Summary
Vi presenterer en metode for oppkjøp av fluorescensreportertidskurs fra enkeltceller ved hjelp av mikropatterned arrays. Protokollen beskriver utarbeidelsen av encellede matriser, oppsett og drift av sanntidsskanningstidsforløpmikroskopi og et bildeanalyseverktøy med åpen kildekode for automatisert forhåndsvalg, visuell kontroll og sporing av celleintegrerte fluorescenstidskurs per adhesjonssted.
Abstract
Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) er en allsidig metode for å samle inn tidsforløp for fluorescenssignaler fra individuelle celler i høy gjennomstrømning. Generelt er oppkjøpet av encellede tidskurs fra dyrkede celler hemmet av cellemotilitet og mangfold av celleformer. Selvklebende mikrokjeder standardiserer encellede forhold og letter bildeanalyse. LISCA kombinerer encellede mikroarrayer med skanning av tidsforløpmikroskopi og automatisert bildebehandling. Her beskriver vi de eksperimentelle trinnene for å ta encellede fluorescenstidskurs i ET LISCA-format. Vi transfekterer celler som holder seg til et mikropatterned array ved hjelp av mRNA-koding for forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP) og overvåker eGFP-uttrykkskinetikken til hundrevis av celler parallelt via skanning av tidsforløpmikroskopi. Bildedatastakkene behandles automatisk av nyutviklet programvare som integrerer fluorescensintensitet over valgte cellekonturer for å generere encellede fluorescenstidskurs. Vi viser at eGFP-uttrykkstidskurs etter mRNA-transfeksjon er godt beskrevet av en enkel kinetisk oversettelsesmodell som avslører uttrykks- og nedbrytningshastigheter for mRNA. Videre anvendelser av LISCA for hendelsestidskorrelasjoner av flere markører i sammenheng med signalering av apoptose diskuteres.
Introduction
I de senere år har betydningen av encellede eksperimenter blitt tydelig. Data fra enkeltceller tillater undersøkelse av celle-til-celle-variasjon, oppløsningen av intracellulære parameterkorrelasjoner og påvisning av cellulær kinetikk som forblir skjult i ensemblemålinger1,2,3. For å undersøke cellulær kinetikk av tusenvis av enkeltceller parallelt, er det nødvendig med nye tilnærminger som gjør det mulig å overvåke cellene under standardiserte forhold over en tidsperiode på flere timer opptil flere dager etterfulgt av en kvantitativ dataanalyse 4. Her presenterer vi Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA), som kombinerer bruken av mikrostrukturerte matriser med tidsforløpmikroskopi og automatisert bildeanalyse.
Flere metoder for å generere mikrostrukturerte encellede matriser er etablert og publisert i litteratur5,6. Her beskriver vi kort mikroskala plasmainitiert proteinmønster (μPIPP). En detaljert protokoll for enkeltcellet matriseproduksjon ved hjelp av μPIPP finnes også i referanse7. Bruken av encellede matriser gjør det mulig å justere tusenvis av celler på standardiserte adhesjonspunkter som presenterer definerte mikromiljø for hver celle og dermed reduserer en kilde til eksperimentell variasjon (Figur 1A). Encellede matriser brukes til å overvåke tidsforløpene til fluorescerende markører med formål å indikere en rekke cellulære prosesser. Langsiktig mikroskopi i skannetidsforløpmodus gjør det mulig å overvåke et stort område av encellede matriser og dermed prøvetaking av encellede data i høy gjennomstrømning over en observasjonstid på flere timer eller til og med dager. Dette genererer tidslinjestakker med bilder fra hver plassering av matrisen (Figur 1B). For å redusere den store mengden bildedata og trekke ut de ønskede enkeltcellede fluorescenstidskursene på en effektiv måte, kreves automatisert bildebehandling som utnytter plasseringen av celler (Figur 1C).
Liscas utfordring er å tilpasse eksperimentelle protokoller og beregningsverktøy for å danne en analyse med høy gjennomstrømning som genererer kvantitative og reproduserbare data om cellulær kinetikk. I denne artikkelen gir vi en trinnvis beskrivelse av de enkelte metodene og hvordan de kombineres i en LISCA-analyse. Som et eksempel diskuterer vi tidsforløpet for forbedret grønt fluorescerende proteinuttrykk (eGFP) etter kunstig mRNA-levering. eGFP-uttrykk etter mRNA-levering er beskrevet ved reaksjonshastighetsligninger modelleringsoversettelse og nedbrytning av mRNA. Montering av modellfunksjonen for tidsforløpet av eGFP-konsentrasjon til LISCA-avlesningen av fluorescensintensiteten for hver enkelt celle over tid gir de beste estimatene av modellparametere som mRNA-nedbrytningshastigheten. Som et representativt resultat diskuterer vi mRNA-leveringseffektiviteten til to forskjellige lipidbaserte transfeksjonsmidler og hvordan deres parameterfordelinger er forskjellige.
Figur 1: Representasjon av LISCA-arbeidsflyten som kombinerer (A) mikromønstrede encellede matriser (B) som skanner tidsforløpmikroskopi og (C) automatisert bildeanalyse av innspilte bildeserier. Encellede matriser består av et todimensjonalt mønster av celleklebende firkanter med et celleavvisende interspace som fører til et arrangement av cellene på mikropatternen, som det fremgår av fasekontrastbildet samt fluorescensbildet av eGFP som uttrykker celler (A). Hele det mikrostrukturerte området er avbildet i en tidsforløpmodus for skanning gjentatte ganger ved å ta bilder i en sekvens av posisjoner (B). Innspilte bildeserier behandles for å lese ut fluorescensintensiteten per celle over tid (C). Skalastenger: 500 μm (A), 200 μm (C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figur 2: Datainnsamling som kombinerer encellede mikroarrayer (A) med skanning av tidsforløpmikroskopi (B). Som forberedelse av tidsforløpeksperimentet utarbeides en encellet matrise med en 2D-mikropattern av adhesjons firkanter (1), etterfulgt av cellesåing og justering av cellene på mikropattern (2) samt tilkobling av et perfusjonssystem til sekskanals lysbildet, noe som muliggjør væskehåndtering under tidsforløpmålingen (3). Et skanningstidsforløpeksperiment er satt opp (4) og cellene transfekteres på mikroskopet ved å injisere en mRNA lipoplex-løsning gjennom perfusjonssystemet under tidsforløpeksperimentet (5). Skalastenger: 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
1. Mikrostrukturert encellet matriseproduksjon (figur 2A)
- Forbered materialene som trengs for μPIPP array fabrikasjon.
- Klargjør steril fosfatbufret saltvann (PBS) ved pH 7.4.
- Forbered sterilt ultrarent vann med en resistivitet på minst 18 MΩcm ved 25 °C.
- Forbered PLL(20 kDa)-g[3,5] PEG(2 kDa) (PLL-PEG) arbeidsløsning med en 2 mg/ml konsentrasjon av PLL-PEG i ultrarent vann som inneholder 150 mM NaCl og 10 mM 4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES).
- Forbered en ekstracellulær matriseproteinløsning for overflatebelegg: 1 mg /ml fibronektin (FN) i PBS.
- Forbered en silisiumskive med en mikropattern fremstilt av fotolitografi8 som fungerer som en gjenbrukbar mester. Mikropattern består av firkanter med en kantlengde på 30 μm, en dybde på 12 μm og en mellomtorlig avstand på 60 μm, arrangert i seks striper som hver har en bredde på 6 mm og en høyde på 18 mm.
- Bland en polydimetylsiloksan (PDMS) monomer med 9% crosslinker (masse %) ved hjelp av et silikonelastomersett og degas det i ca 30 min til det er boblefritt ved hjelp av en desiccator. Kast silisiumskiven med et omtrent 3-5 mm tykt PDMS-lag og avfett det igjen i ca. 30 minutter til det er boblefritt.
- Sett silisiumskiven med PDMS i en stekeovn ved 50 °C for å kurere PDMS i minst 4 timer.
- Klipp ut PDMS-stemplene.
- Bruk en skalpell og klipp ut av PDMS-laget ett PDMS-mesterverk som inneholder de seks mikropatternstripene.
- Plasser PDMS-mesterverket på en benk med mikropatternen vendt oppover.
- Klipp hver av de seks mikropatternstripene til PDMS-mesterverket med et barberblad i et PDMS-stempel. Pass på at kantene på PDMS-stemplene er åpne ved å kutte av noe av det mønstrede området.
- Plasser PDMS-stemplene på et omslag på et sekskanals lysbilde (Figur 3-1).
- Bruk en ubestrøket deksleslip og merk kanalposisjonene til sekskanalsskuffen ved å skrape beskyttelsesfolien på dekslene forsiktig. Plasser deretter dekslene på benken med beskyttelsesfolien vendt nedover.
- Plasser PDMS-stemplene med mikropateren vendt nedover på dekslene i de markerte kanalposisjonene ved hjelp av pinsett.
- Kontroller vedlegget til PDMS-stemplene under et mikroskop. Hvis et PDMS-stempel er helt festet til dekslene, vises rutene i kontakt mørkere enn mellomrommet. Vedlegget av PDMS-stempelet til coverlip er avgjørende for mikropatternkvaliteten.
- Plasser dekslene med de seks PDMS-stemplene på den i en plasmarenser og behandle den med oksygenplasma (trykk 0,2 mbar, ~40 W i 3 min) for å lage overflatene mellom PDMS-stemplene og dekslene hydrofile (Figur 3-2).
- Utfør alle ytterligere trinn i mikropattern fabrikasjonen i et biosikkerhetsskap. Bruk 15 μL av PLL-PEG-oppløsningen og pipetten én dråpe av den ved siden av hvert PDMS-stempel, slik at PLL-PEG-oppløsningen absorberes i det hydrofile mønsteret i PDMS-stempelet (Figur 3-3). La PLL-PEG inkubere i 20 min ved romtemperatur.
- Skyll 1 ml ultrarent vann over dekslene med PDMS-stemplene på og fjern PDMS-stemplene ved hjelp av pinsett (Figur 3-4). Skyll deretter dekslene en gang til med 1 ml ultrarent vann og la det tørke.
- Når dekslene har tørket helt, fester du en sekskanals klebrig sklie til dekslene (Figur 3-4). Pass på at de mikropatternerte områdene stemmer overens med bunnen av kanalene.
- Funksjonaliser vedheftsplassene med FN.
- Fyll 40 μL PBS i hver kanal.
- Forbered en 100 μg/ml FN-løsning i PBS.
- Tilsett 40 μL av FN-oppløsningen i hver kanal (Figur 3-5). Bland FN-løsningen med PBS i kanalen grundig ved å fjerne 40 μL fra ett reservoar og tilsett det til motsatt reservoar av samme kanal i 3 ganger for å generere en homogen løsning. Inkuber FN-løsningen i 45 min ved romtemperatur.
- Vask hver kanal tre ganger med 120 μL PBS (Figur 3-6).
- For å se etter mønsterkvaliteten, bruk en fluorescerende merket FN i trinn 9.2. (Figur 4A).
MERK: Vi anbefaler at du klargjør μPIPP-matrisen ikke mer enn én dag før cellesåing, da PLL-PEG og FN ikke er kovalent bundet til substratet, og kvaliteten på mønsteret kan avta over tid. Oppbevar det tilberedte μPIPP-arrayet i kjøleskapet.
Figur 3: Encellet mikroarray-fabrikasjon av μPIPP. (1) PDMS-stempler med en tredimensjonal mikropatternstruktur på overflaten er ordnet på en deksle på et sekskanals lysbilde. (2) Dekslene med PDMS-frimerkene på behandles med oksygenplasma for å gjøre overflatene hydrofile. (3) PLL-PEG tilsetts. Den absorberes i mikrostrukturen av kapillære krefter og gjør overflatene som ikke dekkes av PDMS-stempelcelleavstøtende. (4) Dekslene skyller med vann for å fjerne den gjenværende PLL-PEG. Deretter fjernes PDMS-stemplene og en sekskanals klebrig lysbilde sitter fast i dekslene. (5) Fibronectin, et protein av den ekstracellulære matrisen, tilsetts for å gjøre områdene uten PLL-PEG cellelim. (6) Sekskanalssklie vaskes med fosfatbufret saltvann. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. Cellesåing (Figur 2A)
MERK: For følgende vasketrinn, tilsett den respektive væsken i ett reservoar og fjern deretter et likt volum væske fra motsatt reservoar av en kanal.
- Vask hver kanal med 120 μL 37 °C fullt supplert cellevekstmedium. Før du legger til celleopphenget, må du sørge for at bare kanalene er fylt med middels, men ikke reservoarene.
- Koble HuH7-celler fra en cellekulturflaske etter standardprotokollen for cellepassering og juster celleopphengskonsentrasjonen til 4 x 105 celler / ml.
- Tilsett 40 μL celleoppheng og bland cellevekstmediet med celleopphenget ved å fjerne 40 μL fra ett reservoar og legge det til motsatt reservoar av samme kanal i 3 ganger for å nå en homogen cellefordeling (Figur 4B).
- Fjern 40 μL fjæring fra kanalen slik at bare kanalen er fylt med celleoppheng.
- Sett lysbildet i en inkubator og kontroller celleadhesjonen 1 t etter sådd ved hjelp av et fasekontrastmikroskop.
- Tilsett 120 μL 37 °C varmecellevekstmedium.
- Men sklien tilbake i inkubatoren i ytterligere 3 timer for å muliggjøre cellulær selvorganisering på mikropatternen (figur 4C).
Figur 4: Cellulær selvorganisering og kvalitetskontroll av μPIPP-matrise. (A) Den mikrostrukturerte overflaten består av kvadrerte FN-belagte vedheftsflekker vist i rødt omgitt av en celleavvisende polymer. (B) Etter cellesåing fordeles HuH7-cellene tilfeldig og (C) holder seg hovedsakelig på vedheftspunktene over en tidsperiode på 4 timer. Skrives ut på nytt med tillatelse 7. Skalastenger: 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Perfusjonssystem (Figur 2A)
MERK: Bruk av et perfusjonssystem er bare nødvendig hvis reagenser eller fluorescerende markører må tilsettes i løpet av tidsforløpmålingen. Avhengig av dine behov, kan du koble hver kanal til et eget perfusjonssystem eller koble flere kanaler i serie til samme perfusjonssystem. Antall perfusjonssystemer tilsvarer antall uavhengige eksperimentelle forhold. Koble rørene under sterile forhold i et biosikkerhetsskap og unngå inkludering av luftbobler i perfusjonssystemet. Hvis det ikke brukes parfymesystem, tilsett reagensene/markørene i et biosikkerhetsskap før målingen av tidsforløpet. Perfusjonssystemet er internt fremstilt, det brukte materialet er oppført i Materialtabellen. Samlingen av perfusjonssystemet er beskrevet tidligere9.
- Bruk en 1 ml sprøyte (med erstatnings sporadisk) og fyll sprøyten med 1 ml 37 °C cellevekstmedium.
- Koble sprøyten til innløpsrøret ved hjelp av ventilen og fyll røret med middels.
- Koble innløpsrøret til et reservoar av en kanal og sørg for at ingen luftbobler er fanget.
- Hvis du vil koble en annen kanal i serien til dette perfusjonssystemet, kobler du en seriell kontakt til reservoaret motsatt av innløpsrøret til gjeldende kanal. Fortsett til neste kanal og koble den frie enden av den serielle kontakten til et av reservoarene.
- Gjenta de forrige trinnene til det nødvendige antallet kanaler er koblet sammen i serie.
- Koble utløpsrøret direkte til det frie reservoaret til den nåværende kanalen. Fyll det tilkoblede røret med medium for å kontrollere at perfusjonssystemet ikke lekker.
- Gjenta de forrige trinnene til alle de seks kanalene i lysbildet er koblet til et perfusjonssystem.
- Plasser gliden med de tilkoblede perfusjonssystemet(e) tilbake i inkubatoren til videre bruk eller plasser den direkte i mikroskopets varmekammer forvarmet til 37 °C for måling av tidsforløp.
4. Mikroskopi for tidsforløp (figur 2B)
MERK: For langsiktige målinger må du opprettholde en stabil temperatur på 37 °C og et stabilt CO2-nivå. Som et alternativ til CO2-avhengigcellevekstmedium, bruk L15 medium som det ikke er nødvendig med gassinkubasjonssystem for.
MERK: For kvantitativ avbildning, bruk cellevekstmedium uten fenolrød under tidsforløpmålingen for å redusere bakgrunnsfluorescens og bruke de samme innstillingene i tidsforløpprotokollen samt det samme mikroskopet for tekniske replikeringer.
- Sett opp en tidsforløpprotokoll for registrering av et fasekontrastbilde og et fluorescensbilde med eksponeringstider på 750 ms (avhengig av kameraet), 10 minutters tidsintervall mellom påfølgende løkker gjennom posisjonslisten, og en observasjonstid på 30 timer, ved hjelp av et 10x objektivt og passende fluorescensfiltre.
- Sett sekskanals lysbildet med cellene på encellede matriser i prøveholderen til det varme varmekammeret på 37 °C. Hvis perfusjonssystemer er koblet til sekskanalsskuffen, fester du rørene til scenen med litt tape for å sikre at sekskanalsskuffen ikke flyttes under væskeutveksling. Sett inn de frie endene av utløpsrørene gjennom et hull på et 15 ml reaksjonsrør for å samle væskeavfallet.
- Angi posisjonslisten for måling av tidsforløp for skanning. Kontroller at antall posisjoner kan skannes innenfor det definerte tidsintervallet mellom påfølgende løkker gjennom plasseringslisten. Med en 10x målsetting kan 10-30 posisjoner per kanal stilles inn til å skanne det totale mikropatternområdet avhengig av kameraets brikkestørrelse.
- Start målingen av tidsforløp. Hvis du vil ha en bedre bildekvalitet på langsiktige målinger, bruker du et automatisert fokuskorrigeringssystem.
5. Fluorescerende markør - mRNA-transfeksjon (Figur 2B)
MERK: For en transfeksjon i to kanaler som er forbundet med et rørsystem, er det nødvendig med et totalt volum på 600 μL transfeksjonsblanding (300 μL for en kanal). De angitte volumene refererer til en transfeksjon i to tilkoblede kanaler.
- Forbered en transfeksjonsmiddelløsning ved å fortynne 1 μL transfeksjonsmiddel i 200 μL serumreduserende medium og la løsningen inkubere i 5 minutter ved romtemperatur.
- Forbered en mRNA-løsning ved å fortynne 300 ng mRNA-koding for eGFP i 150 μL serumreduserende medium.
- Forbered transfeksjonsblandingen ved å legge til 150 μL av transfeksjonsmiddelløsningen til mRNA-løsningen og bland den godt. La transfeksjonsblandingen inkubere i 20 minutter ved romtemperatur.
- Skyll rørsystemet med 1 ml 37 °C varm PBS ved hjelp av en sprøyte under inkubasjon av transfeksjonsblandingen. Når du skyller rørene, må du passe på at mikroskopstadiet ikke beveger seg. Stans målingen av tidsforløpet midlertidig om nødvendig.
- Fortynn transfeksjonsblandingen til den endelige mRNA-konsentrasjonen på 0,5 ng/μL ved å tilsette 300 μL serumreduserende medium.
- Skyll rørsystemet med transfeksjonsblandingen ved hjelp av en sprøyte og la mRNA-lipoplexene inkubere i 1 time (pause tidsforløpmålingen om nødvendig).
- Stopp transfection inkubasjonen og skyll ut de ubundne mRNA lipoplexene ved å vaske med 1 ml 37 °C varm fullt supplert cellevekstmedium ved hjelp av en sprøyte (pause tidsforløpmålingen om nødvendig).
6. Bildeanalyse og fluorescensavlesning
- Når du kjører bildeanalysen for første gang, installerer du versjon 0.1.6 av åpen kildekode-programvaren "Automated Microstructure Analysis in Python" (PyAMA) fra den siterte plasseringen10 i henhold til instruksjonene som følger med der.
- Kontroller at bildekanalene (fasekontrast og fluorescens) er tilgjengelige som 16-biters TIFF-filer med flere bilder. Om nødvendig, konverter dem deretter.
- Start PyAMA og klikk på Åpen stabel... for å åpne bilder for analyse.
- For hver TIFF-fil med flere bilder som skal åpnes, klikker du Åpne og velger filen slik at den vises i listen over innlastede filer på venstre side av dialogboksen (Figur 5-1).
- Merk kanalene som skal inkluderes i analysen. Utfør følgende trinn for hver kanal.
- Velg TIFF-filen som inneholder kanalen, i listen over innlastede filer.
- Velg indeksen for kanalen i TIFF-filen under Legg til ny kanal. Indeksering er nullbasert. Den første kanalen har indeks 0, den andre kanalen har indeks 1 og så videre.
- Velg kanaltype. Velg Fasekontrast eller Fluorescens for de tilsvarende bildekanalene og Segmentering for en binær kanal som angir cellekonturene.
- Du kan eventuelt angi en kanaletikett for å skille mellom ulike fluorescenskanaler: eGFP og DAPI.
- Når du har konfigurert kanalen, klikker du Legg til.
- Når alle kanalene som er lagt til, vises i kanallisten til høyre i dialogboksen, klikker du OK for å laste inn stakken.
- Hvis du vil utføre segmentering ved hjelp av PyAMA's innebygde segmenteringsalgoritme for cellegjenkjenning basert på fasekontrastbildene (Figur 5-2), går du til Verktøy | Binarize... og skriv inn et filnavn for NumPy-filen med den binariserte kanalen.
MERK: I den gjeldende versjonen krever lasting av den binariserte kanalen å laste inn alle kanalene på nytt. - Hvis du vil utføre en bakgrunnskorrigering11 på en fluorescenskanal (Figur 5-3), må du kontrollere at fluorescenskanalen og en segmenteringskanal er lastet inn. Hvis ingen segmenteringskanal lastes inn, må du kontrollere at en fasekontrastkanal er lastet inn for automatisk segmentering. Gå til "Verktøy > bakgrunnskorrigering ..." og velg et filnavn for den resulterende TIFF-filen med den korrigerte fluorescenskanalen.
MERK: I den gjeldende versjonen krever lasting av den bakgrunnskorrigerte kanalen å laste inn alle kanalene på nytt. - Inspiser de forhåndsvalgte cellene (Figur 5-4) og deres integrerte fluorescenssignal (Figur 5-5) ved å bla gjennom tidsrammene, vise kanalene som er oppført i kanalmenyen på venstre side og klikke på celler for å markere fluorescenstidskursene (Figur 1C). Bruk celleutvalget til å utelate celler som ikke er levedyktige, ikke begrenset til et adhesjonspunkt eller knyttet til en annen celle fra videre analyse. Aktiver/deaktiver merkingen av celler for avlesning ved å trykke Skift og klikke cellen, eller ved å merke cellen og trykke ENTER.
- Lagre encellede tidskurs for celleområdet og den integrerte fluorescensen (Figur 5-6) ved å klikke på Fil | Lagre og velg en mappe du vil lagre i.
Figur 5: Automatisert bildebehandling av bildeserier med tidsforløp ved hjelp av PyAMA. (1) Bildeseriene Fasekontrast og fluorescens for hver bildeposisjon importeres. (2) Cellekonturer bestemmes av segmentering på bildestakken for fasekontrast. (3) En bakgrunnskorrigering påføres fluorescensbildene. (4) Cellekonturene spores over tid og forhåndsvalgt for eksport. (5) Fluorescensintensiteten er integrert basert på de sporede cellekonturene. (6) Encellede celleområder og integrerte fluorescensintensiteter evalueres og tidskurs for hver celle eksporteres. Skalastenger: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- For å analysere oversettelseskinetikken etter mRNA-transfeksjon, monter en oversettelsesmodell basert på biokjemiske hastighetsligninger til hvert enkeltcellet tidskurs som beskrevet tidligere av Reiser et al.12. Dataene og koden som brukes i denne studien er offentlig tilgjengelig13.
- For hvert enkeltcellet tidskurs henter du de estimerte tilpasningsparametrene for oversettelsesmodellen som representerer mRNA-nedbrytningshastigheten og tidspunktet for oversettelses utbruddet. Et eksempeldatasett diskuteres i delen representative resultater.
- Utfør videre analyse av fordelingen av beste estimater av parametrene for varierte eksperimentelle forhold for å undersøke celle-til-celle-variasjonen i cellepopulasjonene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LISCA-tilnærmingen gjør det mulig å effektivt samle fluorescenstidskurs fra enkeltceller. Som et representativt eksempel skisserer vi hvordan LISCA-metoden brukes til å måle encellet eGFP-uttrykk etter transfeksjon. Dataene fra LISCA-eksperimentet brukes til å vurdere mRNA-leveringskinetikk, noe som er viktig for utviklingen av effektive mRNA-legemidler.
Spesielt demonstrerer vi den forskjellige effekten av to lipidbaserte mRNA-leveringssystemer med hensyn til tidspunktet for oversettelsesde begynnelse og uttrykkshastigheten på encellet nivå. Vi dyrket celler og delte partiet inn i to populasjoner. En delpopulasjon ble transfektert med lipoplexer som beskrevet i protokolldelen. Den andre subpopuleringen ble transfektert ved hjelp av samme mRNA med samme endelige mRNA-konsentrasjon, men med lipid nanopartikler (LNP) som leveringssystem, som ble produsert ved hjelp av mikrofluidisk blanding12. På grunn av en annen lipidsammensetning og den forskjellige fabrikasjonen av mRNA-leveringssystemene til lipoplexene og LP-ene forventer vi en innvirkning på oversettelseskinetikken, da opptakskinetikken bør påvirkes. Ved hjelp av LISCA-metoden kvantifiserer vi tidspunktet t0 for oversettelsesde begynnelse etter transfeksjonen og hvor sterke cellene uttrykker eGFP, som avhenger av produktet av transfektertemRNA-molekyler m0 og oversettelsesraten kTL. For å oppnå disse to parametrene passer vi til en tretrinns oversettelsesmodell som skissert i figur 6A. Etter vellykket frigjøring av mRNA-molekylene m på tidspunktet t0 i cytosolen, oversettes mRNA med hastighet kTL til umoden eGFP G*, som ikke er fluorescerende. Den umodne G* modnes med hastighet kM til eGFP G, hvis fluorescensintensitet måles under tidsforløpmålingen. MRNA så vel som den (umodne og modne) eGFP forringes over tid med respektive nedbrytningsrater δ og γ. Modellen er beskrevet ved ordinære differensialligninger og den analytiske løsningen for G brukes som modellfunksjon for parameterestimering. Modellfunksjonen er tilpasset hvert av enkeltcelletidskursene som vist i figur 6B med eksempeltidskurs (grå) og de respektive passformene (grønn). I figur 6C viser vi histogrammer av tidspunkt t0 av oversettelsesde begynnelse og uttrykkshastighet m 0kTL av lipoplex transfekterte celler. Siden begge parameterne er estimert for hver celle, kan korrelasjonen mellom disse parameterne analyseres som vist i scatterplot (Figur 6D, blå data) og kan sammenlignes med celler som er transfektert med LNPer (rød). Som vist i figur 6D, viser celler som er transfisert med LNPer, mindre celle-til-celle-variasjon sammenlignet med celler som er transfisert med lipoplekser, og befolkningsgjennomsnittet viser en raskere oversettelsessett samt en høyere uttrykksfrekvens (tykke prikker med svart kontur).
Disse to datasettene er bare ett eksempel på hvordan LISCA kan brukes til å studere oversettelse etter mRNA-transfeksjon. Ytterligere undersøkelser kan for eksempel gjøres med hensyn til mRNA-stabilitet avhengig av mRNA-sekvensendringer 14, varierte reporterproteinstabiliteter 15eller siRNA mediert mRNA-nedbrytning 16.
Figur 6: Dataanalyse av encellet eGFP-oversettelseskinetikk. (A) Oversettelseskinetikken til reporterproteinet eGFP etter mRNA-levering kan beskrives ved en tretrinns reaksjonsrateligning med de respektive parametrene. (B) Modellen er montert (grønne spor) til hvert enkeltcellet eGFP-uttrykkstidskurs (grå spor) for å estimere modellparametrene, for eksempel tidspunktet (t0) for transfeksjonsdeset og uttrykkshastigheten (m0kTL), to parametere for å kvantifisere mRNA-leveringseffektivitet. (C) Histogrammer for parameterfordelingen for transfeksjonsdeset-tiden og uttrykkshastigheten. (D) Når parameterne estimeres for hver celle, viser et punktplott av disse parameterne parameterkorrelasjon. De små prikkene representerer parameterne for en enkelt celle. Plottet viser celler transfektert med mRNA LNPs (rød) og mRNA lipoplexes (blå). De tykke prikkene med svart kontur tilsvarer det respektive befolkningsgjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrev vi LISCA som en allsidig teknikk for å følge cellulær kinetikk av intracellulære fluorescerende etiketter på encellet nivå. For å utføre et vellykket LISCA-eksperiment må hvert av de beskrevne trinnene i protokolldelen etableres individuelt, og deretter må alle trinnene kombineres. Hver av de tre viktigste aspektene ved LISCA har viktige trinn.
Encellet mikroarray fabrikasjon
Kvaliteten på mikroarrayen er avgjørende, da den cellulære justeringen på mikroarrayen ikke bare er viktig for alle ytterligere eksperimentelle trinn, men også har innflytelse på datakvaliteten. Av denne grunn må mønsterets geometri og fabrikasjonsmetoden tilpasses med hensyn til de brukte cellene. De representative resultatene som er diskutert i denne artikkelen, er generert med leverkarsinomcellelinjen HuH7 justert på et (30 μm)2 kvadratisk mønster. Denne mønstergeometrien er også egnet for andre cellelinjer som A549 eller HEK293. For større celler som BEAS-2B kan et større firkantet mønster med 35 μm kantlengde og en inter-firkantet avstand på 80 μm brukes. Den beskrevne såddprosedyren er optimalisert for HuH7-cellene, men den kan tilpasses mange andre tilhengerceller17. Noen cellelinjer trenger for eksempel forskjellige størrelser på adhesjonsflekkene eller trenger større avstand mellom adhesjonspunktene for å unngå cellecellekontakter gjennom langstrakte celler.
Mikropatternet bør justeres slik at adhesjonsområdet oppfyller omtrent det gjennomsnittlige området av en celle i standard kulturretter. Geometrien kan være rund eller kvadrert og har ingen målbar effekt av celle levedyktighet. Cellebevegelser ser ut til å være mer begrenset på et kvadrert mønster sammenlignet med rundt mønster, der celler ofte ses for å rotere. Separat levedyktighetstesting anbefales når nye cellelinjer brukes for første gang. Såingstetthet må justeres for bestemte cellelinjer for å nå et høyt belegg av vedheftsflekker og for å minimere dobbelt belegg av vedheft flekker samtidig. Vanligvis følger det resulterende antallet celler per vedheftssted Poisson-statistikk og er enten null, en eller to. Derfor bør totalt belegg mellom 60% og 80% være rettet mot å unngå doblebelegg 17. Såingsprotokollen må kanskje tilpasses antall frøceller og tidsvarigheten mellom sådd og det første vasketrinnet. For eksempel vil et vasketrinn 30 min etter sådd i stedet for 1 t (se trinn 5 og 6 i protokolldel 2 Cellesåing) redusere antall dobbelt-okkuperte vedheft flekker, men vil også senke det totale antallet okkuperte vedheft flekker for HuH7 celler.
Siden tilkoblingen av et rørsystem til kanalsklier ikke er obligatorisk, er det lettere å etablere bruken av et reagens eller fluorescerende markør uten å bruke et rørsystem for å se etter den best passende konsentrasjonen og inkubasjonstiden. Etter at en passende protokoll er etablert for reagens / markør av interesse, kan rørsystemet inkluderes i arbeidsflyten.
Mikroskopi for tidsforløp
Et annet viktig trinn er innstillingene for tidsforløpmålingen. For eksempel må eksponeringstiden for fluorescensmarkøren velges nøye for å unngå fotobleaching av fluorofor- og fototoksisitetseffektene, men likevel sikre et godt fluorescenssignal. En annen viktig parameter for tidsforløpoppsettet er den best passende kombinasjonen av romlig og tidsmessig oppløsning, som avhenger sterkt av observert cellulær kinetikk. Hvis det er behov for en høy temporal oppløsning, kan bare et mindre antall posisjoner i mikroarray skannes mellom to tidspunkter, noe som reduserer det skannede observasjonsområdet og dermed også reduserer statistikken. Observasjonsområdet er dessuten ikke bare avhengig av antall skannede posisjoner, men også på målet og størrelsen på ett synsfelt på kameraet. I det gitte eksemplet er en tidsoppløsning på 10 min tilstrekkelig ved å bruke et 10x-mål for å observere oversettelseskinetikken. Denne kombinasjonen gjør det mulig å skanne 70-100 posisjoner per tidspunkt avhengig av størrelsen på kamerabrikken, hastigheten på mikroskopstadiet og antall bildekanaler (f.eks. fasekontrast og eGFP-fluorescens).
Behandling av bilder
Analysen av total fluorescens per celle forenkles ettersom cellene er plassert i en matrise. Likevel avhenger kvaliteten på enkeltcellet fluorescenstidskurs, spesielt signal-til-støy-forholdet (SNR), av algoritmen som brukes til integrering av cellefluorescensintensiteter fra bildeserien. Bildebehandlingstrinnene for programvareverktøyet PyAMA vises i figur 5. Bestemmelsen av integrasjonsområdene for enkeltcellet fluorescensavlesning er spesielt viktig fordi cellekonturen til levende celler varierer med tiden. PyAMA integrerer fluorescensintensiteten over en cellekontur, som kan bestemmes av en innebygd segmenteringsalgoritme. Et alternativ ville være å integrere over faste grenser basert på mikropatterngeometrien12,16. Den gjeldende versjonen av PyAMA utfører bildesegmentering basert på en terskel på standardavviket for pikselområder i bildekanalen for fasekontrast. Segmenteringsresultater kan også importeres fra ekstern programvare. For fremtidige versjoner planlegges opprinnelig støtte for segmentering basert på maskinlæring og integrering over faste grenser.
PyAMA tilbyr å filtrere ut ytre celler eller uregelmessige tidskurs ved hjelp av et grensesnitt som muliggjør visuell inspeksjon av både fluorescensbildet og fluorescenstidskursene til utvalgte celler (Figur 1C). Eksempler på celler som kan utelukkes fra analyse er celler som gjennomgår divisjon eller apoptose eller som ligger utenfor et vedheftssted. Aggregasjoner av flere celler feilaktig gjenkjent av sporingsalgoritmen som en enkelt celle, må også filtreres ut for å sikre at tidskursene kommer fra enkeltceller. PyAMA utfører et forhåndsvalg av celler for å redusere mengden manuell interaksjon som kreves for å filtrere ut uregelmessige celler. Forhåndsvalget kan inspiseres og korrigeres for hånd før du eksporterer tidskursene til de merkede cellene for å kompensere for unøyaktigheter i forhåndsvalget. Forhåndsvalget av gjeldende versjon av PyAMA er basert på en terskel for cellestørrelsen for å oppheve merkingen av celleaggregeringer. For fremtidige versjoner planlegges et ekstra maskinlæringsbasert forhåndsvalg, noe som gjør det mulig å redegjøre for ytterligere kriterier, inkludert eksemplene på uregelmessige celler beskrevet ovenfor.
Oppsummert bruker LISCA-tilnærmingen encellede matriser for effektivt å samle opp encellede fluorescenstidskurs. Innesperring av celler til mikrofabricated adhesjon nettsteder letter sporing og bildeanalyse. Videre dyrkes celler i standardiserte lokale mikromiljø og presenteres derfor med ensartet overflateareal når de utsettes for midler som lipid nanopartikler for transfeksjon. Dette aspektet er spesielt gunstig når cellulær heterogenitet i en befolkning undersøkes. μPIPP-teknikken som er beskrevet her, er en av mange mikrofabrikasjonsteknikker som resulterer i vanlige mikroarrayer av proteinmønstre. Leseren henvises til litteratur som gjennomgår mikrokontakttrykk, fotolittografiske tilnærminger og myk litografi som alternative fabrikasjonsprosesser6. Avhengig av cellelinjen kan den ene eller den andre mønsterteknikken være å foretrekke. I våre eksperimenter viste μPIPP-teknikken godt plasserte celler etter sådd av celler på grunn av cellulær selvsortering, som er avhengig av gjenværende cellelim på PEGylated-området slik at cellene kan søke i tilfeldig migrasjon og spre seg på proteinmålmatrisene med differensialt større limhet17.
LISCA tillater oppkjøp av et stort antall encellede tidsforløp av vilkårlige fluorescensmarkører. Analyse av fluorescenssignaler på encellet nivå, i motsetning til bulkeksperimenter, gir uberørte encellede tidskurs og avslører celle-til-celle-variasjon. Cellulær heterogenitet spiller en fremtredende rolle i celle skjebne beslutninger som apoptosis18,19,20. I denne sammenhengen utvidet vi nylig LISCA-tilnærmingen ved hjelp av to fluorescenskanaler som muliggjør analyse av temporale korrelasjoner av to cellulære hendelser til enhver tid som indikerer bestemte stadier innenfor celledødssignalet kaskade19. Innen dette forskningsfeltet presenterer LISCA seg som et alternativ til strømningscytometrimålinger. Mens flowcytometri unektelig gir en raskere arbeidsflyt og vanligvis gir større statistikk, blir dataene samlet inn på et bestemt tidspunkt. Heltidsavhengigheter gir estimater av kinetikkparametere og avslører tidskorrelasjoner mellom ulike fluorescenssignaler, som ellers er vanskelige å få tilgang til. For å kunne bruke flere fluorescenskanaler krever oppsettet automatiserte filterhjul eller flere kameraer. I dette tilfellet bør også encellet FRET-analyse være mulig og muliggjøre tidsavklarte studier av nærhet mellom fluorescerende merkede molekyler. En ulempe med bildebasert analyse som LISCA er arbeidet knyttet til visuelle kontroller og outlier deteksjon. Her kan maskinlæringsverktøy lette databehandlingen og tillate helautomatisk dataanalyse. I fremtiden, ved hjelp av automatiserte mikroskopiplattformer, rask mikrofabrikasjon og kunstig intelligens, kan gjennomstrømningen og anvendbarheten til LISCA økes betydelig. Videre er etterfølgende analyse av celler som viser uvanlige fluorescensresponser ved hjelp av mikrofluidisk ekstraksjon 21og enkeltcellegenomikk et hyppig krav i farmasøytisk industri. Protokollen som presenteres i denne artikkelen passer til etterspørselen etter å studere kinetikken til cellulære prosesser med encellet oppløsning og tilstrekkelig statistikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Den tyske vitenskapsstiftelsen (DFG) til Collaborative Research Center (SFB) 1032. Støtte fra det tyske føderale departementet for utdanning, forskning og teknologi (BMBF) under samarbeidsprosjektet 05K2018-2017-06716 Medisoft samt et stipend fra Bayerische Forschungsstiftung er takknemlig anerkjent. Anita Reiser ble støttet av et DFG Fellowship gjennom Graduate School of Quantitative Biosciences Munich (QBM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adtech Polymer Engineering PTFE Microtubing | Fisher Scientific | 10178071 | |
| baking oven | Binder | 9010-0190 | |
| CFI Plan Fluor DL 10x | Nikon | MRH20100 | |
| Desiccator | Roth | NX07.1 | |
| Eclipse Ti-E | Nikon | ||
| eGFP mRNA | Trilink | L-7601 | |
| Female Luer to Tube Connector | MEDNET | FTL210-6005 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Fibronectin | Yo Proteins | 663 | |
| Filter set eGFP | AHF | F46-002 | |
| Fisherbrand Translucent Platinum-Cured Silicone Tubing | Fisher Scientific | 11768088 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Incubation Box | Okolab | OKO-H201 | |
| incubator | Binder | 9040-0012 | |
| L-15 without phenol red | Thermo Fisher | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668027 | |
| Male Luer | in-house fabricated consisting of teflon | ||
| Male Luer to Tube Connector | MEDNET | MTLS210-6005 | alternative to in-house fabricated male luers |
| NaCl (5 M) | Thermo Fisher | AM9760G | |
| Needleless Valve to Male Luer Connector | MEDNET | NVFMLLPC | |
| NIS Elements | Nikon | Imaging software Version 5.02.00 | |
| NOA81 | Thorlabs | NOA81 | Fast Curing Optical Adhesive for tube system assembly |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| PCO edge 4.2 M-USB-HQ-PCO | pco | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | in-house prepared | ||
| Plasma Cleaner | Diener Femto | Pico-BRS | |
| PLL(20 kDa)-g[3.5]-PEG(2 kDa) | SuSoS AG | ||
| silicon wafer mit mircorstructures | in-house fabricated | ||
| Sola Light Engine | Lumencor | ||
| sticky slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 1673921 | |
| Tango 2 | Märzhäuser | 00-24-626-0000 | |
| Ultrapure water | in-house prepared | ||
| uncoated coverslips | ibidi | 10813 | |
| Injekt-F Solo, 1 mL | Omilab | 9166017V | with replacement sporn |
References
- Altschuler, S. J., Wu, L. F. Cellular heterogeneity: do differences make a difference. Cell. 141 (4), 559-563 (2010).
- Locke, J. C., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).
- Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
- El-Ali, J., Sorger, P. K., Jensen, K. F. Cells on chips. Nature. 442 (7101), 403-411 (2006).
- Segerer, F. J., et al. Versatile method to generate multiple types of micropatterns. Biointerphases. 11 (1), 011005 (2016).
- Piel, M., Théry, M. Micropatterning in cell biology, part A/B/C. , Elsevier. (2014).
- Reiser, A., Zorn, M. L., Murschhauser, A., Rädler, J. O. Cell-Based Microarrays: Methods and Protocols. Ertl, P., Rothbauer, M. , Springer. New York. 41-54 (2018).
- Picone, R., Baum, B., McKendry, R. Methods in cell biology. 119, Elsevier. 73-90 (2014).
- Reiser, A. Single-cell time courses of mRNA transport and translation kinetics. , Ludwig-Maximilians University. PhD thesis (2019).
- Woschée, D. Softmatter LMU-Raedler Group. , Available from: https://github.com/SoftmatterLMU-RaedlerGroup/pyama (2020).
- Schwarzfischer, M., et al. MIAAB, 29262. , Available from: https://push-zb.helmholtz-muenchen.de/frontdoor.php?source_opus=6773 (2020).
- Reiser, A., et al. Correlation of mRNA delivery timing and protein expression in lipid-based transfection. Integrative Biology. 11 (9), 362-371 (2019).
- Reiser, A., Woschée, D., Mehrotra, N., Krzysztoń, R. S., Strey, H. H., Rädler, J. O. Supplementing data and code for: "Correlation of mRNA delivery timing and protein expression in lipid-based transfection". Zenodo. , Version 1.0 (2019).
- Ferizi, M., et al. Stability analysis of chemically modified mRNA using micropattern-based single-cell arrays. Lab on a Chip. 15 (17), 3561-3571 (2015).
- Fröhlich, F., et al. Multi-experiment nonlinear mixed effect modeling of single-cell translation kinetics after transfection. NPJ systems biology and applications. 4 (1), 1-12 (2018).
- Krzysztoń, R., et al. Single-cell kinetics of siRNA-mediated mRNA degradation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 21, 102077 (2019).
- Röttgermann, P. J., Alberola, A. P., Rädler, J. O. Cellular self-organization on micro-structured surfaces. Soft Matter. 10 (14), 2397-2404 (2014).
- Röttgermann, P. J., Dawson, K. A., Rädler, J. O. Time-resolved study of nanoparticle induced apoptosis using microfabricated single cell arrays. Microarrays. 5 (2), 8 (2016).
- Murschhauser, A., et al. A high-throughput microscopy method for single-cell analysis of event-time correlations in nanoparticle-induced cell death. Communications Biology. 2 (1), 1-11 (2019).
- Chatzopoulou, E. I., et al. Chip-based platform for dynamic analysis of NK cell cytolysis mediated by a triplebody. Analyst. 141 (7), 2284-2295 (2016).
- Sztilkovics, M., et al. Single-cell adhesion force kinetics of cell populations from combined label-free optical biosensor and robotic fluidic force microscopy. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
