Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Live-cell Imaging af single-cell arrays (LISCA) - en alsidig teknik til at kvantificere Cellular Kinetics

doi: 10.3791/62025 Published: March 18, 2021

Summary

Vi præsenterer en metode til erhvervelse af fluorescens reporter tid kurser fra enkelt celler ved hjælp af mikropatterned arrays. Protokollen beskriver forberedelsen af enkeltcellede arrays, opsætningen og driften af live-celle scanning time-lapse mikroskopi og en open source billedanalyse værktøj til automatiseret forvalg, visuel kontrol og sporing af celle-integreret fluorescens tid kurser pr vedhæftning site.

Abstract

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) er en alsidig metode til at indsamle tidsforløb af fluorescenssignaler fra individuelle celler i høj overførselshastighed. Generelt hæmmes erhvervelsen af enkeltcelletidskurser fra kultiverede celler af cellemotilitet og mangfoldighed af celleformer. Klæbende mikro-arrays standardisere enkelt-celle betingelser og lette billedanalyse. LISCA kombinerer enkeltcellemikrofi med scanning af time-lapse-mikroskopi og automatiseret billedbehandling. Her beskriver vi de eksperimentelle trin til at tage enkeltcellede fluorescenstidskurser i LISCA-format. Vi transfect celler klæber til en micropatterned array ved hjælp af mRNA kodning for forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP) og overvåge eGFP udtryk kinetik af hundredvis af celler parallelt via scanning time-lapse mikroskopi. Billeddatastakkene behandles automatisk af nyudviklet software, der integrerer fluorescensintensiteten over udvalgte cellekonturer for at generere kurser i fluorescens i en enkelt celle. Vi demonstrerer, at eGFP udtryk tidskurser efter mRNA transfection er godt beskrevet af en simpel kinetisk oversættelse model, der afslører udtryk og nedbrydning satser for mRNA. Yderligere anvendelser af LISCA for begivenhedstid korrelationer af flere markører i forbindelse med signalering apoptose diskuteres.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I de senere år er betydningen af enkeltcelleeksperimenter blevet tydelig. Data fra enkelte celler gør det muligt at undersøge celle-til-cellevariation, opløsningen af intracellulære parameterkorrelationer og detektion af cellulære kinetik, der forbliver skjult i ensemblemålinger1,2,3. For at undersøge cellulære kinetik af tusinder af enkeltceller parallelt er der behov for nye tilgange, der gør det muligt at overvåge cellerne under standardiserede forhold over en periode på flere timer op til flere dage efterfulgt af en kvantitativ dataanalyse 4. Her præsenterer vi Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA), som kombinerer brugen af mikrostrukturerede arrays med time-lapse mikroskopi og automatiseret billedanalyse.

Flere metoder til generering af mikrostrukturerede enkeltcelle arrays er blevet etableret og offentliggjort i litteratur5,6. Her beskriver vi kort Microscale Plasma-Initieret Protein Patterning (μPIPP). En detaljeret protokol for enkeltcellematrixfremstillingen ved hjælp af μPIPP findes også i reference7. Brugen af enkeltcellede arrays muliggør justering af tusindvis af celler på standardiserede vedhæftningspletter, der præsenterer definerede mikromiljøer for hver celle og reducerer dermed en kilde til eksperimentel variation (Figur 1A). Enkeltcellede arrays bruges til at overvåge tidsforløbene for fluorescerende markører, der har til formål at angive en række cellulære processer. Langsigtet mikroskopi i scanningstidsforskydningstilstand gør det muligt at overvåge et stort område af enkeltcellematrixerne og dermed udtage stikprøver af enkeltcelledata i høj overførselshastighed over en observationstid på flere timer eller endda dage. Dette genererer tidslinjestakke af billeder fra hver position af matrixen (Figur 1B). For at reducere den store mængde billeddata og udtrække de ønskede enkeltcellede fluorescenstidskurser på en effektiv måde kræves automatiseret billedbehandling, der drager fordel af placeringen af celler (Figur 1C).

Udfordringen ved LISCA er at tilpasse de eksperimentelle protokoller og beregningsværktøjer til at danne en høj gennemstrømningsanalyse, der genererer kvantitative og reproducerbare data fra cellulære kinetik. I denne artikel giver vi en trinvis beskrivelse af de enkelte metoder, og hvordan de kombineres i en LISCA-analyse. Som et eksempel diskuterer vi tidsforløbet for udvidet grønt fluorescerende protein (eGFP) udtryk efter kunstig mRNA-levering. eGFP-udtryk efter mRNA-levering beskrives ved reaktionshastighedsligninger, der modellerer oversættelse og nedbrydning af mRNA. Tilpasning af modelfunktionen for eGFP-koncentrationens tidsforløb til LISCA-udlæsningen af fluorescensintensiteten for hver enkelt celle over tid giver de bedste skøn over modelparametre som mRNA-nedbrydningshastigheden. Som et repræsentativt resultat diskuterer vi mRNA-leveringseffektiviteten af to forskellige lipidbaserede transfektmidler, og hvordan deres parameterfordelinger adskiller sig.

