAMA och klicka på Öppna stacken... för att öppna bilder för analys.
- För varje TIFF-fil med flera bilder att öppna klickar du på Öppna och markerar filen så att den visas i listan över inlästa filer till vänster i dialogrutan (bild 5-1).
- Markera de kanaler som ska inkluderas i analysen. Utför följande steg för varje kanal.
- Välj I listan över inlästa filer TIFF-filen som innehåller kanalen.
- I avsnittet Lägg till ny kanalväljer du kanalens index i TIFF-filen. Indexeringen är nollbaserad. den första kanalen har index 0, den andra kanalen har index 1 och så vidare.
- Välj kanaltyp. Välj Faskontrast eller Fluorescens för motsvarande bildkanaler och segmentering för en binär kanal som anger cellkonturerna.
- Om du vill anger du en etikett på kanalen för att skilja olika fluorescenskanaler: eGFP och DAPI.
- När du har konfigurerat kanalen klickar du på Lägg till.
- När alla tillagda kanaler visas i kanallistan till höger i dialogrutan klickar du på OK för att läsa in stapeln.
- Om du vill utföra segmentering med PyAMA:s inbyggda segmenteringsalgoritm för celligenkänning baserat på faskontrastbilderna (bild 5-2) går du till Verktyg | Binarize... och ange ett filnamn för NumPy-filen med den binariserade kanalen.
OBS: I den aktuella versionen kräver inläsning av binariserad kanal att alla kanaler läses in igen. - För att utföra enbakgrundskorrigering 11 på en fluorescenskanal (figur 5-3), se till att fluorescenskanalen och en segmenteringskanal laddas. Om ingen segmenteringskanal läses in kontrollerar du att en faskontrastkanal läses in för automatisk segmentering. Gå till "Verktyg > bakgrundskorrigering..." och välj ett filnamn för den resulterande TIFF-filen med den korrigerade fluorescenskanalen.
OBS: I den aktuella versionen kräver inläsning av den bakgrundskorrigerade kanalen att alla kanaler läses in igen. - Inspektera de förvalda cellerna (bild 5-4) och deras integrerade fluorescenssignal (bild 5-5) genom att bläddra igenom tidsramarna, visa kanalerna som anges i kanalmenyn till vänster och klicka på celler för att markera deras fluorescenstidskurser (figur 1C). Använd cellmarkeringen för att utesluta celler som inte är livskraftiga, inte begränsade till en vidhäftningsplats eller kopplade till en annan cell från ytterligare analys. Växla markering av celler för avläsning genom att trycka på Skift och klicka på cellen, eller genom att markera cellen och trycka på Retur.
- Spara tidskurserna för encelliga celler för cellområdet och den integrerade fluorescensen (bild 5-6) genom att klicka på | Spara och markera en katalog som du vill spara i.
Bild 5:Automatiserad bildbehandling av timelapse-bildserier med pyama. (1) faskontrast- och fluorescensbildserier för varje bildposition importeras. (2) Cellkonturer bestäms genom segmentering på bildstacken för faskontrast. (3) En bakgrundskorrigering tillämpas på fluorescensbilderna. (4) Cellkonturerna spåras över tid och väljs för export. (5) Fluorescensintensiteten är integrerad på grundval av de spårade cellkonturerna. (6) Encelliga cellområden och integrerade fluorescensintensiteter utvärderas och tidskurser för varje cell exporteras. Skalstänger: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Om du vill analysera översättningskinetiken efter mRNA-transfektionen, anpassa en översättningsmodell baserad på biokemiska hastighetsekvationer till varje encellig tidskurs enligt beskrivningen tidigare av Reiser et al.12. De data och den kod som används i den studien är allmänt tillgängliga13.
- För varje tidskurs med en cell hämtar du de uppskattade anpassningsparametrarna för översättningsmodellen som representerar mRNA-nedbrytningshastigheten och tidspunkten för översättningsuppsättningen. Ett exempel på datauppsättning diskuteras i avsnittet representativa resultat.
