Summary
マイクロパターン配列を用いた単一細胞からの蛍光レポータータイムコースの取得方法を紹介する。このプロトコルは、単一細胞アレイの調製、ライブセルスキャンタイムラプス顕微鏡のセットアップと動作、および接着部位あたりの細胞統合蛍光時間コースの自動事前選択、視覚制御および追跡のためのオープンソース画像分析ツールを記述する。
Abstract
単一細胞アレイ(LISCA)のライブセルイメージングは、高スループットで個々の細胞からの蛍光信号の時間コースを収集するための汎用性の高い方法です。一般に、培養細胞からの単細胞時間コースの獲得は、細胞の運動性および細胞形状の多様性によって妨げられる。接着剤マイクロアレイは、単一細胞条件を標準化し、画像解析を容易にします。LISCAは、単一細胞マイクロアレイと、走査時間経過顕微鏡と自動画像処理を組み合わせたものです。ここでは、単細胞蛍光時間コースをLISCA形式で取る実験ステップについて説明する。また、強化された緑色蛍光タンパク質(eGFP)用のmRNAコードを用いて微小パターン配列に付着した細胞をトランスフェクトし、走査時間経過顕微鏡を介して数百個の細胞のeGFP発現動態を並行して監視します。画像データスタックは、選択した細胞の輪郭に蛍光強度を統合して単一細胞蛍光時間コースを生成する新開発のソフトウェアによって自動的に処理されます。mRNAトランスフェクション後のeGFP発現時間コースは、mRNAの発現および分解率を明らかにする単純な運動翻訳モデルによって十分に記述されていることを実証する。アポトーシスのシグナル伝達の文脈における複数マーカーのイベント時間相関に対するLISCAのさらなる応用が議論される。
Introduction
近年、単細胞実験の重要性が明らかになってきた。単一細胞からのデータは、細胞間変動、細胞内パラメータ相関の分解能、およびアンサンブル測定1、2、3に隠されたままの細胞動態の検出の調査を可能にする。数千個の単一細胞の細胞動態を並行して調べるには、数時間から数日間の期間にわたって標準化された条件下で細胞を監視し、定量的なデータ分析4を行う新しいアプローチが必要である。ここでは、マイクロ構造化アレイとタイムラプス顕微鏡と自動画像解析を組み合わせた単一細胞アレイ(LISCA)のライブセルイメージングを紹介します。
マイクロ構造化単一細胞アレイを生成するためのいくつかの方法が確立され、文献5,6に掲載されています。ここでは、マイクロスケールのプラズマ開始タンパク質パターニング(μPIPP)について簡単に説明します。μPIPPを用いた単一セルアレイ製作の詳細なプロトコルは、リファレンス7にも記載されています。単一細胞配列を用いると、各細胞に対して定義された微小環境を提示する標準化された接着スポットに数千個の細胞を整列させ、実験変動の原因を減少させる(図 1A)。単一細胞アレイは、さまざまな細胞プロセスを示すために目的とする蛍光マーカーの時間コースを監視するために使用されます。スキャンタイムラプスモードにおける長期顕微鏡検査により、単一細胞アレイの広い領域を監視し、数時間または数日の観察時間にわたってハイスループットで単一細胞データをサンプリングすることができます。これにより、配列の各位置から画像の時系列スタックが生成されます(図1B)。大量の画像データを削減し、望ましい単一細胞蛍光時間コースを効率的に抽出するためには、細胞の位置決めを利用した自動画像処理が必要である(図1C)。
LISCAの課題は、実験プロトコルと計算ツールを適応させて、細胞動態の定量的で再現可能なデータを生成するハイスループットアッセイを形成することです。本稿では、個々の方法と、それらをLISCAアッセイでどのように組み合わせるかについて、ステップバイステップで説明します。一例として、人工mRNA送達後の強化された緑色蛍光タンパク質(eGFP)発現の経時経過について考察する。mRNA送達後のeGFP発現は、mRNAの翻訳および分解をモデル化した反応速度式によって説明される。eGFP濃度の時間経過に対するモデル関数を、時間の経過とともに個々の細胞ごとに蛍光強度のLISCA読み出しに適合させることで、mRNA分解率などのモデルパラメータの最良の推定値が得られます。代表的な結果として、2種類の異なる脂質系トランスフェクション剤のmRNA送達効率と、そのパラメータ分布の違いについて考察する。