Figure 1
Figur 1: Repræsentation af LISCA-arbejdsgangen, der kombinerer (A) mikromønstrede enkeltcellematrixer (B) scanning af time-lapse-mikroskopi og (C) automatiseret billedanalyse af indspillede billedserier. Enkeltcellematrixerne består af et todimensionelt mønster af celleklæbende firkanter med et celleafvisende interrum, der fører til et arrangement af cellerne på mikropatternen, som det kan ses i fasekontrastbilledet samt fluorescensbilledet af eGFP, der udtrykker celler (A). Hele det mikrostrukturerede område afbildes i en scanningstidsforskydningstilstand, hvor der gentagne gange optages billeder i en sekvens af positioner (B). Optagede billedserier behandles for at aflæse fluorescensintensiteten pr. celle over tid (C). Skalastænger: 500 μm (A), 200 μm (C). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figure 2
Figur 2: Dataindsamling, der kombinerer enkeltcellemikrobiærer (A) med scanning af time-lapse-mikroskopi (B). Som forberedelse af time-lapse-eksperimentet fremstilles en enkeltcellet matrix med en 2D-mikropattern af vedhæftningsfråninger (1), efterfulgt af cellesåning og justering af cellerne på mikropatternen (2) samt tilslutning af et perfusionssystem til sekskanalsdiaset, hvilket muliggør væskehåndtering under time-lapse-målingen (3). Der er etableret et time-lapse-scanningseksperiment (4), og cellerne transceres på mikroskopet ved at injicere en mRNA lipoplex-opløsning gennem perfusionssystemet under time-lapse-eksperimentet (5). Skalalinjer: 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

1. Mikrostruktureret fremstilling af enkeltcellede array(figur 2A)

  1. Forbered de materialer, der er nødvendige for μPIPP array fabrikation.
    1. Der fremstilles steril fosfat-bufferet saltvand (PBS) ved pH 7.4.
    2. Der tilberedes sterilt ultrapurt vand med en modstand på mindst 18 MΩcm ved 25 °C.
    3. Pll(20 kDa)-g[3.5] PEG(2 kDa) (PLL-PEG) arbejdsopløsning fremstilles med en 2 mg/mL koncentration pll-peg i ultrapure vand indeholdende 150 mM NaCl og 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonsyre (HEPES).
    4. Forbered en ekstracellulær matrixproteinopløsning til overfladebelægning: 1 mg/mL fibronectin (FN) i PBS.
    5. Forbered en silicium wafer med en mikropattern fremstillet af fotolitografi8, der fungerer som en genanvendelig mester. Mikropattern består af firkanter med en kantlængde på 30 μm, en dybde på 12 μm og en mellemtrektafstand på 60 μm, arrangeret i seks striber, der hver har en bredde på 6 mm og en højde på 18 mm.
  2. Bland en polydimethylsiloxan (PDMS) monomer med 9% crosslinker (masse %) ved hjælp af en silikone elastomer kit og afgas det i ca 30 min, indtil det er boble fri ved hjælp af en desiccator. Kast siliciumskiflen med et ca. 3-5 mm tykt PDMS-lag og afgas det igen i ca. 30 minutter, indtil det er boblefrit.
    1. Sæt siliciumskiflen med PDMS i en bageovn ved 50 °C for at hærde PDMS i mindst 4 timer.
  3. Klip PDMS-frimærkerne.
    1. Brug en skalpel og skæres ud af PDMS lag en PDMS mesterværk, der indeholder de seks mikropattern striber.
    2. Placer PDMS-mesterværket på en bænk med mikropatternen opad.
    3. Skær hver af de seks mikropattern striber af PDMS mesterværk med et barberblad i en PDMS stempel. Pas på, at kanterne af PDMS-frimærkerne er åbne ved at afskære noget af det mønstrede område.
  4. Placer PDMS-stemplerne på en coverlip af et sekskanals dias(Figur 3-1).
    1. Brug en ubestrøget coverlip og markere kanalpositionerne på sekskanalsglidet ved omhyggeligt at ridse beskyttelsesfolien på coverlipet. Placer derefter coverlip på bænken med beskyttelsesfolien nedad.
    2. Placer PDMS-stemplerne med mikropatternen nedad på coverlipet ved de markerede kanalpositioner ved hjælp af pincet.
    3. Kontroller vedhæftningen af PDMS-stemplerne under et mikroskop. Hvis et PDMS-stempel er fuldt fastgjort til coverlipet, ser de firkanter, der er i kontakt, mørkere ud end mellemrummet. Fastgørelsen af PDMS-stemplet på coverlipet er afgørende for mikropatternkvaliteten.
  5. Dækslet anbringes med de seks PDMS-stempler på i en plasmarenser, og det behandles med iltplasma (tryk 0,2 mbar, ~40 W i 3 min.) for at gøre overfladerne mellem PDMS-stemplerne og coverlip hydrofile (figur 3-2).
  6. Udfør alle yderligere trin i mikropatternfremstillingen i et biosikkerhedsskab. Brug 15 μL PLL-PEG-opløsningen, og pipetten en dråbe af den ved siden af hvert PDMS-stempel, så PLL-PEG-opløsningen absorberes i PDMS-stemplets hydrofile mønster (figur 3-3). Lad PLL-PEG inkubere i 20 minutter ved stuetemperatur.
  7. 1 mL ultrapure vand skylles over coverlip'en med PDMS-stemplerne på og fjernes PDMS-stemplerne med pincet(figur 3-4). Skyl derefter coverlip en anden gang med 1 mL ultrapure vand og lad det tørre.
  8. Når coverlipet er tørret helt, skal du sætte en sekskanals klæbrig rutsjebane på coverlipet (Figur 3-4). Pas på, at de mikropatternerede områder flugter med bunden af kanalerne.
  9. Funktionaliser vedhæftningsdrene med FN.
    1. Fyld 40 μL PBS i hver kanal.
    2. Forbered en 100 μg/mL FN-opløsning i PBS.
    3. Der tilsættes 40 μL FN-opløsning til hver kanal(figur 3-5). FN-opløsningen blandes grundigt med PBS i kanalen ved at fjerne 40 μL fra et reservoir og tilføje det til det modsatte reservoir af samme kanal i 3 gange for at generere en homogen opløsning. FN-opløsningen inkuberes i 45 minutter ved stuetemperatur.
    4. Hver kanal vaskes tre gange med 120 μL PBS(figur 3-6).
  10. For at kontrollere mønsterkvaliteten skal du bruge en fluorescerende mærket FN i trin 9.2. (Figur 4A).
    BEMÆRK: Vi anbefaler, at du forbereder μPIPP-systemet senest en dag før cellesåning, da PLL-PEG og FN ikke er kovalent bundet til substratet, og mønsterets kvalitet kan falde over tid. Opbevar det forberedte μPIPP-system i køleskabet.

