Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Estimering af krystallinsk celluloseindhold i plantebiomasse ved hjælp af Updegraff-metoden

Published: May 15, 2021 doi: 10.3791/62031
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Plant and Soil Science, Texas Tech University, 2Fiber and Biopolymer Research Institute (FBRI), Department of Plant and Soil Science, Texas Tech University

Summary

Updegraff-metoden er den mest anvendte metode til celluloseestimatet. Hovedformålet med denne demonstration er at tilvejebringe en detaljeret Updegraff-protokol til vurdering af celluloseindholdet i plantebiomasseprøver.

Abstract

Cellulose er den mest rigelige polymer på Jorden genereret af fotosyntese og den vigtigste bærende komponent af cellevægge. Cellevæggen spiller en væsentlig rolle i plantevækst og -udvikling ved at give styrke, stivhed, hastighed og retning af cellevækst, celleformvedligeholdelse og beskyttelse mod biotiske og abiotiske stressorer. Cellevæggen består primært af cellulose, lignin, hemicellulose og pektin. For nylig er plantecellevægge blevet målrettet mod andengenerationsbiobrændstof- og bioenergiproduktion. Specifikt anvendes cellulosekomponenten i plantecellevæggen til fremstilling af cellulosebaseret ethanol. Estimering af celluloseindholdet i biomasse er afgørende for grundlæggende forskning i cellevægge. Updegraff-metoden er enkel, robust og den mest anvendte metode til vurdering af krystallinsk celluloseindhold i plantebiomasse. Alkohol uopløselige rå cellevæg fraktion ved behandling med Updegraff reagens eliminerer hemicellulose og lignin fraktioner. Senere udsættes Updegraff-reagensresistent cellulosefraktionen for svovlsyrebehandling for at hydrolysere cellulosehompolymeren i monomere glukoseenheder. En regressionslinje udvikles ved hjælp af forskellige koncentrationer af glukose og bruges til at estimere mængden af glukose, der frigives ved cellulosehydrolyse i forsøgsprøverne. Endelig anslås celluloseindholdet baseret på mængden af glukosemonomer ved kolorometrisk anthronanalyse.

Introduction

Cellulose er den primære bærende komponent i cellevægge, som er til stede i både primære og sekundære cellevægge. Cellevæggen er en ekstracellulær matrix, der omgiver planteceller og primært består af cellulose, lignin, hemicellulose, pektin og matrixproteiner. Omkring en tredjedel af planterne biomasse er cellulose1, og det spiller en væsentlig rolle i plantevækst og udvikling ved at give styrke, stivhed, hastighed og retning af cellevækst, celleform vedligeholdelse, og beskyttelse mod biotiske og abiotiske stressfaktorer. Bomuldsfiber indeholder 95% cellulose2 indhold, mens træer indeholder 40% til 50% af cellulose afhængigt af plantearter og organtyper3. Cellulosen består af gentagne enheder af cellobiose, en disaccharid af glukoserester forbundet med β-1,4 glykosidbindinger4. Cellulose ethanol fremstilles af glucose fra den cellulose, der er til stede i plantecellevæggene5. Cellulosisk fiber består af flere mikrofibriller, hvor hver mikrofibril fungerer som kerneenhed med 500-15000 glukosemonomerer1,6. Cellulose homopolymeren syntetiseres af plasmamembran indlejrede cellulosesyntasekomplekser (CSC'er)1,7. Individuelle cellulosesyntese A -proteiner (CESA) syntetiserer glucankæder, og de tilstødende glucankæder forbindes af hydrogenbindinger til krystallinsk cellulose1,8. Cellulose findes i flere krystallinske former med to fremherskende former, cellulose Iα og cellulose Iβ som oprindelige former9. I højere planter findes cellulose i cellulose Iβ-form, mens der findes lavere plantecellulose i Iα form10,11. Samlet set cellulose spiller en væsentlig rolle i at give styrke og stivhed til planten cellevægge.

Førstegenerationsbiobrændstoffer fremstilles primært af majsstivelse, rørsukker og roesukker, som er fødevarekilder, mens andengenerationsbiobrændstoffer fokuserer på biobrændstofproduktionen fra nonfood-plantebiomassecellemateriale12. Et nøjagtigt skøn over indholdet af krystallinsk cellulose er ikke kun vigtigt for grundforskningen i cellulosebiosyntese og cellevægdynamik, men også for anvendt forskning i biobrændstof og bioprodukter. Der er udviklet og optimeret forskellige metoder til vurdering af cellulose i plantebiomassen, og Updegraff-metoden er den mest anvendte metode til celluloseestimering. Den første rapporterede metode til celluloseestimering var af Cross og Bevan i 190813. Metoden var baseret på princippet om alternativ chlorering og ekstraktion ved natriumsulfat. Den cellulose, der blev opnået ved den oprindelige såvel som ændrede protokoller for Cross- og Bevan-metoden, viste imidlertid forurening af små fraktioner af lignin ud over en betydelig mængde xylaner og mannans14. På trods af flere modifikationer for at fjerne lignin og hemicellulose fra cellulosefraktionen beholdt Cross-Bevan-metoden en betydelig mængde mannaner sammen med cellulose. Senere blev Kurschners metode udviklet ved at anvende salpetersyre og ethanol til at udvinde cellulose15. Denne metode erklærede, at den samlede lignin og 75% af pentosanerne blev fjernet, men de sande celluloseresultater var de samme som dem, der blev anslået ved kloreringsmetoden Cross og Bevan. En anden metode (Norman og Jenkins) blev udviklet ved at anvende methanolbenzen, natriumsulfat og natriumhypochlorit til at udvinde cellulose16. Denne metode beholdt også en del af lignin (3%) og betydelige mængder af pentosaner, der fører til en nøjagtig vurdering af cellulose. Senere brugte Kiesel og Semiganowsky en anden tilgang til hydrolyze cellulose ved hjælp af 80% koncentreret svovlsyre, og det hydrolyserede reducerede sukker blev anslået ved Bertrands metode17. De to metoder, Waksman's og Stevens18 og Salo14,19, som blev udviklet baseret på Kiesel og Semiganowsky's metode, også gav 4-5% mindre cellulose indhold i forhold til tidligere metoder20.