図1:(A)マイクロパターン単細胞アレイ(B)走査時間経過顕微鏡と(C)記録画像系列の自動画像解析を組み合わせたLISCAワークフローの表現単細胞アレイは、マイクロパターン上の細胞の配置につながる細胞忌避的な空間を有する細胞接着性の二次元パターンからなるが、相コントラスト画像ならびにeGFP発現細胞の蛍光像(A)に見られるように。マイクロ構造領域全体が、一連の位置(B)で繰り返し画像を撮影するスキャンタイムラプスモードで画像化されます。記録された画像シリーズは、時間の経過に関する細胞あたりの蛍光強度を読み出すために処理される(C)。スケールバー:500 μm(A)、200μm(C)この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Protocol
図2:単細胞マイクロアレイ(A)と走査タイムラプス顕微鏡(B)を組み合わせたデータ取得タイムラプス実験の準備として、2Dマイクロパターンの接着四角形を持つ単一細胞配列を用意し(1)、続いて細胞播種とマイクロパターン上の細胞の位置合わせ(2)、および6チャンネルスライドへの灌流システムの接続を行い、タイムラプス測定中の液体処理を可能にする(3)。走査タイムラプス実験(4)を設定し、細胞は、タイムラプス実験(5)の間に灌流系を介してmRNAリポプレックス溶液を注入することによって顕微鏡にトランスフェクトされる。スケールバー:200 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
1. マイクロストラクチャード単一セルアレイ製造 (図2A)
- μPIPPアレイの製造に必要な材料を準備します。
- pH 7.4で無菌リン酸緩衝生理食塩分(PBS)を準備します。
- 25°Cで少なくとも18 MΩcmの抵抗率で滅菌超純水を調製してください。
- PLL(20 kDa)-g[3.5] PEG(2 kDa) (PLL-PEG) 150 mM NaClおよび10 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジネタンスルホン酸(HEPES)を含む超純水中のPLL-PEG濃度2mg/mLの働く溶液を準備します。
- 表面コーティング用の細胞外マトリックスタンパク質溶液を調製:PBSで1 mg/mLフィブロネクチン(FN)
- 再利用可能なマスターとして機能するフォトリソグラフィ8 によって作製されたマイクロパターンを用いてシリコンウエハーを用意する。マイクロパターンは、エッジ長が30μm、深さ12μm、60μmの角距離で構成され、幅6mm、高さ18mmの6つのストライプに配置されています。
- ポリジメチルシロキサン(PDMS)モノマーを9%架橋機(質量%)と混合するシリコーンエラストマーキットを使用し、デシケータを使用して気泡がなくなるまで約30分間脱気します。シリコンウエハースを約3~5mmの厚いPDMS層でキャストし、泡がなくなるまで約30分間再び脱気します。
- 50°CのベーキングオーブンにPDMSとシリコンウエハーを入れて、PDMSを少なくとも4時間硬化させる。
- PDMS スタンプを切ります。
- メスを使用し、6つのマイクロパターンストライプを含むPDMS層1 PDMS傑作を切り取ります。
- マイクロパターンを上向きにしてベンチにPDMSの傑作を置きます。
- PDMSの傑作の6つのマイクロパターンストライプを、カミソリの刃でそれぞれPDMSスタンプに切り取ります。PDMS スタンプのエッジが開いている場合は、パターン化された領域の一部を切り取ります。
- PDMS スタンプを、6 チャンネルスライドのカバースリップに置きます (図 3-1)。
- コーティングされていないカバースリップを使用し、カバースリップの保護箔を慎重に引っ掻いて、6チャンネルスライドのチャンネル位置をマークします。次に、保護ホイルを下向きにして、カバースリップをベンチに置きます。
- マイクロパターンが下向きの PDMS スタンプを、ピンセットを使用してマークされたチャネル位置のカバースリップの下方に置きます。
- PDMSスタンプの取り付けを顕微鏡で確認します。PDMS スタンプがカバースリップに完全に取り付けられている場合、接触する正方形はスペースのスペースよりも暗く見えます。PDMS スタンプをカバースリップに取り付けるのは、マイクロパターンの品質にとって非常に重要です。
- 6つのPDMSスタンプを入れてプラズマクリーナーにカバースリップを置き、酸素プラズマ(圧力0.2mbar、〜40 Wで3分間)で処理し、PDMSスタンプとカバースリップ親水性の間の表面を作ります(図3-2)。
- バイオセーフティキャビネットでマイクロパターン製作のすべてのさらなるステップを実行します。PLL-PEG溶液の15 μLを使用し、各PDMSスタンプの隣にピペットを1滴ずつ使用して、PLL-PEG溶液をPDMSスタンプの親水性パターンに吸収するようにします(図3-3)。PLL-PEGを室温で20分間インキュベートします。
