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Estimación del contenido de celulosa cristalina de biomasa vegetal utilizando el método Updegraff

Published: May 15, 2021 doi: 10.3791/62031
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Plant and Soil Science, Texas Tech University, 2Fiber and Biopolymer Research Institute (FBRI), Department of Plant and Soil Science, Texas Tech University

Summary

El método Updegraff es el método más utilizado para la estimación de celulosa. El objetivo principal de esta demostración es proporcionar un protocolo detallado de Updegraff para la estimación del contenido de celulosa en muestras de biomasa vegetal.

Abstract

La celulosa es el polímero más abundante de la Tierra generado por la fotosíntesis y el principal componente portador de carga de las paredes celulares. La pared celular desempeña un papel significativo en el crecimiento y desarrollo de la planta al proporcionar fuerza, rigidez, tasa y dirección del crecimiento celular, mantenimiento de la forma celular, y la protección contra factores de estrés bióticos y abióticos. La pared celular se compone principalmente de celulosa, lignina, hemicellulosa y pectina. Recientemente, las paredes de las células vegetales han sido objeto de la producción de biocombustibles y bioenergía de segunda generación. Específicamente, el componente de celulosa de la pared celular de la planta se utiliza para la producción de etanol celulósico. La estimación del contenido de celulosa de la biomasa es fundamental para la investigación fundamental y aplicada de la pared celular. El método Updegraff es simple, robusto y el método más utilizado para la estimación del contenido cristalino de celulosa de la biomasa vegetal. La fracción de pared celular cruda insoluble en alcohol tras el tratamiento con reactivo Updegraff elimina las fracciones de hemicellulosa y lignina. Más tarde, la fracción de celulosa resistente a reactivos Updegraff se somete a un tratamiento con ácido sulfúrico para hidrolizador del homopolímero de celulosa en unidades monómeros de glucosa. Una línea de regresión se desarrolla utilizando varias concentraciones de glucosa y se utiliza para estimar la cantidad de glucosa liberada sobre la hidrólisis de celulosa en las muestras experimentales. Por último, el contenido de celulosa se estima en función de la cantidad de monómeros de glucosa mediante ensayo de antronétesis colorimétrica.

Introduction

La celulosa es el componente principal de carga de las paredes celulares, que está presente en las paredes celulares primarias y secundarias. La pared celular es una matriz extracelular que rodea las células vegetales y está compuesta principalmente de celulosa, lignina, hemicellulosa, pectina y proteínas matriciales. Aproximadamente un tercio de la biomasa de las plantas es celulosa1 y desempeña un papel importante en el crecimiento y desarrollo de la planta al proporcionar fuerza, rigidez, tasa y dirección del crecimiento celular, mantenimiento de la forma celular, y la protección contra factores de estrés bióticos y abióticos. La fibra de algodón contiene 95% de celulosa2 contenido, mientras que los árboles contienen 40% a 50% de celulosa dependiendo de las especies vegetales y los tipos de órganos3. La celulosa se compone de unidades repetidas de celobiosa, un disacárido de residuos de glucosa conectados por β-1,4 enlaces glicosidos4. El etanol celulósico se produce a partir de la glucosa derivada de la celulosa presente en las paredes celulares de la planta5. La fibra celulósica se compone de varias micro fibrillas en las que cada micro fibril actúa como unidad central con monómeros de glucosa 500-150001,6. El homopolímero de celulosa se sintetiza mediante complejos de celulosa sintasa incrustados por membrana plasmática (CSC)1,7. Las proteínas de celulosa individual sintasa A (CESA) sintetizan cadenas de glucano y las cadenas de glucano adyacentes están conectadas por enlaces de hidrógeno para formar celulosa cristalina1,8. La celulosa existe en varias formas cristalinas con dos formas predominantes, la celulosa Iα y la celulosa Iβ como formas nativas9. En plantas superiores, la celulosa existe en forma de celulosa Iβ mientras que la celulosa vegetal inferior existe en Iα forma10,11. En general, la celulosa desempeña un papel importante en la impartición de fuerza y rigidez a las paredes de las células vegetales.

Los biocombustibles de primera generación se producen principalmente a partir de almidón de maíz, azúcares de caña y azúcares de remolacha, que son fuentes de alimentos, mientras que los biocombustibles de segunda generación se centran en la producción de biocombustibles a partir del material celular de biomasa de plantas no alimentarias12. La estimación precisa del contenido de celulosa cristalina no sólo es importante para la investigación fundamental sobre la biosíntesis de celulosa y la dinámica de la pared celular, sino también para la investigación aplicada de biocombustibles y bioproductos. Varios métodos han sido desarrollados y optimizados para la estimación de la celulosa en la biomasa vegetal, y el método Updegraff es el método más utilizado para la estimación de celulosa. El primer método notificado para la estimación de celulosa fue por Cross y Bevan en 190813. El método se basó en el principio de cloración y extracción alternativa por sulfato de sodio. Sin embargo, la celulosa obtenida por el método original, así como modificado de Cross y Bevan, mostró contaminación de pequeñas fracciones de lignina, además de una cantidad sustancial de xylans y mannans14. A pesar de varias modificaciones para eliminar la lignina y hemicellulosa de la fracción de celulosa, el método Cross-Bevan retuvo una cantidad considerable de mannans junto con celulosa. Más tarde, el método de Kurschner fue desarrollado mediante el empleo de ácido nítrico y etanol para extraer celulosa15. Este método indicó que se eliminaron el total de lignina y el 75% de los pentosanos, pero los verdaderos resultados de celulosa fueron los mismos que los estimados por el método de cloración de Cross y Bevan. Otro método (Norman y Jenkins) fue desarrollado mediante el empleo de metanol-benceno, sulfato de sodio, e hipoclorito de sodio para extraer celulosa16. Este método también retuvo alguna fracción de lignina (3%) y cantidades significativas de pentosanos que conducen a una estimación precisa de la celulosa. Más tarde, Kiesel y Semiganowsky utilizaron un enfoque diferente para hidrolizar la celulosa utilizando ácido sulfúrico concentrado al 80%, y los azúcares reducidos hidrolizados fueron estimados por el método17de Bertrand. Los dos métodos, Waksman's y Stevens18 y Salo14,19 que fueron desarrollados sobre la base del método de Kiesel y Semiganowsky, también produjeron un 4-5% menos de contenido de celulosa en comparación con los métodos anteriores20.

El método Updegraff es el método más utilizado para la estimación del contenido de celulosa cristalina. Este método fue descrito por primera vez por Updegraff para la medición de celulosa en 196921. El método Updegraff integra el método Kurschner (uso de ácido nítrico), métodos Kiesel y Seminowsky (hidrólisis de celulosa en monómeros de glucosa utilizando ácido sulfúrico) con algunas modificaciones, y el ensayo de antronosis de Viles y Silverman para una estimación colorimétrica simple de glucosa y contenido de celulosa cristalina22. El principio de este método es el uso de ácido acético y ácido nítrico (reactivo updegraff) para eliminar la hemicellulosa y la lignina de los tejidos vegetales homogeneizados, que deja celulosa resistente a ácido acético/nítrico para su posterior procesamiento y estimación15. La celulosa resistente a los ácidos acéticos/nítricos se trata con un 67% de ácido sulfúrico para romper la celulosa en monómeros de glucosa y los monómeros de glucosa liberados se estiman mediante ensayo de antronidad21,23. Se utilizaron varias modificaciones del método Updegraff original para simplificar el procedimiento y la estimación de celulosa mediante ensayo de antronérona24. En términos generales, este método se puede dividir en cinco fases. En la primera fase, se prepara el material vegetal. En la segunda fase, la pared de células brutas está separada de la biomasa total, ya que la celulosa es el componente clave de las paredes celulares de las plantas. Más tarde, en la tercera fase, la celulosa se separa de los componentes de la pared celular no celulósica mediante el tratamiento con reactivo Updegraff. En la cuarta fase, la celulosa resistente al ácido acético/nítrico se divide en monómeros de glucosa mediante el tratamiento con ácido sulfúrico. El tratamiento con ácido sulfúrico de la celulosa da lugar a la formación de compuestos 5-hidroximetilfurfurales a partir de la reacción de monómeros de glucosa con ácido sulfúrico. Finalmente, en la última fase, la antrone genera un complejo azul verdoso hirviendo con el compuesto furfural generado en la fase anterior25. Este método colorimétrico basado en antrones fue utilizado por primera vez en 1942 por Dreywood. La antronétesis es un tinte que identifica compuestos furfurales de productos deshidratados de pentosa y hexose como 5-hidroximetilfurfurfural, en condiciones ácidas. La reacción con hexasa produce un color intenso y una mejor respuesta en comparación con las pentoses25. La cantidad de glucosa encuadernada se mide mediante absorbancia de espectrofotómetro a 620 nm y la intensidad del complejo azul verdoso es directamente proporcional a la cantidad de azúcar en la muestra. Los valores de absorbancia medidos se compararon con una línea de regresión de curva estándar de glucosa para calcular la concentración de glucosa de la muestra. El contenido medido de glucosa se utilizó para estimar el contenido de celulosa de la biomasa vegetal.

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Protocol

1. Preparación experimental

  1. Moler el material vegetal seco en un polvo fino.
  2. Buffer de solubilización de proteínas (PSB): Preparar soluciones de stock de 1 M Tris (pH 8.8), ácido etilenodiaminetetraacetic de 0,5 M (EDTA) (pH 8.0) y autoclavarlos. Haga un amortiguador PSB fresco a partir de estas soluciones de stock con concentraciones finales de Tris de 50 mM, 0,5 mM EDTA y 10% de sulfato de dodecilo sódico (SDS) en agua estéril.
  3. Preparar 100 ml de etanol del 70% (v/v): 70 ml de etanol 100% y 30 ml de agua estéril.
  4. Preparar 100 ml de metanol: cloroformo en una relación de 1:1 (metanol de 50 ml y cloroformo de 50 ml).
  5. Prepare 82,5 ml de reactivo Updegraff. Añadir 75 ml de ácido acético al 80% a 7,5 ml de ácido nítrico para que la relación final del agua: ácido acético: ácido nítrico esté en 2:8:1 (v/v). Para preparar el ácido acético 80%, disolver 80 ml de ácido acético glacial en 20 ml de agua estéril (v/v).
  6. Preparar un caldo fresco de 1 mg/ml de solución de glucosa. Disolver 10 mg de glucosa en 10 ml de agua (w/v).
  7. Para preparar 100 ml de ácido sulfúrico al 67% (v/v), agregue 67 ml de ácido sulfúrico concentrado a 33 ml de agua. Utilice siempre una botella de vidrio y agregue ácido lentamente al agua. Este paso es exotérmico (libera calor). Por lo tanto, preparar esta solución sobre hielo y enfriar en el refrigerador durante al menos 2 horas antes de su uso.
  8. Preparar antrones frescas del 0,2% (w/v) para cada lote de muestras experimentales. Pesar 0,2 g de antronérea y disolverse en 100 ml de ácido sulfúrico concentrado preenfriado en una botella de vidrio envuelta con papel de aluminio. Conservar en el refrigerador durante 1-2 horas antes de su uso.
    NOTA: El ácido sulfúrico concentrado pre-escalofriante en el refrigerador el día del experimento, y la preparación fresca de la antronérona es altamente recomendable para la estimación precisa del contenido de glucosa.

2. Preparación de material de biomasa vegetal

  1. Recoger muestras de biomasa vegetal de líneas experimentales de algodón de 2 meses de antigüedad cultivadas en el invernadero con las mismas condiciones de crecimiento, la misma etapa de desarrollo, la misma posición de las plantas y el mismo tipo de tejido (hoja / tallo / raíz).
    NOTA: Recoger un mínimo de tres réplicas biológicas para cada muestra. Lávalo bien con agua para eliminar toda la suciedad del tejido radicular.
  2. Tejido de raíz seca al aire durante 2 días en toallas de papel a temperatura ambiente para eliminar el contenido de humedad(Figura 1).
    NOTA: Tejido deseado aire seco para la estimación de celulosa para evitar cualquier contaminación fúngica.
  3. Coloque las muestras raíz en contenedores individuales. A continuación, etiquete y séquelos en la incubadora a 49 °C durante 10 días(Tabla de Materiales).
    NOTA: Alternativamente, un secador congelado se puede utilizar para secar el tejido vegetal en menos tiempo (1 o 2 días) sin causar ningún cambio químico en el material de biomasa de la planta.
  4. Corta las muestras secas en trozos pequeños, congele en nitrógeno líquido y moler en polvo fino uniforme usando un mortero y pestle, un molino de congelador o una trituradora de biomasa(Figura 1).
    NOTA: El molino congelador se utilizó a una velocidad de 10 cps durante 3 ciclos.
  5. Recoja el tejido conectado a tierra(Figura 2)y proceda con la extracción de la pared celular.
    NOTA: El proceso se puede pausar en este punto almacenando las muestras en recipientes herméticos a temperatura ambiente.

3. Extracción de paredes de células crudas de biomasa vegetal

NOTA: Las paredes de células vegetales contienen celulosa, lignina, componentes no celulosa, pectina, proteínas matriciales, compuestos fenólicos y agua26. Dado que la celulosa está presente en las paredes celulares, el primer paso es separar el componente de pared celular de los componentes de pared no celulares de la biomasa vegetal26.

  1. Etiquete y pese tubos individuales en blanco de 2 ml antes de iniciar el proceso de extracción de la pared celular.
  2. Tome nota de los pesos vacíos del tubo en un cuaderno de laboratorio antes de continuar.
  3. Pesar 20 mg de tejido en polvo desde el paso 2.5 y transferirlo a tubos prepesados de 2 ml y etiquetarlos.
  4. Añadir 1 ml de tampón de solubilización proteica (PSB) (clorhidrato tris (HCl) de 50 mM buffer pH 8.8, 0.5 mM EDTA y 10% sulfato de dodecilo sódico (SDS) para solubilizar proteínas. Vórtice y centrífuga a 25.200 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT). Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y salve el pellet.
    NOTA: El sobrenadante se puede guardar si es necesario analizar el componente proteico.
  5. Repita el paso 3.4 dos veces más.
  6. Al pellet retenido, añadir 1 ml de agua destilada y vórtice. Centrífuga a 25.200 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT) y retire el sobrenadante.
  7. Repita el paso 3.6 dos veces más.
  8. Añadir 1 ml de etanol al pellet, vórtice y calentarlo a 70 °C durante 1 h en un baño de agua/bloque de calor para eliminar los componentes solubles y el almidón de las muestras. Vórtice y centrífuga a 25.200 x g durante 5 minutos en RT. Deseche el sobrenadante y guarde el pellet.
  9. Repita el paso 3.8 una vez más.
  10. Al pellet añadir 1 ml de 100% metanol y vórtice. Centrífuga a 25.200 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT) y retire el sobrenadante.
  11. Añadir 1 ml de cloroformo/metanol (cloroformo y metanol en relación 1:1) al pellet y vórtice. Centrífuga a 25.200 x g durante 5 minutos en RT y retire el sobrenadante. La adición de metanol y solubilizes solventes cloroformos y elimina la fracción lipídica de la biomasa27.
  12. Al pellet, añadir 1 ml de acetona y vórtice al 100%. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Centrífuga a 25.200 x g durante 5 minutos en RT y retire el sobrenadante. Acetona elimina pigmentos como clorofila y ácidos grasos libres de la biomasa28,29.
  13. Seque el pellet a 37 °C durante la noche o continúe secando al vacío.
    NOTA: El pellet seco es la pared celular cruda utilizada para la estimación de celulosa cristalina. El proceso se puede pausar en este punto o continuar utilizando secador de vacío para muestras de secado.

4. Tratamiento con reactivo Updegraff (ácido acético y nítrico) para eliminar componentes no celulósicos

NOTA: El protocolo implica el uso de ácidos y otros productos químicos. Use equipo de protección personal (EPI) durante todo el proceso.

  1. Mida 5 mg del pellet de pared de celda cruda seca en un tubo tapado de tornillo fresco de 2 ml. Tenga en cuenta el peso exacto (Figura 3)30.
  2. Incluya un control positivo en este punto. Utilice 2 mg de papel filtrante(Tabla de materiales)como un control positivo que produce un 80% de contenido de celulosa.
  3. Añadir 1,5 ml del reactivo Updegraff al pesado 5 mg de extracto de pared celular y control positivo. Mezclar por vórtice.
    NOTA: El control positivo debe procesarse de la misma manera que las muestras experimentales a partir de este paso. Este paso debe llevarse a cabo en el capó de humo con el equipo de protección personal adecuado (EPI).
    PRECAUCIÓN: Este paso debe llevarse a cabo en tubos de tapa de tornillo para evitar salpicaduras de muestra y estallido de los tubos. Deben incluirse tres réplicas biológicas de cada muestra junto con tres réplicas para un control positivo.
  4. Caliente la suspensión a 100 °C durante 30 minutos en un baño de agua hirviendo y enfríe en un banco durante 10 minutos. Centrífuga a 25.200 x g durante 10 minutos en RT. Retire el sobrenadante por centrifugación y guarde el pellet.
    NOTA: Los residuos generados deben recogerse por separado para disolventes orgánicos, ácido sulfúrico y reactivo Updegraff (ácido acético y ácido nítrico). Los residuos con ácido acético y ácido nítrico deben mantenerse a temperaturas frescas con tapas ventiladas y nunca mezclarse con ningún otro disolventes orgánicos y otros ácidos para evitar cualquier explosión.
  5. Añadir 1 ml de agua al pellet. Centrífuga a 25.200 x g durante 10 minutos en RT. Retire 500 μL del sobrenadante y agregue 1 ml de acetona al tubo.
  6. Centrífuga a 25.200 x g durante 5 minutos en RT. Retire 1 ml de sobrenadante y agregue 1 ml de acetona al tubo y centrífuga a 25.200 x g durante 5 minutos en RT.
  7. Después de la centrifugación, retire todo el sobrenadante y suspenda el pellet en 1 ml de acetona. Incuba los tubos a temperatura ambiente durante 5 minutos y gira a 25.200 x g durante 5 minutos en RT.
  8. Deseche el sobrenadante y guarde el pellet. Seque el pellet a 37 °C durante la noche(Figura 3).
    NOTA: El proceso se puede pausar en este punto o continuar utilizando más seco al vacío para secar y proceder al siguiente paso.

5. Hidrólisis de celulosa por ácido para producir unidades monómeros de glucosa

  1. Añadir 1 ml de ácido sulfúrico al pellet seco. Vórtice para mezclar el pellet completamente en el ácido.
  2. Agitar tubos a temperatura ambiente durante 1 h para disolver el pellet de celulosa en un 67% de ácido sulfúrico.
    NOTA: Como alternativa, la solubilización del pellet de celulosa en un 67% de ácido sulfúrico se puede mejorar mediante sonicación de cada muestra durante 10 minutos después de 30 minutos de incubación en la coctelera. Después de la sonicación, las muestras se pueden volver a incubar en la coctelera en RT. Sin embargo, observamos solubilidad completa de pellet de celulosa sin sonicación cuando comenzamos con 5 mg de extracto de pared celular cruda (Figura 3). Este procedimiento funcionó bien para varias muestras de biomasa vegetal3.

6. Medición del contenido de glucosa por el ensayo de antrones y estimación del contenido de celulosa

  1. En esta etapa, la celulosa está en forma de monómeros libres de glucosa. Determine la cantidad de celulosa midiendo la cantidad de glucosa presente en la muestra mediante espectrofotometría.
  2. Tome 10 μL de la muestra del paso 5 y agréguela a 490 μL de agua destilada estéril para hacer una dilución de cada muestra a 500 μL. Vórtice la mezcla diluida de muestra y agua durante 10 segundos.
  3. Añadir 1 ml de reactivo de antronización recién preparado al 0,2% a cada tubo y mezclar inmediatamente por vórtice.
  4. Hierva muestras a 100 °C durante 10 minutos y enfríe los tubos sobre hielo durante 5 minutos. Transfiera 200 μL de cada muestra en tres pozos de una placa de 96 pozos. Cargue la placa de 96 pozos en un espectrofotómetro para medir la absorbancia a 620 nm.
    NOTA: Para hervir a alta temperatura, utilice tubos tapados atornillados para evitar salpicaduras de productos químicos dañinos y evitar la pérdida de muestras.

7. Preparación de la curva estándar de glucosa

  1. Para preparar el estándar de glucosa, hacer un caldo fresco de glucosa de 1 mg/ml disolviendo 10 mg de glucosa en 10 ml de agua destilada estéril. Añadir esta solución de stock de 1 mg/ml en incrementos de 20 μL (0, 20, 40, 60, 80.100,120,140, 160, 180 μL) a agua destilada estéril (volumen total 1 ml) para preparar estándares de glucosa que van desde 0 μg a 180 concentraciones de μg/ml(Figura 3). Vórtice cada estándar de glucosa después de añadir agua estéril.
  2. A partir de estas 10 concentraciones diferentes, aliquot 500 μL de cada concentración de glucosa en un tubo tapado de tornillo fresco de 2 ml.
  3. Añadir 1 ml de antronización recién preparada del 0,2% a cada tubo y mezclar inmediatamente por vórtice. Incubar sobre hielo y hervir a 100 °C durante 10 min seguido de incubación en hielo durante 5 min23.
  4. Transfiera 200 μL de cada estándar a tres pozos en una placa micro-titer de 96 pozos para tres réplicas técnicas y mida la absorbancia a 620 nm (Figura 3).
  5. Desarrollar una curva de glucosa estándar trazando diferentes concentraciones de glucosa (0 a 180 μg/ml) contra valores de absorbancia normalizados a 620 nm (Figura 7). Utilice la línea de regresión Y= mx+c generada a partir de los valores de absorbancia para calcular el contenido de celulosa en las muestras preparadas.
    NOTA: Los estándares de glucosa deben estar recién preparados para cada conjunto de experimentos. La concentración de la glucosa debe aumentarse si los valores de OD son demasiado altos/ bajos para que estos valores estén dentro del rango de los valores de absorbancia de curva estándar. La línea de regresión genera diferentes valores m y c basados en los estándares de glucosa utilizados para cada lote de muestras. Mezcle los tubos inmediatamente después de la adición de la antrones23. La antronérona, las muestras diluidas y los estándares preparados siempre se mantuvieron fríos hasta que se realizó el ensayo de antronización debido a la naturaleza exotérmica de esta reacción.

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Representative Results

Las plantas de algodón cultivadas en la casa verde fueron seleccionadas para este estudio. Se seleccionaron dos líneas experimentales diferentes de algodón para el análisis comparativo del contenido de celulosa. Para cada línea experimental, el tejido radicular se recogió de tres réplicas biológicas. Un total de 500 mg de tejido fue homogeneizado y 20 mg de él se utilizó para la extracción de pared de células crudas. Más tarde, 5 mg de extracto de pared celular cruda se utilizó para el tratamiento reactivo Updegraff para eliminar la hemicellulosa y la lignina de celulosa. La celulosa purificada fue hidrolizada por el tratamiento del ácido sulfúrico para descompone la celulosa en unidades de glucosa. Los resultados de las lecturas de absorbancia a 620 nm(Tabla suplementaria 1)se utilizaron para medir la concentración de glucosa y estimar el contenido de celulosa mediante el ensayo de antronérona. Los valores medios de absorbancia de tres réplicas técnicas se normalizaron restando el valor de absorbancia en blanco de la concentración de glucosa de 0 μg. La curva estándar de glucosa se generó utilizando un gráfico de barras dispersas (Figura 4).

La línea de regresión resultante, y = mx + c de esta curva estándar, se utiliza para calcular una concentración de glucosa desconocida en las muestras de prueba extraídas utilizando las lecturas de absorbancia normalizadas. Para calcular x (la concentración desconocida de glucosa en μg/μL), se utilizó la fórmula (x = absorbancia normalizada-c/m). Los valores c y m de la línea de regresión de la curva de glucosa estándar (R2 = 0,99) se utilizaron para medir la concentración de glucosa en μg/μL. A continuación, este valor se divide por un factor de dilución de 2, ya que el volumen final es de 500 μL y se divide además por un volumen de muestra de 10 μL para medir la concentración de glucosa en μg/μL. Puesto que el valor calculado es para 5 mg de extracto de pared celular, se divide aún más por 5 o con el peso de pared de celda bruta respectiva utilizado para cada muestra experimental para obtener concentración de glucosa por mg. El valor se divide además por 1,1 para compensar el agua obtenida en el proceso de hidrólisis (la glucosa tiene un peso molecular de 180 y una molécula de agua tiene un peso molecular de 18 y por lo tanto el agua generada en el proceso de liberación de monómeros de glucosa se eliminó dividiendo el factor de humedad, 1,1). El valor resultante se multiplicará por 100 para calcular el contenido cristalino de celulosa en porcentaje (Tabla suplementaria 1).

Los resultados del contenido de celulosa muestran que son consistentes entre las réplicas biológicas, lo que sugiere la precisión técnica del método Updegraff. Además, las diferencias se trazaron utilizando gráficos 2D. Estos resultados mostraron las diferencias de contenido de celulosa en los números de muestra experimentales comparados 1 y 2 (Figura 4). La muestra 1 muestra el 43,4%, mientras que la muestra 2 muestra el 28,12%, lo que sugiere que este método puede distinguir las diferencias entre las muestras experimentales. Una prueba t para estudiantes se aplicó al nivel de significancia del 95% para poner a prueba sus diferencias significativas.

Figure 1
Figura 1: Preparación de biomasa de plantas de algodón para la estimación de contenido de celulosa en raíces. (A) Las plantas cultivadas en invernadero fueron sacadas suavemente del suelo y lavadas a fondo con agua. El tejido de la raíz de la planta se separó, se mantuvo en las toallas de papel y se le permitió secar al aire durante 2 días. (B) A continuación, el tejido radicular se transfirió a recipientes etiquetados individualmente y se le permitió secar en la incubadora a 49 °C durante -10 días. (C) El tejido seco se cortó en trozos pequeños, congelado en nitrógeno líquido, cargado en los viales de molienda y molido en polvo fino utilizando molino congelador. (D) Se recogió polvo de tejido finamente molido en el tubo de 50 ml. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Diagrama de flujo de los pasos principales implicados en el método Updegraff. (A) Representación pictórica de los pasos clave en el protocolo. (B) Explica los pasos críticos que se mostraron en el panel (A). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Preparación de diferentes concentraciones de glucosa para la curva estándar. (A) Preparar la solución de glucosa mediante la disolución de 10 mg de glucosa en 10 ml de agua destilada estéril para que la concentración final del caldo sea de 1 mg/ml. Añadir solución de 1 mg/ml de glucosa en incrementos de 20 μL a un volumen final de 1 ml con agua destilada estéril para preparar diferentes concentraciones de glucosa de 0 μg a 180 μg/ml. (B) Tabla que muestra una cantidad de 1 mg/ml de glucosa y agua destilada estéril que se añadirá para realizar diferentes concentraciones de glucosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Curva estándar deglucosa generada utilizando valores de absorbancia de diferentes concentraciones de glucosa a 620 nm. (A) Tabla que muestra diferentes concentraciones de glucosa que van de 0 a 180 μg/mL con los respectivos valores de absorbancia normalizados a 620 nm. (B) Curva estándar de glucosa generada utilizando un gráfico de dispersión a partir de los valores de absorbancia (A). (C) Gráfico de barras que muestra diferencias de contenido de celulosa cristalina en las muestras experimentales 1 y 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla complementaria 1: Estimación del contenido de celulosa en las muestras experimentales. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

Las fibras de algodón son fibras naturales producidas a partir de la semilla de algodón. La fibra de algodón es una sola célula con ~95% contenido de celulosa2 con alto contenido de celulosa cristalina con amplias aplicaciones en la industria textil31. Como, fibra de algodón contiene ~ 95% celulosa, hemos utilizado tejidos de raíz de algodón para la demostración de la estimación del contenido de celulosa cristalina. Los tejidos de raíz de algodón son moderadamente ricos en contenido de celulosa cristalina y representan una biomasa vegetal comúnmente disponible. La cantidad total de pared celular necesaria para el contenido de celulosa cristalina es de sólo 5 mg y por lo tanto este método se puede emplear para estimar el contenido de celulosa cristalina en diferentes etapas de desarrollo / estimación de contenido de celulosa específica del tejido. El porcentaje de ácido sulfúrico (67%) también desempeña un papel crítico en la ruptura de la celulosa en monómeros de glucosa y la disolución de la celulosa completamente23 sin necesidad de sonicación. La pérdida de muestras es común después del tratamiento con Updegraff, ya que el pellet de celulosa cristalina no es sólido en la parte inferior del tubo en diferentes pasos en el proceso de estimación. Esto se puede minimizar eliminando pequeños volúmenes de sobrenadante en cada paso de agua y lavados de acetona después del tratamiento con Updegraff. Además, el vórtice inmediato de la muestra y los estándares con antronétesis desempeñan un papel significativo en el desarrollo del color y una mayor precisión de los estándares, lo que conduce a un coeficiente del 99,5% de los valores de determinación (R2)(Figura 3). La curva estándar de glucosa es clave para determinar la concentración de glucosa, que a su vez se utiliza para estimar el contenido cristalino de celulosa. Por lo tanto, las concentraciones de glucosa se pueden ajustar de acuerdo con el rango requerido de concentraciones. Dependiendo del rango de valores para adaptarse a los valores experimentales, la curva estándar puede variar de 0 a 100 μg/mL o de 0 a 200 μg/ml hasta 1000 concentraciones de μg/ml de glucosa; esto cambia aún más los valores de regresión c y m, mejorando la precisión de la estimación de celulosa cristalina. Es importante hacer siempre antronización fresca del 0,2% tanto para muestras como para el estándar. R-cuadrado, una medición estadística, representa la variabilidad de todos los puntos de datos en la línea de regresión. Es importante hervir tanto los estándares como las muestras después de añadir antrones durante la misma cantidad de tiempo. Siempre es importante incluir un control positivo con un contenido de celulosa conocido. Para una reproducibilidad efectiva de los datos, todo el procedimiento debe seguirse con precisión, incluida la preparación de soluciones (estándares, curva estándar y reactivo Updegraff).

Recientemente, la celulosa se explora para aplicaciones no textiles como aerosoles celulósicos, piezas de computadora y etanol celulósico32,33; por lo tanto, este método tendrá amplias aplicaciones en el futuro. El avance científico se logra mediante progresos incrementales en la comprensión de conceptos, la propuesta de hipótesis alternativas y la provisión/desmentición de los conocimientos existentes. Se pueden observar progresos similares en el desarrollo de un método fiable para la estimación del contenido de celulosa en la biomasa vegetal. La pared celular es una matriz compleja y el método Updegraff elimina las fracciones de celulosa no celulosa de la celulosa pura de una manera secuencial, lo que conduce a una estimación precisa del contenido de celulosa en la biomasa de la planta. Además, el método colorimétrico simple desarrollado para la estimación del contenido de celulosa mediante la medición de la concentración de glucosa hizo que este método altamente adaptable y ampliamente utilizado. En el estudio actual, los datos de celulosa fueron consistentes entre las diferentes réplicas biológicas de las muestras recogidas de una sola línea. Por lo tanto, sugiere que los datos producidos por este método son consistentes, fiables, reproducibles y fáciles de medir el contenido de celulosa mediante un simple ensayo colorimétrico.

El método Updegraff es el método más utilizado para la estimación de celulosa. Con la reciente expansión de la aplicación industrial de la celulosa como alimentos, madera, papel, fibras, biocombustibles, ropa, cosméticos y farmacéuticos, la estimación precisa del contenido de celulosa de la biomasa vegetal es crucial para diversas aplicaciones. Aunque este es el método más utilizado para la estimación de celulosa, es importante tomar varias precauciones para obtener datos reproducibles. Las muestras de biomasa deben estar molidas al mismo tamaño para obtener una estimación precisa y reproducible del contenido de celulosa. Se debe tener cuidado al generar la curva estándar de glucosa. Los estándares de glucosa utilizados para la preparación de curvas estándar de glucosa deben aumentarse o disminuirse en función de las lecturas de absorbancia de la muestra para que las concentraciones desconocidas estén dentro del rango de concentraciones de glucosa que se utilizan para preparar la curva estándar. Si no es así, los valores m y c pueden variar, lo que resulta en la estimación inexacta del contenido de celulosa cristalina. La preparación fresca de 0,2 % de antronérona para cada lote de muestras es otro paso crítico del método Updegraff. Es esencial utilizar antrones del 0,2 % recién preparados para la estimación precisa del contenido de celulosa.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.

Acknowledgments

Agradecemos al Departamento de Ciencia de Plantas y Suelos y Cotton Inc. por su apoyo parcial a este estudio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Chemical A18-500 Used in the protocol
Anthrone Sigma Aldrich 90-44-8 For colorimetric assay
Centrifuge Eppendorf 5424 For centrifugation
Chloroform Mallinckrodt 67-66-3 Used in the protocol
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich 6381-92-6 Used in the protocol
Ethanol Millipore Sigma EM-EX0276-4S Used in the protocol
Filter paper Whatman 1004-090 Positive control
Glacial acetic acid Sigma SKU A6283 Used in the protocol
Heat block/ ThermoMixer F1.5 Eppendorf 13527550 For controlled temperatures
Incubator Fisherbrand 150152633 Used for drying plant sample
Measuring Scale Mettler Toledo 30243386 For specific quantities
Methanol 100 % Fisher Chemical A412-500 Used in the protocol
Microplate (96 well) Evergreen Scientific 222-8030-01F For anthrone assay
Nitric acid Sigma Aldrich 695041 Used in the protocol
Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes BioSpec Products 10831 For high temperatures
Spectrophotometer(Multimode Detector) Beckmancoulter DTX880 1000814 For measuring absorbances
Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill Spex Sample Prep 68-701-15 For grinding plant tissues into fine powder
Sulphuric acid J.T.Baker 02-004-382 Used in the protocol
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma Aldrich 151-21-3 Used in the PSB buffer
Tubes (2 mL) Fisher Scientific 05-408-138 Used in the protocol
Tris Hydrochloride Sigma Aldrich  1185-53-1 Used in the PSB buffer
Ultrapure distilled water Invitrogen 10977 Used in the protocol
Vacuum dryer (vacufuge plus) Eppendorf 22820001 For drying samples
Vortex mixer Fisherbrand 14-955-151 For mixing
Waterbath Thermoscientific TSGP02PM05 For temperature controlled conditions at specific steps
Weighing Paper Fisher Scientific 09-898-12A Used in the protocol

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Ciencias Ambientales Número 171 Pared celular biomasa celulosa hemicellulosa lignina hemicellulosa y ensayo de antrones
Estimación del contenido de celulosa cristalina de biomasa vegetal utilizando el método Updegraff
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Dampanaboina, L., Yuan, N., Mendu, V. Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method. J. Vis. Exp. (171), e62031, doi:10.3791/62031 (2021).

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