Updegraff-metoden er den mest anvendte metode til estimering af krystallinsk celluloseindhold. Denne metode blev første gang beskrevet af Updegraff til måling af cellulose i 196921. Updegraff-metoden integrerer Kurschner-metoden (anvendelse af salpetersyre), Kiesel- og Seminowsky-metoderne (hydrolyse af cellulose i glukosemonomerer ved hjælp af svovlsyre) med nogle modifikationer og anthronanalysen af Viles og Silverman for simpel kolorimetrisk estimering af glukose og krystallinsk celluloseindhold22. Princippet for denne metode er anvendelse af eddikesyre og salpetersyre (Updegraff reagens) til at fjerne hemicellulose og lignin fra det homogeniserede plantevæv, som efterlader eddikesyre/salpetersyreresistent cellulose til videre behandling og estimering15. Den eddikesyre-/salpetersyreresistente cellulose behandles med 67% svovlsyre for at bryde cellulose i glukosemonomerer, og de frigivne glukosemonomerer anslås ved anthronanalyse21,23. Flere ændringer af den oprindelige Updegraff-metode blev brugt til at forenkle proceduren og celluloseestimering ved anthronanalyse24. Generelt kan denne metode opdeles i fem faser. I den første fase fremstilles plantematerialet. I anden fase adskilles råcellevæggen fra den samlede biomasse, da cellulose er nøglekomponenten i plantecellevægge. Senere, i tredje fase, adskilles cellulose fra de ikke-celluloseholdige cellevægkomponenter ved at behandle med Updegraff reagens. I fjerde fase nedbrydes den eddikesyre-/salpetersyreresistente cellulose i glukosemonomerer ved svovlsyrebehandling. Svovlsyrebehandling af cellulose resulterer i dannelse af 5-hydroxymethylfurfuralforbindelser fra reaktionen af glukosemonomerer med svovlsyre. Endelig genererer antronen i den sidste fase et grønligt blåt kompleks ved kogning med furfuralforbindelsen genereret i den foregående fase25. Denne anthrone baserede kolorimetriske metode blev første gang brugt i 1942 af Dreywood. Anthron er et farvestof, der identificerer furfuralforbindelser af pentose og hexose dehydrerede produkter såsom 5-hydroxymethylfurfural under sure forhold. Reaktion med hexose producerer en intens farve og bedre respons i forhold til pentoses25. Mængden af bundet glukose måles ved spektrofotometerabsorptance ved 620 nm, og intensiteten af det grønlige blå kompleks er direkte proportional med mængden af sukker i prøven. De målte absorbansværdier blev sammenlignet med en regressionslinje for glukosekurven for at beregne prøvens glukosekoncentration. Det målte glukoseindhold blev anvendt til at estimere celleuloseindholdet i plantebiomassen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Eksperimentel forberedelse

  1. Grind tørret plantemateriale i et fint pulver.
  2. Proteinsopløselighedsbuffer (PSB): Forbered stamopløsninger på 1 M Tris (pH 8.8), 0,5 M ethylendiaminetetraeddikesyre (EDTA) (pH 8.0) og autoklave dem. Lav frisk PSB buffer fra disse stamopløsninger med endelige koncentrationer på 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA og 10% natrium dodecyl sulfat (SDS) i sterilt vand.
  3. Forbered 100 mL 70% ethanol (v/v): 70 mL 100% ethanol og 30 mL sterilt vand.
  4. Der fremstilles 100 ml methanol: kloroform i et forhold på 1:1 (50 ml methanol og 50 ml kloroform).
  5. Forbered 82,5 mL Updegraff reagens. Der tilsættes 75 ml 80% eddikesyre til 7,5 ml salpetersyre, således at det endelige forhold mellem vand: eddikesyre: salpetersyre er i 2:8:1 (v/v). For at forberede 80% eddikesyre opløses 80 ml iseddike i 20 ml sterilt vand (v/v).
  6. Forbered et nyt lager på 1 mg/mL glukoseopløsning. 10 mg glucose opløses i 10 mL vand (w/v).
  7. Tilbered 100 mL 67% svovlsyre (v/v) tilsættes 67 mL koncentreret svovlsyre til 33 mL vand. Brug altid en glasflaske og tilsæt syre langsomt til vandet. Dette trin er exotermt (frigiver varme). Derfor fremstilles denne opløsning på is og afkøles i køleskabet i mindst 2 timer før brug.
  8. Der fremstilles friske 0,2% anthron (w/v) til hvert parti forsøgsprøver. Der afvejes 0,2 g anthron og opløses i 100 mL forkølet koncentreret svovlsyre i en glasflaske indpakket i aluminiumsfolie. Opbevares i køleskab i 1-2 timer før brug.
    BEMÆRK: Forkølende koncentreret svovlsyre i køleskabet på forsøgsdagen, og frisk tilberedning af anthron anbefales stærkt til nøjagtig vurdering af glukoseindholdet.