- PDMSスタンプを貼ったカバースリップの上に1mLの超純水をすすいで、ピンセットを使用してPDMSスタンプを取り除きます(図3-4)。その後、1 mLの超純水でカバースリップを2回リンスし、乾燥させます。
- カバースリップが完全に乾燥したら、6チャンネルのスティッキースライドをカバースリップに貼り付けます(図3-4)。マイクロパターン化された領域がチャネルの下部に合うように注意してください。
- FNで接着の正方形を機能化します。
- 各チャンネルに40μLのPBSを充填します。
- PBSで100μg/mL FN溶液を調製します。
- FN溶液の40μLを各チャンネルに追加します(図3-5)。1つの貯留層から40 μLを取り除き、同じチャネルの反対側の貯留層に3回加えて均質な溶液を生成することによって、チャネル内のPBSとFN溶液を完全に混合します。FN溶液を室温で45分間インキュベートします。
- 各チャンネルを120μLのPBSで3回洗浄します(図3-6)。
- パターンの品質を確認するには、ステップ9.2で蛍光標識FNを使用してください。(図4A)
注:PLL-PEGとFNが基板に共有結合せず、時間の経過とともにパターンの品質が低下する可能性があるため、セルシードの1日前までにμPIPPアレイを準備することをお勧めします。準備したμPIPPアレイを冷蔵庫に保管します。
図3μPIPPによる単一細胞マイクロアレイの製造(1)表面に三次元マイクロパターン構造を有するPDMSスタンプは、6チャンネルスライドのカバースリップ上に配置されている。(2)PDMSスタンプを貼ったカバースリップを酸素プラズマで処理し、表面を親水性にする。(3) PLL-PEGが追加されます。毛細管力によって微細構造に吸収され、PDMSスタンプセル忌避剤で覆われない表面を作ります。(4) カバースリップは、残りのPLL-PEGを除去するために水ですすがされる。その後、PDMSスタンプが取り外され、6チャンネルのスティッキースライドがカバースリップに貼り付けられます。(5)フィブロネクチンは、細胞外マトリックスのタンパク質であり、PLL-PEG細胞接着剤を含まない領域を作るために添加される。(6)6チャンネルスライドをリン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
2. 細胞の播種 (図 2A)
注:次の洗浄手順では、1つのリザーバにそれぞれの液体を追加し、チャネルの反対側の貯水池から液体の等しい量を取り除きます。
- 37 °C完全に補った細胞増殖培地の120 μLで各チャネルを洗浄します。セルサスペンションを追加する前に、チャネルのみが培地で満たされ、リザーバが充填されていないことを確認してください。
- 細胞の通過のための標準的なプロトコルに従って細胞培養フラスコからHuH7細胞を取り外し、細胞懸濁液濃度を4 x 105 細胞/mLに調整します。
- 40 μLの細胞懸濁液を加え、1つのリザーバから40μLを取り除き、同じチャネルの反対側の貯留層に3回加えて均質な細胞分布に到達することによって細胞増殖培地を細胞懸濁液と混合する(図4B)。
- チャンネルから40μLのサスペンションを取り除き、チャンネルだけがセルサスペンションで満たされるようにします。
- スライドをインキュベーターに入れ、位相対照顕微鏡を用いて播種後1時間で細胞接着を確認します。
- 37°Cの温細胞増殖培地の120μLを加えます。
- しかし、マイクロパターン上で細胞自己組織化を可能にするために、さらに3時間インキュベーターに戻ってスライドする(図4C)。
図4μPIPPアレイの細胞自己組織化と品質管理( A)マイクロ構造表面は、セル忌避ポリマーに囲まれた赤で示された二乗FN被覆接着スポットから構成されています。(B)細胞播種後、HuH7細胞はランダムに分布し、(C)は4時間の期間にわたって主に接着点に付着する。許可付きで再印刷7.スケールバー:200 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
3. 灌流システム (図2A)
注:灌流システムの使用は、試薬または蛍光マーカーをタイムラプス測定の過程で追加する必要がある場合にのみ必要です。ニーズに応じて、各チャンネルを別々の灌流システムに接続したり、直列の複数のチャンネルを同じ灌流システムに接続したりできます。灌流システムの数は、独立した実験条件の数に対応しています。バイオセーフティキャビネットで無菌状態でチューブを接続し、灌流システムに気泡が含まれるのを避けてください。灌流システムを使用しない場合は、タイムラプス測定の前にバイオセーフティキャビネットに試薬/マーカーを追加します。灌流システムは社内で製造され、使用材料は材料表に記載されています。灌流システムの組立については、前述9.