Figure 3
Figur 3: Enkeltcellet mikroarray fabrikation af μPIPP. (1) PDMS-frimærker med en tredimensionel mikropatternstruktur på overfladen er arrangeret på en coverlip af et sekskanals dias. (2) Coverlip med PDMS-stemplerne på behandles med iltplasma for at gøre overfladerne hydrofile. (3) PLL-PEG tilføjes. Det absorberes i mikrostrukturen af kapillærkræfter og gør overfladerne ikke dækket af PDMS-stempelcelleafvisende. (4) Dækslet skylles med vand for at fjerne den resterende PLL-PEG. Derefter fjernes PDMS-frimærkerne, og en sekskanals klæbrig slide sidder fast i coverlipet. (5) Fibronectin, et protein i den ekstracellulære matrix, tilsættes for at gøre områderne uden PLL-PEG celleklæbende. (6) Sekskanalsskredset vaskes med fosfatbufferet saltvand. Klik her for at se en større version af dette tal.

2. Cellesåning (figur 2A)

BEMÆRK: For følgende vasketrin tilsættes den respektive væske til et reservoir og derefter fjernes et lige stort volumen væske fra det modsatte reservoir af en kanal.

  1. Hver kanal vaskes med 120 μL på 37 °C fuldt suppleret cellevækstmedium. Før du tilføjer celleophænget, skal du sikre dig, at kun kanalerne er fyldt med medium, men ikke reservoirerne.
  2. Fjern HuH7-celler fra en cellekulturkolbe efter standardprotokollen for cellepasning, og juster celleaffjedringskoncentrationen til 4 x 105 celler/mL.
  3. Der tilsættes 40 μL celleophæng, og cellevækstmediet blandes med celleophænget ved at fjerne 40 μL fra et reservoir og tilføje det til det modsatte reservoir af samme kanal i 3 gange for at nå en homogen cellefordeling (Figur 4B).
  4. Fjern 40 μL affjedring fra kanalen, så kun kanalen er fyldt med celleaffjedring.
  5. Sæt diaset i en inkubator, og kontroller cellehæftningen 1 time efter såning ved hjælp af et fasekontrastmikroskop.
  6. Der tilsættes 120 μL på 37 °C varmt cellevækstmedium.
  7. Men diaset tilbage i inkubatoren i yderligere 3 timer for at muliggøre cellulær selvorganiseringen på mikropattern (Figur 4C).

Figure 4
Figur 4: Cellulær selvorganiseringen og kvalitetskontrol af μPIPP-systemet. (A) Den mikrostrukturerede overflade består af kvadrerede FN-belagte vedhæftningspletter vist med rødt omgivet af en celleafvisende polymer. (B) Efter cellesåning fordeles HuH7-cellerne tilfældigt, og (C) klæber hovedsageligt på vedhæftningspletterne over en periode på 4 timer. Genoptrykt med tilladelse 7. Skalalinjer: 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

3. Perfusionssystem (figur 2A)

BEMÆRK: Det er kun nødvendigt at anvende et perfusionssystem, hvis det er nødvendigt at tilføje reagenser eller lysstofrør i løbet af tidsforskydningsmålingen. Afhængigt af dine behov kan du forbinde hver kanal til et separat perfusionssystem eller forbinde flere kanaler i serie til det samme perfusionssystem. Antallet af perfusionssystemer svarer til antallet af uafhængige forsøgsbetingelser. Tilslut rørene under sterile forhold i et biosikkerhedsskab, og undgå, at luftbobler medtages i perfusionssystemet. Hvis der ikke anvendes et perfusionssystem, tilsættes reagenser/markører i et biosikkerhedsskab inden time-lapse-målingen. Perfusionssystemet er internt fremstillet, det anvendte materiale er opført i materialebordet. Samlingen af perfusionssystemet er blevet beskrevet tidligere9.

  1. Brug en 1 mL sprøjte (med udskiftning sporn) og fyld sprøjten med 1 mL på 37 °C cellevækst medium.
  2. Tilslut sprøjten til indløbsrøret ved hjælp af ventilen, og fyld røret med medium.
  3. Tilslut indløbsrøret til et reservoir på en kanal, og sørg for, at der ikke er nogen luftbobler fanget.
  4. Hvis du vil tilslutte en anden kanal i serie til dette perfusionssystem, skal du tilslutte et serielt stik til reservoiret modsat indløbsrøret på den aktuelle kanal. Fortsæt til den næste kanal, og tilslut den frie ende af det serielle stik til et af dets reservoirer.
  5. Gentag de forrige trin, indtil det krævede antal kanaler er forbundet i serie.
  6. Tilslut udløbsrøret direkte til den aktuelle kanals frie reservoir. Fyld det tilsluttede rør med medium for at kontrollere, at perfusionssystemet ikke lækker.
  7. Gentag de foregående trin, indtil alle seks kanaler på diaset er tilsluttet et perfusionssystem.
  8. Skub med det eller de tilsluttede perfusionsanlæg anbringes i inkubatoren, indtil det anvendes yderligere, eller placer det direkte i mikroskopets varmekammer, forvarmet til 37 °C til time-lapse-måling.

4. Time-lapse mikroskopi (Figur 2B)

BEMÆRK: Ved langsigtede målinger skal der opretholdes en stabil temperatur på 37 °C og et stabilt CO2-niveau. Som et alternativ til CO2-afhængigcellevækst medium, brug L15 medium, som ingen gas inkubationssystem er påkrævet.

BEMÆRK: Til kvantitativ billeddannelse skal du bruge cellevækstmediet uden phenolrødt under time-lapse-målingen for at reducere baggrundsfluorescens og bruge de samme indstillinger i time-lapse-protokollen samt det samme mikroskop til tekniske replikater.