2. Fremstilling af plantebiomassemateriale

  1. Indsamle plantebiomasseprøver fra 2 måneder gamle bomuldsforsøgslinjer dyrket i drivhuset med de samme vækstbetingelser, samme udviklingsstadium, planternes samme position og samme type væv (blad/stamme/rod).
    BEMÆRK: Der indsamles mindst tre biologiske replikater for hver prøve. Vask dem grundigt med vand for at fjerne alt snavs fra rodvævet.
  2. Lufttørret rodvæv i 2 dage på papirhåndklæder ved stuetemperatur for at fjerne vandindholdet(figur 1).
    BEMÆRK: Lufttørret ønsket væv til cellulosevurdering for at forhindre svampeforurening.
  3. Placer rodprøverne i individuelle beholdere. Derefter mærkes og tørres de i inkubatoren ved 49 °C i 10 dage (Materialetabel).
    BEMÆRK: Alternativt kan en frysetørrer bruges til at tørre plantevævet på kortere tid (1 eller 2 dage) uden at forårsage kemiske ændringer i anlæggets biomassemateriale.
  4. De tørrede prøver skæres i små stykker, fryses i flydende nitrogen, og formales til ensartet fint pulver ved hjælp af en mørtel og støder, en frysemølle eller en biomassekværn (figur 1).
    BEMÆRK: Frysemøllen blev anvendt med en hastighed på 10 cps i 3 cyklusser.
  5. Opsamle det jordede væv (Figur 2) og fortsæt med cellevægudtrækningen.
    BEMÆRK: Processen kan sættes på pause på dette tidspunkt ved at opbevare prøverne i lufttætte beholdere ved stuetemperatur.

3. Udvinding af råcellevægge fra plantebiomasse

BEMÆRK: Plantecellevæggene indeholder cellulose, lignin, ikke-cellulosekomponenter, pektin, matrixproteiner, phenolforbindelser og vand26. Da cellulose er til stede i cellevægge, er det første skridt at adskille cellevægkomponent fra ikke-cellevægkomponenter i plantebiomassen26.

  1. Mærke og veje individuelle blanke 2 mL rør, før du starter cellevægudtrækningsprocessen.
  2. Noter tomme rørvægte i en laboratorienotesbog, før du går videre.
  3. Der vejes 20 mg pulveriseret væv fra trin 2.5, og det overføres til for vejede 2 mL-rør, og de mærkes.
  4. Der tilsættes 1 mL proteinopløselighedsbuffer (PSB) (50 mM Tris hydrochlorid (HCl) buffer pH 8,8, 0,5 mM EDTA og 10% natrium dodecyl sulfat (SDS) for at opløse proteiner. Vortex og centrifuge ved 25.200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur (RT). Efter centrifugering kasseres supernatanten og pelleten gemmes.
    BEMÆRK: Supernatanten kan gemmes, hvis proteinkomponenten skal analyseres.
  5. Gentag trin 3.4 to gange mere.
  6. Til den tilbageholdte pellet tilsættes 1 mL destilleret vand og vortex. Centrifuge ved 25.200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur (RT) og fjern supernatanten.
  7. Gentag trin 3.6 to gange mere.
  8. Der tilsættes 1 mL 70% ethanol til den gemte pellet, vortex og opvarmes ved 70 °C i 1 time i et vandbad/varmeblok for at fjerne opløselige komponenter og stivelse fra prøverne. Vortex og centrifuge ved 25.200 x g i 5 min på RT. Kassér supernatanten og gem pelleten.
  9. Gentag trin 3.8 en gang til.
  10. Til pellet tilføje 1 mL af 100% methanol og vortex. Centrifuge ved 25.200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur (RT) og fjern supernatanten.
  11. Der tilsættes 1 ml chloroform/methanol (kloroform og methanol i 1:1-forhold) til pellet og vortex. Centrifuge ved 25.200 x g i 5 min ved RT og fjern supernatanten. Tilsætningen af methanol og chloroform opløsningsmiddel opløser og fjerner lipidfraktionen fra biomassen27.
  12. Til pellet, tilsæt 1 ml 100% acetone og vortex. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min. Centrifuge ved 25.200 x g i 5 min ved RT og fjern supernatanten. Acetone fjerner pigmenter som klorofyl og frie fedtsyrer fra biomassen28,29.
  13. Pelletlen tørres ved 37 °C natten over, eller der fortsættes yderligere ved vakuumtørring.
    BEMÆRK: Den tørrede pellet er den rå cellevæg, der bruges til krystallinsk cellulosevurdering. Processen kan standses midlertidigt på dette tidspunkt eller fortsætte med at bruge vakuumtørrer til tørring af prøver.