- 1 mL のシリンジ (交換用スポーン付き) を使用し、37 °C の細胞増殖培地の 1 mL でシリンジを充填します。
- バルブを使用して注射器を入口チューブに接続し、チューブに媒体を充填します。
- 入口管をチャネルの貯留層に接続し、気泡が閉じ込められないようにします。
- この灌流システムに直列の別のチャネルを接続するには、現在のチャネルの入口管と反対のリザーバにシリアルコネクタを接続します。次のチャネルに進み、シリアルコネクタのフリーエンドをその貯水池の1つに接続します。
- 必要な数のチャンネルが連続して接続されるまで、上記の手順を繰り返します。
- 現在のチャネルのフリー貯蔵所に直接出口の管を接続して下さい。接続されたチューブを媒体で満たし、灌流システムが漏れていないことを確認します。
- スライドの 6 つのチャネルすべてが灌流システムに接続されるまで、前の手順を繰り返します。
- 接続された灌流システムを使用してスライドをインキュベーターに戻し、さらに使用するか、顕微鏡の加熱室に直接置き、タイムラプス測定のために37°Cに予め温めます。
4. タイムラプス顕微鏡 (図 2B)
注:長期測定では、安定温度37°C、安定したCO2レベルを維持してください。CO2依存性細胞増殖培地の代替として、ガスインキュベーションシステムが不要なL15培地を使用する。
注:定量的イメージングの場合、タイムラプス測定中にフェノールレッドのない細胞増殖培地を使用してバックグラウンド蛍光を低減し、タイムラプスプロトコルと同じ設定を技術的な複製に使用します。
- 10x目的および適切な蛍光フィルタを使用して、750 ms(カメラによって異なる)の露光時間(カメラによって異なる)、連続したループ間の10分間隔、および30時間の観察時間を持つ位相コントラスト画像と蛍光画像を記録するためのタイムラプスプロトコルを設定します。
- 37°Cの温熱室のサンプルホルダーに、セルを単一セルアレイに入れた6チャンネルスライドを置きます。灌流システムが6チャンネルスライドに接続されている場合は、液体交換中に6チャンネルスライドが移動しないように、テープを使用してチューブをステージに固定します。15 mL反応チューブの穴を通して出口管の自由端を挿入し、液体廃棄物を収集します。
- スキャン時間経過測定の位置リストを設定します。位置リストを通じて連続ループの間に定義された時間間隔内で、位置の数をスキャンできることを確認します。10xの目的を使用すると、カメラチップのサイズに応じてマイクロパターン領域全体をスキャンするようにチャンネルあたり10〜30の位置を設定できます。
- タイムラプス測定を開始します。長期測定の画質を向上するには、自動焦点補正システムを使用してください。
5. 蛍光マーカー - mRNA トランスフェクション (図 2B)
注:チューブシステムで接続された2つのチャンネルのトランスフェクションでは、合計600 μLトランスフェクションミックス(1チャンネルに対して300 μL)が必要です。示されたボリュームは、2つの接続されたチャネルでのトランスフェクションを指します。
- トランスフェクション剤を200μLの血清還元培地に1μL希釈してトランスフェクション剤溶液を調製し、室温で5分間インキュベートします。
- 血清還元培地の150 μLでeGFP用にコードするmRNAの300 ngを希釈してmRNA溶液を調製します。
- トランスフェクション剤溶液150μLをmRNA溶液に添加してトランスフェクションミックスを調製し、よく混合します。トランスフェクションミックスを室温で20分間インキュベートします。
- トランスフェクションミックスのインキュベーション中に注射器を使用して、37°Cの温かいPBSの1 mLでチューブシステムを洗い流します。チューブをフラッシュする際は、顕微鏡の段階が動かないことを確認してください。必要に応じて、タイムラプスの測定を一時停止します。
- トランスフェクションミックスを、300 μLの血清還元培地を添加して、0.5 ng/μLの最終的なmRNA濃度まで希釈します。
- 注射器を使用してトランスフェクションミックスでチューブシステムを洗い流し、mRNAリポプレックスを1時間インキュベートさせます(必要に応じてタイムラプス測定を一時停止します)。
- トランスフェクションインキュベーションを停止し、注射器を使用して37°Cの温かい完全に補った細胞増殖培地の1 mLで洗浄することによって、非結合mRNAリポプレックスを洗い流します(必要に応じてタイムラプス測定を一時停止)。
6. 画像解析と蛍光読み出し
- 画像解析を初めて実行する場合、オープンソースソフトウェア「Pythonでの自動微細構造解析」(PyAMA)のバージョン0.1.6を、引用した場所10 から、そこに提供されている指示に従ってインストールします。
- イメージ チャンネル (位相コントラストと蛍光) がマルチイメージ 16 ビット TIFF ファイルとして使用できることを確認します。必要に応じて、それに応じて変換します。
- PyAMAを起動し、 オープンスタックを クリックして、分析用の画像を開きます。
- 開くマルチイメージ TIFF ファイルごとに、[開く] をクリックし、ダイアログの左側にあるロードされたファイルの一覧に表示されるようにファイルを選択します (図 5-1)。
- 解析に含めるチャネルをマークします。各チャネルについて、次の手順を実行します。
- 読み込まれたファイルのリストから、チャネルを含む TIFF ファイルを選択します。
- [ 新しいチャネルの追加 ]セクションで、TIFF ファイルでチャネルのインデックスを選択します。インデックスは 0 から始まります。最初のチャネルにはインデックス 0 が、2 番目のチャネルにはインデックス 1 が含まれます。
- チャンネルタイプを選択します。対応する画像チャンネルに対して「 位相コントラスト 」または「 蛍光」 を選択し、セルの輪郭線を示すバイナリチャンネルの セグメンテーション を選択します。
- 必要に応じて、異なる蛍光チャネルを識別するためのチャネルのラベルを入力します: eGFP と DAPI.