  1. Opret en time-lapse-protokol til optagelse af et fasekontrastbillede og et fluorescensbillede med eksponeringstider på 750 ms (afhængigt af kameraet), 10 minutters tidsinterval mellem på hinanden følgende sløjfer gennem positionslisten og en observationstid på 30 timer ved hjælp af et 10x mål og passende fluorescensfiltre.
  2. Sæt sekskanalsrutsjebanen med cellerne på enkeltcellematrixerne i prøveholderen i varmekammeret på 37 °C. Hvis perfusionssystemerne er tilsluttet sekskanalsdiaset, fastgør rørene til scenen ved hjælp af noget tape for at sikre, at sekskanalsdiaset ikke flyttes under væskeudveksling. Sæt udløbsrørenes frie ender gennem et hul i et 15 mL reaktionsrør for at indsamle det flydende affald.
  3. Angiv placeringslisten for målingen af tidsforskydning ved scanning. Sørg for, at antallet af positioner kan scannes inden for det definerede tidsinterval mellem fortløbende sløjfer gennem positionslisten. Med et mål på 10x kan 10-30 positioner pr. kanal indstilles til at scanne det samlede mikropatternområde afhængigt af kamerachipstørrelsen.
  4. Start time-lapse-målingen. Hvis du vil have en bedre billedkvalitet af langsigtede målinger, skal du bruge et automatiseret fokuskorrektionssystem.

5. Lysstofrør - mRNA-transfekt (figur 2B)

BEMÆRK: For en transinfektion i to kanaler, der er forbundet med et slangesystem, er der behov for et samlet volumen på 600 μL transfektureblanding (300 μL for en kanal). De angivne mængder henviser til en transfekt i to tilsluttede kanaler.

  1. Der fremstilles en transfektmiddelopløsning ved at fortynde 1 μL transfektmiddel i 200 μL serumreduceret medium og lade opløsningen inkubere i 5 minutter ved stuetemperatur.
  2. Der fremstilles en mRNA-opløsning ved at fortynde 300 ng mRNA-kodning til eGFP i 150 μL serumreduceret medium.
  3. Forbered transfektureblandingen ved at tilsætte 150 μL af transfektmidlets opløsning til mRNA-opløsningen og bland den godt. Lad transfektureblandingen inkubere i 20 minutter ved stuetemperatur.
  4. Rørsystemet skylles med 1 mL 37 °C varm PBS med en sprøjte under inkubation af transfektureblandingen. Når rørene skylles, skal du sørge for, at mikroskopstadiet ikke bevæger sig. Sæt time-lapse-målingen på pause, hvis det er nødvendigt.
  5. Transfektblandingen fortyndes til den endelige mRNA-koncentration på 0,5 ng/μL ved at tilsætte 300 μL serumreduceret medium.
  6. Rørsystemet skylles med transfektureblandingen ved hjælp af en sprøjte, og mRNA-lipoplexerne inkuberes i 1 time (stop time-lapse-målingen, hvis det er nødvendigt).
  7. Transfektinkubationen standses, og de ubundne mRNA-lipoplexer skylles ud ved at vaske med 1 mL 37 °C varmt fuldt suppleret cellevækstmedium ved hjælp af en sprøjte (stop time-lapse-målingen, hvis det er nødvendigt).

6. Billedanalyse og udlæsning af fluorescens

  1. Når du kører billedanalysen for første gang, skal du installere version 0.1.6 af open source-softwaren "Automated Microstructure Analysis in Python" (PyAMA) fra den nævnte placering10 i henhold til instruktionerne der.
  2. Sørg for, at billedkanalerne (fasekontrast og fluorescens) er tilgængelige som 16-bit TIFF-filer med flere billeder. Om nødvendigt konvertere dem i overensstemmelse hermed.
  3. Start PyAMA og klik på Åbn stakken... for at åbne billeder til analyse.
  4. Hvis hver TIFF-fil med flere billeder skal åbnes, skal du klikke på Åbn og markere filen, så den vises på listen over indlæste filer i venstre side af dialogboksen (Figur 5-1).
  5. Marker de kanaler, der skal medtages i analysen. Udfør følgende trin for hver kanal.
    1. Vælg den TIFF-fil, der indeholder kanalen, på listen over indlæste filer.
    2. Vælg indekset for kanalen i TIFF-filen i sektionen Tilføj ny kanal. Indekseringen er nulbaseret. den første kanal har indeks 0, den anden kanal har indeks 1 og så videre.
    3. Vælg kanaltypen. Vælg Fasekontrast eller Fluorescens for de tilsvarende billedkanaler og Segmentering for en binær kanal, der angiver cellekonturerne.
    4. Du kan også angive en etiket på kanalen til at skelne mellem forskellige fluorescenskanaler: eGFP og DAPI.
    5. Når du har konfigureret kanalen, skal du klikke på Tilføj.
  6. Når alle tilføjede kanaler vises på kanallisten i højre side af dialogboksen, skal du klikke på OK for at indlæse stakken.
  7. Hvis du vil udføre segmentering ved hjælp af PyAMA's indbyggede segmenteringsalgoritme til cellegenkendelse baseret på fasekontrastbillederne (Figur 5-2), skal du gå til Værktøjer | Binarize... og angiv et filnavn til NumPy-filen med den binariserede kanal.
    BEMÆRK: I den aktuelle version kræver indlæsning af den binariserede kanal, at alle kanaler genindlæses.
  8. Hvis du vil udføre en baggrundskorrektion11 på en fluorescenskanal (figur 5-3), skal du sikre dig, at lysstofkanalen og en segmenteringskanal indlæses. Hvis der ikke indlæses en segmenteringskanal, skal du sikre dig, at der indlæses en kanal med fasekontrast til automatisk segmentering. Gå til "Værktøjer > baggrundskorrektion..." og vælg et filnavn til den resulterende TIFF-fil med den korrigerede fluorescenskanal.
    BEMÆRK: I den aktuelle version kræver indlæsning af den baggrundskorrigerede kanal, at alle kanaler genindlæses.
  9. Undersøg de forvalgte celler (Figur 5-4) og deres integrerede fluorescenssignal (figur 5-5) ved at rulle gennem tidsrammerne, se de kanaler, der er angivet i kanalmenuen i venstre side, og klikke på celler for at fremhæve deres fluorescenstidskurser(Figur 1C). Brug cellemarkeringen til at udelukke celler, der ikke er levedygtige, ikke begrænset til et vedhæftningspunkt eller knyttet til en anden celle, fra yderligere analyse. Slå markeringen af celler til udlæsning til og fra ved at trykke på Skift og klikke på cellen eller ved at fremhæve cellen og trykke på Enter.
  10. Gem enkeltcelletidskurserne for celleområdet og den integrerede fluorescens (figur 5-6) ved at klikke på Fil | Gemme og vælge en mappe, der skal gemmes i.

