Summary
Presentiamo un metodo per l'acquisizione di corsi di tempo reporter a fluorescenza da singole cellule utilizzando array micropatterned. Il protocollo descrive la preparazione di array a cella singola, la configurazione e il funzionamento della microscopia time-lapse di scansione a celle vive e uno strumento di analisi delle immagini open source per la preselezione automatizzata, il controllo visivo e il tracciamento dei corsi di tempo di fluorescenza integrati nelle celle per sito di adesione.
Abstract
Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) è un metodo versatile per raccogliere corsi di tempo di segnali di fluorescenza da singole cellule ad alta produttività. In generale, l'acquisizione di corsi di tempo a cella singola da cellule coltivate è ostacolata dalla motilità cellulare e dalla diversità delle forme cellulari. I micro array adesivi standardizzano le condizioni a cella singola e facilitano l'analisi delle immagini. LISCA combina microarray a cella singola con microscopia time-lapse di scansione e elaborazione automatizzata delle immagini. Qui descriviamo le fasi sperimentali di prendere corsi di tempo di fluorescenza a singola cella in formato LISCA. Trasfetteiamo le cellule aderenti a un array di micropattern utilizzando la codifica mRNA per proteine fluorescenti verdi avanzate (eGFP) e monitoriamo la cinetica di espressione eGFP di centinaia di cellule in parallelo tramite microscopia time-lapse di scansione. Gli stack di dati delle immagini vengono elaborati automaticamente da un software di nuova sviluppo che integra l'intensità della fluorescenza sui contorni delle celle selezionati per generare corsi di tempo a fluorescenza a singola cella. Dimostriamo che i corsi di tempo di espressione eGFP dopo la trasfezione dell'mRNA sono ben descritti da un semplice modello di traduzione cinetica che rivela i tassi di espressione e degradazione dell'mRNA. Vengono discusse ulteriori applicazioni di LISCA per le correlazioni del tempo degli eventi di più marcatori nel contesto dell'apoptosi di segnalazione.
Introduction
Negli ultimi anni, l'importanza degli esperimenti a una cellula è diventata evidente. I dati provenienti da singole celle consentono l'analisi della variabilità da cella a cella, la risoluzione delle correlazioni dei parametri intracellulari e il rilevamento della cinetica cellulare che rimangono nascoste nelle misurazionidell'insieme 1,2,3. Al fine di studiare la cinetica cellulare di migliaia di singole cellule in parallelo, sono necessari nuovi approcci che consentano di monitorare le cellule in condizioni standardizzate per un periodo di tempo di diverse ore fino a diversi giorni seguito da un'analisi quantitativa dei dati 4. Qui presentiamo Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA), che combina l'uso di array microstrutturati con microscopia time-lapse e analisi automatizzata delle immagini.
Diversi metodi per generare array microstrutturati a cella singola sono stati stabiliti e pubblicati nella letteratura5,6. Qui, descriviamo brevemente il modello proteico avviato dal plasma su microscala (μPIPP). Un protocollo dettagliato della fabbricazione di array a cella singola utilizzando μPIPP si trova anche nel riferimento7. L'uso di matrici a cella singola consente l'allineamento di migliaia di celle su punti di adesione standardizzati che presentano microambientati definiti per ogni cella e riduce così una fonte di variabilità sperimentale (Figura 1A). Gli array a cella singola vengono utilizzati per monitorare i corsi di tempo dei marcatori fluorescenti allo scopo di indicare una varietà di processi cellulari. La microscopia a lungo termine in modalità time-lapse di scansione consente di monitorare una vasta area degli array a singola cella e quindi di campioare i dati a cella singola in alta velocità effettiva per un tempo di osservazione di diverse ore o addirittura giorni. In questo modo vengono generati stack di immagini a linee di tempo da ogni posizione della matrice (Figura 1B). Al fine di ridurre la grande quantità di dati immagine ed estrarre i corsi di tempo di fluorescenza a singola cella desiderati in modo efficiente, è necessaria un'elaborazione automatizzata delle immagini che sfrofitti il posizionamento delle cellule (Figura 1C).
La sfida di LISCA è adattare i protocolli sperimentali e gli strumenti computazionali per formare un saggio ad alta produttività che generi dati quantitativi e riproducibili della cinetica cellulare. In questo articolo forniamo una descrizione dettagliata dei singoli metodi e di come vengono combinati in un test LISCA. Ad esempio, discutiamo il corso del tempo dell'espressione di proteina fluorescente verde migliorata (eGFP) dopo la consegna artificiale di mRNA. L'espressione eGFP dopo la consegna dell'mRNA è descritta da equazioni della velocità di reazione che modellano la traduzione e la degradazione dell'mRNA. Adattando la funzione del modello per il corso del tempo della concentrazione eGFP alla lettura LISCA dell'intensità di fluorescenza per ogni singola cella nel tempo si ottiene la migliore stima dei parametri del modello come il tasso di degradazione dell'mRNA. Come risultato rappresentativo discutiamo dell'efficienza di erogazione dell'mRNA di due diversi agenti di trasfezione a base lipidica e di come differiscono le loro distribuzioni dei parametri.