- チャネルを構成したら、[ 追加] をクリックします。
- 追加したすべてのチャンネルがダイアログの右側のチャンネルリストに表示されたら 、[OK] をクリックしてスタックをロードします。
- 位相コントラスト画像に基づくセル認識用のPyAMA組み込みセグメンテーションアルゴリズムを使用してセグメンテーションを実行するには(図5-2)、ツール|バイナライズ.をクリックし、バイナリ化されたチャネルを持つ NumPy ファイルのファイル名を入力します。
注: 現在のバージョンでは、バイナリ化されたチャネルをロードするには、すべてのチャネルを再ロードする必要があります。 - 蛍光チャネル(図5−3)でバックグラウンド補正11を実行するには、蛍光チャネルとセグメンテーションチャネルがロードされていることを確認する。セグメンテーション チャネルがロードされていない場合は、自動セグメンテーション用に位相コントラスト チャネルがロードされていることを確認します。「ツール>背景修正.」に移動します。をクリックし、結果として生成される TIFF ファイルのファイル名を選択し、蛍光チャネルが正しい。
注: 現在のバージョンでは、バックグラウンドで補正されたチャネルをロードするには、すべてのチャンネルを再ロードする必要があります。 - 事前に選択されたセル (図 5-4) とそれらの統合蛍光シグナル (図 5-5)を、時間枠をスクロールし、左側のチャネル メニューにリストされているチャネルを表示し、セルをクリックして蛍光時間コースをハイライト表示します (図 1C)。セル選択を使用して、生存不可能なセル、接着スポットに限定されない、または別のセルに結合されたセルを、さらなる分析から除外します。 Shift キー を押しながらセルをクリックするか、セルを強調表示して Enterキーを押して、読み出しのセルの選択を切り替えます。
- | [ファイル]をクリックして、セル領域と統合蛍光の単一セル時間コースを保存します(図5-6)。 保存 先のディレクトリを保存して選択します。
図5:PyAMAを用いたタイムラプス画像シリーズの自動画像処理(1)各撮像位置の位相コントラストおよび蛍光画像系列がインポートされる。(2) セルの輪郭は、位相コントラスト画像スタック上のセグメンテーションによって決定されます。(3)蛍光画像に背景補正を適用する。(4) セルの輪郭は時間の経過とともに追跡され、エクスポートのために事前に選択されます。(5)蛍光強度は、追跡された細胞の輪郭に基づいて統合される。(6)単細胞領域と統合蛍光強度を評価し、各細胞の時間コースをエクスポートする。スケールバー:100 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- mRNAトランスフェクション後の翻訳動力学を解析するために、Reiser et al.12が前述したように、生化学的速度方程式に基づく翻訳モデルを各単細胞時間経過に適合させる。その研究で使用されるデータとコードは、公開されている13.
- 各単一細胞時間コースについて、mRNA分解速度と翻訳の起点を表す翻訳モデルの推定フィッティングパラメータを取得します。サンプル・データ・セットについては、代表的な結果セクションで説明します。
- さまざまな実験条件のパラメータの最良の推定値の分布に関するさらなる分析を実行し、細胞集団内の細胞間変動を調査します。
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Representative Results
LISCAアプローチは、単一細胞から効率的に蛍光時間コースを収集することができます。代表的な例として、トランスフェクション後の単細胞eGFP発現を測定するためにLISCA法がどのように適用されるかの概要を示す。LISCA実験のデータは、効率的なmRNA薬の開発に重要であるmRNA送達キネティックスを評価するために使用されます。
特に、翻訳の時点の発症と発現速度に関する2つの脂質ベースのmRNA送達系の影響を単細胞レベルで示す。細胞を培養し、そのバッチを2つの集団に分けた。プロトコルセクションに記載されているように、1つの亜集団がリポプレックスでトランスフェクトされた。他の亜集団は、同じ最終mRNA濃度を有する同じmRNAを用いてトランスフェクトしたが、送達系として脂質ナノ粒子(LNP)を用いて、マイクロ流体混合12を用いて製造した。異なる脂質組成とリポプレックスとLnPsのmRNA送達系の異なる製造のために、我々は取り込み動力学が影響を受けるべきであるように翻訳キネティクスに影響を与えることを期待する。LISCA法を用いて、トランスフェクション後の翻訳発症の時点t0を定量化し、細胞がeGFPを発現する強さを定量化し、これはトランスフェクトされたmRNA分子の生成物m0および翻訳速度kTLに依存する。これら 2 つのパラメータを取得するには、図 6Aでスケッチした 3 段階の変換モデルを適合させます。mRNA分子がサイトゾル内の時点t0で正常に放出された後、mRNAはレートkTLで非蛍光性である非凝結されたeGFP G*に翻訳される。非凝結G*は、レートkM〜eGFPGで成熟し、その蛍光強度は、タイムラプス測定中に測定される。mRNAは、(未化および交配された)eGFPと同様に、それぞれの分解速度δおよびγで時間の経過とともに低下する。モデルは通常の微分方程式で記述され、Gの解析解はパラメータ推定のモデル関数として使用されます。モデル関数は、図 6Bに示すように、各単一セル時間コースに適合し、時間コースの例(グレー)とそれぞれの適合度(緑)を使用します。図6Cでは、翻訳発症の時点t0のヒストグラムとリポプレックストランスフェクト細胞の発現率m0kTLを示す。 両方のパラメータが各セルについて推定されるため、これらのパラメータの相関は散布図(図6D、青のデータ)に示すように分析することができ、LNP(赤)でトランスフェクトされた細胞と比較することができます。図6Dに示すように、LNPでトランスフェクトされた細胞は、リポプレックスにトランスフェクトされた細胞と比較して細胞間変動性が低く、母集団平均は、より速い発現速度(黒い輪郭を持つ太いドット)の翻訳の発症を示す。