Figure 5
Figur 5: Automatiseret billedbehandling af time-lapse-billedserier ved hjælp af PyAMA. (2) Cellekonturer bestemmes af segmentering på billedstakken med fasekontrast. (3) Der anvendes en baggrundskorrektion på fluorescensbillederne. (4) Cellekonturerne spores over tid og vælges på forhånd til eksport. (5) Fluorescensintensiteten er integreret på basis af de sporede cellekonturer. (6) Enkeltcelleområder og integrerede fluorescensintensiteter evalueres, og tidskurser for hver celle eksporteres. Skalalinjer: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Hvis du vil analysere oversættelseskinetik efter mRNA-transinfektion, skal du montere en oversættelsesmodel baseret på biokemiske satsligninger på hvert enkeltcellet tidsforløb som beskrevet tidligere af Reiser et al.12. De data og den kode, der anvendes i undersøgelsen, er offentligt tilgængelige13.
  2. For hvert enkeltcellet tidsforløb skal du hente de anslåede monteringsparametre for oversættelsesmodellen, der repræsenterer mRNA-nedbrydningshastigheden og tidspunktet for oversættelsesdestillet. Et eksempeldatasæt diskuteres i afsnittet med repræsentative resultater.
  3. Foretage yderligere analyse af fordelingen af de bedste estimater af parametrene for varierede forsøgsbetingelser for at undersøge celle-til-celle-variabiliteten i cellepopulationerne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

LISCA-tilgangen gør det muligt effektivt at indsamle fluorescenstidskurser fra enkelte celler. Som et repræsentativt eksempel skitserer vi, hvordan LISCA-metoden anvendes til at måle enkeltcellet eGFP-udtryk efter transfekt. Dataene fra LISCA-eksperimentet bruges til at vurdere mRNA-leveringskinetik, hvilket er vigtigt for udviklingen af effektive mRNA-lægemidler.

Vi demonstrerer især den forskellige virkning af to lipidbaserede mRNA-leveringssystemer med hensyn til tidspunktet for oversættelsesdestillet og ekspressionshastigheden på enkeltcelleniveau. Vi dyrkede celler og opdelte partiet i to populationer. En subpopulation blev transfected med lipoplexes som beskrevet i protokollen sektion. Den anden delpopulation blev transfected ved hjælp af samme mRNA med samme endelige mRNA-koncentration, men med lipid nanopartikler (LNP) som leveringssystem, som blev produceret ved hjælp af mikrofluidisk blanding12. På grund af en anden lipidsammensætning og den forskellige fremstilling af lipoplexernes og LNP'ernes mRNA-leveringssystemer forventer vi en indvirkning på oversættelseskinetik, da optagelseskinetik bør påvirkes. Ved hjælp af LISCA-metoden kvantificerer vi tidspunktet t0 for oversættelsesdestillet efter transfekten, og hvor stærke cellerne udtrykker eGFP, som afhænger af produktet af transfected mRNA molekyler m0 og oversættelseshastigheden kTL. For at opnå disse to parametre passer vi til en tretrinsoversættelsesmodel som skitseret i figur 6A. Efter vellykket frigivelse af mRNA molekyler m på tidspunktet t0 i cytosol, er mRNA oversat med hastighed kTL i unmaturated eGFP G*, som er ikke-fluorescerende. Den umættede G* modnes med hastighed kM til eGFP G, hvis fluorescensintensitet måles under time-lapse-målingen. MRNA'et såvel som det (umættede og modnede) eGFP nedbrydes over tid med respektive nedbrydningshastigheder δ og γ. Modellen beskrives ved almindelige differentialligninger, og analyseløsningen til G bruges som modelfunktion til parameterestimering. Modelfunktionen er monteret på hvert enkeltcellet tidsforløb som vist i figur 6B med eksempel tidskurser (grå) og de respektive pasformer (grøn). I figur 6C viser vi histogrammerne for tidspunktet t0 i oversættelsesdemode og udtrykshastigheden m0kTL af lipoplex transfected celler. Da begge parametre er estimeret for hver celle, kan korrelationen af disse parametre analyseres som vist i scatterplot (Figur 6D, blå data) og kan sammenlignes med celler transfected med LNPs (rød). Som vist i figur 6Dviser celler, der er transfected med LNP'er, mindre variation mellem celler sammenlignet med celler, der er transfected med lipoplexes, og befolkningsgennemsnittet viser en hurtigere debut af oversættelse samt en højere ekspressionshastighed (tykke prikker med sort kontur).

Disse to datasæt er blot ét eksempel på, hvordan LISCA kan bruges til at studere oversættelse efter mRNA-transinfektion. Der kan foretages yderligere undersøgelser , f.eks .