Figura 1: Rappresentazione del flusso di lavoro LISCA che combina(A) array a celle singole a micro pattern (B) microscopia time-lapse di scansione e (C) analisi automatica delle immagini delle serie di immagini registrate. Gli array a cella singola consistono in un modello bidimensionale di quadrati cell-adesivi con un interspazio repellente per cellule che porta a una disposizione delle cellule sul micropattern, come si può vedere nell'immagine a contrasto di fase e nell'immagine di fluorescenza delle cellule che esprimono eGFP (A). L'intera area microstrutturata viene immagine in modalità time-lapse di scansione che scatta ripetutamente immagini in una sequenza di posizioni (B). Le serie di immagini registrate vengono elaborate per leggere l'intensità di fluorescenza per cella nel tempo (C). Barre di scala: 500 μm(A),200 μm (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Protocol
Figura 2: Acquisizione di dati che combina microarray a cella singola (A) con microscopia time-lapse a scansione (B). Durante la preparazione dell'esperimento time-lapse, viene preparato un array a cella singola con un micropattern 2D di quadrati di adesione (1), seguito dalla semina cellulare e dall'allineamento delle cellule sul micropattern (2), nonché dalla connessione di un sistema di perfusione allo scivolo a sei canali, che consente la movimentazione del liquido durante la misurazione time-lapse (3). Viene impostato un esperimento time-lapse di scansione (4) e le cellule vengono trasfette al microscopio iniettando una soluzione lipoplex di mRNA attraverso il sistema di perfusione durante l'esperimento time-lapse (5). Barre di scala: 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
1. Fabbricazione di array a cella singola microstrutturata(figura 2A)
- Preparare i materiali necessari per la fabbricazione dell'array μPIPP.
- Preparare la salina sterile tamponata con fosfato (PBS) a pH 7.4.
- Preparare acqua ultrapura sterile con una resistività di almeno 18 MΩcm a 25 °C.
- Preparare la soluzione di lavoro PLL(20 kDa)-g[3.5] PEG(2 kDa) (PLL-PEG) con una concentrazione di 2 mg/mL di PLL-PEG in acqua ultrapura contenente 150 mM NaCl e 10 mM 4-(2-idrossietile)-1-piperazinaetanosilfofonico (HEPES).
- Preparare una soluzione proteica a matrice extracellulare per il rivestimento superficiale: 1 mg/mL di fibronectina (FN) in PBS.
- Preparare un wafer di silicio con un micropattern fabbricato dalla fotolitografia8 che funziona come un master riutilizzabile. Il micropattern è costituito da quadrati con una lunghezza del bordo di 30 μm, una profondità di 12 μm e una distanza inter quadrato di 60 μm, disposti in sei strisce ciascuna con una larghezza di 6 mm e un'altezza di 18 mm.
- Mescolare un monomero polidimetilsilossano (PDMS) con un reticolo al 9% (massa %) utilizzando un kit di elastomero in silicone e degasarlo per circa 30 minuti fino a quando non è privo di bolle usando un essiccatore. Lanciare il wafer di silicio con uno strato PDMS di circa 3-5 mm di spessore e degasarlo di nuovo per circa 30 minuti fino a quando non è privo di bolle.
- Mettere il wafer di silicio con il PDMS in un forno da forno a 50 °C per curare il PDMS per almeno 4 ore.
- Tagliare i francobolli PDMS.
- Usa un bisturi e ritaglia dal livello PDMS un capolavoro PDMS che contiene le sei strisce micropattern.
- Posizionare il capolavoro PDMS su una panchina con il micropattern rivolto verso l'alto.
- Tagliare ognuna delle sei strisce micropattern del capolavoro PDMS con una lama di rasoio in un timbro PDMS. Fare attenzione che i bordi dei timbri PDMS siano aperti tagliando parte dell'area modellata.
- Posizionare i timbri PDMS su un coverslip di una diapositiva a sei canali (Figura 3-1).
- Utilizzare un coverslip non rivestito e contrassegnare le posizioni del canale dello scivolo a sei canali graffiando accuratamente il foglio di protezione del coverslip. Quindi posizionare il copripata sul banco con il foglio di protezione rivolto verso il basso.
- Posizionare i timbri PDMS con il micropattern rivolto verso il basso sul coverslip nelle posizioni del canale contrassegnate utilizzando una pinzetta.
- Controllare l'attacco dei francobolli PDMS al microscopio. Se un timbro PDMS è completamente attaccato al coverslip, i quadrati in contatto appaiono più scuri dell'interspazio. L'attacco del timbro PDMS al coverslip è fondamentale per la qualità del micropattern.
- Posizionare il coverslip con i sei timbri PDMS su di esso in un detergente al plasma e trattarlo con plasma di ossigeno (pressione 0,2 mbar, ~ 40 W per 3 minuti) per rendere idrofile le superfici tra i francobolli PDMS e il coverslip idrofilo(Figura 3-2).
- Eseguire tutti gli ulteriori passaggi della fabbricazione del micropattern in un armadio per la biosicurezza. Utilizzare 15 μL della soluzione PLL-PEG e pipettarne una goccia accanto a ciascun timbro PDMS in modo che la soluzione PLL-PEG sia assorbita nel modello idrofilo del timbro PDMS (Figura 3-3). Lasciare incubare il PLL-PEG per 20 minuti a temperatura ambiente.
- Risciacquare 1 mL di acqua ultrapura sopra il coperchio con i francobolli PDMS su di esso e rimuovere i francobolli PDMS utilizzando una pinzetta (Figura 3-4). Quindi sciacquare il coverslip una seconda volta con 1 mL di acqua ultrapura e lasciarlo asciugare.
- Quando il coverslip si è asciugato completamente, attaccare uno scivolo appiccicoso a sei canali al coverslip (Figura 3-4). Fare attenzione che le aree micropatterned si allineino con la parte inferiore dei canali.
- Funzionalizzare i quadrati di adesione con FN.