これら2つのデータセットは、LISCAを使用してmRNAトランスフェクション後の翻訳を研究する方法の一例に過ぎません。さらに調査は、例えばmRNA配列修飾 14に依存するmRNA安定性に関して、可変レポータータンパク質安定性 15、またはsiRNA媒介mRNA分解 16に関して行うことができる。
図6:単細胞eGFP翻訳動態のデータ分析(A)mRNA送達後のレポータータンパク質eGFPの翻訳動態は、それぞれのパラメータを用いた3段階反応速度式で記述できる。(B)モデルは、各単一細胞eGFP発現時間経過(灰色のトレース)に適合(緑色のトレース)を用いて、トランスフェクション発症の時点(t0)および発現速度(m0kTL)などのモデルパラメータを推定し、mRNA送達効果を定量化するための2つのパラメータを示す。(C) トランスフェクション発症時間および発現率のパラメータ分布のヒストグラム。(D) 各セルのパラメータが推定されるため、これらのパラメータの散布図はパラメータの相関を示します。小さなドットは、単一のセルのパラメータを表します。このプロットは、mRNA LNPs(赤)およびmRNAリポプレックス(青)でトランスフェクトされた細胞を示しています。黒いアウトラインの太いドットは、それぞれの母集団平均に対応します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、単細胞レベルで細胞内蛍光標識の細胞動態に従う多目的技術としてLISCAを説明した。LISCA実験を成功させるためには、プロトコルセクションの各ステップを個別に確立し、すべてのステップを組み合わせる必要があります。LISCAの3つの主要な側面のそれぞれは、重要なステップを備えています。
単一細胞マイクロアレイ製造
マイクロアレイの細胞の位置合わせは、さらなる実験ステップだけでなく、データ品質にも影響を与えるため、マイクロアレイの品質は非常に重要です。このため、パターンの幾何学および製造方法は、使用される細胞に対して適合されなければならない。本稿で説明した代表的な結果は、肝臓癌細胞株HuH7が(30μm)2の正方形のパターンに整列して生成された。このパターンジオメトリは、A549 や HEK293 などの他のセルラインにも適しています。BEAS-2B のような大きなセルでは、35 μm のエッジ長と 80 μm の 2 乗距離を持つ大きな正方形パターンを使用できます。記載された播種手順はHuH7細胞に対して最適化されるが、他の多くの接着細胞17に適合させることができる。例えば、一部の細胞株は、接着スポットの異なるサイズを必要とするか、または細長い細胞を介して細胞細胞の接触を避けるために接着スポット間のより大きな間隔を必要とします。
マイクロパターンは、接着部位領域が標準的な培養皿における細胞の平均面積とほぼ一致するよう調整されるべきである。ジオメトリは円形または二乗することができ、細胞生存率の測定可能な効果はありません。セルの動きは、セルが回転することが多いラウンドパターンに比べて、正方形のパターンでは制限されているようです。新しい細胞株を初めて使用する場合は、別の生存率テストをお勧めします。特定の細胞株が接着スポットの占有率を高くし、同時に接着スポットの二重占有を最小限に抑えるために、シード密度を調整する必要があります。典型的には、接着部位あたりの細胞数の占有率はポアソン統計に従い、ゼロ、1または2のいずれかである。したがって、60%と80%の間の総占有率は、二重占有を避けることを目的とすべきである17.シード処理プロトコルは、シードされた細胞の数と、播種と第1の洗浄工程との間の時間の持続時間に関して適合させる必要がある場合があります。例えば、1hの代わりに播種後の洗浄工程30分(プロトコルセクション2セルシードのステップ5と6を参照)は、二重占有接着スポットの数を減らすが、HuH7細胞の占有接着スポットの総数も減少する。
チューブシステムとチャンネルスライドの接続は必須ではないため、最適な濃度とインキュベーション時間をチェックするためにチューブシステムを使用せずに試薬や蛍光マーカーの使用を確立する方が簡単です。目的の試薬/マーカーに適したプロトコルが確立された後、チューブシステムをワークフローに含めることができます。
タイムラプス顕微鏡
もう一つの重要なステップは、タイムラプス測定の設定です。例えば、蛍光マーカーの暴露時間は、蛍光色素の光の消光を避け、光毒性の効果を避けるために慎重に選択する必要がありますが、それでも良好な蛍光シグナルを確保する必要があります。タイムラプスセットアップのもう一つの重要なパラメータは、観測された細胞動態に大きく依存する空間と時間分解能の最適な組み合わせです。高い時間分解能が必要な場合、マイクロアレイ内の位置の数を小さくして2つの時間ポイント間でスキャンするだけで、スキャンされた観測領域が減少し、統計も減少します。観察領域は、スキャンされた位置の数だけでなく、カメラの1つの視野の目的とサイズにも依存します。例では、10倍の目的を使用して10分の時間分解能で翻訳キネティクスを観察します。この組み合わせは、カメラチップのサイズ、顕微鏡ステージの速度、およびイメージングチャネルの数(例えば、位相コントラストおよびeGFP蛍光)に応じて、時間ポイントあたり70〜100の位置をスキャンすることができます。
画像処理
細胞が配列内に配置されると、細胞あたりの全蛍光の分析が容易になります。しかし、単一細胞蛍光時間コースの品質、特に信号対雑音比(SNR)は、画像系列からの細胞蛍光強度の統合に使用されるアルゴリズムに依存する。ソフトウェア ツール PyAMA の画像処理手順を図 5に示します。生細胞の細胞輪郭は時間とともに変化するため、単細胞蛍光読み出しのための積分領域の決定は特に重要である。PyAMAは、組み込みのセグメンテーションアルゴリズムによって決定することができる細胞輪郭上の蛍光強度を統合します。代替方法として、マイクロパターンジオメトリ12,16に基づいて固定境界を介して統合する方法があります。PyAMAの現在のバージョンは位相コントラスト画像チャネルの画素近傍の標準偏差に基づいて画像セグメンテーションを行います。セグメンテーション結果は、外部ソフトウェアからもインポートできます。将来のバージョンでは、機械学習に基づくセグメンテーションと固定境界を越えた統合のためのネイティブサポートが計画されています。
PyAMAは、選択した細胞の蛍光時間コースと同様に蛍光画像の両方の目視検査を可能にするインターフェースを使用して外れ値細胞または異常な時間コースをフィルタリングすることを提供する(図1C)。分析から除外される可能性のある細胞の例としては、分裂またはアポトーシスを受ける細胞、または接着部位の外側に位置する細胞がある。また、単一のセルからタイム コースが発生していることを確認するために、追跡アルゴリズムによって誤って認識される複数のセルの集計もフィルターで除外する必要があります。PyAMAは、異常な細胞をフィルタリングするために必要な手動相互作用の量を減らすために、セルの事前選択を行います。事前選択は、事前選択の不正確さを補うために選択したセルの時間コースをエクスポートする前に、手作業で検査および修正することができます。PyAMA の現在のバージョンの事前選択は、セルの集計を選択解除するセル サイズのしきい値に基づいています。将来のバージョンでは、機械学習ベースの事前選択が計画されており、上記の異常な細胞の例を含むさらなる基準を考慮することができます。
要約すると、LISCAアプローチは単一細胞配列を用い、単一細胞の蛍光時間コースを効率的に収集します。細胞を微細加工された接着部位に閉じ込めるので、追跡と画像解析が容易になります。さらに、細胞は標準化された局所的な微小環境で培養され、従って、トランスフェクションのために脂質ナノ粒子のような薬剤に曝露されると均一な表面積を提示される。この側面は、集団内の細胞異質性を調査する場合に特に有益である。ここで説明するμPIPP技術は、タンパク質パターンの通常のマイクロアレイをもたらす多くの微細加工技術の1つです。読者は、マイクロコンタクト印刷、フォトリソグラフィアプローチ、ソフトリソグラフィを代替製造プロセス6としてレビューする文献と呼ばれています。細胞株に応じて、一方または他のパターン化技術が好ましい場合がある。我々の実験では、μPIPP技術は、細胞の自己選別による細胞の播種後の細胞の良好な位置を示し、細胞がランダムな移動で探索し、タンパク質標的アレイ上に差額差の大きな接着性17で広がることができるように、PEGylated領域上の残留細胞接着性に依存する。
LISCAは任意の蛍光マーカーの単一細胞時間コースの多数の取得を可能にする。一括実験とは対照的に、単一細胞レベルでの蛍光シグナルの分析は、手付かずの単細胞時間コースを生み出し、細胞間変動を明らかにする。細胞異質性は、アポトーシス18、19、20などの細胞運命決定において著しい役割を果たす。この文脈では、我々は最近、2つの蛍光チャネルを用いてLISCAアプローチを拡張し、細胞死シグナル伝達カスケード19内の特定の段階を示す任意の時点で2つの細胞事象の時間的相関を分析することを可能にする。この研究分野では、LISCAはフローサイトメトリー測定の代替手段として自らを紹介しています。フローサイトメトリーは間違いなくワークフローを高速化し、通常はより大きな統計を生成しますが、データはある特定の時点で取得されます。フルタイムの依存関係は、運動パラメータの推定値を生み出し、異なる蛍光シグナル間の時間的相関を明らかにするが、それ以外の場合はアクセスが困難である。複数の蛍光チャネルを使用するためには、セットアップには自動フィルタホイールまたは複数のカメラが必要です。この場合、単細胞FRET分析も実現可能であり、蛍光標識分子間の近接性に関する時間を解決した研究を可能にする必要があります。LISCAのような画像ベースの分析の欠点の1つは、視覚制御と外れ値検出に関連する労働です。機械学習ツールを使用すると、データ処理が容易になり、完全に自動化されたデータ分析が可能になります。将来的には、自動顕微鏡プラットフォーム、高速アレイ微細加工、人工知能を使用して、LISCAのスループットと適用性を大幅に向上させることができます。さらに、マイクロ流体抽出21および単一細胞ゲノムを用いた異常蛍光応答を示す細胞のその後の分析は、製薬業界において頻繁に必要とされる。この記事で紹介するプロトコルは、単一細胞分解能と適切な統計を用いて細胞プロセスの運動を研究するための需要に適しています。
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Disclosures
著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。
Acknowledgments
この研究は、ドイツ科学財団(DFG)から共同研究センター(SFB)1032への助成金によって支援されました。ドイツ連邦教育研究技術省(BMBF)による協力プロジェクト05K2018-2017-06716メディソフトの支援とバイエリッシェ・フォルシュングスシュティフトゥンからの助成金は感謝しています。アニタ・ライナーは、ミュンヘン(QBM)の定量バイオサイエンス大学院を通じてDFGフェローシップによって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adtech Polymer Engineering PTFE Microtubing | Fisher Scientific | 10178071 | |
| baking oven | Binder | 9010-0190 | |
| CFI Plan Fluor DL 10x | Nikon | MRH20100 | |
| Desiccator | Roth | NX07.1 | |
| Eclipse Ti-E | Nikon | ||
| eGFP mRNA | Trilink | L-7601 | |
| Female Luer to Tube Connector | MEDNET | FTL210-6005 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Fibronectin | Yo Proteins | 663 | |
| Filter set eGFP | AHF | F46-002 | |
| Fisherbrand Translucent Platinum-Cured Silicone Tubing | Fisher Scientific | 11768088 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Incubation Box | Okolab | OKO-H201 | |
| incubator | Binder | 9040-0012 | |
| L-15 without phenol red | Thermo Fisher | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668027 | |
| Male Luer | in-house fabricated consisting of teflon | ||
| Male Luer to Tube Connector | MEDNET | MTLS210-6005 | alternative to in-house fabricated male luers |
| NaCl (5 M) | Thermo Fisher | AM9760G | |
| Needleless Valve to Male Luer Connector | MEDNET | NVFMLLPC | |
| NIS Elements | Nikon | Imaging software Version 5.02.00 | |
| NOA81 | Thorlabs | NOA81 | Fast Curing Optical Adhesive for tube system assembly |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| PCO edge 4.2 M-USB-HQ-PCO | pco | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | in-house prepared | ||
| Plasma Cleaner | Diener Femto | Pico-BRS | |
| PLL(20 kDa)-g[3.5]-PEG(2 kDa) | SuSoS AG | ||
| silicon wafer mit mircorstructures | in-house fabricated | ||
| Sola Light Engine | Lumencor | ||
| sticky slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 1673921 | |
| Tango 2 | Märzhäuser | 00-24-626-0000 | |
| Ultrapure water | in-house prepared | ||
| uncoated coverslips | ibidi | 10813 | |
| Injekt-F Solo, 1 mL | Omilab | 9166017V | with replacement sporn |
References
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