Figure 6
Figur 6: Dataanalyse af enkeltcellede eGFP-oversættelseskinetik. (A) Oversættelseskinetik af reporterproteinet eGFP efter mRNA-levering kan beskrives ved en tretrins reaktionshastighedsligning med de respektive parametre. (B) Modellen er monteret (grønne spor) på hvert enkeltcellet eGFP-udtrykstidskursus (grå spor) for at estimere modelparametrene, såsom tidspunktet (t0) for transfektde debut og udtrykshastigheden (m0kTL), to parametre til kvantificering af mRNA-leveringseffektivitet. (C) Histogrammer for parameterfordelingen for transfekturets debuttid og udtrykshastighed. (D) Da parametrene er estimeret for hver celle, viser et punktområde af disse parametre parameterkorrelation. De små prikker repræsenterer parametrene for en enkelt celle. Plottet viser celler transfected med mRNA LNPs (rød) og mRNA lipoplexes (blå). De tykke prikker med sort kontur svarer til det respektive befolkningsgennemsnit. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Her beskrev vi LISCA som en alsidig teknik til at følge cellulære kinetik af intracellulære fluorescerende etiketter på enkeltcelleniveau. For at kunne udføre et vellykket LISCA-eksperiment skal hvert af de beskrevne trin i protokolafsnittet fastlægges individuelt, og derefter skal alle trin kombineres. Hvert af de tre hovedaspekter af LISCA har afgørende skridt.

Fremstilling af mikroarray med en enkelt celle
Kvaliteten af mikroarray er afgørende, da den cellulære tilpasning til mikroarray er ikke kun vigtigt for alle yderligere eksperimentelle trin, men også har indflydelse på datakvaliteten. Af denne grund skal mønsterets geometri og fremstillingsmetoden tilpasses de anvendte celler. De repræsentative resultater, der diskuteres i denne artikel, er blevet genereret med leverkarcinomcellelinjen HuH7 justeret på et (30 μm)2 kvadratisk mønster. Denne mønstergeometri er også velegnet til andre cellelinjer som A549 eller HEK293. For større celler som BEAS-2B kan der anvendes et større kvadratisk mønster med en kantlængde på 35 μm og en mellemdistance på 80 μm. Den beskrevne såningsprocedure er optimeret til HuH7-cellerne, men den kan tilpasses mange andre vedhængende celler17. Nogle cellelinjer har f.eks. brug for forskellige størrelser af vedhæftningspunkterne eller har brug for større afstand mellem vedhæftningspunkterne for at undgå cellecellekontakter gennem aflange celler.

Mikropatternen skal justeres således, at vedhæftningsområdet stort set opfylder det gennemsnitlige areal af en celle i standardkulturretter. Geometrien kan være rund eller kvadreret og har ingen målbar effekt af celle levedygtighed. Cellebevægelser synes at være mere begrænset på et kvadreret mønster i forhold til runde mønster, hvor celler ofte ses at rotere. Separat levedygtighedstest anbefales, når nye cellelinjer bruges første gang. Såningstætheden skal justeres for specifikke cellelinjer for at nå en høj belægning af vedhæftningspletterne og for at minimere dobbeltbelægning af vedhæftningspletter på samme tid. Typisk følger den resulterende belægning af antallet af celler pr. vedhæftningssted Poisson-statistikker og er enten nul, en eller to. Den samlede belægning på mellem 60 % og 80 % bør derfor tage sigte på at undgå dobbeltværelser17. Det kan være nødvendigt at tilpasse såningsprotokollen med hensyn til antallet af såede celler og varigheden mellem såning og det første vasketrin. For eksempel vil et vasketrin 30 minutter efter såning i stedet for 1 time (se trin 5 og 6 i protokolafsnit 2 Cellesåning) reducere antallet af dobbeltbesatte vedhæftningspletter, men vil også sænke det samlede antal besatte vedhæftningspladser for HuH7-celler.

Da tilslutning af et slangesystem til kanalrutsjebanerne ikke er obligatorisk, er det lettere at fastslå brugen af et reagens eller fluorescerende markør uden at bruge et slangesystem til at kontrollere, om der er den bedst egnede koncentrations- og inkubationstid. Når der er udarbejdet en passende protokol for reagenset/markøren for interesse, kan slangesystemet indgå i arbejdsgangen.

Time-lapse mikroskopi
Et andet afgørende skridt er indstillingerne for time-lapse-målingen. F.eks. skal eksponeringstiden for lysstofmarkøren vælges omhyggeligt for at undgå fotobleaching af fluorophore- og fototoksicitetseffekterne, men stadig sikre et godt fluorescenssignal. En anden vigtig parameter i time-lapse-opsætningen er den bedst egnede kombination af rumlig og tidsmæssig opløsning, som i høj grad afhænger af de observerede cellulære kinetik. Hvis der er behov for en høj tidsmæssig opløsning, kan kun et mindre antal positioner i mikroarray scannes mellem to tidspunkter, hvilket reducerer det scannede observationsområde og dermed også reducerer statistikkerne. Observationsområdet afhænger desuden ikke kun af antallet af scannede positioner, men også af målet og størrelsen af et synsfelt af kameraet. I det givne eksempel er en tidsopløsning på 10 min tilstrækkelig ved hjælp af et 10x mål for at observere oversættelseskinetikken. Denne kombination gør det muligt at scanne 70-100 positioner pr. tidspunkt afhængigt af kamerachippens størrelse, mikroskopstadiets hastighed og antallet af billedkanaler (f.eks. fasekontrast og eGFP-fluorescens).

billedbehandling
Analysen af den samlede fluorescens pr. celle lettes, da cellerne er placeret i en matrix. Men kvaliteten af enkeltcellede fluorescenstidskurser, især signal-til-støj-forholdet (SNR), afhænger af den algoritme, der bruges til integration af cellefluorescensintensiteter fra billedserien. Trinene til billedbehandling af softwareværktøjet PyAMA er vist i figur 5. Bestemmelsen af integrationsområderne for udlæsning af fluorescens med en enkelt celle er særlig vigtig, fordi cellernes kontur af levende celler varierer med tiden. PyAMA integrerer fluorescensintensiteten over en cellekontur, som kan bestemmes af en indbygget segmenteringsalgoritme. Et alternativ ville være at integrere over faste grænser baseret på mikropatterngeometrien12,16. Den aktuelle version af PyAMA udfører billedsegmentering baseret på en tærskel for standardafvigelsen for pixelkvarterer i billedkanalen med fasekontrast. Segmenteringsresultater kan også importeres fra ekstern software. I fremtidige versioner er der planlagt indbygget understøttelse af segmentering baseret på maskinlæring og integration over faste grænser.