- Utför ytterligare analyser av fördelningarna av bästa uppskattningar av parametrarna för olika experimentella förhållanden för att undersöka cell-till-cell-variabiliteten inom cellpopulationerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LISCA-metoden gör det möjligt att effektivt samla fluorescenstidskurser från enstaka celler. Som ett representativt exempel beskriver vi hur LISCA-metoden tillämpas för att mäta eGFP-uttryck med en cell efter transfection. Data från LISCA-experimentet används för att bedöma mRNA-leveranskinetik, vilket är viktigt för utvecklingen av effektiva mRNA-läkemedel.
I synnerhet visar vi de olika effekterna av två lipidbaserade mRNA-leveranssystem med avseende på tidspunkten för översättningsuppkomst och uttryckshastigheten på encellsnivå. Vi odlade celler och delade upp partiet i två populationer. En subpopulation transfected med lipoplexes som beskrivs i protokoll avsnittet. Den andra subpopulationen transfected med samma mRNA med samma slutliga mRNA koncentration, men med lipid nanopartiklar (LNP) som leveranssystem, som producerades med hjälp av mikrofluidic blandning12. På grund av en annan lipidkomposition och olika tillverkning av mRNA-leveranssystemen i lipoplexerna och LNPs förväntar vi oss en inverkan på översättningskinetiken eftersom upptaget kinetik bör påverkas. Med LISCA-metoden kvantifierar vi tidspunkten t0 för översättningsuppkomst efter transfektionen och hur starka cellerna uttrycker eGFP, vilket beror på produkten av transfekterade mRNA-molekyler m0 och översättningshastigheten k TL. För att få dessa två parametrar passar vi in i en översättningsmodell i tre steg som skissas i figur 6A. Efter lyckad frisättning av mRNA-molekylerna m vid tidpunkt t0 i cytosolen översätts mRNA med hastighet kTL till omättad eGFP G*, som inte är fluorescerande. Det omogna G* mognar med hastighet k Mtill eGFP G, vars fluorescensintensitet mäts under tidsfördröjningsmätningen. MRNA samt (omättade och mogna) eGFP försämras med tiden med respektive nedbrytningshastigheter δ och γ. Modellen beskrivs av vanliga differentialekvationer och analyslösningen för G används som modellfunktion för parameteruppskattning. Modellfunktionen är monterad på var och en av encellskurserna som visas i figur 6B med exempeltidskurser (grå) och respektive passform (grön). I figur 6C visar vi histogrammen i tidspunkten t0 för översättningsuppkomst och uttryckshastigheten m0kTL lipoplextransfekterade celler. Eftersom båda parametrarna uppskattas för varje cell kan korrelationen mellan dessa parametrar analyseras som visas i scatterploten (figur 6D, blå data) och kan jämföras med celler som transfecteras med LNPs (röd). Som visas i figur 6Dvisar celler som transfecteras med LNPs mindre cell-till-cell variabilitet jämfört med celler som är transfekterade med lipoplexer och befolkningsgenomsnittet visar en snabbare uppkomsten av översättning samt en högre uttryckshastighet (tjocka punkter med svart kontur).
Dessa två datamängder är bara ett exempel på hur LISCA kan användas för att studera översättning efter mRNA-transfection. Ytterligare undersökningar kan göras till exempel med avseende på mRNA stabilitet beroende på mRNA sekvens modifieringar 14,varierade reporter protein stabilisering 15, eller siRNA medierad mRNA nedbrytning 16.
Figur 6: Dataanalys av eGFP-översättningskinetik med en cell. (A) Översättningskinetiken för reporterproteinet eGFP efter mRNA-leverans kan beskrivas med en trestegs reaktionshastighetsekvation med respektive parametrar. (B) Modellen är monterad (gröna spår) på varje eGFP-uttryckstidskurs med en cell (grå spår) för att uppskatta modellparametrarna,t.ex. C)Histogram av parameterfördelningen för transfection debuttid och uttryckshastighet. (D) Eftersom parametrarna uppskattas för varje cell visar ett spridningsdiagram över dessa parametrar parameterkorrelation. De små punkterna representerar parametrarna för en enskild cell. Tomten visar celler transfected med mRNA LNPs (röd) och mRNA lipoplexes (blå). De tjocka prickarna med svart kontur motsvarar respektive befolkningsmedelvärde. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskrev vi LISCA som en mångsidig teknik för att följa cellulär kinetik av intracellulära fluorescerande etiketter på encellsnivå. För att utföra ett framgångsrikt LISCA-experiment måste vart och ett av de beskrivna stegen i protokollavsnittet upprättas individuellt och sedan måste alla steg kombineras. Var och en av de tre viktigaste aspekterna av LISCA har avgörande steg.
Encellig mikroarraytillverkning
Kvaliteten på mikroarrayen är avgörande eftersom cellulär inriktning på mikroarrayen inte bara är viktig för alla ytterligare experimentella steg utan också har inflytande på datakvaliteten. Av denna anledning måste mönstrets geometri och tillverkningsmetoden anpassas med avseende på de använda cellerna. De representativa resultaten som diskuteras i denna artikel har genererats med lever carcinom cellinjen HuH7 anpassade på ett (30 μm)2 kvadratiskt mönster. Denna mönstergeometri är också lämplig för andra cellinjer som A549 eller HEK293. För större celler som BEAS-2B kan ett större kvadratmönster med 35 μm kantlängd och ett mellan kvadratiskt avstånd på 80 μm användas. Den beskrivna såddproceduren är optimerad för HuH7-cellerna men den kan anpassas till många andra vidhäftande celler17. Vissa cellinjer behöver till exempel olika storlekar av vidhäftningsfläckarna eller behöver större avstånd mellan vidhäftningsfläckarna för att undvika cellcellskontakter genom långsträckta celler.
Mikromönster bör justeras så att vidhäftningsplatsens område uppfyller ungefär den genomsnittliga ytan av en cell i standardkulturrätter. Geometrin kan rundas eller kvadrateras och har ingen mätbar effekt av cellens livskraft. Cellrörelser verkar vara mer begränsade på ett kvadratiskt mönster jämfört med runda mönster, där celler ofta ses rotera. Separat lönsamhetstestning rekommenderas när nya cellinjer används för första gången. Såddtätheten måste justeras för specifika cellinjer för att nå en hög beläggning av vidhäftningsplatserna och för att minimera dubbla ocker i vidhäftningsfläckar samtidigt. Vanligtvis följer den resulterande beläggningen av antalet celler per vidhäftningsplats Poisson-statistik och är antingen noll, en eller två. Därför bör den totala beläggningen mellan 60% och 80% syfta till att undvika dubbla beläggningar17. Såddprotokollet kan behöva anpassas med avseende på antalet sådda celler och tidslängden mellan sådd och det första tvättsteget. Till exempel kommer ett tvättsteg 30 min efter sådd istället för 1 h (se steg 5 och 6 i protokollavsnitt 2 Cell sådd) att minska antalet dubbelbebodda vidhäftningsplatser men kommer också att sänka det totala antalet upptagna vidhäftningsplatser för HuH7-celler.
Eftersom anslutningen av ett rörsystem till kanalrutschbanorna inte är obligatorisk är det lättare att fastställa användningen av ett reagens eller fluorescerande markör utan att använda ett rörsystem för att kontrollera om det finns bästa möjliga koncentrations- och inkubationstid. När ett lämpligt protokoll har upprättats för reagens/intressemarkör kan slangsystemet inkluderas i arbetsflödet.
Tidsfördröjning mikroskopi
Ett annat viktigt steg är inställningarna för tidsfördröjningsmätningen. Exponeringstiden för fluorescensmarkören måste till exempel väljas noggrant för att undvika fotoblekning av fluorfor- och fototoxicitetseffekterna men ändå säkerställa en bra fluorescenssignal. En annan viktig parameter för timelapse-installationen är den bästa lämpliga kombinationen av rumslig och temporal upplösning, som starkt beror på den observerade cellulära kinetiken. Om en hög temporal upplösning behövs kan endast ett mindre antal positioner i mikroarrayen skannas mellan två tidpunkter, vilket minskar det skannade observationsområdet och därmed också minskar statistiken. Observationsområdet är dessutom inte bara beroende av antalet skannade positioner utan också av målet och storleken på ett synfält på kameran. I det givna exemplet är en tidsupplösning på 10 min tillräcklig med hjälp av ett 10x-mål för att observera översättningskinetiken. Denna kombination gör det möjligt att skanna 70-100 positioner per tidpunkt beroende på kamerachipets storlek, mikroskopstegets hastighet och antalet bildkanaler (t.ex. faskontrast och eGFP-fluorescens).
bildbehandling
Analysen av den totala fluorescensen per cell underlättas eftersom cellerna placeras i en matris. Ändå beror kvaliteten på encelliga fluorescenstidskurser, särskilt signal-till-brusförhållandet (SNR), på algoritmen som används för integration av cellfluorescensintensiteter från bildserien. Bildbehandlingsstegen för programvaruverktyget PyAMA visas i figur 5. Bestämningen av integrationsområdena för encells fluorescensläsningen är särskilt viktig eftersom cellkonturen hos levande celler varierar med tiden. PyAMA integrerar fluorescensintensiteten över en cellkontur, som kan bestämmas av en inbyggd segmenteringsalgoritm. Ett alternativ skulle vara att integrera över fasta gränser baserat på mikromönstergeometri12,16. Den aktuella versionen av PyAMA utför bildsegmentering baserat på ett tröskelvärde för standardavvikelsen för pixelområden i bildkanalen för faskontrast. Segmenteringsresultat kan också importeras från extern programvara. För framtida versioner planeras inbyggt stöd för segmentering baserat på maskininlärning och för integrering över fasta gränser.
PyAMA erbjuder sig att filtrera bort avvikande celler eller avvikande tidskurser med hjälp av ett gränssnitt som möjliggör visuell inspektion av både fluorescensbilden samt fluorescenstidskurserna för valda celler (Figur 1C). Exempel på celler som kan uteslutas från analys är celler som genomgår delning eller apoptos eller som ligger utanför ett vidhäftningsställe. Aggregeringar av flera celler som felaktigt känns igen av spårningsalgoritmen som en enda cell måste också filtreras bort för att säkerställa att tidskurserna kommer från enstaka celler. PyAMA utför en förval av celler för att minska mängden manuell interaktion som krävs för att filtrera bort avvikande celler. Förvalet kan inspekteras och korrigeras för hand innan du exporterar tidsförrättarna för de markerade cellerna för att kompensera för felaktigheter i förvalet. Förvalet av den aktuella versionen av PyAMA baseras på ett tröskelvärde för cellstorleken för att avmarkera cellaggregeringar. För framtida versioner planeras ytterligare ett maskininlärningsbaserat förval, vilket gör det möjligt att ta hänsyn till ytterligare kriterier, inklusive exemplen för avvikande celler som beskrivs ovan.
Sammanfattningsvis använder LISCA-metoden encelliga matriser för att effektivt samla in fluorescenstidskurser med en cell. Att begränsa celler till mikrofabricerade vidhäftningsplatser underlättar spårning och bildanalys. Dessutom odlas celler i standardiserade lokala mikromiljö och presenteras därför med enhetlig yta när de utsätts för medel som lipidnanopartiklar för transfection. Denna aspekt är särskilt fördelaktig när cellulära heterogenitet inom en population undersöks. μPIPP-tekniken som beskrivs här är en av många mikrotillverkningstekniker som resulterar i regelbundna mikroarrayer av proteinmönster. Läsaren hänvisas till litteratur som granskar mikrokontakttryck, fotolitografiska metoder och mjuk litografi som alternativa tillverkningsprocesser6. Beroende på cellinjen kan den ena eller den andra mönstringstekniken vara att föredra. I våra experiment visade μPIPP-tekniken välpositionerade celler efter sådd av celler på grund av cellulär självsortering, som förlitar sig på restcellslim på PEGylated-området så att celler kan söka i slumpmässig migration och sprida sig på proteinmålmatriserna med differentiellt större självhäftsamhet17.
LISCA möjliggör förvärv av ett stort antal encelliga tidskurser av godtyckliga fluorescensmarkörer. Analys av fluorescenssignaler på encellsnivå, i motsats till bulkexperiment, ger orörda encelliga tidskurser och avslöjar cell-till-cell-variabilitet. Cellulär heterogenitet spelar en framträdande roll i cell öde beslut såsom apoptos18,19,20. I detta sammanhang utvidgade vi nyligen LISCA-metoden med hjälp av två fluorescenskanaler som möjliggör analys av temporala korrelationer av två cellulära händelser samtidigt som vi anger särskilda stadier inom celldödssignaleringskaskaden19. Inom detta forskningsområde presenterar sig LISCA som ett alternativ till flödescytometrimätningar. Även om flödescytometri onekligen ger ett snabbare arbetsflöde och vanligtvis ger större statistik, förvärvas data vid en viss tidpunkt. Heltidsberoenden ger uppskattningar av kinetiska parametrar och avslöjar temporala korrelationer mellan olika fluorescenssignaler, som annars är svåra att komma åt. För att kunna använda flera fluorescenskanaler kräver installationen automatiserade filterhjul eller flera kameror. I detta fall bör även encellig FRET-analys vara genomförbar och möjliggöra tidsbefriade studier av närheten mellan fluorescerande märkta molekyler. En nackdel med bildbaserad analys som LISCA är arbetet kopplat till visuella kontroller och avvikande identifiering. Här kan maskininlärningsverktyg underlätta databehandling och möjliggöra helautomatisk dataanalys. I framtiden, med hjälp av automatiserade mikroskopiplattformar, snabbmatrismikrotillverkning och artificiell intelligens, kan LISCA:s genomströmning och tillämplighet ökas avsevärt. Dessutom är efterföljande analys av celler som uppvisar ovanliga fluorescenssvar med mikrofluidisk extraktion 21och encellig genomik ett vanligt krav inom läkemedelsindustrin. Protokollet som presenteras i denna artikel passar efterfrågan på att studera kinetiken i cellulära processer med encellsupplösning och adekvat statistik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från German Science Foundation (DFG) till Collaborative Research Center (SFB) 1032. Stöd från det tyska federala ministeriet för utbildning, forskning och teknik (BMBF) inom ramen för samarbetsprojektet 05K2018-2017-06716 Medisoft samt ett bidrag från Bayerische Forschungsstiftung är tacksamt erkänt. Anita Reiser fick stöd av ett DFG-stipendium genom Graduate School of Quantitative Biosciences Munich (QBM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adtech Polymer Engineering PTFE Microtubing | Fisher Scientific | 10178071 | |
| baking oven | Binder | 9010-0190 | |
| CFI Plan Fluor DL 10x | Nikon | MRH20100 | |
| Desiccator | Roth | NX07.1 | |
| Eclipse Ti-E | Nikon | ||
| eGFP mRNA | Trilink | L-7601 | |
| Female Luer to Tube Connector | MEDNET | FTL210-6005 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Fibronectin | Yo Proteins | 663 | |
| Filter set eGFP | AHF | F46-002 | |
| Fisherbrand Translucent Platinum-Cured Silicone Tubing | Fisher Scientific | 11768088 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Incubation Box | Okolab | OKO-H201 | |
| incubator | Binder | 9040-0012 | |
| L-15 without phenol red | Thermo Fisher | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668027 | |
| Male Luer | in-house fabricated consisting of teflon | ||
| Male Luer to Tube Connector | MEDNET | MTLS210-6005 | alternative to in-house fabricated male luers |
| NaCl (5 M) | Thermo Fisher | AM9760G | |
| Needleless Valve to Male Luer Connector | MEDNET | NVFMLLPC | |
| NIS Elements | Nikon | Imaging software Version 5.02.00 | |
| NOA81 | Thorlabs | NOA81 | Fast Curing Optical Adhesive for tube system assembly |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| PCO edge 4.2 M-USB-HQ-PCO | pco | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | in-house prepared | ||
| Plasma Cleaner | Diener Femto | Pico-BRS | |
| PLL(20 kDa)-g[3.5]-PEG(2 kDa) | SuSoS AG | ||
| silicon wafer mit mircorstructures | in-house fabricated | ||
| Sola Light Engine | Lumencor | ||
| sticky slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 1673921 | |
| Tango 2 | Märzhäuser | 00-24-626-0000 | |
| Ultrapure water | in-house prepared | ||
| uncoated coverslips | ibidi | 10813 | |
| Injekt-F Solo, 1 mL | Omilab | 9166017V | with replacement sporn |
References
- Altschuler, S. J., Wu, L. F. Cellular heterogeneity: do differences make a difference. Cell. 141 (4), 559-563 (2010).
- Locke, J. C., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).
- Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
- El-Ali, J., Sorger, P. K., Jensen, K. F. Cells on chips. Nature. 442 (7101), 403-411 (2006).
- Segerer, F. J., et al. Versatile method to generate multiple types of micropatterns. Biointerphases. 11 (1), 011005 (2016).
- Piel, M., Théry, M. Micropatterning in cell biology, part A/B/C. , Elsevier. (2014).
- Reiser, A., Zorn, M. L., Murschhauser, A., Rädler, J. O. Cell-Based Microarrays: Methods and Protocols. Ertl, P., Rothbauer, M. , Springer. New York. 41-54 (2018).
- Picone, R., Baum, B., McKendry, R. Methods in cell biology. 119, Elsevier. 73-90 (2014).
- Reiser, A. Single-cell time courses of mRNA transport and translation kinetics. , Ludwig-Maximilians University. PhD thesis (2019).
- Woschée, D. Softmatter LMU-Raedler Group. , Available from: https://github.com/SoftmatterLMU-RaedlerGroup/pyama (2020).
- Schwarzfischer, M., et al. MIAAB, 29262. , Available from: https://push-zb.helmholtz-muenchen.de/frontdoor.php?source_opus=6773 (2020).
- Reiser, A., et al. Correlation of mRNA delivery timing and protein expression in lipid-based transfection. Integrative Biology. 11 (9), 362-371 (2019).
- Reiser, A., Woschée, D., Mehrotra, N., Krzysztoń, R. S., Strey, H. H., Rädler, J. O. Supplementing data and code for: "Correlation of mRNA delivery timing and protein expression in lipid-based transfection". Zenodo. , Version 1.0 (2019).
- Ferizi, M., et al. Stability analysis of chemically modified mRNA using micropattern-based single-cell arrays. Lab on a Chip. 15 (17), 3561-3571 (2015).
- Fröhlich, F., et al. Multi-experiment nonlinear mixed effect modeling of single-cell translation kinetics after transfection. NPJ systems biology and applications. 4 (1), 1-12 (2018).
- Krzysztoń, R., et al. Single-cell kinetics of siRNA-mediated mRNA degradation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 21, 102077 (2019).
- Röttgermann, P. J., Alberola, A. P., Rädler, J. O. Cellular self-organization on micro-structured surfaces. Soft Matter. 10 (14), 2397-2404 (2014).
- Röttgermann, P. J., Dawson, K. A., Rädler, J. O. Time-resolved study of nanoparticle induced apoptosis using microfabricated single cell arrays. Microarrays. 5 (2), 8 (2016).
- Murschhauser, A., et al. A high-throughput microscopy method for single-cell analysis of event-time correlations in nanoparticle-induced cell death. Communications Biology. 2 (1), 1-11 (2019).
- Chatzopoulou, E. I., et al. Chip-based platform for dynamic analysis of NK cell cytolysis mediated by a triplebody. Analyst. 141 (7), 2284-2295 (2016).
- Sztilkovics, M., et al. Single-cell adhesion force kinetics of cell populations from combined label-free optical biosensor and robotic fluidic force microscopy. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