- Riempire 40 μL di PBS in ogni canale.
- Preparare una soluzione FN da 100 μg/mL in PBS.
- Aggiungere 40 μL della soluzione FN a ciascun canale (Figura 3-5). Mescolare accuratamente la soluzione FN con il PBS nel canale rimuovendo 40 μL da un serbatoio e aggiungendola al serbatoio opposto dello stesso canale per 3 volte per generare una soluzione omogenea. Incubare la soluzione FN per 45 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare ogni canale tre volte con 120 μL di PBS(Figura 3-6).
- Per verificare la qualità del modello, utilizzare un FN etichettato fluorescentmente nel passaggio 9.2. (Figura 4A).
NOTA: Si consiglia di preparare l'array μPIPP non più di un giorno prima della semina cellulare in quanto PLL-PEG e FN non sono legati in modo covalente al substrato e la qualità del modello può diminuire nel tempo. Conservare l'array μPIPP preparato in frigo.
Figura 3: Fabbricazione di microarray a cella singola mediante timbri PDMSμPIPP. (1) con una struttura micromodello tridimensionale sulla superficie sono disposti su un coperchio di una diapositiva a sei canali. (2) Il copripasta con i timbri PDMS su di esso viene trattato con plasma di ossigeno per rendere le superfici idrofile. (3) Viene aggiunto PLL-PEG. Viene assorbito nella microstruttura da forze capillari e rende le superfici non coperte dal timbro PDMS repellente per cellule. (4) Il coverslip viene risciacquato con acqua per rimuovere il restante PLL-PEG. Quindi, i timbri PDMS vengono rimossi e una diapositiva appiccicosa a sei canali è bloccata sul coperchio. (5) La fibronectina, una proteina della matrice extracellulare, viene aggiunta per rendere le aree senza PLL-PEG cell-adhesive. (6) Lo scivolo a sei canali viene lavato con salina tamponata con fosfati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
2. Semina cellulare(figura 2A)
NOTA: Per i seguenti passaggi di lavaggio, aggiungere il rispettivo liquido a un serbatoio e quindi rimuovere un volume uguale di liquido dal serbatoio opposto di un canale.
- Lavare ogni canale con 120 μL di 37 °C di mezzo di crescita cellulare completamente integrato. Prima di aggiungere la sospensione cellulare, assicurarsi che solo i canali siano riempiti con mezzi ma non con i serbatoi.
- Staccare le celle HuH7 da un pallone di coltura cellulare seguendo il protocollo standard per la passatura delle celle e regolare la concentrazione di sospensione cellulare a 4 x 105 celle/ml.
- Aggiungere 40 μL di sospensione cellulare e mescolare il mezzo di crescita cellulare con la sospensione cellulare rimuovendo 40 μL da un serbatoio e aggiungendolo al serbatoio opposto dello stesso canale per 3 volte per raggiungere una distribuzione cellulare omogenea (Figura 4B).
- Rimuovere 40 μL di sospensione dal canale in modo che solo il canale sia riempito con sospensione cellulare.
- Mettere lo scivolo in un incubatore e controllare l'adesione cellulare 1 h dopo la semina utilizzando un microscopio a contrasto di fase.
- Aggiungere 120 μL di mezzo di crescita delle cellule calde a 37 °C.
- Ma la diapositiva indietro nell'incubatore per ulteriori 3 ore per consentire l'auto-organizzazione cellulare sul micropattern (Figura 4C).
Figura 4: Auto-organizzazione cellulare e controllo di qualità dell'arrayμPIPP. (A) La superficie microstrutturata è costituita da punti di adesione quadrati rivestiti di FN mostrati in rosso circondati da un polimero repellente per cellule. (B) Dopo la semina cellulare, le cellule HuH7 sono distribuite casualmente e (C) aderiscono principalmente alle macchie di adesione per un periodo di tempo di 4 ore. Ristampato con autorizzazione 7. Barre di scala: 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
3. Sistema di perfusione(figura 2A)
NOTA: L'uso di un sistema di perfusione è necessario solo se è necessario aggiungere reagenti o marcatori fluorescenti nel corso della misurazione time-lapse. A seconda delle esigenze, è possibile collegare ogni canale a un sistema di perfusione separato o collegare più canali in serie allo stesso sistema di perfusione. Il numero di sistemi di perfusione corrisponde al numero di condizioni sperimentali indipendenti. Collegare i tubi in condizioni sterili in un armadio di biosicurezza ed evitare l'inclusione di bolle d'aria nel sistema di perfusione. Se non viene utilizzato alcun sistema di perfusione, aggiungere i reagenti/marcatori in un armadio di biosicurezza prima della misurazione time-lapse. Il sistema di perfusione è fabbricato internamente, il materiale usato è elencato nella tabella dei materiali. L'assemblaggio del sistema di perfusione è stato descritto in precedenza9.
- Utilizzare una siringa da 1 ml (con sporn sostitutivo) e riempire la siringa con 1 ml di mezzo di crescita cellulare a 37 °C.
- Collegare la siringa al tubo di ingresso utilizzando la valvola e riempire il tubo con il mezzo.
- Collegare il tubo di ingresso a un serbatoio di un canale e assicurarsi che non siano intrappolate bolle d'aria.
- Per collegare un altro canale in serie a questo sistema di perfusione, collegare un connettore seriale al serbatoio opposto al tubo di ingresso del canale corrente. Procedere al canale successivo e collegare l'estremità libera del connettore seriale a uno dei suoi serbatoi.