PyAMA tilbyder at filtrere outlier celler eller unormale tidskurser ved hjælp af en grænseflade, der giver mulighed for visuel inspektion af både fluorescens billede samt fluorescens tid kurser af udvalgte celler (Figur 1C). Eksempler på celler, der kan udelukkes fra analyse, er celler, der gennemgår opdeling eller apoptose, eller som er placeret uden for et vedhæftningssted. Sammenlægninger af flere celler, der fejlagtigt genkendes af sporingsalgoritmen som en enkelt celle, skal også filtreres ud for at sikre, at tidskurserne stammer fra enkelte celler. PyAMA udfører en forhåndsmarkering af celler for at reducere mængden af manuel interaktion, der kræves for at filtrere unormale celler fra. Forhåndsudvælgelsen kan inspiceres og korrigeres manuelt, før tidskurserne i de valgte celler eksporteres for at kompensere for unøjagtigheder i forhåndsudvælgelsen. Forhåndsmarkeringen af den aktuelle version af PyAMA er baseret på en tærskel for cellestørrelsen for at fravælge cellesammenlægninger. I fremtidige versioner planlægges en yderligere maskinlæringsbaseret forhåndsudvælgelse, som gør det muligt at tage højde for yderligere kriterier, herunder eksemplerne på unormale celler, der er beskrevet ovenfor.

Sammenfattende anvender LISCA-tilgangen enkeltcellede arrays til effektivt at indsamle enkeltcellede fluorescenstidskurser. At begrænse celler til mikrofabrikerede vedhæftningssteder letter sporing og billedanalyse. Desuden dyrkes celler i standardiserede lokale mikromiljøer og præsenteres derfor for et ensartet overfladeareal, når de udsættes for stoffer som lipid nanopartikler til transfekt. Dette aspekt er især gavnligt, når cellulær heterogenitet i en befolkning undersøges. μPIPP-teknikken, der er beskrevet her, er en af mange mikrofabrikationsteknikker, der resulterer i regelmæssige mikroarrays af proteinmønstre. Læseren henvises til litteratur, der gennemgår mikrokontakttryk, fotolitografiske tilgange og blød litografi som alternative fabrikationsprocesser6. Afhængigt af cellelinjen kan den ene eller den anden mønsterteknik være at foretrække. I vores eksperimenter viste μPIPP-teknikken velplacerede celler efter såning af celler på grund af cellulær selvsortering, som er afhængig af restcelleklæbeevne på PEGylated-området, så celler er i stand til at søge i tilfældig migration og sprede sig på proteinmålmatrixerne med differentieret større klæbeevne17.

LISCA giver mulighed for erhvervelse af et stort antal enkeltcellede tidskurser af vilkårlige fluorescensmarkører. Analyse af fluorescenssignaler på enkeltcelleniveau, i modsætning til bulkeksperimenter, giver uberørte enkeltcelletidskurser og afslører celle-til-celle-variabilitet. Cellulær heterogenitet spiller en fremtrædende rolle i celle skæbne beslutninger såsom apoptose18,19,20. I denne forbindelse har vi for nylig udvidet LISCA-tilgangen ved hjælp af to fluorescenskanaler, der giver mulighed for analyse af tidsmæssige korrelationer af to cellulære begivenheder på et hvilket som helst tidspunkt, der angiver bestemte stadier i celledødssignalkaskaden19. På dette forskningsområde præsenterer LISCA sig selv som et alternativ til flowcytometrimålinger. Mens flowcytometry unægtelig giver en hurtigere arbejdsgang og typisk giver større statistikker, erhverves dataene på et bestemt tidspunkt. Fuldtidsafhængigheder giver estimater af kinetikparametre og afslører tidsmæssige korrelationer mellem forskellige fluorescenssignaler, som ellers er vanskelige at få adgang til. For at kunne bruge flere lysstofkanaler kræver opsætningen automatiske filterhjul eller flere kameraer. I dette tilfælde bør også enkeltcellet FRET-analyse være mulig og muliggøre tidsløste undersøgelser af nærhed mellem fluorescerende mærkede molekyler. En ulempe ved billedbaseret analyse som LISCA er arbejdskraften forbundet med visuelle kontroller og outlier-detektion. Her kan maskinlæringsværktøjer lette databehandlingen og muliggøre fuldautomatisk dataanalyse. I fremtiden vil LISCA's gennemløb og anvendelighed kunne øges betydeligt ved hjælp af automatiserede mikroskopiplatforme, hurtig arraymikrobiæring og kunstig intelligens. Desuden er efterfølgende analyse af celler, der udviser usædvanlige fluorescensresponser ved hjælp af mikrofluidisk ekstraktion 21og enkeltcellegenomik, et hyppigt krav i lægemiddelindustrien. Protokollen, der præsenteres i denne artikel, passer til efterspørgslen efter at studere kinetik af cellulære processer med enkeltcelleopløsning og passende statistikker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Den Tyske Videnskabsfond (DFG) til Collaborative Research Center (SFB) 1032. Støtte fra det tyske forbundsministerium for uddannelse, forskning og teknologi (BMBF) under samarbejdsprojektet 05K2018-2017-06716 Medisoft samt et tilskud fra Bayerische Forschungsstiftung er taknemmeligt anerkendt. Anita Reiser blev støttet af et DFG Fellowship gennem Graduate School of Quantitative Biosciences München (QBM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adtech Polymer Engineering PTFE Microtubing  Fisher Scientific 10178071
baking oven Binder 9010-0190
CFI Plan Fluor DL 10x Nikon MRH20100
Desiccator Roth NX07.1
Eclipse Ti-E Nikon
eGFP mRNA Trilink L-7601
Female Luer to Tube Connector MEDNET FTL210-6005
Fetal bovine serum Thermo Fisher 10270106
Fibronectin Yo Proteins 663
Filter set eGFP AHF F46-002
Fisherbrand Translucent Platinum-Cured Silicone Tubing Fisher Scientific 11768088
HEPES (1 M) Thermo Fisher 15630080
Incubation Box Okolab OKO-H201
incubator Binder 9040-0012
L-15 without phenol red Thermo Fisher 21083027
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher 11668027
Male Luer in-house fabricated consisting of teflon
Male Luer to Tube Connector MEDNET MTLS210-6005 alternative to in-house fabricated male luers
NaCl (5 M) Thermo Fisher AM9760G
Needleless Valve to Male Luer Connector MEDNET NVFMLLPC
NIS Elements Nikon Imaging software Version 5.02.00
NOA81 Thorlabs NOA81 Fast Curing Optical Adhesive for tube system assembly
Opti-MEM Thermo Fisher 31985062
PCO edge 4.2 M-USB-HQ-PCO pco
Phosphate buffered saline (PBS) in-house prepared
Plasma Cleaner Diener Femto Pico-BRS
PLL(20 kDa)-g[3.5]-PEG(2 kDa) SuSoS AG
silicon wafer mit mircorstructures in-house fabricated
Sola Light Engine Lumencor
sticky slide VI 0.4  ibidi 80608
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 1673921
Tango 2 Märzhäuser 00-24-626-0000
Ultrapure water in-house prepared
uncoated coverslips ibidi 10813
Injekt-F Solo, 1 mL Omilab 9166017V with replacement sporn