4. Behandling med Updegraff reagens (eddikesyre og salpetersyre) for at fjerne ikke-cellulosiske komponenter

BEMÆRK: Protokollen omfatter brug af syrer og andre kemikalier. Brug personlige værnemidler (PPE) under hele processen.

  1. Mål 5 mg af den tørrede rå cellevæg pellet i en frisk 2 mL skrue udjævnet rør. Bemærk den nøjagtige vægt (figur 3)30.
  2. Medtag et positivt kontrolelement på dette tidspunkt. Brug 2 mg filterpapir (Tabel over materialer) som en positiv kontrol, der giver 80% celluloseindhold.
  3. Der tilsættes 1,5 mL Updegraff-reagens til det vejede 5 mg cellevægekstrakt og positiv kontrol. Bland ved hvirvelstrømning.
    BEMÆRK: Den positive kontrol skal behandles på samme måde som forsøgsprøverne fra dette trin og fremefter. Dette trin skal udføres i røghætten med korrekt personlige værnemidler (PPE).
    ADVARSEL: Dette trin skal udføres i skruehætterør for at forhindre sprøjt af prøven og affyret af rørene. Tre biologiske replikater af hver prøve sammen med tre replikater for positiv kontrol bør medtages.
  4. Affjedringen opvarmes ved 100 °C i 30 minutter i et kogende vandbad og afkøles på en bænk i 10 minutter. Centrifuge ved 25.200 x g i 10 min ved RT. Fjern supernatanten ved centrifugering og gem pelleten.
    BEMÆRK: Det producerede affald skal indsamles separat for organiske opløsningsmidler, svovlsyre og Updegraff-reagens (eddikesyre og salpetersyre). Affald med eddikesyre og salpetersyre bør opbevares ved kølige temperaturer med ventilerede hætter og aldrig blandes med andre organiske opløsningsmidler og andre syrer for at forhindre eksplosion.
  5. Tilsæt 1 mL vand til pellet. Centrifuge ved 25.200 x g i 10 min ved RT. Fjern 500 μL af supernatanten og tilsæt 1 ml acetone til røret.
  6. Centrifuge ved 25.200 x g i 5 min ved RT. Fjern 1 ml supernatant, og tilsæt 1 ml acetone til røret og centrifuge ved 25.200 x g i 5 min ved RT.
  7. Efter centrifugering fjernes alle supernatanten og pellets i 1 ml acetone. Inkuber rørene ved stuetemperatur i 5 min og spin ved 25.200 x g i 5 minutter ved RT.
  8. Kassér supernatanten og gem pelleten. Pelletlen tørres ved 37 °C natten over (figur 3).
    BEMÆRK: Processen kan sættes på pause på dette tidspunkt eller fortsætte med at bruge vakuumtørrer til tørring og gå videre til næste trin.

5. Hydrolyse af cellulose med syre til fremstilling af monomere glucoseenheder

  1. Der tilsættes 1 mL 67% svovlsyre til den tørrede pellet. Vortex at blande pellet helt i syren.
  2. Ryst rør ved stuetemperatur i 1 time for at opløse cellulosepillen i 67% svovlsyre.
    BEMÆRK: Som et alternativ kan opløselsen af cellulosepillen i 67% svovlsyre forbedres ved sonikering af hver prøve i 10 minutter efter 30 minutters inkubation i shakeren. Efter sonikering kan prøverne inkuberes igen i shakeren på RT. Vi observerede dog fuldstændig opløselighed af cellulosepellet uden sonikering, når vi starter med 5 mg råcellevægekstrakt (figur 3). Denne procedure fungerede godt for forskellige plantebiomasseprøver3.

6. Måling af glucoseindholdet ved anthronanalyse og estimering af celluloseindholdet

  1. På dette stadium er cellulose i form af frie glukosemonomerer. Mængden af cellulose bestemmes ved at måle mængden af glucose, der er til stede i prøven, ved spektrofotometri.
  2. Der udtages 10 μL af prøven fra trin 5, og den tilsættes til 490 μL sterilt destilleret vand for at fortynde hver prøve til 500 μL. Vortex den fortyndede blanding af prøve og vand i 10 sekunder.
  3. Der tilsættes 1 mL frisklavet anthronreagens på 0,2% til hvert rør og blandes straks ved hvirvelstrømning.
  4. Kog prøverne ved 100 °C i 10 minutter, og afkøl rørene på is i 5 min. 200 μL af hver prøve overføres i tre brønde af en 96 brøndplade. Lad 96-brøndpladen i et spektrofotometer for at måle absorbansen ved 620 nm.
    BEMÆRK: Ved kogning ved høj temperatur skal du bruge skruekårede rør for at forhindre sprøjt af skadelige kemikalier og for at undgå tab af prøver.

7. Forberedelse af glukosestandardkurve

  1. For at forberede glukosestandarden skal du lave en frisk bestand på 1 mg/mL glukose ved at opløse 10 mg glukose i 10 mL sterilt destilleret vand. Denne stamopløsning tilsættes på 1 mg/mL i trin på 20 μL (0, 20, 40, 60, 80,100,120,140, 160, 180 μL) til sterilt destilleret vand (samlet volumen 1 mL) til udarbejdelse af glukosestandarder fra 0 μg til 180 μg/mL koncentrationer(figur 3). Vortex hver glukosestandard efter tilsætning af sterilt vand.
  2. Fra disse 10 forskellige koncentrationer, aliquot 500 μL af hver glukosekoncentration i en frisk 2 mL skrue udjævnet rør.
  3. Der tilsættes 1 mL frisklavet 0,2% anthron til hvert rør og blandes straks ved hvirvelstrømning. Inkuber på is og kog ved 100 °C i 10 minutter efterfulgt af inkubation på is i 5min. 23.
  4. 200 μL af hver standard overføres til tre brønde i en 96 brøndmikrotitplade for tre tekniske replikater, og absorbansen måles ved 620 nm (figur 3).
  5. Udvikle en standardglukosekurve ved at afbilde forskellige glukosekoncentrationer (0 til 180 μg/mL) i forhold til normaliserede absorbansværdier ved 620 nm (figur 7). Brug regressionslinjen Y= mx+c, der genereres fra absorbansværdierne, til at beregne celluloseindholdet i de forberedte prøver.
    BEMÆRK: Glukosestandarderne skal være frisklavede til hvert forsøgssæt. Koncentrationen af glucose bør øges, hvis OD-værdierne er for høje/ lave, således at disse værdier falder inden for intervallet af standardkurveabsorptanceværdierne. Regressionslinjen genererer forskellige m- og c-værdier baseret på de glukosestandarder, der anvendes for hvert parti prøver. Rør blandes umiddelbart efter tilsætning af anthron23. Anthron, fortyndede prøver og tilberedte standarder blev altid holdt kolde, indtil anthronanalysen blev udført på grund af denne reaktions eksoterme karakter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bomuldsplanter dyrket i det grønne hus blev udvalgt til denne undersøgelse. Der blev udvalgt to forskellige forsøgslinjer for bomuld til komparativ analyse af celluloseindholdet. For hver eksperimentel linje blev rodvævet indsamlet fra tre biologiske replikater. I alt 500 mg væv blev homogeniseret, og 20 mg af det blev brugt til udvinding af rå cellevægge. Senere blev 5 mg råcellevægekstrakt brugt til Updegraff reagensbehandling for at fjerne hemicellulose og lignin fra cellulose. Den rensede cellulose blev hydrolyseret af svovlsyrebehandling for at nedbryde cellulose i glukoseenheder. Resultaterne af absorbansaflæsninger ved 620 nm (supplerende tabel 1) blev anvendt til at måle glukosekoncentrationen og estimere celluloseindholdet ved anthronanalysen. De gennemsnitlige absorbansværdier for tre tekniske replikater blev normaliseret ved at trække blindabsorberende værdi af glukosekoncentrationen på 0 μg fra. Glukosestandardkurven blev genereret ved hjælp af en spredt søjlediagram (Figur 4).

Den resulterende regressionslinje, y = mx + c fra denne standardkurve, anvendes til at beregne en ukendt glukosekoncentration i de ekstraherede testprøver ved hjælp af de normaliserede absorbansaflæsninger. Til beregning af x (den ukendte glukosekoncentration i μg/μL) blev formlen (x = normaliseret absorbans-c/m) anvendt. C- og m-værdierne fra regressionslinjen i standardglukosekurven (R2 = 0,99) blev anvendt til at måle glukosekoncentrationen i μg/μL. Derefter divideres denne værdi med en fortyndingsfaktor på 2, da det endelige volumen er 500 μL og yderligere divideret med et 10 μL prøvevolumen for at måle glukosekoncentrationen i μg/μL. Da den beregnede værdi er for 5 mg cellevægekstrakt, divideres den yderligere med 5 eller med den respektive råcellevægvægt, der anvendes til hver forsøgsprøve for at få glukosekoncentration pr. mg. Værdien divideres yderligere med 1,1 for at kompensere for det vand, der opnås i hydrolyseprocessen (glukose har en molekylvægt på 180, og et vandmolekyle har en molekylvægt på 18, og dermed blev det vand, der genereres i processen med at frigive glukosemonomer, fjernet ved at dividere fugtfaktoren, 1.1). Den resulterende værdi ganges med 100 for at beregne indholdet af krystallinsk cellulose i procent (Supplerende tabel 1).

Resultaterne af celluloseindholdet viser, at de er konsistente blandt de biologiske replikater, hvilket tyder på den tekniske nøjagtighed af Updegraff-metoden. Desuden blev forskellene afbildet ved hjælp af 2D-grafer. Disse resultater viste forskelle i celluloseindholdet i de sammenlignede eksperimentelle stikprøvenumre 1 og 2 (figur 4). Prøve 1 viser 43,4%, mens stikprøve 2 viser 28,12%, hvilket tyder på, at denne metode kan skelne mellem forsøgsprøverne. En Student t-test blev anvendt på 95% betydning niveau for at teste deres betydelige forskelle.

Figure 1
Figur 1:Udarbejdelse af biomasse fra bomuldsanlæg til skøn over celluloseindholdet i rødderne. (A) Drivhus dyrkede planter blev forsigtigt trukket fra jorden og grundigt vasket med vand. Plantens rodvæv blev adskilt, holdt på papirhåndklæderne og fik lov til at lufttørre i 2 dage. (B) Derefter blev rodvævet overført til individuelt mærkede beholdere og fik lov til at tørre i inkubatoren ved 49 °C i -10 dage. (C) Det tørrede væv blev skåret i små stykker, frosset i flydende nitrogen, læsset i slibeglasset og formalet til fint pulver ved hjælp af frysemølle. (D) Fint jordet vævspulver blev indsamlet i 50 mL røret. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Rutediagram over de vigtigste trin, der er involveret i Updegraff-metoden. (A)Billedlig repræsentation af de vigtigste trin i protokollen. (B) Forklarer kritiske trin, der blev vist i panelet (A). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Forberedelse af forskellige koncentrationer afglucose tilstandardkurven. Der tilsættes en stamopløsning på 1 mg/mL glukose i trin på 20 μL til et slutvolumen på 1 ml med sterilt destilleret vand for at forberede forskellige koncentrationer af glukose fra 0 μg til 180 μg/mL. (B) Tabel over mængden af 1 mg/mL glucose og sterilt destilleret vand, der skal tilsættes for at fremstille forskellige koncentrationer af glucose. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Glucosestandardkurve genereret ved hjælp af absorbansværdier for forskellige glukosekoncentrationer ved 620 nm. (A) Tabel, der viser forskellige koncentrationer af glukose fra 0 til 180 μg/mL med de respektive normaliserede absorbansværdier ved 620 nm. (B) Glukosestandardkurve, der genereres ved hjælp af et punktdiagram ud fra absorbansværdierne (A). c) Søjlediagram med krystallinske celluloseindholdsforskelle i forproeveeksemplarerne 1 og 2. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende tabel 1: Vurdering af celluloseindholdet i forsøgsprøverne. Klik her for at hente denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bomuldsfibre er naturlige fibre fremstillet af cottonseed. Bomuldsfiber er en enkelt celle med ~95% celluloseindhold2 med højt krystallinsk celluloseindhold med omfattende anvendelser i tekstilindustrien31. Som, bomuld fiber indeholder ~ 95% cellulose, har vi brugt bomuld rodvæv til påvisning af skøn over krystallinsk cellulose indhold. Rodvæv af bomuld er moderat rigt på krystallinsk celluloseindhold og repræsenterer en almindeligt tilgængelig plantebiomasse. Den mængde cellevæg, der kræves til indholdet af krystallinsk cellulose, er kun 5 mg, og derfor kan denne metode anvendes til at anslå indholdet af krystallinsk cellulose i forskellige udviklingsstadier/vævsspecifikke celluloseindholdsestimationer. Procentdelen af svovlsyre (67 %) spiller også en afgørende rolle i at bryde cellulose i glukosemonomerer og opløse cellulose helt23 uden behov for sonikering. Prøvetab er almindeligt efter Updegraff-behandlingen, da den krystallinske cellulosepellet ikke er fast i bunden af røret på forskellige trin i estimeringsprocessen. Dette kan minimeres ved at fjerne små mængder af supernatant i hvert trin af vand og acetone vasker efter Updegraff behandling. Endvidere spiller øjeblikkelig hvirvelstrømning af prøven og standarderne med anthron betydelig rolle i farveudvikling og øget nøjagtighed af standarderne, hvilket fører til 99,5% bestemmelseskoefficient (R2) værdier (Figur 3). Glukosestandardkurven er nøglen til bestemmelse af glukosekoncentrationen, som igen bruges til at estimere det krystallinske celluloseindhold. Derfor kan koncentrationerne af glukose justeres i henhold til det krævede koncentrationsområde. Afhængigt af det værdiinterval, der passer til forsøgsværdierne, kan standardkurven variere fra 0 til 100 μg/mL eller 0 til 200 μg/mL op til 1000 μg/mL koncentrationer af glucose. dette ændrer regressionsværdierne c og m yderligere, hvilket forbedrer nøjagtigheden af krystallinsk celluloseestimat. Det er vigtigt altid at lave frisk 0,2% anthron til både prøver og såvel som til standarden. R-square, en statistisk måling, repræsenterer variabiliteten af alle datapunkter på regressionslinjen. Det er vigtigt at koge både standarder og prøver efter tilsætning af anthron i samme mængde tid. Det er altid vigtigt at medtage en positiv kontrol med et kendt celluloseindhold. For at opnå effektiv datagenreprebilitet skal hele proceduren følges nøjagtigt, herunder løsningsforberedelse (standarder, standardkurve og Updegraff-reagens).

For nylig undersøges cellulose til ikke-tekstilapplikationer såsom celluloseiske aerosoler, computerdele og cellulosebaseret ethanol32,33; Derfor vil denne metode have brede anvendelser i fremtiden. Videnskabelige fremskridt sker gennem gradvise fremskridt med hensyn til at forstå begreber, foreslå alternative hypoteser og give/modbevise den eksisterende viden. Lignende fremskridt kan ses i udviklingen af en pålidelig metode til vurdering af celluloseindholdet i plantebiomassen. Cellevæggen er en kompleks matrix, og Updegraff-metoden eliminerer ikke-cellulosefraktioner fra ren cellulose på en sekventiel måde, hvilket fører til nøjagtig vurdering af celluloseindholdet i plantebiomassen. Endvidere gjorde den enkle kolorimetriske metode, der blev udviklet til estimering af celluloseindholdet ved at måle glukosekoncentrationen, denne metode meget tilpasningsbar og udbredt. I den aktuelle undersøgelse var cellulosedataene konsistente blandt forskellige biologiske replikater af de prøver, der blev indsamlet fra en enkelt linje. Det antyder således, at de data, der produceres ved denne metode, er konsistente, pålidelige, reproducerbare og lette at måle celluloseindholdet ved simpel kolorimetrisk analyse.

Updegraff-metoden er den mest anvendte metode til celluloseestimatet. Med den seneste udvidelse af den industrielle anvendelse af cellulose såsom fødevarer, træ, papir, fibre, biobrændstoffer, tøj, kosmetik og lægemidler, er nøjagtig vurdering af celluloseindholdet i plantebiomassen afgørende for forskellige anvendelser. Selvom dette er den mest anvendte metode til celluloseestimering, er det vigtigt at tage flere forholdsregler for at opnå reproducerbare data. Biomasseprøverne bør jordes i samme størrelse for at opnå præcist og reproducerbart skøn over celluloseindholdet. Der skal udvises forsigtighed, samtidig med at glukosestandardkurven genereres. Glukosestandarderne for glucosestandardkurvepræparatet bør forhøjes eller sænkes på grundlag af prøveabsorptanceaflæsningerne, således at de ukendte koncentrationer falder inden for det interval af glukosekoncentrationer, der anvendes til at forberede standardkurven. Hvis ikke, kan m- og c-værdierne variere, hvilket resulterer i unøjagtig vurdering af krystallinsk celluloseindhold. Frisk tilberedning af 0,2 % anthron for hvert parti prøver er endnu et kritisk trin i Updegraff-metoden. Det er vigtigt at anvende frisklavet 0,2 % anthron til nøjagtig vurdering af celluloseindholdet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi takker Institut for Plant &Soil Science og Cotton Inc. for deres delvise støtte til denne undersøgelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Chemical A18-500 Used in the protocol
Anthrone Sigma Aldrich 90-44-8 For colorimetric assay
Centrifuge Eppendorf 5424 For centrifugation
Chloroform Mallinckrodt 67-66-3 Used in the protocol
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich 6381-92-6 Used in the protocol
Ethanol Millipore Sigma EM-EX0276-4S Used in the protocol
Filter paper Whatman 1004-090 Positive control
Glacial acetic acid Sigma SKU A6283 Used in the protocol
Heat block/ ThermoMixer F1.5 Eppendorf 13527550 For controlled temperatures
Incubator Fisherbrand 150152633 Used for drying plant sample
Measuring Scale Mettler Toledo 30243386 For specific quantities
Methanol 100 % Fisher Chemical A412-500 Used in the protocol
Microplate (96 well) Evergreen Scientific 222-8030-01F For anthrone assay
Nitric acid Sigma Aldrich 695041 Used in the protocol
Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes BioSpec Products 10831 For high temperatures
Spectrophotometer(Multimode Detector) Beckmancoulter DTX880 1000814 For measuring absorbances
Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill Spex Sample Prep 68-701-15 For grinding plant tissues into fine powder
Sulphuric acid J.T.Baker 02-004-382 Used in the protocol
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma Aldrich 151-21-3 Used in the PSB buffer
Tubes (2 mL) Fisher Scientific 05-408-138 Used in the protocol
Tris Hydrochloride Sigma Aldrich  1185-53-1 Used in the PSB buffer
Ultrapure distilled water Invitrogen 10977 Used in the protocol
Vacuum dryer (vacufuge plus) Eppendorf 22820001 For drying samples
Vortex mixer Fisherbrand 14-955-151 For mixing
Waterbath Thermoscientific TSGP02PM05 For temperature controlled conditions at specific steps
Weighing Paper Fisher Scientific 09-898-12A Used in the protocol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Somerville, C. Cellulose synthesis in higher plants. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 53-78 (2006).
  2. Balasubramanian, V. K., Rai, K. M., Thu, S. W., Hii, M. M., Mendu, V. Genome-wide identification of multifunctional laccase gene family in cotton (Gossypium spp.); expression and biochemical analysis during fiber development. Scientific Reports. 6, 34309 (2016).
  3. Mendu, V., et al. Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production. Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).
  4. Kraszkiewicz, A., Kachel-Jakubowska, M., Lorencowicz, E., Przywara, A. Influence of cellulose content in plant biomass on selected qualitative traits of pellets. Agriculture and Agricultural Science Procedia. 7, 125-130 (2015).
  5. Jordan, D. B., et al. Plant cell walls to ethanol. Biochemical Journal. 442, 241-252 (2012).
  6. Brett, C. T. Cellulose microfibrils in plants: biosynthesis, deposition, and integration into the cell wall. International Review of Cytology. 199, 161-199 (2000).
  7. Li, S., et al. Cellulose synthase complexes act in a concerted fashion to synthesize highly aggregated cellulose in secondary cell walls of plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 11348-11353 (2016).
  8. Polko, J. K., Kieber, J. J. The regulation of cellulose biosynthesis in plants. The Plant Cell. 31, 282-296 (2019).
  9. Brown, R. M. The biosynthesis of cellulose. Journal of Macromolecular Science, Part A. 33, 1345-1373 (1996).
  10. Gautam, S. P., Bundela, P. S., Pandey, A. K., Jamaluddin, M. K., Sarsaiya, A., Sarsaiya, S. A review on systematic study of cellulose. Journal of Applied and Natural Science. 2, (2010).
  11. Coughlan, M. P. Enzymic hydrolysis of cellulose: An overview. Bioresource Technology. 39, 107-115 (1992).
  12. Robak, K., Balcerek, M. Review of second generation bioethanol production from residual biomass. Food Technology and Biotechnology. 56, 174-187 (2018).
  13. Cross, C. F., Bevan, E. J. Cellulose and chemical industry. Journal of the Society of Chemical Industry. 27, 1187-1193 (1908).
  14. Paloheimo, L., Eine, H., Kero, M. L. A method for cellulose determination. Agricultural and Food Science. 34, (1962).
  15. Kurschner, K., Hanak, A., Diese, Z. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung. 59, 448-485 (1930).
  16. Norman, A. G., Jenkins, S. A new method for the determination of cellulose, based upon observations on the removal of lignin and other encrusting materials. Biochemical Journalournal. 27, (1933).
  17. Kiesel, A., Semiganowsky, N. Cellulose-Bestimmung durch quantitative verzuckerung. Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft (A and B Series). 60, 333-338 (1927).
  18. Waksman, S. A. S., et al. A system of proximate chemical analysis of plant materials. Industrial Engineering Chemistry and Analytical Edition. 2, 167-173 (1930).
  19. Salo, M. -L. Determination of carbohydrates in animal foods as seven fractions. Agricultural and Food Science. , 32-38 (1961).
  20. Giger-Reverdin, S. Review of the main methods of cell wall estimation: interest and limits for ruminants. Animal Feed Science and Technology. 55, 295-334 (1995).
  21. Updegraff, D. M. Semimicro determination of cellulose inbiological materials. Analytical Biochemistry. 32, 420-424 (1969).
  22. Viles, F. J., Silverman, L. Determination of starch and cellulose with anthrone. Analytical Chemistry. 21, 950-953 (1949).
  23. Scott, T. A., Melvin, E. H. Determination of dextran with anthrone. Analytical Chemistry. 25, 1656-1661 (1953).
  24. Kumar, M., Turner, S. Protocol: a medium-throughput method for determination of cellulose content from single stem pieces of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 11, 46 (2015).
  25. Yemm, E. W., Willis, A. J. The estimation of carbohydrates in plant extractsby anthrone. Biochemical Journal. 57, 508-514 (1954).
  26. Houston, K., Tucker, M. R., Chowdhury, J., Shirley, N., Little, A. The plant cell wall: A complex and dynamic structure as revealed by the responses of genes under Stress conditions. Frontiers in Plant Science. 7, (2016).
  27. Jiang, G., et al. Biomass extraction using non-chlorinated solvents for biocompatibility improvement of polyhydroxyalkanoates. Polymers. 10, 731 (2018).
  28. Li, T., et al. A saponification method for chlorophyll removal from microalgae biomass as oil feedstock. Marine Drugs. 14, 162 (2016).
  29. Wiltshire, K. H., Boersma, M., Möller, A., Buhtz, H. Extraction of pigments and fatty acids from the green alga Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae). Aquatic Ecology. 34, 119-126 (2000).
  30. Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. Comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part II: carbohydrates. Journal of Visualized Experiments. (1837), (2010).
  31. Haigler, C., Betancur, L., Stiff, M., Tuttle, J. Cotton fiber: a powerful single-cell model for cell wall and cellulose research. Frontiers in Plant Science. 3, (2012).
  32. Spirk, S., Nypelö, T., Kontturi, E. Editorial: Biopolymer thin films and coatings. Frontiers in Chemistry. 7, (2019).
  33. Long, L. -Y., Weng, Y. -X., Wang, Y. -Z. Cellulose aerogels: Synthesis, applications, and prospects. Polymers. 10, 623 (2018).

Tags

Miljøvidenskab Cellevæg biomasse cellulose hemicellulose lignin hemicellulose og anthronanalyse
Estimering af krystallinsk celluloseindhold i plantebiomasse ved hjælp af Updegraff-metoden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dampanaboina, L., Yuan, N., Mendu,… More

Dampanaboina, L., Yuan, N., Mendu, V. Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method. J. Vis. Exp. (171), e62031, doi:10.3791/62031 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter