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Estimation de la teneur en cellulose cristalline de la biomasse végétale à l’aide de la méthode Updegraff

Published: May 15, 2021 doi: 10.3791/62031
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Plant and Soil Science, Texas Tech University, 2Fiber and Biopolymer Research Institute (FBRI), Department of Plant and Soil Science, Texas Tech University

Summary

La méthode Updegraff est la méthode la plus largement utilisée pour l’estimation de la cellulose. L’objectif principal de cette démonstration est de fournir un protocole updegraff détaillé pour l’estimation de la teneur en cellulose dans les échantillons de biomasse végétale.

Abstract

La cellulose est le polymère le plus abondant sur Terre généré par la photosynthèse et le principal composant porteur des parois cellulaires. La paroi cellulaire joue un rôle important dans la croissance et le développement des plantes en fournissant la force, la rigidité, le taux et la direction de la croissance cellulaire, le maintien de la forme cellulaire et la protection contre les facteurs de stress biotiques et abiotiques. La paroi cellulaire est principalement composée de cellulose, lignine, hémicellulose et pectine. Récemment, les parois cellulaires végétales ont été ciblées pour la production de biocarburants et de bioénergie de deuxième génération. Plus précisément, la composante cellulose de la paroi cellulaire végétale est utilisée pour la production d’éthanol cellulosique. L’estimation de la teneur en cellulose de biomasse est essentielle pour la recherche fondamentale et appliquée sur les paroi cellulaires. La méthode Updegraff est simple, robuste et la méthode la plus utilisée pour estimer la teneur en cellulose cristalline de la biomasse végétale. La fraction insoluble de mur brut d’alcool de cellules au traitement avec le réagent d’Updegraff élimine les fractions d’hémicellulose et de lignine. Plus tard, la fraction résistante à la cellulose réaccétique Updegraff est soumise à un traitement à l’acide sulfurique pour hydrolyser l’homopolymère de cellulose en unités de glucose monomères. Une ligne de régression est développée en utilisant diverses concentrations de glucose et utilisée pour estimer la quantité de glucose libérée sur l’hydrolyse de cellulose dans les échantillons expérimentaux. Enfin, la teneur en cellulose est estimée en fonction de la quantité de monomères de glucose par essai colorimétrique anthrone.

Introduction

La cellulose est le principal composant porteur de charges des parois cellulaires, qui est présent dans les parois cellulaires primaires et secondaires. La paroi cellulaire est une matrice extracellulaire qui entoure les cellules végétales et est principalement composée de cellulose, lignine, hémicellulose, pectine et protéines matricielles. Environ un tiers de la biomasse végétale est la cellulose1 et elle joue un rôle important dans la croissance et le développement des plantes en fournissant la force, la rigidité, le taux et la direction de la croissance cellulaire, le maintien de la forme cellulaire et la protection contre les facteurs de stress biotiques et abiotiques. La fibre de coton contient 95% de cellulose2 contenu, tandis que les arbres contiennent 40% à 50% de cellulose selon les espèces végétales et les typesd’organes 3. La cellulose est composée d’unités répétées de cellobiose, un disaccharide de résidus de glucose reliés par β-1,4 liaisons glycosidiques4. L’éthanol cellulosique est produit à partir du glucose dérivé de la cellulose présente dans les parois cellulairesvégétales 5. La fibre cellulosique est composée de plusieurs micro fibrilles dans lesquelles chaque micro fibril agit comme unité centrale avec 500-15000 monomères de glucose1,6. L’homopolymère de cellulose est synthétisé par des complexes de synthase de cellulose embarqués par membrane plasmatique (CSC)1,7. Les protéines individuelles de synthase de cellulose A (CESA) synthétisent des chaînes de glucane et les chaînes de glucanes adjacentes sont reliées par des liaisons hydrogène pour former la cellulose cristalline1,8. La cellulose existe sous plusieurs formes cristallines avec deux formes prédominantes, la cellulose Iα et la cellulose Iβ sous forme de formes indigènes9. Dans les plantes supérieures, la cellulose existe sous forme de cellulose Iβ tandis que la cellulose végétale inférieure existe sous forme Iα10,11. Dans l’ensemble, la cellulose joue un rôle important en donnant de la force et de la rigidité aux parois des cellules végétales.

Les biocarburants de première génération sont principalement produits à partir de amidon de maïs, de sucres de canne et de sucres de betterave, qui sont des sources alimentaires, tandis que les biocarburants de deuxième génération se concentrent sur la production de biocarburants à partir de matériaux non alimentaires de paroi cellulaire à base de cellules debiomasse végétale 12. L’estimation précise de la teneur en cellulose cristalline est non seulement importante pour la recherche fondamentale sur la biosynthèse de la cellulose et la dynamique des paroi cellulaires, mais aussi pour la recherche appliquée sur les biocarburants et les bioprodits. Diverses méthodes ont été développées et optimisées pour l’estimation de la cellulose dans la biomasse végétale, et la méthode Updegraff est la méthode la plus largement utilisée pour l’estimation de la cellulose. La première méthode rapportée pour l’estimation de cellulose était par Croix et Bevan en 190813. La méthode était basée sur le principe de la chloration et de l’extraction alternatives par sulfate de sodium. Cependant, la cellulose obtenue par les protocoles originaux et modifiés de la méthode Cross et Bevan a montré la contamination de petites fractions de lignine en plus d’une quantité substantielle de xylans et mannans14. En dépit de plusieurs modifications pour enlever la lignine et les hémicelluloses de la fraction de cellulose, la méthode de Cross-Bevan a conservé une quantité considérable de mannans avec la cellulose. Plus tard, la méthode de Kurschner a été développée en employant l’acide nitrique et l’éthanol pour extraire la cellulose15. Cette méthode a déclaré que la lignine totale et 75% des pentosans ont été enlevés, mais les résultats réels de cellulose étaient les mêmes que ceux estimés par la méthode de chloration de Cross et Bevan. Une autre méthode (Norman et Jenkins) a été développée en employant le méthanol-benzène, le sulfate de sodium, et l’hypochlorite de sodium pour extraire la cellulose16. Cette méthode a également conservé une fraction de lignine (3%) et des quantités importantes de pentosans conduisant à une estimation précise de la cellulose. Plus tard, Kiesel et Semiganowsky ont utilisé une approche différente pour hydrolyser la cellulose en utilisant 80% d’acide sulfurique concentré, et les sucres réduits hydrolysés ont été estimés par la méthode de Bertrand17. Les deux méthodes, Waksman et Stevens18 et Salo14,19 quiont été développées sur la base de la méthode de Kiesel et Semiganowsky, ont également donné 4-5% moins de contenu en cellulose par rapport aux méthodes antérieures20.

La méthode Updegraff est la méthode la plus utilisée pour estimer la teneur en cellulose cristalline. Cette méthode a été décrite pour la première fois par Updegraff pour la mesure de la cellulose en 196921. La méthode Updegraff intègre la méthode Kurschner (utilisation d’acide nitrique), les méthodes Kiesel et Seminowsky (hydrolyse de cellulose dans les monomères de glucose utilisant de l’acide sulfurique) avec quelques modifications, et l’essai anthrone de Viles et Silverman pour une estimation colorimétrique simple du glucose et de la teneur en cellulose cristalline22. Le principe de cette méthode est l’utilisation de l’acide acétique et de l’acide nitrique (réagent updegraff) pour éliminer l’hémicellulose et la lignine des tissus végétaux homogénéisés, qui laisse la cellulose résistante à l’acide acétique/nitrique pour un traitement et une estimationultérieurs 15. La cellulose résistante à l’acide acétique/nitrique est traitée avec 67% d’acide sulfurique pour casser la cellulose en monomères de glucose et les monomères de glucose libérés sont estimés par essai anthrone21,23. Plusieurs modifications de la méthode originale d’Updegraff ont été employées pour simplifier la procédure et l’estimation de cellulose par l’essai anthrone24. Dans l’ensemble, cette méthode peut être divisée en cinq phases. Dans la première phase, le matériel végétal est préparé. Dans la deuxième phase, la paroi cellulaire brute est séparée de la biomasse totale, car la cellulose est le composant clé des parois cellulaires végétales. Plus tard, dans la troisième phase, la cellulose est séparée des composants non cellulosiques de la paroi cellulaire en traitant avec le réaccente Updegraff. Dans la quatrième phase, la cellulose résistante à l’acide acétique/nitrique est divisée en monomères de glucose par traitement à l’acide sulfurique. Le traitement acide sulfurique de la cellulose entraîne la formation de composés 5 hydroxyméthylfurfural de la réaction des monomères de glucose avec de l’acide sulfurique. Enfin, dans la dernière phase, l’anthrone génère un complexe bleu verdâtre en bouillant avec le composé furfural généré dans la phaseprécédente 25. Cette méthode colorimétrique à base d’anthrone a été utilisée pour la première fois en 1942 par Dreywood. Anthrone est un colorant qui identifie les composés furfural de pentose et de produits déshydratés à l’hexose tels que les produits déshydratés 5 hydroxyméthylfurfural, dans des conditions acides. La réaction avec l’hexose produit une couleur intense et une meilleure réponse comparée aux pentoses25. La quantité de glucose lié est mesurée par absorption du spectrophotomètre à 620 nm et l’intensité du complexe bleu verdâtre est directement proportionnelle à la quantité de sucre dans l’échantillon. Les valeurs d’absorption mesurées ont été comparées à une ligne standard de régression de courbe de glucose pour calculer la concentration de glucose de l’échantillon. La teneur mesurée en glucose a été utilisée pour estimer la teneur en cellulose de la biomasse végétale.

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Protocol

1. Préparation expérimentale

  1. Moudre le matériel végétal séché en poudre fine.
  2. Tampon de solubilisation protéique (PSB) : Préparez des solutions de stock de 1 M Tris (pH 8,8), 0,5 M d’acide éthylèneediaminetétraacetic (EDTA) (pH 8.0) et autoclavez-les. Faites tampon PSB frais de ces solutions de stock avec des concentrations finales de 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA et 10% de sulfate de dodecyl de sodium (SDS) dans l’eau stérile.
  3. Préparer 100 mL d’éthanol à 70 % (v/v) : 70 mL d’éthanol à 100 % et 30 mL d’eau stérile.
  4. Préparer 100 mL de méthanol : chloroforme dans un rapport de 1:1 (50 mL de méthanol et 50 mL de chloroforme).
  5. Préparer 82,5 mL de réagencé Updegraff. Ajouter 75 mL d’acide acétique à 80% d’acide acétique à 7,5 mL d’acide nitrique de sorte que le rapport ultime de l’eau: acide acétique: acide nitrique est en 2:8:1 (v/ v). Pour préparer 80% d’acide acétique, dissoudre 80 mL d’acide acétique glaciaire dans 20 mL d’eau stérile (v/v).
  6. Préparer un bouillon frais de 1 mg/mL de solution de glucose. Dissoudre 10 mg de glucose dans 10 mL d’eau (w/v).
  7. Pour préparer 100 mL d’acide sulfurique à 67 % (v/v), ajouter 67 mL d’acide sulfurique concentré à 33 mL d’eau. Toujours utiliser une bouteille en verre et ajouter de l’acide lentement à l’eau. Cette étape est exothermique (libère de la chaleur). Par conséquent, préparer cette solution sur la glace et laisser refroidir au réfrigérateur pendant au moins 2 heures avant utilisation.
  8. Préparer de l’anthrone frais de 0,2 % (w/v) pour chaque lot d’échantillons expérimentaux. Peser 0,2 g d’anthrone et dissoudre dans 100 mL d’acide sulfurique concentré pré-réfrigéré dans une bouteille en verre enveloppée de papier d’aluminium. Conserver au réfrigérateur de 1 à 2 heures avant utilisation.
    REMARQUE : L’acide sulfurique concentré pré-refroidissement dans le réfrigérateur le jour de l’expérience, et la préparation fraîche de l’anthrone est fortement recommandé pour l’estimation précise de la teneur en glucose.

2. Préparation de biomasse végétale

  1. Recueillir des échantillons de biomasse végétale à partir de lignées expérimentales de coton de 2 mois cultivées en serre avec les mêmes conditions de croissance, le même stade de développement, la même position des plantes et le même type de tissu (feuilles/tige/racine).
    REMARQUE : Recueillir un minimum de trois répliques biologiques pour chaque échantillon. Lavez-les soigneusement avec de l’eau pour enlever toute la saleté du tissu racinaire.
  2. Tissu racinaire sec à l’air pendant 2 jours sur du papier absorbant à température ambiante pour éliminer la teneur en humidité (Figure 1).
    REMARQUE : Tissu désiré à sec à l’air pour l’estimation de la cellulose afin d’éviter toute contamination fongique.
  3. Placez les échantillons de racines dans des contenants individuels. Puis les étiqueter et les sécher dans l’incubateur à 49 °C pendant 10 jours (Table des matériaux).
    REMARQUE : Alternativement, un séchoir à congélation peut être utilisé pour sécher le tissu végétal en moins de temps (1 ou 2 jours) sans causer de changements chimiques au matériau de biomasse végétale.
  4. Couper les échantillons séchés en petits morceaux, les congeler dans de l’azote liquide et moudre en poudre fine uniforme à l’aide d’un mortier et d’un pilon, d’un moulin à congélateur ou d’un broyeur à biomasse (figure 1).
    REMARQUE : L’usine de congélation a été utilisée à raison de 10 cps pendant 3 cycles.
  5. Recueillir le tissu anoché (figure 2) et procéder à l’extraction de la paroi cellulaire.
    REMARQUE : Le processus peut être interrompu à ce stade en stockant les échantillons dans des contenants hermétiques à température ambiante.

3. Extraction de parois cellulaires brutes à partir de biomasse végétale

REMARQUE : Les parois cellulaires végétales contiennent de la cellulose, de la lignine, des composants autres que la cellulose, de la pectine, des protéines matricielles, des composés phénoliques et del’eau 26. Puisque la cellulose est présente dans les parois cellulaires, la première étape consiste à séparer le composant de la paroi cellulaire des composants muraux non cellulaires de la biomassevégétale 26.

  1. Étiquetez et pesez les tubes blancs individuels de 2 mL avant de commencer le processus d’extraction de la paroi cellulaire.
  2. Notez les poids des tubes vides dans un cahier de laboratoire avant d’aller plus loin.
  3. Pesez 20 mg de tissu en poudre à partir de l’étape 2.5 et transférez-le dans des tubes pré-pesés de 2 mL et étiquetez-les.
  4. Ajouter 1 mL de tampon de solubilisation protéique (PSB) (50 mM tris hydrochlorure (HCl) tampon pH 8,8, 0,5 mM EDTA, et 10% de sulfate de dodédecyl de sodium (SDS) pour solubiliser les protéines. Vortex et centrifugeuse à 25 200 x g pendant 5 min à température ambiante (RT). Après centrifugation, jeter le supernatant et enregistrer la pastille.
    REMARQUE : Le supernatant peut être sauvé si le composant protéique doit être analysé.
  5. Répétez l’étape 3.4 deux fois de plus.
  6. À la pastille retenue, ajouter 1 mL d’eau distillée et de vortex. Centrifugeuse à 25 200 x g pendant 5 min à température ambiante (RT) et retirer le supernatant.
  7. Répétez l’étape 3.6 deux fois de plus.
  8. Ajouter 1 mL d’éthanol à 70 % d’éthanol à la pastille, au vortex économisé et chauffer à 70 °C pendant 1 h dans un bain d’eau/bloc thermique pour éliminer les composants solubles et l’amidon des échantillons. Vortex et centrifugeuse à 25 200 x g pendant 5 min à RT. Jetez le supernatant et économisez la pastille.
  9. Répétez l’étape 3.8 une fois de plus.
  10. À la pastille ajouter 1 mL de 100% de méthanol et vortex. Centrifugeuse à 25 200 x g pendant 5 min à température ambiante (RT) et retirer le supernatant.
  11. Ajouter 1 mL de chloroforme/méthanol (chloroforme et méthanol en 1:1 ratio) à la pastille et au vortex. Centrifugeuse à 25.200 x g pendant 5 min à RT et enlever le supernatant. L’ajout de solubilise et de solubilise le solvant de méthanol et de chloroforme et élimine la fraction lipidique de labiomasse 27.
  12. À la pastille, ajouter 1 mL d’acétone et de vortex à 100 %. Incuber à température ambiante pendant 5 min. Centrifugeuse à 25.200 x g pendant 5 min à RT et enlever le supernatant. L’acétone élimine les pigments tels que la chlorophylle et les acides gras libres de labiomasse 28,29.
  13. Séchez la pastille à 37 °C pendant la nuit ou procédez plus loin en séchant sous vide.
    REMARQUE : La pastille séchée est la paroi cellulaire brute utilisée pour l’estimation cristalline de la cellulose. Le processus peut être interrompu à ce stade ou aller plus loin en utilisant le séchoir à vide pour sécher les échantillons.

4. Traitement par réaccente Updegraff (acide acétique et nitrique) pour enlever les composants non cellulosiques

REMARQUE : Le protocole implique l’utilisation d’acides et d’autres produits chimiques. Portez de l’équipement de protection individuelle (EPI) tout au long du processus.

  1. Mesurer 5 mg de granulés bruts séchés de mur de cellules dans un tube plafonné frais de vis de 2 mL. Notez le poids exact (Figure 3)30.
  2. Incluez un contrôle positif à ce stade. Utilisez 2 mg de papier filtre (Tableau des matériaux) comme un contrôle positif qui donne 80% de contenu en cellulose.
  3. Ajouter 1,5 mL du réagencé Updegraff à la pesée 5 mg d’extrait de paroi cellulaire et un contrôle positif. Mélanger par vortex.
    REMARQUE : Le contrôle positif doit être traité de la même manière que les échantillons expérimentaux à partir de cette étape. Cette étape doit être effectuée dans le capot de fumée avec l’équipement de protection individuelle approprié (PPE).
    ATTENTION : Cette étape doit être effectuée dans des tubes à bouchon à vis pour éviter les éclaboussures d’échantillon et le popping des tubes. Trois répliques biologiques de chaque échantillon ainsi que trois répliques pour un contrôle positif devraient être incluses.
  4. Chauffer la suspension à 100 °C pendant 30 min dans un bain d’eau bouillante et laisser refroidir sur un banc pendant 10 min. Centrifugeuse à 25 200 x g pendant 10 min à RT. Retirer le supernatant par centrifugation et économiser la pastille.
    REMARQUE : Les déchets produits doivent être collectés séparément pour les solvants organiques, l’acide sulfurique et le réaccente Updegraff (acide acétique et acide nitrique). Les déchets avec de l’acide acétique et de l’acide nitrique doivent être conservés à des températures fraîches avec des bouchons ventilés et jamais mélangés avec d’autres solvants organiques et d’autres acides pour prévenir toute explosion.
  5. Ajouter 1 mL d’eau à la pastille. Centrifugeuse à 25 200 x g pendant 10 min à RT. Retirer 500 μL du surnatant et ajouter 1 mL d’acétone au tube.
  6. Centrifugeuse à 25 200 x g pendant 5 min à RT. Retirer 1 mL de supernatant et ajouter 1 mL d’acétone au tube et à la centrifugeuse à 25 200 x g pendant 5 min à RT.
  7. Après centrifugation, retirer tout le supernatant et suspendre la pastille dans 1 mL d’acétone. Incuber les tubes à température ambiante pendant 5 min et tourner à 25 200 x g pendant 5 min à RT.
  8. Jeter le supernatant et enregistrer la pastille. Séchez la pastille à 37 °C pendant la nuit( figure 3).
    REMARQUE : Le processus peut être interrompu à ce stade ou continuer à utiliser le séchoir à vide pour le séchage et passer à l’étape suivante.

5. Hydrolyse de cellulose par acide pour produire des unités de monomère de glucose

  1. Ajouter 1 mL d’acide sulfurique à 67 % à la pastille séchée. Vortex pour mélanger la pastille complètement dans l’acide.
  2. Agiter les tubes à température ambiante pendant 1 h pour dissoudre la pastille de cellulose dans 67% d’acide sulfurique.
    REMARQUE : Comme alternative, la solubilisation de la pastille de cellulose dans l’acide sulfurique de 67% peut être améliorée par la sonication de chaque échantillon pendant 10 min après 30 min d’incubation dans le shaker. Après la sonication, les échantillons peuvent être réincubés dans le shaker à RT. Cependant, nous avons observé la solubilité complète de la pastille de cellulose sans sonication quand nous commençons avec 5 mg d’extrait brut de paroi cellulaire (figure 3). Cette procédure a bien fonctionné pour divers échantillons de biomasse végétale3.

6. Mesure de la teneur en glucose par l’analyse anthrone et l’estimation de la teneur en cellulose

  1. À ce stade, la cellulose est sous forme de monomères de glucose libres. Déterminer la quantité de cellulose en mesurant la quantité de glucose présente dans l’échantillon par spectrophotométrie.
  2. Prenez 10 μL de l’échantillon de l’étape 5 et ajoutez-le à 490 μL d’eau distillée stérile pour faire une dilution de chaque échantillon à 500 μL. Vortex le mélange dilué d’échantillon et d’eau pendant 10 secondes.
  3. Ajouter 1 mL de 0,2 % de réagenène fraîchement préparé à chaque tube et mélanger immédiatement par vortex.
  4. Faire bouillir les échantillons à 100 °C pendant 10 min et refroidir les tubes sur la glace pendant 5 min. Transférer 200 μL de chaque échantillon dans trois puits d’une plaque de puits de 96 puits. Chargez la plaque de puits 96 dans un spectrophotomètre pour mesurer l’absorption à 620 nm.
    REMARQUE : Pour faire bouillir à haute température, utilisez des tubes à vis pour éviter les éclaboussures de produits chimiques nocifs et pour éviter la perte d’échantillons.

7. Préparation de la courbe standard de glucose

  1. Pour préparer la norme de glucose, faire un stock frais de 1 mg/mL de glucose en dissolvant 10 mg de glucose dans 10 mL d’eau distillée stérile. Ajouter cette solution de stock de 1 mg/mL en incréments de 20 μL (0, 20, 40, 60, 80 100 120 140, 160, 180 μL) à l’eau distillée stérile (volume total de 1 mL) pour préparer des normes de glucose allant de 0 μg à 180 concentrations de μg/mL(figure 3). Vortex chaque norme de glucose après l’ajout d’eau stérile.
  2. De ces 10 concentrations différentes, aliquot 500 μL de chaque concentration de glucose dans un tube frais de 2 mL à vis plafonné.
  3. Ajouter 1 mL d’anthrone fraîchement préparé à chaque tube et mélanger immédiatement par vortex. Incuber sur la glace et faire bouillir à 100 °C pendant 10 min, puis incubation sur glace pendant 5 min23.
  4. Transférer 200 μL de chaque norme à trois puits dans une plaque de micro-litre de 96 puits pour trois répliques techniques et mesurer l’absorption à 620 nm (figure 3).
  5. Développer une courbe de glucose standard en traçant différentes concentrations de glucose (0 à 180 μg/mL) par rapport aux valeurs normalisées d’absorption à 620 nm (figure 7). Utilisez la ligne de régression Y= mx+c générée à partir des valeurs d’absorption pour calculer la teneur en cellulose dans les échantillons préparés.
    REMARQUE : Les normes de glucose doivent être fraîchement préparées pour chaque ensemble d’expériences. La concentration du glucose doit être augmentée si les valeurs d’OD sont trop élevées/basses de sorte que ces valeurs entrent dans la gamme des valeurs standard d’absorption de courbe. La ligne de régression génère différentes valeurs m et c basées sur les normes de glucose utilisées pour chaque lot d’échantillons. Mélanger les tubes immédiatement après l’ajout d’anthrone23. Anthrone, échantillons dilués et normes préparées ont toujours été maintenus au froid jusqu’à ce que l’essai anthrone a été effectué en raison de la nature exothermique de cette réaction.

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Representative Results

Les plants de coton cultivés dans la maison verte ont été sélectionnés pour cette étude. Deux lignées expérimentales différentes de coton ont été sélectionnées pour l’analyse comparative de la teneur en cellulose. Pour chaque lignée expérimentale, le tissu racinaire a été prélevé à partir de trois répliques biologiques. Un total de 500 mg de tissu a été homogénéisé et 20 mg de celui-ci a été utilisé pour l’extraction de la paroi cellulaire brute. Plus tard, 5 mg d’extrait brut de paroi cellulaire ont été utilisés pour le traitement des réaccentieux Updegraff pour enlever l’hémicellulose et la lignine de la cellulose. La cellulose purifiée a été hydrolysée par traitement à l’acide sulfurique pour décomposer la cellulose en unités de glucose. Les résultats des lectures d’absorption à 620 nm(tableau supplémentaire 1)ont été utilisés pour mesurer la concentration de glucose et estimer la teneur en cellulose par l’analyse anthrone. Les valeurs moyennes d’absorption de trois répliques techniques ont été normalisées en soustrayant la valeur d’absorption vierge de la concentration de glucose de 0 μg. La courbe standard du glucose a été générée à l’aide d’un graphique à barres épars( figure 4).

La ligne de régression qui en résulte, y = mx + c de cette courbe standard, est utilisée pour calculer une concentration inconnue de glucose dans les échantillons d’essai extraits à l’aide des lectures normalisées d’absorption. Pour calculer x (la concentration inconnue de glucose en μg/μL), la formule (x = absorption normalisée-c/m) a été utilisée. Les valeurs c et m de la ligne de régression de la courbe standard de glucose (R2 = 0,99) ont été utilisées pour mesurer la concentration de glucose en μg/μL. Ensuite, cette valeur est divisée par un facteur de dilution de 2 car le volume final est de 500 μL et encore divisé par un volume d’échantillon de 10 μL pour mesurer la concentration de glucose en μg/μL. Puisque la valeur calculée est pour 5 mg d’extrait de paroi cellulaire, il est encore divisé par 5 ou avec le poids brut respectif de paroi cellulaire utilisé pour chaque échantillon expérimental pour obtenir la concentration de glucose par mg. La valeur est encore divisée par 1,1 pour compenser l’eau acquise dans le processus d’hydrolyse (le glucose a un poids moléculaire de 180 et une molécule d’eau a un poids moléculaire de 18 et donc l’eau produite dans le processus de libération des monomères de glucose a été enlevée en divisant le facteur d’humidité, 1.1). La valeur qui en résultera sera multipliée par 100 pour calculer la teneur en cellulose cristalline en pourcentage(tableau supplémentaire 1).

Les résultats de la teneur en cellulose montrent qu’ils sont cohérents parmi les répliques biologiques, ce qui suggère l’exactitude technique de la méthode Updegraff. En outre, les différences ont été tracées à l’aide de graphiques 2D. Ces résultats ont montré les différences de teneur en cellulose dans les numéros d’échantillon expérimentaux comparés 1 et 2 (Figure 4). L’échantillon 1 montre 43,4 % tandis que l’échantillon 2 montre 28,12 %, ce qui suggère que cette méthode peut distinguer les différences entre les échantillons expérimentaux. Un test t de l’élève a été appliqué à un niveau d’importance de 95 % pour tester leurs différences significatives.

Figure 1
Figure 1 :Préparation de la biomasse végétale de coton pour l’estimation de la teneur en cellulose dans les racines. (A) Les plantes cultivées en serre ont été délicatement retirées du sol et soigneusement lavées avec de l’eau. Le tissu racinaire de la plante a été séparé, conservé sur les serviettes en papier et laissé sécher à l’air pendant 2 jours. (B) Puis le tissu racinaire a été transféré dans des contenants étiquetés individuellement et laissé sécher dans l’incubateur à 49 °C pendant -10 jours. (C) Le tissu séché a été coupé en petits morceaux, congelé dans de l’azote liquide, chargé dans les flacons de broyage, et broyé en poudre fine à l’aide d’un moulin à congélateur. (D) Poudre de tissu finement moulue a été recueillie dans le tube de 50 mL. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2: Diagramme de flux des principales étapes de la méthode Updegraff. (A) Représentation picturale des étapes clés du protocole. (B) Explique les étapes critiques qui ont été montrées dans le panneau (A). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3: Préparation de différentes concentrations de glucose pour la courbe standard. (A) Préparer la solution de stock de glucose en dissolvant 10 mg de glucose dans 10 mL d’eau distillée stérile de sorte que la concentration finale du stock soit de 1 mg/mL. Ajouter une solution de stock de glucose de 1 mg/mL en incréments de 20 μL à un volume final de 1 mL avec de l’eau distillée stérile pour préparer différentes concentrations de glucose de 0 μg à 180 μg/mL. (B) Tableau montrant la quantité de glucose de 1 mg/mL et d’eau distillée stérile à ajouter pour faire différentes concentrations de glucose. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4: Courbe standard de glucose générée à l’aide de valeurs d’absorption de différentes concentrations de glucose à 620 nm. (A) Tableau montrant différentes concentrations de glucose allant de 0 à 180 μg/mL avec les valeurs d’absorption normalisées respectives à 620 nm. (B) Courbe standard de glucose générée à l’aide d’un diagramme de dispersion des valeurs d’absorption (A). (C) Graphique à barres montrant des différences de teneur en cellulose cristalline dans les échantillons expérimentaux 1 et 2. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Tableau supplémentaire 1 : Estimation de la teneur en cellulose dans les échantillons expérimentaux. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette table.

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Discussion

Les fibres de coton sont des fibres naturelles produites à partir des oléagineux. La fibre de coton est une cellule unique avec la teneur en cellulose ~95%2 avec la teneur élevée en cellulose cristalline avec des applications étendues dans l’industrie textile31. Comme, fibre de coton contient ~ 95% cellulose, nous avons utilisé des tissus de racine de coton pour la démonstration de l’estimation de la teneur en cellulose cristalline. Les tissus racinaires de coton sont modérément riches en cellulose cristalline et représentent une biomasse végétale couramment disponible. La quantité totale de paroi cellulaire requise pour la teneur en cellulose cristalline n’est que de 5 mg et donc cette méthode peut être utilisée pour estimer la teneur en cellulose cristalline à différents stades de développement / estimation du contenu en cellulose spécifique des tissus. Le pourcentage d’acide sulfurique (67%) joue également un rôle essentiel dans la rupture de la cellulose en monomères de glucose et la dissolution de la cellulosecomplètement 23 sans avoir besoin de sonication. La perte d’échantillon est commune après le traitement d’Updegraff car la pastille cristalline de cellulose n’est pas solide au fond du tube à différentes étapes du processus d’estimation. Ceci peut être minimisé en enlevant de petits volumes de supernatant dans chaque étape de l’eau et l’acétone se lave après le traitement d’Updegraff. De plus, le vortex immédiat de l’échantillon et les normes avec anthrone jouent un rôle important dans le développement des couleurs et l’exactitude accrue des normes, ce qui conduit à un coefficient de détermination de 99,5 % (R2) valeurs (figure 3). La courbe standard de glucose est essentielle pour déterminer la concentration de glucose, qui à son tour est utilisée pour estimer la teneur en cellulose cristalline. Par conséquent, les concentrations du glucose peuvent être ajustées en fonction de la plage requise de concentrations. Selon la gamme de valeurs pour s’adapter aux valeurs expérimentales, la courbe standard peut varier de 0 à 100 μg/mL ou de 0 à 200 μg/mL jusqu’à 1000 concentrations de glucose de μg/mL; cela modifie encore les valeurs de régression c et m, améliorant la précision de l’estimation cristalline de la cellulose. Il est important de toujours faire de l’anthrone frais de 0,2% pour les deux échantillons et aussi bien que pour la norme. R-square, une mesure statistique, représente la variabilité de tous les points de données sur la ligne de régression. Il est important de faire bouillir les normes et les échantillons après avoir ajouté de l’anthrone pour la même quantité de temps. Il est toujours important d’inclure un contrôle positif avec une teneur connue en cellulose. Pour une reproductibilité efficace des données, l’ensemble de la procédure doit être suivi avec précision, y compris la préparation des solutions (normes, courbe standard et réaccente Updegraff).

Récemment, la cellulose est explorée pour des applications non textiles telles que les aérosols cellulosiques, les pièces informatiques etl’éthanol cellulosique 32,33; par conséquent, cette méthode aura de larges applications à l’avenir. Les progrès scientifiques sont réalisés grâce à des progrès progressifs dans la compréhension des concepts, la proposition d’hypothèses alternatives et la fourniture/la réfutation des connaissances existantes. Des progrès similaires peuvent être observés dans le développement d’une méthode fiable pour l’estimation de la teneur en cellulose dans la biomasse végétale. La paroi cellulaire est une matrice complexe et la méthode Updegraff élimine les fractions non cellulose de la cellulose pure d’une manière séquentielle, conduisant à une estimation précise de la teneur en cellulose dans la biomasse végétale. En outre, la méthode colorimétrique simple développée pour l’estimation de la teneur en cellulose en mesurant la concentration de glucose a rendu cette méthode très adaptable et largement utilisée. Dans la étude actuelle, les données sur la cellulose étaient cohérentes entre différentes répliques biologiques des échantillons prélevés à partir d’une seule lignée. Ainsi, il suggère que les données produites par cette méthode sont cohérentes, fiables, reproductibles et faciles à mesurer le contenu en cellulose par simple analyse colorimétrique.

La méthode Updegraff est la méthode la plus largement utilisée pour l’estimation de la cellulose. Avec l’expansion récente de l’application industrielle de la cellulose comme les aliments, le bois, le papier, les fibres, les biocarburants, les vêtements, les cosmétiques et les produits pharmaceutiques, une estimation précise de la teneur en cellulose de la biomasse végétale est cruciale pour diverses applications. Bien qu’il s’agit de la méthode la plus utilisée pour l’estimation de la cellulose, il est important de prendre plusieurs précautions pour obtenir des données reproductibles. Les échantillons de biomasse doivent être broyés de la même taille pour obtenir une estimation précise et reproductible de la teneur en cellulose. Il faut prendre soin de générer la courbe standard du glucose. Les normes de glucose utilisées pour la préparation standard de la courbe de glucose devraient être augmentées ou diminuées en fonction des lectures d’absorption de l’échantillon de sorte que les concentrations inconnues se trouvent dans la fourchette des concentrations de glucose qui sont utilisées pour préparer la courbe standard. Sinon, les valeurs m et c peuvent varier, ce qui entraîne une estimation inexacte de la teneur en cellulose cristalline. La préparation fraîche de 0,2 % d’anthrone pour chaque lot d’échantillons est une autre étape critique de la méthode Updegraff. Il est essentiel d’utiliser de l’anthrone fraîchement préparé à 0,2 % pour l’estimation précise de la teneur en cellulose.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Nous remercions le ministère des Sciences des plantes et des sols et Cotton Inc. pour leur appui partiel à cette étude.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Chemical A18-500 Used in the protocol
Anthrone Sigma Aldrich 90-44-8 For colorimetric assay
Centrifuge Eppendorf 5424 For centrifugation
Chloroform Mallinckrodt 67-66-3 Used in the protocol
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich 6381-92-6 Used in the protocol
Ethanol Millipore Sigma EM-EX0276-4S Used in the protocol
Filter paper Whatman 1004-090 Positive control
Glacial acetic acid Sigma SKU A6283 Used in the protocol
Heat block/ ThermoMixer F1.5 Eppendorf 13527550 For controlled temperatures
Incubator Fisherbrand 150152633 Used for drying plant sample
Measuring Scale Mettler Toledo 30243386 For specific quantities
Methanol 100 % Fisher Chemical A412-500 Used in the protocol
Microplate (96 well) Evergreen Scientific 222-8030-01F For anthrone assay
Nitric acid Sigma Aldrich 695041 Used in the protocol
Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes BioSpec Products 10831 For high temperatures
Spectrophotometer(Multimode Detector) Beckmancoulter DTX880 1000814 For measuring absorbances
Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill Spex Sample Prep 68-701-15 For grinding plant tissues into fine powder
Sulphuric acid J.T.Baker 02-004-382 Used in the protocol
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma Aldrich 151-21-3 Used in the PSB buffer
Tubes (2 mL) Fisher Scientific 05-408-138 Used in the protocol
Tris Hydrochloride Sigma Aldrich  1185-53-1 Used in the PSB buffer
Ultrapure distilled water Invitrogen 10977 Used in the protocol
Vacuum dryer (vacufuge plus) Eppendorf 22820001 For drying samples
Vortex mixer Fisherbrand 14-955-151 For mixing
Waterbath Thermoscientific TSGP02PM05 For temperature controlled conditions at specific steps
Weighing Paper Fisher Scientific 09-898-12A Used in the protocol

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Sciences de l’environnement numéro 171 Mur cellulaire biomasse cellulose hémicellulose lignine hémicellulose et analyse d’anthrone
Estimation de la teneur en cellulose cristalline de la biomasse végétale à l’aide de la méthode Updegraff
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