- Ripetere i passaggi precedenti fino a quando il numero richiesto di canali non è collegato in serie.
- Collegare il tubo di uscita direttamente al serbatoio libero del canale corrente. Riempire il tubo collegato con mezzo per verificare che il sistema di perfusione non perda.
- Ripetere i passaggi precedenti fino a quando tutti e sei i canali della diapositiva non sono collegati a un sistema di perfusione.
- Riposizionare lo scivolo con i sistemi di perfusione collegati nell'incubatore fino a quando non utilizzarlo ulteriormente o posizionarlo direttamente nella camera di riscaldamento del microscopio preriscaldato a 37 °C per la misurazione time-lapse.
4. Microscopia time-lapse(figura 2B)
NOTA: Per le misurazioni a lungo termine, mantenere una temperatura stabile di 37 °C e un livello stabile di CO2. In alternativa al mezzo di crescita cellulare dipendente da CO2,utilizzare il mezzo L15 per il quale non è richiesto alcun sistema di incubazione del gas.
NOTA: Per l'imaging quantitativo, utilizzare il mezzo di crescita cellulare senza rosso fenolo durante la misurazione time-lapse per ridurre la fluorescenza di fondo e utilizzare le stesse impostazioni del protocollo time-lapse e lo stesso microscopio per le repliche tecniche.
- Impostare un protocollo time-lapse per la registrazione di un'immagine a contrasto di fase e un'immagine a fluorescenza con tempi di esposizione di 750 ms (a seconda della fotocamera), intervallo di tempo di 10 minuti tra cicli consecutivi attraverso l'elenco di posizione e un tempo di osservazione di 30 ore, utilizzando un obiettivo 10x e filtri di fluorescenza appropriati.
- Mettere lo scivolo a sei canali con le celle sugli array a cella singola nel portacampioni della camera di riscaldamento caldo a 37 °C. Se i sistemi di perfusione sono collegati allo scivolo a sei canali, fissare i tubi sul palco utilizzando del nastro per assicurarsi che lo scivolo a sei canali non si sposti durante lo scambio di liquidi. Inserire le estremità libere dei tubi di uscita attraverso un foro di un tubo di reazione da 15 ml per raccogliere i rifiuti liquidi.
- Impostare l'elenco delle posizione per la misurazione time-lapse di scansione. Assicurarsi che il numero di posizioni possa essere analizzato entro l'intervallo di tempo definito tra cicli consecutivi nell'elenco delle posizioni. Con un obiettivo 10x, è possibile impostare 10-30 posizioni per canale per scansionare l'area totale del micropattern a seconda delle dimensioni del chip della fotocamera.
- Avviare la misurazione time-lapse. Per una migliore qualità dell'immagine delle misurazioni a lungo termine, utilizzare un sistema automatizzato di correzione della messa a fuoco.
5. Marcatore fluorescente - trasfezione dell'mRNA(Figura 2B)
NOTA: Per una trasfezione in due canali collegati da un sistema di tubi, è necessario un volume totale di 600 μL di miscela di trasfezione (300 μL per un canale). I volumi indicati si riferiscono a una trasfezione in due canali collegati.
- Preparare una soluzione di agente di trasfezione diluire 1 μL di agente di trasfezione in 200 μL di mezzo ridotto al siero e lasciare incubare la soluzione per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Preparare una soluzione di mRNA diluire 300 ng di codifica mRNA per eGFP in 150 μL di mezzo ridotto al siero.
- Preparare la miscela di trasfezione aggiungendo 150 μL della soluzione di agente di trasfezione alla soluzione di mRNA e mescolarla bene. Lasciare incubare la miscela di trasfezione per 20 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare il sistema di tubi con 1 ml di PBS caldo a 37 °C utilizzando una siringa durante l'incubazione della miscela di trasfezione. Quando si scaricano i tubi, assicurarsi che lo stadio del microscopio non si muova. Sospendere la misurazione time-lapse, se necessario.
- Diluire la miscela di trasfezione alla concentrazione finale di mRNA di 0,5 ng/μL aggiungendo un mezzo ridotto al siero di 300 μL.
- Sciacquare il sistema di tubi con la miscela di trasfezione utilizzando una siringa e lasciare incubare i lipoplex mRNA per 1 h (mettere in pausa la misurazione time-lapse se necessario).
- Interrompere l'incubazione di trasfezione e sciacquare i lipoplex mRNA non collegati lavandosi con 1 ml di 37 °C di mezzo di crescita cellulare caldo completamente integrato utilizzando una siringa (mettere in pausa la misurazione time-lapse se necessario).
6. Analisi delle immagini e lettura della fluorescenza
- Quando si esegue l'analisi delle immagini per la prima volta, installare la versione 0.1.6 del software open source "Automated Microstructure Analysis in Python" (PyAMA) dallaposizione citata 10 secondo le istruzioni fornite lì.
- Assicurarsi che i canali dell'immagine (contrasto di fase e fluorescenza) siano disponibili come file TIFF a 16 bit multi-immagine. Se necessario, convertirli di conseguenza.
- Inizia PyAMA e fai clic su Apri stack... per aprire le immagini per l'analisi.
- Per aprire ogni file TIFF con più immagini, fare clic su Apri e selezionare il file in modo che sia visualizzato nell'elenco dei file caricati sul lato sinistro della finestra di dialogo (Figura 5-1).
- Contrassegnare i canali da includere nell'analisi. Per ogni canale, eseguire la procedura seguente.
- Selezionare nell'elenco dei file caricati il file TIFF contenente il canale.
- Nella sezione Aggiungi nuovo canaleselezionare l'indice del canale nel file TIFF. L'indicizzazione è in base zero; il primo canale ha l'indice 0, il secondo canale ha l'indice 1 e così via.
- Selezionare il tipo di canale. Selezionate Contrasto di fase o Fluorescenza per i canali di immagine e segmentazione corrispondenti per un canale binario che indica i contorni delle celle.
- Facoltativamente, immettere un'etichetta del canale per distinguere diversi canali di fluorescenza: eGFP e DAPI.
- Dopo aver configurato il canale, fare clic su Aggiungi.
- Quando tutti i canali aggiunti vengono visualizzati nell'elenco dei canali sul lato destro della finestra di dialogo, fare clic su OK per caricare lo stack.
- Per eseguire la segmentazione utilizzando l'algoritmo di segmentazione incorporato di PyAMA per il riconoscimento delle celle basato sulle immagini a contrasto di fase (Figura 5-2), passare a Strumenti | Binarizza... e immettere un nome di file per il file NumPy con il canale binarizzato.
NOTA: nella versione corrente, il caricamento del canale binarizzato richiede il ricaricamento di tutti i canali. - Per eseguire una correzione in background11 su un canale di fluorescenza (Figura 5-3), assicurarsi che il canale di fluorescenza e un canale di segmentazione siano caricati. Se non viene caricato alcun canale di segmentazione, assicurarsi che un canale di contrasto di fase sia caricato per la segmentazione automatica. Vai a "Strumenti per > in background..." e selezionare un nome di file per il file TIFF risultante con il canale di fluorescenza corretto.
NOTA: nella versione corrente, il caricamento del canale corretto in background richiede il ricaricamento di tutti i canali. - Ispezionare le celle preselezione (Figura 5-4) e il segnale di fluorescenza integrato (Figura 5-5) scorrendo i tempi, visualizzando i canali elencati nel menu del canale sul lato sinistro e facendo clic sulle celle per evidenziare i corsi di tempo di fluorescenza (Figura 1C). Utilizzare la selezione di celle per escludere da ulteriori analisi le celle non vitali, non limitate a un punto di adesione o attaccate a un'altra cella. Attivare o disattivare la selezione delle celle per la lettura premendo MAIUSC e facendo clic sulla cella oppure evidenziando la cella e premendo INVIO.
- Salvare i corsi di tempo a cella singola per l'area cellulare e la fluorescenza integrata (Figura 5-6) facendo clic su File | Salvare e selezionare una directory in cui salvare.
Figura 5: Elaborazioneautomatizzata delle immagini in serie di immagini time-lapse utilizzando pyAMA. (1) Vengono importate serie di immagini a contrasto di fase e fluorescenza per ogni posizione di imaging. (2) I contorni delle celle sono determinati dalla segmentazione dello stack di immagini a contrasto di fase. (3) Alle immagini a fluorescenza viene applicata una correzione di fondo. (4) I contorni delle celle sono tracciati nel tempo e preselezione per l'esportazione. (5) L'intensità della fluorescenza è integrata in base ai contorni delle cellule tracciate. (6) Vengono valutate le aree a celle singole e le intensità integrate di fluorescenza e vengono esportati i corsi di tempo per ciascuna cellula. Barre di scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Per analizzare la cinetica di traduzione dopo la trasfezione dell'mRNA, adattare un modello di traduzione basato su equazioni di velocità biochimiche a ciascun corso di tempo a cellasingolacome descritto in precedenza da Reiser et al. I dati e il codice utilizzati in tale studio sono disponibili al pubblico13.
- Per ogni corso di tempo a cella singola, recuperate i parametri di raccordo stimati del modello di traslazione che rappresentano la velocità di degradazione dell'mRNA e il punto di tempo di inizio della traslazione. Un set di dati di esempio viene discusso nella sezione dei risultati rappresentativi.
- Eseguire ulteriori analisi sulle distribuzioni delle migliori stime dei parametri per varie condizioni sperimentali per studiare la variabilità da cellula a cellula all'interno delle popolazioni cellulari.
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Representative Results
L'approccio LISCA consente di raccogliere in modo efficiente corsi di tempo di fluorescenza da singole cellule. Come esempio rappresentativo viene illustrato come viene applicato il metodo LISCA per misurare l'espressione eGFP a cella singola dopo la trasfezione. I dati dell'esperimento LISCA vengono utilizzati per valutare la cinetica di somministrazione dell'mRNA, che è importante per lo sviluppo di farmaci mRNA efficienti.
In particolare dimostriamo il diverso impatto di due sistemi di erogazione di mRNA a base lipidica rispetto al punto di tempo di insorgenza della traduzione e alla velocità di espressione a livello di singola cellula. Abbiamo coltivato le cellule e diviso il lotto in due popolazioni. Una sottopopolazione è stata trasfettata con lipoplex come descritto nella sezione del protocollo. L'altra sottopopolazione è stata transessuale usando lo stesso mRNA con la stessa concentrazione finale di mRNA, ma con nanoparticelle lipidiche (LNP) come sistema di somministrazione, che sono state prodotte utilizzando la miscelazione microfluidica12. A causa di una diversa composizione lipidica e della diversa fabbricazione dei sistemi di erogazione dell'mRNA dei lipoplex e degli LNP ci aspettiamo un impatto sulla cinetica traslazione in quanto la cinetica di assorbimento dovrebbe essere influenzata. Utilizzando il metodo LISCA quantifichiamo il punto di tempo t0 dell'inizio della traslazione dopo la trasfezione e quanto forti le cellule esprimono eGFP, che dipende dal prodotto delle molecole di mRNA trasfette m0 e dal tasso di traslazione k TL. Per ottenere questi due parametri, si adatta un modello di traslazione in tre fasi come sketch nella figura 6A. Dopo il rilascio riuscito delle molecole di mRNA m al momento t0 nel citosol, l'mRNA viene tradotto con velocità kTL in eGFP G*insaturo, che non è fluorescente. L'insaturo G* matura con velocità da kM a eGFP G, la cui intensità di fluorescenza viene misurata durante la misurazione time-lapse. L'mRNA e l'eGFP (insaturo e maturato) si degradano nel tempo con i rispettivi tassi di degradazione δ e γ. Il modello è descritto dalle equazioni differenziali ordinarie e la soluzione analitica per G è usata come funzione modello per la stima dei parametri. La funzione modello è adattata a ciascuno dei corsi di tempo a cella singola, come mostrato nella figura 6B con corsi di tempo di esempio (grigio) e i rispettivi adatta (verde). Nella figura 6C mostriamo gli istogrammi del punto di tempo t0 dell'esordio traslazione e la velocità di espressione m0kTL delle cellule trasfette lipoplex. Poiché entrambi i parametri sono stimati per ogni cella, la correlazione di questi parametri può essere analizzata come mostrato nello scatterplot(Figura 6D, dati blu) e può essere confrontata con le celle trasfette da LNP (rosso). Come mostrato nella figura 6D, le celle trasfette da LNP mostrano una minore variabilità da cella a cella rispetto alle cellule trasfette da lipoplex e la media della popolazione mostra un inizio più rapido della traslazione e una maggiore velocità di espressione (punti spessi con contorno nero).
Questi due set di dati sono solo un esempio di come LISCA può essere utilizzato per studiare la traduzione dopo la trasfezione dell'mRNA. Ulteriori indagini possono essere fatte ad esempio per quanto riguarda la stabilità dell'mRNA dipendente dalle modifiche della sequenza di mRNA 14, varie proteine reporter stabiliti 15, o degradazione dell'mRNA mediata da siRNA 16.
Figura 6: Analisi dei dati dellacinetica di traduzione eGFP a cella singola. (A) La cinetica traslazione della proteina reporter eGFP dopo la consegna dell'mRNA può essere descritta da un'equazione della velocità di reazione a tre fasi con i rispettivi parametri. (B) Il modello è montato (tracce verdi) su ogni corso del tempo di espressione eGFP a cella singola (tracce grigie) per stimare i parametri del modello come il punto di tempo (t0) dell'inizio della trasfezione e la velocità di espressione (m0kTL), due parametri per quantificare l'efficacia di erogazione dell'mRNA. (C) Istogrammi della distribuzione dei parametri per il tempo di insorgenza della trasfezione e la velocità di espressione. (D) Poiché i parametri sono stimati per ogni cella, un grafico a dispersione di questi parametri mostra la correlazione dei parametri. I puntini rappresentano i parametri di una singola cella. La trama mostra cellule trasfette da LNP mRNA (rosso) e lipoplex mRNA (blu). I punti spessi con contorno nero corrispondono alla rispettiva media della popolazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui abbiamo descritto LISCA come una tecnica versatile per seguire la cinetica cellulare delle etichette fluorescenti intracellulari a livello a singola cellula. Per eseguire un esperimento LISCA riuscito, ciascuno dei passaggi descritti della sezione del protocollo deve essere stabilito singolarmente e quindi tutti i passaggi devono essere combinati. Ognuno dei tre aspetti principali di LISCA presenta passaggi cruciali.
Fabbricazione di microarray a cella singola
La qualità del microarray è fondamentale in quanto l'allineamento cellulare sul microarray non è solo importante per tutti gli ulteriori passaggi sperimentali, ma ha anche un'influenza sulla qualità dei dati. Per questo motivo, la geometria del modello e il metodo di fabbricazione devono essere adattati rispetto alle celle utilizzate. I risultati rappresentativi discussi in questo articolo sono stati generati con la linea cellulare del carcinoma epatico HuH7 allineata su un modello quadrato (30 μm)2. Questa geometria del modello è adatta anche ad altre linee cellulari come A549 o HEK293. Per celle più grandi come il BEAS-2B, è possibile utilizzare un modello quadrato più grande con una lunghezza del bordo di 35 μm e una distanza inter quadrato di 80 μm. La procedura di semina descritta è ottimizzata per le cellule HuH7, ma può essere adattata a molte altre cellule aderenti17. Ad esempio, alcune linee cellulari necessitano di dimensioni diverse delle macchie di adesione o necessitano di una spaziatura maggiore tra le punti di adesione per evitare contatti cellulare-cella attraverso celle allungate.
Il micropattern dovrebbe essere regolato in modo che l'area del sito di adesione soddisfi approssimativamente l'area media di una cellula nei piatti di coltura standard. La geometria può essere rotonda o quadrata e non ha alcun effetto misurabile della vitalità cellulare. I movimenti cellulari sembrano essere più limitati su un motivo quadrato rispetto al motivo rotondo, dove le celle sono spesso viste ruotare. Si consiglia un test di fattibilità separato quando vengono utilizzate per la prima volta nuove linee cellulari. La densità di semina deve essere regolata per linee cellulari specifiche per raggiungere un'elevata occupazione dei punti di adesione e ridurre al minimo le doppie occupazioni di punti di adesione allo stesso tempo. Tipicamente, l'occupazione risultante del numero di celle per sito di adesione segue le statistiche di Poisson ed è zero, una o due. Pertanto, l'occupazione totale tra il 60% e l'80% dovrebbe essere volta ad evitare doppie occupazioni17. Potrebbe essere necessario adattare il protocollo di semina per quanto riguarda il numero di cellule sementi e la durata tra la semina e la prima fase di lavaggio. Ad esempio, un passaggio di lavaggio 30 min dopo la semina invece di 1 h (vedi passaggi 5 e 6 della sezione di protocollo 2 Cell seeding) ridurrà il numero di punti di adesione a doppia occupazione, ma ridurrà anche il numero totale di punti di adesione occupati per le cellule HuH7.
Poiché il collegamento di un sistema di tubi alle diapositive del canale non è obbligatorio, è più facile stabilire l'uso di un marcatore reagente o fluorescente senza utilizzare un sistema di tubi per verificare il tempo di concentrazione e incubazione più adatto. Dopo aver stabilito un protocollo adatto per il reagente/marcatore di interesse, il sistema di tubi può essere incluso nel flusso di lavoro.
Microscopia time-lapse
Un altro passo cruciale sono le impostazioni della misurazione time-lapse. Ad esempio, il tempo di esposizione per il marcatore di fluorescenza deve essere scelto con cura per evitare il fotolicenza degli effetti di fluoroforo e fototossicità, ma garantire comunque un buon segnale di fluorescenza. Un altro parametro importante della configurazione time-lapse è la migliore combinazione adatta di risoluzione spaziale e temporale, che dipende fortemente dalla cinetica cellulare osservata. Se è necessaria un'alta risoluzione temporale, solo un numero minore di posizioni nel microarray può essere scansionato tra due punti temporali, il che riduce l'area di osservazione scansionata e, quindi, riduce anche le statistiche. L'area di osservazione dipende inoltre non solo dal numero di posizioni scansionate, ma anche dall'obiettivo e dalle dimensioni di un campo visivo della telecamera. Nell'esempio dato, una risoluzione del tempo di 10 min è sufficiente usando un obiettivo 10x per osservare la cinetica di traduzione. Questa combinazione consente di scansionare 70-100 posizioni per punto di tempo a seconda delle dimensioni del chip della fotocamera, della velocità dello stadio del microscopio e del numero di canali di imaging (ad esempio, contrasto di fase e fluorescenza eGFP).
elaborazione di immagini
L'analisi della fluorescenza totale per cellula è facilitata in quanto le cellule sono posizionate in un array. Tuttavia, la qualità dei corsi di tempo di fluorescenza a cella singola, in particolare il rapporto segnale/rumore (SNR), dipende dall'algoritmo utilizzato per l'integrazione delle intensità di fluorescenza cellulare dalla serie di immagini. Le fasi di elaborazione delle immagini dello strumento software PyAMA sono mostrate nella figura 5. La determinazione delle aree di integrazione per la lettura della fluorescenza a singola cella è particolarmente importante perché il contorno cellulare delle cellule viventi varia con il tempo. PyAMA integra l'intensità della fluorescenza su un contorno cellulare, che può essere determinato da un algoritmo di segmentazione integrato. Un'alternativa sarebbe quella di integrarsi oltre i limiti fissi in base alla geometria del micropattern12,16. La versione corrente di PyAMA esegue la segmentazione dell'immagine in base a una soglia sulla deviazione standard dei quartieri dei pixel del canale dell'immagine a contrasto di fase. I risultati della segmentazione possono essere importati anche da software esterno. Per le versioni future, è previsto il supporto nativo per la segmentazione basata sull'apprendimento automatico e per l'integrazione oltre i limiti fissi.
PyAMA offre di filtrare le celle fuori uscita o i corsi di tempo anomali utilizzando un'interfaccia che consente l'ispezione visiva sia dell'immagine a fluorescenza che dei corsi di tempo di fluorescenza di celle selezionate (Figura 1C). Esempi di celle che possono essere escluse dall'analisi sono le celle che subiscono divisione o apoptosi o che si trovano al di fuori di un sito di adesione. Anche le aggregazioni di più celle erroneamente riconosciute dall'algoritmo di rilevamento come singola cella devono essere filtrate per garantire che i corsi di tempo provengano da singole celle. PyAMA esegue una preselezione delle celle per ridurre la quantità di interazione manuale necessaria per filtrare le cellule anomale. La preselezione può essere ispezionata e corretta a mano prima di esportare i corsi di tempo delle celle selezionate per compensare le imprecisioni della preselezione. La preselezione della versione corrente di PyAMA si basa su una soglia per la dimensione della cella per deselezionare le aggregazioni di celle. Per le versioni future, è prevista un'ulteriore preselezione basata sull'apprendimento automatico, che consente di tenere conto di ulteriori criteri, inclusi gli esempi per le celle anomale sopra descritte.
In sintesi, l'approccio LISCA utilizza array a cella singola per raccogliere in modo efficiente corsi di tempo a fluorescenza a singola cella. Limitare le celle ai siti di adesione microfabbricati facilita il tracciamento e l'analisi delle immagini. Inoltre, le cellule sono coltivate in microambientati locali standardizzati e, quindi, sono presentate con una superficie uniforme quando esposte ad agenti come le nanoparticelle lipidiche per la trasfezione. Questo aspetto è particolarmente utile quando si studia l'eterogeneità cellulare all'interno di una popolazione. La tecnica μPIPP descritta qui è una delle molte tecniche di microfabbricazione che si traducono in microarray regolari di modelli proteici. Si riferisce alla letteratura che esamina la stampa di microcontatti, gli approcci fotolitografici e la litografia morbida come processi di fabbricazione alternativi6. A seconda della linea cellulare, potrebbe essere preferibile l'una o l'altra tecnica di patterning. Nei nostri esperimenti, la tecnica μPIPP ha mostrato cellule ben posizionate dopo la semina di cellule a causa dell'auto-smistamento cellulare, che si basa sull'adesività cellulare residua sull'area PEGylated in modo che le cellule siano in grado di cercare in migrazione casuale e diffondersi sugli array bersaglio proteici con adesivitàdifferenzialemente più grande 17.
LISCA consente l'acquisizione di un gran numero di corsi di tempo a cella singola di marcatori di fluorescenza arbitrari. L'analisi dei segnali di fluorescenza a livello di singola cellula, a differenza degli esperimenti alla rinfusa, produce corsi di tempo uni-cella incontaminati e rivela variabilità da cellula a cellula. L'eterogeneità cellulare gioca un ruolo eminente nelle decisioni sul destino cellulare come l'apoptosi18,19,20. In questo contesto, abbiamo recentemente esteso l'approccio LISCA utilizzando due canali di fluorescenza consentendo l'analisi delle correlazioni temporali di due eventi cellulari contemporaneamente indicando particolari stadi all'interno della cascata di segnalazione della morte cellulare19. In questo campo di ricerca, LISCA si presenta come un'alternativa alle misurazioni della citometria del flusso. Mentre la citometria del flusso fornisce innegabilmente un flusso di lavoro più veloce e in genere produce statistiche più grandi, i dati vengono acquisiti in un particolare momento. Le dipendenze a tempo pieno producono stime dei parametri cinetici e rivelano correlazioni temporali tra diversi segnali di fluorescenza, che altrimenti sono di difficile accesso. Per utilizzare più canali di fluorescenza, la configurazione richiede ruote filtranti automatizzate o più telecamere. In questo caso anche l'analisi FRET a singola cellula dovrebbe essere fattibile e consentire studi risolti nel tempo sulla vicinanza tra molecole etichettate fluorescentmente. Uno svantaggio dell'analisi basata su immagini come LISCA è il lavoro legato ai controlli visivi e al rilevamento degli outlier. Qui gli strumenti di machine learning potrebbero facilitare l'elaborazione dei dati e consentire l'analisi dei dati completamente automatizzata. In futuro, utilizzando piattaforme di microscopia automatizzate, microfabbricazione rapida e intelligenza artificiale, la produttività e l'applicabilità di LISCA potrebbero essere notevolmente aumentate. Inoltre, la successiva analisi di cellule che mostrano insolite risposte di fluorescenza utilizzando l'estrazione microfluidale 21e la genomica a singola cellula è un requisito frequente nell'industria farmaceutica. Il protocollo presentato in questo articolo si adatta alla richiesta di studiare la cinetica dei processi cellulari con risoluzione a cella singola e statistiche adeguate.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Fondazione tedesca della scienza (DFG) al Collaborative Research Center (SFB) 1032. Il sostegno del Ministero federale tedesco dell'istruzione, della ricerca e della tecnologia (BMBF) nell'ambito del progetto cooperativo 05K2018-2017-06716 Medisoft e una sovvenzione della Bayerische Forschungsstiftung sono riconosciuti con gratitudine. Anita Reiser è stata sostenuta da una Borsa di Studio DFG attraverso la Graduate School of Quantitative Biosciences Munich (QBM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adtech Polymer Engineering PTFE Microtubing | Fisher Scientific | 10178071 | |
| baking oven | Binder | 9010-0190 | |
| CFI Plan Fluor DL 10x | Nikon | MRH20100 | |
| Desiccator | Roth | NX07.1 | |
| Eclipse Ti-E | Nikon | ||
| eGFP mRNA | Trilink | L-7601 | |
| Female Luer to Tube Connector | MEDNET | FTL210-6005 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Fibronectin | Yo Proteins | 663 | |
| Filter set eGFP | AHF | F46-002 | |
| Fisherbrand Translucent Platinum-Cured Silicone Tubing | Fisher Scientific | 11768088 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Incubation Box | Okolab | OKO-H201 | |
| incubator | Binder | 9040-0012 | |
| L-15 without phenol red | Thermo Fisher | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668027 | |
| Male Luer | in-house fabricated consisting of teflon | ||
| Male Luer to Tube Connector | MEDNET | MTLS210-6005 | alternative to in-house fabricated male luers |
| NaCl (5 M) | Thermo Fisher | AM9760G | |
| Needleless Valve to Male Luer Connector | MEDNET | NVFMLLPC | |
| NIS Elements | Nikon | Imaging software Version 5.02.00 | |
| NOA81 | Thorlabs | NOA81 | Fast Curing Optical Adhesive for tube system assembly |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| PCO edge 4.2 M-USB-HQ-PCO | pco | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | in-house prepared | ||
| Plasma Cleaner | Diener Femto | Pico-BRS | |
| PLL(20 kDa)-g[3.5]-PEG(2 kDa) | SuSoS AG | ||
| silicon wafer mit mircorstructures | in-house fabricated | ||
| Sola Light Engine | Lumencor | ||
| sticky slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 1673921 | |
| Tango 2 | Märzhäuser | 00-24-626-0000 | |
| Ultrapure water | in-house prepared | ||
| uncoated coverslips | ibidi | 10813 | |
| Injekt-F Solo, 1 mL | Omilab | 9166017V | with replacement sporn |
References
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