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Altschuler, S. J., Wu, L. F. Cellular heterogeneity: do differences make a difference. Cell. 141, (4), 559-563 (2010).
  2. Locke, J. C., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews Microbiology. 7, (5), 383-392 (2009).
  3. Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459, (7245), 428-432 (2009).
  4. El-Ali, J., Sorger, P. K., Jensen, K. F. Cells on chips. Nature. 442, (7101), 403-411 (2006).
  5. Segerer, F. J., et al. Versatile method to generate multiple types of micropatterns. Biointerphases. 11, (1), 011005 (2016).
  6. Piel, M., Théry, M. Micropatterning in cell biology, part A/B/C. Elsevier. (2014).
  7. Reiser, A., Zorn, M. L., Murschhauser, A., Rädler, J. O. Cell-Based Microarrays: Methods and Protocols. Ertl, P., Rothbauer, M. Springer. New York. 41-54 (2018).
  8. Picone, R., Baum, B., McKendry, R. Methods in cell biology. 119, Elsevier. 73-90 (2014).
  9. Reiser, A. Single-cell time courses of mRNA transport and translation kinetics. Ludwig-Maximilians University. PhD thesis (2019).
  10. Woschée, D. Softmatter LMU-Raedler Group. Available from: https://github.com/SoftmatterLMU-RaedlerGroup/pyama (2020).
  11. Schwarzfischer, M., et al. MIAAB, 29262. Available from: https://push-zb.helmholtz-muenchen.de/frontdoor.php?source_opus=6773 (2020).
  12. Reiser, A., et al. Correlation of mRNA delivery timing and protein expression in lipid-based transfection. Integrative Biology. 11, (9), 362-371 (2019).
  13. Reiser, A., Woschée, D., Mehrotra, N., Krzysztoń, R. S., Strey, H. H., Rädler, J. O. Supplementing data and code for: "Correlation of mRNA delivery timing and protein expression in lipid-based transfection". Zenodo. Version 1.0 (2019).
  14. Ferizi, M., et al. Stability analysis of chemically modified mRNA using micropattern-based single-cell arrays. Lab on a Chip. 15, (17), 3561-3571 (2015).
  15. Fröhlich, F., et al. Multi-experiment nonlinear mixed effect modeling of single-cell translation kinetics after transfection. NPJ systems biology and applications. 4, (1), 1-12 (2018).
  16. Krzysztoń, R., et al. Single-cell kinetics of siRNA-mediated mRNA degradation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 21, 102077 (2019).
  17. Röttgermann, P. J., Alberola, A. P., Rädler, J. O. Cellular self-organization on micro-structured surfaces. Soft Matter. 10, (14), 2397-2404 (2014).
  18. Röttgermann, P. J., Dawson, K. A., Rädler, J. O. Time-resolved study of nanoparticle induced apoptosis using microfabricated single cell arrays. Microarrays. 5, (2), 8 (2016).
  19. Murschhauser, A., et al. A high-throughput microscopy method for single-cell analysis of event-time correlations in nanoparticle-induced cell death. Communications Biology. 2, (1), 1-11 (2019).
  20. Chatzopoulou, E. I., et al. Chip-based platform for dynamic analysis of NK cell cytolysis mediated by a triplebody. Analyst. 141, (7), 2284-2295 (2016).
  21. Sztilkovics, M., et al. Single-cell adhesion force kinetics of cell populations from combined label-free optical biosensor and robotic fluidic force microscopy. Scientific Reports. 10, (1), 1-13 (2020).
Live-cell Imaging af single-cell arrays (LISCA) - en alsidig teknik til at kvantificere Cellular Kinetics
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Reiser, A., Woschée, D., Kempe, S. M., Rädler, J. O. Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - a Versatile Technique to Quantify Cellular Kinetics. J. Vis. Exp. (169), e62025, doi:10.3791/62025 (2021).More

Reiser, A., Woschée, D., Kempe, S. M., Rädler, J. O. Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - a Versatile Technique to Quantify Cellular Kinetics. J. Vis. Exp. (169), e62025, doi:10.3791/62025 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter