Summary
De Updegraff-methode is de meest gebruikte methode voor de celluloseschatting. Het belangrijkste doel van deze demonstratie is om een gedetailleerd Updegraff-protocol te bieden voor de schatting van het cellulosegehalte in biomassamonsters van planten.
Abstract
Cellulose is het meest voorkomende polymeer op aarde dat wordt gegenereerd door fotosynthese en de belangrijkste dragende component van celwanden. De celwand speelt een belangrijke rol in de groei en ontwikkeling van planten door het bieden van kracht, stijfheid, snelheid en richting van celgroei, onderhoud van celvorm en bescherming tegen biotische en abiotische stressoren. De celwand bestaat voornamelijk uit cellulose, lignine, hemicellulose en pectine. Onlangs zijn de celwanden van planten gericht op de productie van biobrandstof en bio-energie van de tweede generatie. In het bijzonder wordt de cellulosecomponent van de plantencelwand gebruikt voor de productie van cellulose-ethanol. Schatting van het cellulosegehalte van biomassa is van cruciaal belang voor fundamenteel en toegepast celwandonderzoek. De Updegraff-methode is eenvoudig, robuust en de meest gebruikte methode voor de schatting van het kristallijne cellulosegehalte van plantaardige biomassa. De alcohol onoplosbare ruwe celwandfractie bij behandeling met Updegraff reagens elimineert de hemicellulose- en ligninefracties. Later wordt de Updegraff reagensresistente cellulosefractie onderworpen aan zwavelzuurbehandeling om het cellulosehomopolymeer te hydrolyseren tot monomere glucose-eenheden. Een regressielijn wordt ontwikkeld met behulp van verschillende concentraties glucose en gebruikt om de hoeveelheid glucose te schatten die vrijkomt bij hydrolyse van cellulose in de experimentele monsters. Ten slotte wordt het cellulosegehalte geschat op basis van de hoeveelheid glucosemonomeren door colorimetrische antroposofietest.
Introduction
Cellulose is de primaire dragende component van celwanden, die aanwezig is in zowel primaire als secundaire celwanden. De celwand is een extracellulaire matrix die plantencellen omringt en bestaat voornamelijk uit cellulose, lignine, hemicellulose, pectine en matrixeiwitten. Ongeveer een derde van de biomassa van planten is cellulose1 en het speelt een belangrijke rol in de groei en ontwikkeling van planten door kracht, stijfheid, snelheid en richting van celgroei, onderhoud van celvorm en bescherming tegen biotische en abiotische stressoren. Katoenvezel bevat 95% cellulose2-gehalte, terwijl bomen 40% tot 50% cellulose bevatten, afhankelijk van de plantensoort en orgaantypen3. De cellulose bestaat uit herhalende eenheden cellobiose, een disaccharide van glucoseresiduen verbonden door β-1,4 glycosidische bindingen4. Cellulose-ethanol wordt geproduceerd uit de glucose die is afgeleid van de cellulose die aanwezig is in de plantencelwanden5. Cellulosevezel bestaat uit verschillende microfibrils waarin elke microfibril fungeert als kerneenheid met 500-15000 glucosemonomeren1,6. Het cellulosehopolymeer wordt gesynthetiseerd door plasmamembraan ingebedde cellulosesynthasecomplexen (CSC's)1,7. Individuele cellulosesynthase A (CESA)-eiwitten synthetiseren glucanketens en de aangrenzende glucanketens worden door waterstofbindingen verbonden tot kristallijne cellulose1,8. Cellulose bestaat in verschillende kristallijne vormen met twee overheersende vormen, cellulose Iα en cellulose Iβ als inheemse vormen9. In hogere installaties bestaat cellulose in cellulose Iβ-vorm, terwijl lagere plantaardige cellulose bestaat in Iα-vorm10,11. Over het algemeen speelt de cellulose een belangrijke rol bij het overbrengen van sterkte en stijfheid aan de celwanden van de plant.
Biobrandstoffen van de eerste generatie worden voornamelijk geproduceerd uit maïszetmeel, rietsuikers en bietensuikers, die voedselbronnen zijn, terwijl biobrandstoffen van de tweede generatie zich richten op de productie van biobrandstoffen uit niet-voedsel plantaardig biomassacelwandmateriaal12. Een nauwkeurige schatting van het kristallijne cellulosegehalte is niet alleen belangrijk voor fundamenteel onderzoek naar cellulosebiosynthese en celwanddynamiek, maar ook voor toegepast onderzoek naar biobrandstof en bioproducten. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld en geoptimaliseerd voor het schatten van cellulose in de biomassa van de installatie, en de Updegraff-methode is de meest gebruikte methode voor celluloseschatting. De eerste gerapporteerde methode voor de schatting van cellulose was door Cross en Bevan in 190813. De methode was gebaseerd op het principe van alternatieve chlorering en extractie door natriumsulfaat. De cellulose verkregen door de oorspronkelijke en gewijzigde protocollen van de Cross- en Bevan-methode vertoonde echter verontreiniging van kleine fracties lignine naast een aanzienlijke hoeveelheid xylanen en mannans14. Ondanks verschillende modificaties om lignine en hemicelluloses uit de cellulosefractie te verwijderen, behield de Cross-Bevan-methode een aanzienlijke hoeveelheid mannans samen met cellulose. Later werd Kurschner's methode ontwikkeld door salpeterzuur en ethanol te gebruiken om cellulose15te extraheren. Deze methode verklaarde dat de totale lignine en 75% van de pentosans werden verwijderd, maar de werkelijke celluloseresultaten waren dezelfde als die welke werden geschat met de chloreringsmethode van Cross en Bevan. Een andere methode (Norman en Jenkins) werd ontwikkeld door gebruik te maken van methanol-benzeen, natriumsulfaat en natriumhypochloriet om cellulose te extraheren16. Deze methode behield ook een fractie lignine (3%) en aanzienlijke hoeveelheden pentosans die leiden tot een nauwkeurige schatting van cellulose. Later gebruikten Kiesel en Semiganowsky een andere benadering van hydrolysecellulose met behulp van 80% geconcentreerd zwavelzuur, en de gehydrolyseerde gereduceerde suikers werden geschat door Bertrand's methode17. De twee methoden, Waksman's en Stevens18 en Salo14,19 die werden ontwikkeld op basis van kiesel en Semiganowsky's methode, leverden ook 4-5% minder cellulosegehalte op in vergelijking met eerdere methoden20.
De Updegraff-methode is de meest gebruikte methode voor de schatting van het kristallijne cellulosegehalte. Deze methode werd voor het eerst beschreven door Updegraff voor de meting van cellulose in 196921. De Updegraff-methode integreert de Kurschner-methode (gebruik van salpeterzuur), Kiesel- en Seminowsky-methoden (hydrolyse van cellulose in glucosemonomeren met behulp van zwavelzuur) met enkele wijzigingen, en de antroposinetest van Viles en Silverman voor een eenvoudige colorimetrische schatting van het glucose- en kristallijne cellulosegehalte22. Het principe van deze methode is het gebruik van azijnzuur en salpeterzuur (Updegraff-reagens) om hemicellulose en lignine uit de gehomogeniseerde plantenweefsels te verwijderen, waardoor azijnzuur/salpeterzuurresistente cellulose voor verdere verwerking en schatting15. De azijnzuur/salpeterzuurresistente cellulose wordt behandeld met 67% zwavelzuur om de cellulose in glucosemonomeren te breken en de vrijgekomen glucosemonomeren worden geschat door antroposofie21,23. Verschillende wijzigingen van de oorspronkelijke Updegraff-methode werden gebruikt om de procedure en de celluloseraming te vereenvoudigen door antroposofie24. In grote lijnen kan deze methode worden onderverdeeld in vijf fasen. In de eerste fase wordt het plantmateriaal bereid. In de tweede fase wordt de ruwe celwand gescheiden van de totale biomassa, omdat cellulose het belangrijkste onderdeel is van plantencelwanden. Later, in de derde fase, wordt de cellulose gescheiden van de niet-cellulosecelwandcomponenten door behandeling met Updegraff-reagens. In de vierde fase wordt de azijnzuur/salpeterzuurresistente cellulose door zwavelzuurbehandeling in glucosemonomeren afgebroken. Zwavelzuurbehandeling van cellulose resulteert in de vorming van 5-hydroxymethylfurfurale verbindingen uit de reactie van glucosemonomeren met zwavelzuur. Ten slotte genereert het anthrone in de laatste fase een groenblauw complex door te koken met de furfurale verbinding die in de vorige fase25werd gegenereerd . Deze antroposofische colorimetrische methode werd voor het eerst gebruikt in 1942 door Dreywood. Anthrone is een kleurstof die furfurale verbindingen van pentose en hexose gedehydrateerde producten zoals 5-hydroxymethylfurfural identificeert, onder zure omstandigheden. Reactie met hexose produceert een intense kleur en een betere respons in vergelijking met pentoses25. De hoeveelheid gebonden glucose wordt gemeten door spectrofotometerabsorptie bij 620 nm en de intensiteit van het groenblauwe complex is direct evenredig met de hoeveelheid suiker in het monster. De gemeten absorptiewaarden werden vergeleken met een glucosestandaard curveregressielijn om de glucoseconcentratie van het monster te berekenen. Het gemeten glucosegehalte werd gebruikt om het cellulosegehalte van de plantaardige biomassa te schatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Experimentele voorbereiding
- Maal gedroogd plantmateriaal tot een fijn poeder.
- Protein Solubilization Buffer (PSB): Bereid stamoplossingen van 1 M Tris (pH 8,8), 0,5 M ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) (pH 8,0) en autoclaaf ze. Maak verse PSB-buffer van deze voorraadoplossingen met eindconcentraties van 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA en 10% natriumdodecylsulfaat (SDS) in steriel water.
- Bereid 100 ml 70% ethanol (v/v): 70 ml 100% ethanol en 30 ml steriel water.
- Bereid 100 ml methanol: chloroform in een verhouding van 1:1 (50 ml methanol en 50 ml chloroform).
- Bereid 82,5 ml Updegraff-reagens voor. Voeg 75 ml 80% azijnzuur toe aan 7,5 ml salpeterzuur, zodat de uiteindelijke verhouding van water: azijnzuur: salpeterzuur in 2:8:1 (v/v) ligt. Om 80% azijnzuur te bereiden, lost u 80 ml ijsazijn op in 20 ml steriel water (v/v).
- Bereid een verse bouillon van 1 mg/ml glucoseoplossing. Los 10 mg glucose op in 10 ml water (m/v).
- Om 100 ml 67% zwavelzuur (v/v) te bereiden, voegt u 67 ml geconcentreerd zwavelzuur toe aan 33 ml water. Gebruik altijd een glazen fles en voeg langzaam zuur toe aan het water. Deze stap is exotherm (geeft warmte af). Bereid deze oplossing daarom op ijs en koel deze minstens 2 uur voor gebruik in de koelkast.
- Bereid verse 0,2% anthrone (w/v) voor elke partij experimentele monsters. Weeg 0,2 g anthrone en los op in 100 ml voorgekoeld geconcentreerd zwavelzuur in een glazen fles gewikkeld met aluminiumfolie. Voor gebruik 1-2 uur in de koelkast bewaren.
OPMERKING: Het voorkoelen van geconcentreerd zwavelzuur in de koelkast op de dag van het experiment, en een nieuwe bereiding van antroposofie wordt ten zeerste aanbevolen voor een nauwkeurige schatting van het glucosegehalte.
2. Bereiding van plantaardig biomassamateriaal
- Verzamel biomassamonsters van planten van 2 maanden oude katoenen experimentele lijnen die in de kas worden gekweekt met dezelfde groeiomstandigheden, dezelfde ontwikkelingsfase, dezelfde positie van de planten en hetzelfde type weefsel (blad / stengel / wortel).
OPMERKING: Verzamel minimaal drie biologische replica's voor elk monster. Was ze grondig met water om al het vuil uit het wortelweefsel te verwijderen. - Droog wortelweefsel gedurende 2 dagen op papieren handdoeken bij kamertemperatuur om het vochtgehalte te verwijderen (Figuur 1).
OPMERKING: Aan de lucht gedroogd gewenst weefsel voor cellulose schatting om schimmelbesmetting te voorkomen. - Plaats de basismonsters in afzonderlijke containers. Etiketteer ze vervolgens en droog ze gedurende 10 dagen in de incubator bij 49 °C(tabel met materialen).
OPMERKING: Als alternatief kan een vriesdroger worden gebruikt om het plantenweefsel in minder tijd (1 of 2 dagen) te drogen zonder chemische veranderingen in het biomassamateriaal van de installatie te veroorzaken. - Snijd de gedroogde monsters in kleine stukjes, vries ze in vloeibare stikstof in en maal ze tot eenvormig fijn poeder met behulp van een mortel en stamper, een diepvriesmolen of een biomassamolen (figuur 1).
OPMERKING: De vriesmolen werd gedurende 3 cycli met een snelheid van 10 cps gebruikt. - Verzamel het geaarde weefsel (figuur 2) en ga verder met de celwandextractie.
OPMERKING: Het proces kan op dit punt worden onderbroken door de monsters op kamertemperatuur in luchtdichte containers op te slaan.
3. Winning van ruwe celwanden uit plantaardige biomassa
OPMERKING: De plantencelwanden bevatten cellulose, lignine, niet-cellulosecomponenten, pectine, matrixeiwitten, fenolverbindingen en water26. Aangezien cellulose aanwezig is in celwanden, is de eerste stap het scheiden van celwandcomponenten van niet-celwandcomponenten van de plantaardige biomassa26.
- Label en weeg individuele lege buizen van 2 ml voordat u met het celwandextractieproces begint.
- Noteer lege buisgewichten in een labnotitieboekje voordat u verder gaat.
- Weeg 20 mg weefselpoeder vanaf stap 2.5 en breng het over op voorgewogen buizen van 2 ml en label ze.
- Voeg 1 ml eiwitslubilisatiebuffer (PSB) (50 mM Tris hydrochloride (HCl) buffer pH 8,8, 0,5 mM EDTA en 10% natriumdodecylsulfaat (SDS) toe om eiwitten te solubiliseren. Vortex en centrifugeer bij 25.200 x g gedurende 5 min bij kamertemperatuur (RT). Gooi na het centrifugeren het supernatant weg en bewaar de pellet.
OPMERKING: Het supernatant kan worden opgeslagen als de eiwitcomponent moet worden geanalyseerd. - Herhaal stap 3.4 nog twee keer.
- Voeg aan de vastgehouden pellet 1 ml gedestilleerd water en vortex toe. Centrifugeer op 25.200 x g gedurende 5 min bij kamertemperatuur (RT) en verwijder het supernatant.
- Herhaal stap 3.6 nog twee keer.
- Voeg 1 ml 70% ethanol toe aan de opgeslagen pellet, vortex en verwarm deze gedurende 1 uur op 70 °C in een waterbad/warmteblok om oplosbare componenten en zetmeel uit de monsters te verwijderen. Vortex en centrifugeer op 25.200 x g gedurende 5 min bij RT. Gooi het supernatant weg en bewaar de pellet.
- Herhaal stap 3.8 nog een keer.
- Voeg aan de pellet 1 ml 1 ml 100% methanol en vortex toe. Centrifugeer op 25.200 x g gedurende 5 min bij kamertemperatuur (RT) en verwijder het supernatant.
- Voeg 1 ml chloroform/methanol (chloroform en methanol in 1:1 verhouding) toe aan de pellet en vortex. Centrifugeer op 25.200 x g gedurende 5 minuten bij RT en verwijder het supernatant. De toevoeging van methanol en chloroform oplosmiddel oplosbaar en verwijdert de lipidefractie uit de biomassa27.
- Voeg aan de pellet 1 ml 100% aceton en vortex toe. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Centrifugeer op 25.200 x g gedurende 5 minuten bij RT en verwijder het supernatant. Aceton verwijdert pigmenten zoals chlorofyl en vrije vetzuren uit de biomassa28,29.
- Droog de pellet 's nachts bij 37 °C of ga verder met vacuümdrogen.
OPMERKING: De gedroogde pellet is de ruwe celwand die wordt gebruikt voor het schatten van kristallijne cellulose. Het proces kan op dit punt worden onderbroken of verder gaan met behulp van vacuümdroger voor het drogen van monsters.
4. Behandeling met Updegraff reagens (azijnzuur en salpeterzuur) om niet-cellulosecomponenten te verwijderen
OPMERKING: Het protocol omvat het gebruik van zuren en andere chemicaliën. Draag tijdens het hele proces persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM).
- Meet 5 mg van de gedroogde ruwe celwand pellet in een verse 2 ml schroef afgedekte buis. Noteer het exacte gewicht (figuur 3)30.
- Voeg op dit punt een positieve controle toe. Gebruik 2 mg filterpapier (Tabel van materialen) als een positieve controle die 80% cellulosegehalte oplevert.
- Voeg 1,5 ml van het Updegraff-reagens toe aan de gewogen 5 mg celwandextract en positieve controle. Mix door vortexen.
OPMERKING: De positieve controle moet vanaf deze stap op dezelfde manier worden verwerkt als de experimentele monsters. Deze stap moet worden uitgevoerd in de zuurkast met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM).
LET OP: Deze stap moet worden uitgevoerd in schroefdopbuizen om spatten van het monster en knallen van de buizen te voorkomen. Van elk monster moeten drie biologische duplo's en drie duplo's voor positieve controle worden opgenomen. - Verwarm de suspensie op 100 °C gedurende 30 minuten in een kokend waterbad en koel gedurende 10 minuten af op een bankje. Centrifugeer op 25.200 x g gedurende 10 minuten bij RT. Verwijder het supernatant door centrifugeren en bewaar de pellet.
OPMERKING: Het geproduceerde afval moet afzonderlijk worden ingezameld voor organische oplosmiddelen, zwavelzuur en Updegraff-reagens (azijnzuur en salpeterzuur). Afval met azijnzuur en salpeterzuur moet op koele temperatuur worden bewaard met geventileerde doppen en nooit worden gemengd met andere organische oplosmiddelen en andere zuren om explosies te voorkomen. - Voeg 1 ml water toe aan de pellet. Centrifugeer bij 25.200 x g gedurende 10 min bij RT. Verwijder 500 μL van het supernatant en voeg 1 ml aceton toe aan de buis.
- Centrifugeer op 25.200 x g gedurende 5 min bij RT. Verwijder 1 ml supernatant en voeg 1 ml aceton toe aan de buis en centrifugeer bij 25.200 x g gedurende 5 minuten bij RT.
- Verwijder na centrifugeren al het supernatant en schors de pellet in 1 ml aceton. Incubeer de buizen op kamertemperatuur gedurende 5 minuten en draai op 25.200 x g gedurende 5 minuten bij RT.
- Gooi het supernatant weg en bewaar de pellet. Droog de pellet 's nachts bij 37 °C (figuur 3).
OPMERKING: Het proces kan op dit punt worden onderbroken of verder worden gebruikt met vacuümdroger voor het drogen en doorgaan naar de volgende stap.
5. Hydrolyse van cellulose door zuur om glucosemonomeereenheden te produceren
- Voeg 1 ml 67% zwavelzuur toe aan de gedroogde pellet. Vortex om de pellet volledig in het zuur te mengen.
- Schud buizen op kamertemperatuur gedurende 1 uur om de cellulosekorrel op te lossen in 67% zwavelzuur.
OPMERKING: Als alternatief kan de oplosbaarheid van de cellulosekorrel in 67% zwavelzuur worden verbeterd door sonicatie van elk monster gedurende 10 minuten na 30 minuten incubatie in de shaker. Na sonicatie kunnen monsters opnieuw worden geïncubeerd in de shaker bij RT. We hebben echter volledige oplosbaarheid van cellulosekorrels zonder sonicatie waargenomen wanneer we beginnen met 5 mg ruw celwandextract (figuur 3). Deze procedure werkte goed voor verschillende biomassamonsters van installaties3.
6. Meting van het glucosegehalte aan de slag met de antroposofie en schatting van het cellulosegehalte
- In dit stadium is de cellulose in de vorm van vrije glucosemonomeren. Bepaal de hoeveelheid cellulose door de hoeveelheid glucose in het monster te meten aan de den I2000 per spectrofotometrie.
- Neem 10 μL van het monster uit stap 5 en voeg het toe aan 490 μL steriel gedestilleerd water om een verdunning van elk monster te maken tot 500 μL. Vortex het verdunde mengsel van monster en water gedurende 10 seconden.
- Voeg 1 ml van 0,2% vers bereid antroposinereagens toe aan elke buis en meng onmiddellijk door vortexen.
- Kook monsters op 100 °C gedurende 10 minuten en koel de buizen gedurende 5 minuten op ijs. Breng 200 μL van elk monster over in drie putten van een plaat van 96 putten. Laad de 96 putplaat in een spectrofotometer om de absorptie bij 620 nm te meten.
OPMERKING: Gebruik voor koken op hoge temperatuur buizen met schroefdop om spatten van schadelijke chemicaliën te voorkomen en verlies van monsters te voorkomen.
7. Bereiding van glucosestandaardcurve
- Om de glucosestandaard te bereiden, maakt u een verse voorraad van 1 mg/ml glucose door 10 mg glucose op te lossen in 10 ml steriel gedestilleerd water. Voeg deze stamoplossing van 1 mg/ml in stappen van 20 μL (0, 20, 40, 60, 80.100.120.140, 160, 180 μL) toe aan steriel gedestilleerd water (totaal volume 1 ml) om glucosenormen voor te bereiden, variërend van 0 μg tot 180 μg/ml concentraties (figuur 3). Vortex elke glucosestandaard na toevoeging van steriel water.
- Van deze 10 verschillende concentraties, aliquot 500 μL van elke glucoseconcentratie in een verse 2 ml schroef afgedekte buis.
- Voeg 1 ml vers bereid 0,2% anthrone toe aan elke buis en meng onmiddellijk door vortexen. Incubeer op ijs en kook gedurende 10 minuten bij 100 °C, gevolgd door incubatie op ijs gedurende 5 min23.
- Breng 200 μL van elke norm over naar drie putten in een microtiterplaat van 96 putten voor drie technische replica's en meet de absorptie bij 620 nm (figuur 3).
- Ontwikkel een standaardglucosecurve door verschillende glucoseconcentraties (0 tot 180 μg/ml) te plotten tegen genormaliseerde absorptiewaarden bij 620 nm (figuur 7). Gebruik de regressielijn Y= mx+c die is gegenereerd op basis van de absorptiewaarden om het cellulosegehalte in de bereide monsters te berekenen.
OPMERKING: Glucosenormen moeten vers worden voorbereid voor elke reeks experimenten. De concentratie van de glucose moet worden verhoogd als de OD-waarden te hoog/laag zijn, zodat deze waarden binnen het bereik van de standaardcurveabsorpancewaarden vallen. De regressielijn genereert verschillende m- en c-waarden op basis van de glucosenormen die voor elke partij monsters worden gebruikt. Meng buizen onmiddellijk na toevoeging van anthrone23. Antroposofen, verdunde monsters en bereide normen werden altijd koud gehouden totdat de antroposofie werd uitgevoerd vanwege de exotherme aard van deze reactie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Katoenplanten die in het groene huis werden gekweekt, werden geselecteerd voor deze studie. Voor de vergelijkende analyse van het cellulosegehalte werden twee verschillende experimentele katoenlijnen geselecteerd. Voor elke experimentele lijn werd het wortelweefsel verzameld uit drie biologische replica's. In totaal werd 500 mg weefsel gehomogeniseerd en 20 mg ervan werd gebruikt voor extractie van ruwe celwanden. Later werd 5 mg ruw celwandextract gebruikt voor updegraff-reagensbehandeling om hemicellulose en lignine uit cellulose te verwijderen. De gezuiverde cellulose werd gehydrolyseerd door zwavelzuurbehandeling om de cellulose af te breken in glucose-eenheden. De resultaten van absorptiewaarden bij 620 nm (aanvullende tabel 1) werden gebruikt om de glucoseconcentratie te meten en het cellulosegehalte te schatten aan de slagingsmeter. De gemiddelde absorptiewaarden van drie technische duplo's werden genormaliseerd door de blanco absorptiewaarde van de glucoseconcentratie van 0 μg af te trekken. De glucosestandaardcurve werd gegenereerd met behulp van een spreidingsbalkgrafiek (figuur 4).
De resulterende regressielijn, y = mx + c uit deze standaardcurve, wordt gebruikt om een onbekende glucoseconcentratie in de geëxtraheerde testmonsters te berekenen met behulp van de genormaliseerde absorptiewaarden. Om x (de onbekende glucoseconcentratie in μg/μL) te berekenen, werd de formule (x = genormaliseerde absorptie-c/m) gebruikt. De c- en m-waarden van de regressielijn van de standaardglucosecurve (R2 = 0,99) werden gebruikt om de glucoseconcentratie in μg/μL te meten. Vervolgens wordt deze waarde gedeeld door een verdunningsfactor van 2, aangezien het uiteindelijke volume 500 μL is en verder gedeeld door een monstervolume van 10 μL om de glucoseconcentratie in μg/μL te meten. Aangezien de berekende waarde voor 5 mg celwandextract is, wordt deze verder gedeeld door 5 of met het respectieve ruwe celwandgewicht dat voor elk experimenteel monster wordt gebruikt om glucoseconcentratie per mg te krijgen. De waarde wordt verder gedeeld door 1,1 om het water te compenseren dat is opgedaan tijdens het hydrolyseproces (glucose heeft een molecuulgewicht van 180 en een watermolecuul heeft een molecuulgewicht van 18 en daarom werd het water dat werd gegenereerd tijdens het vrijgeven van glucosemonomeren verwijderd door de vochtfactor te delen, 1.1). De resulterende waarde wordt vermenigvuldigd met 100 om het kristallijne cellulosegehalte in procenten te berekenen (Aanvullende tabel 1).
De resultaten van het cellulosegehalte laten zien dat ze consistent zijn tussen de biologische replica's, wat wijst op de technische nauwkeurigheid van de Updegraff-methode. Verder werden de verschillen uitgezet met behulp van 2D-grafieken. Deze resultaten toonden de verschillen in het cellulosegehalte aan in de vergeleken experimentele monsternummers 1 en 2 (figuur 4). Monster 1 toont 43,4% terwijl monster 2 28,12% laat zien, wat suggereert dat deze methode verschillen tussen de experimentele monsters kan onderscheiden. Een Student t-test werd toegepast op 95% significantieniveau om hun significante verschillen te testen.
Figuur 1: Bereiding van biomassa van katoenplanten voor schatting van het cellulosegehalte in wortels. (A) Kasplanten werden voorzichtig uit de grond getrokken en grondig gewassen met water. Het wortelweefsel van de plant werd gescheiden, op de papieren handdoeken bewaard en 2 dagen aan de lucht gedroogd. (B) Vervolgens werd het wortelweefsel overgebracht naar individueel gelabelde containers en gedurende -10 dagen in de incubator bij 49 °C laten drogen. (C) Het gedroogde weefsel werd in kleine stukjes gesneden, bevroren in vloeibare stikstof, in de maalflacons geladen en met behulp van de vriesmolen tot fijn poeder gemalen. (D) Fijngemalen weefselpoeder werd verzameld in de buis van 50 ml. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Stroomdiagram van de belangrijkste stappen die betrokken zijn bij de Updegraff-methode. (A) Picturale weergave van de belangrijkste stappen in het protocol. (B) Legt kritieke stappen uit die in paneel (A) zijn weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Bereiding van verschillende concentraties glucose voor de standaardcurve. (A) Bereid de stamoplossing van glucose voor door 10 mg glucose op te lossen in 10 ml steriel gedestilleerd water, zodat de uiteindelijke concentratie van het bestand 1 mg/ml is. Voeg stamoplossing van 1 mg/ml glucose in stappen van 20 μL toe aan een eindvolume van 1 ml met steriel gedestilleerd water om verschillende concentraties glucose van 0 μg tot 180 μg/ml te bereiden. (B) Tabel met de hoeveelheid glucose van 1 mg/ml en steriel gedestilleerd water die moet worden toegevoegd om verschillende concentraties glucose te maken. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Glucosestandaardcurve gegenereerd met absorptiewaarden van verschillende glucoseconcentraties bij 620 nm. (A) Tabel met verschillende glucoseconcentraties variërend van 0 tot 180 μg/ml met de respectieve genormaliseerde absorptiewaarden bij 620 nm. (B) Glucosestandaardcurve gegenereerd met behulp van een spreidingsdiagram van de absorptiewaarden (A). (C) Staafdiagram met kristallijne cellulosegehalteverschillen in de experimentele monsters 1 en 2. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Aanvullende tabel 1: Schatting van het cellulosegehalte in de experimentele monsters. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Katoenvezels zijn natuurlijke vezels die worden geproduceerd uit het katoenzaad. Katoenvezel is een enkele cel met ~95% cellulosegehalte2 met een hoog kristallijn cellulosegehalte met uitgebreide toepassingen in de textielindustrie31. Omdat katoenvezel ~ 95% cellulose bevat, hebben we katoenwortelweefsels gebruikt om de schatting van het kristallijne cellulosegehalte te demonstreren. Katoenwortelweefsels zijn matig rijk aan kristallijne cellulose en vertegenwoordigen een algemeen beschikbare plantaardige biomassa. De totale celwand die nodig is voor het kristallijne cellulosegehalte is slechts 5 mg en daarom kan deze methode worden gebruikt voor het schatten van het kristallijne cellulosegehalte in verschillende ontwikkelingsstadia / weefselspecifieke cellulosegehalteschatting. Het percentage zwavelzuur (67%) speelt ook een cruciale rol bij het breken van cellulose in glucosemonomeren en het oplossen van cellulose volledig23 zonder sonicatie. Monsterverlies komt vaak voor na de Updegraff-behandeling, omdat de kristallijne cellulosekorrel niet vast is aan de onderkant van de buis bij verschillende stappen in het schattingsproces. Dit kan worden geminimaliseerd door kleine hoeveelheden supernatant te verwijderen in elke stap water en acetonwassingen na updegraff-behandeling. Bovendien speelt onmiddellijke vortexing van het monster en de normen met antroposofie een belangrijke rol bij de kleurontwikkeling en verhoogde nauwkeurigheid van de normen, wat leidt tot 99,5% bepalingscoëfficiënt (R2) waarden (figuur 3). De glucosestandaardcurve is essentieel bij het bepalen van de glucoseconcentratie, die op zijn beurt wordt gebruikt om het kristallijne cellulosegehalte te schatten. Daarom kunnen de concentraties van de glucose worden aangepast aan het vereiste concentratiebereik. Afhankelijk van het waardenbereik dat bij de experimentele waarden past, kan de standaardcurve variëren van 0 tot 100 μg/ml of 0 tot 200 μg/ml tot 1000 μg/ml glucoseconcentraties; dit verandert verder de regressiewaarden c en m, waardoor de nauwkeurigheid van de kristallijne celluloseschatting wordt verbeterd. Het is belangrijk om altijd verse 0,2% anthrone te maken voor zowel monsters als voor de standaard. R-kwadraat, een statistische meting, vertegenwoordigt de variabiliteit van alle gegevenspunten op de regressielijn. Het is belangrijk om zowel normen als monsters te koken na het toevoegen van antroposine voor dezelfde hoeveelheid tijd. Het is altijd belangrijk om een positieve controle met een bekend cellulosegehalte op te nemen. Voor een effectieve reproduceerbaarheid van de gegevens moet de hele procedure nauwkeurig worden gevolgd, inclusief oplossingsvoorbereiding (normen, standaardcurve en Updegraff-reagens).
Onlangs is cellulose onderzocht voor niet-textieltoepassingen zoals celluloseaerosols, computeronderdelen en cellulose-ethanol32,33; daarom zal deze methode in de toekomst brede toepassingen hebben. Wetenschappelijke vooruitgang wordt geboekt door incrementele vooruitgang in het begrijpen van concepten, het voorstellen van alternatieve hypothesen en het leveren/weerleggen van de bestaande kennis. Een vergelijkbare vooruitgang is te zien in de ontwikkeling van een betrouwbare methode voor de schatting van het cellulosegehalte in de biomassa van de installatie. De celwand is een complexe matrix en de Updegraff-methode elimineert niet-cellulosefracties uit zuivere cellulose op een sequentiële manier, wat leidt tot een nauwkeurige schatting van het cellulosegehalte in de plantaardige biomassa. Verder maakte de eenvoudige colorimetrische methode die is ontwikkeld voor de schatting van het cellulosegehalte door het meten van de glucoseconcentratie deze methode zeer aanpasbaar en op grote schaal gebruikt. In de huidige studie waren de cellulosegegevens consistent tussen verschillende biologische replica's van de monsters die uit één lijn werden verzameld. Het suggereert dus dat de gegevens die door deze methode worden geproduceerd consistent, betrouwbaar, reproduceerbaar en gemakkelijk zijn om het cellulosegehalte te meten door middel van eenvoudige colorimetrische test.
De Updegraff-methode is de meest gebruikte methode voor de celluloseschatting. Met de recente uitbreiding van de industriële toepassing van cellulose zoals voedsel, hout, papier, vezels, biobrandstoffen, kleding, cosmetica en farmaceutica, is een nauwkeurige schatting van het cellulosegehalte van de plantaardige biomassa cruciaal voor verschillende toepassingen. Hoewel dit de meest gebruikte methode is voor het schatten van cellulose, is het belangrijk om verschillende voorzorgsmaatregelen te nemen om reproduceerbare gegevens te verkrijgen. De biomassamonsters moeten op dezelfde grootte worden gemalen om een nauwkeurige en reproduceerbare schatting van het cellulosegehalte te verkrijgen. Voorzichtigheid is aanwezig bij het genereren van de glucosestandaardcurve. De glucosenormen die voor het preparaat van de glucosestandaardcurve worden gebruikt, moeten worden verhoogd of verlaagd op basis van de monsterabsorpte waarden, zodat de onbekende concentraties binnen het bereik van de glucoseconcentraties vallen die worden gebruikt om de standaardcurve voor te bereiden. Zo niet, dan kunnen de m- en c-waarden variëren, wat resulteert in een onjuiste schatting van het kristallijne cellulosegehalte. Een nieuwe bereiding van 0,2 % anthrone voor elke partij monsters is een andere cruciale stap van de Updegraff-methode. Het is van essentieel belang om vers bereid 0,2 % anthrone te gebruiken voor een nauwkeurige schatting van het cellulosegehalte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen belangenverstrengeling hebben.
Acknowledgments
We danken het Department of Plant &Soil Science en Cotton Inc. voor hun gedeeltelijke steun aan deze studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Fisher Chemical | A18-500 | Used in the protocol |
| Anthrone | Sigma Aldrich | 90-44-8 | For colorimetric assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | For centrifugation |
| Chloroform | Mallinckrodt | 67-66-3 | Used in the protocol |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | 6381-92-6 | Used in the protocol |
| Ethanol | Millipore Sigma | EM-EX0276-4S | Used in the protocol |
| Filter paper | Whatman | 1004-090 | Positive control |
| Glacial acetic acid | Sigma | SKU A6283 | Used in the protocol |
| Heat block/ ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 13527550 | For controlled temperatures |
| Incubator | Fisherbrand | 150152633 | Used for drying plant sample |
| Measuring Scale | Mettler Toledo | 30243386 | For specific quantities |
| Methanol 100 % | Fisher Chemical | A412-500 | Used in the protocol |
| Microplate (96 well) | Evergreen Scientific | 222-8030-01F | For anthrone assay |
| Nitric acid | Sigma Aldrich | 695041 | Used in the protocol |
| Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes | BioSpec Products | 10831 | For high temperatures |
| Spectrophotometer(Multimode Detector) | Beckmancoulter DTX880 | 1000814 | For measuring absorbances |
| Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill | Spex Sample Prep | 68-701-15 | For grinding plant tissues into fine powder |
| Sulphuric acid | J.T.Baker | 02-004-382 | Used in the protocol |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | 151-21-3 | Used in the PSB buffer |
| Tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | Used in the protocol |
| Tris Hydrochloride | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | Used in the PSB buffer |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977 | Used in the protocol |
| Vacuum dryer (vacufuge plus) | Eppendorf | 22820001 | For drying samples |
| Vortex mixer | Fisherbrand | 14-955-151 | For mixing |
| Waterbath | Thermoscientific | TSGP02PM05 | For temperature controlled conditions at specific steps |
| Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12A | Used in the protocol |
References
- Somerville, C. Cellulose synthesis in higher plants. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 53-78 (2006).
- Balasubramanian, V. K., Rai, K. M., Thu, S. W., Hii, M. M., Mendu, V. Genome-wide identification of multifunctional laccase gene family in cotton (Gossypium spp.); expression and biochemical analysis during fiber development. Scientific Reports. 6, 34309 (2016).
- Mendu, V., et al. Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production. Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).
- Kraszkiewicz, A., Kachel-Jakubowska, M., Lorencowicz, E., Przywara, A. Influence of cellulose content in plant biomass on selected qualitative traits of pellets. Agriculture and Agricultural Science Procedia. 7, 125-130 (2015).
- Jordan, D. B., et al. Plant cell walls to ethanol. Biochemical Journal. 442, 241-252 (2012).
- Brett, C. T. Cellulose microfibrils in plants: biosynthesis, deposition, and integration into the cell wall. International Review of Cytology. 199, 161-199 (2000).
- Li, S., et al. Cellulose synthase complexes act in a concerted fashion to synthesize highly aggregated cellulose in secondary cell walls of plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 11348-11353 (2016).
- Polko, J. K., Kieber, J. J. The regulation of cellulose biosynthesis in plants. The Plant Cell. 31, 282-296 (2019).
- Brown, R. M. The biosynthesis of cellulose. Journal of Macromolecular Science, Part A. 33, 1345-1373 (1996).
- Gautam, S. P., Bundela, P. S., Pandey, A. K., Jamaluddin, M. K., Sarsaiya, A., Sarsaiya, S. A review on systematic study of cellulose. Journal of Applied and Natural Science. 2, (2010).
- Coughlan, M. P. Enzymic hydrolysis of cellulose: An overview. Bioresource Technology. 39, 107-115 (1992).
- Robak, K., Balcerek, M. Review of second generation bioethanol production from residual biomass. Food Technology and Biotechnology. 56, 174-187 (2018).
- Cross, C. F., Bevan, E. J. Cellulose and chemical industry. Journal of the Society of Chemical Industry. 27, 1187-1193 (1908).
- Paloheimo, L., Eine, H., Kero, M. L. A method for cellulose determination. Agricultural and Food Science. 34, (1962).
- Kurschner, K., Hanak, A., Diese, Z. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung. 59, 448-485 (1930).
- Norman, A. G., Jenkins, S. A new method for the determination of cellulose, based upon observations on the removal of lignin and other encrusting materials. Biochemical Journalournal. 27, (1933).
- Kiesel, A., Semiganowsky, N. Cellulose-Bestimmung durch quantitative verzuckerung. Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft (A and B Series). 60, 333-338 (1927).
- Waksman, S. A. S., et al. A system of proximate chemical analysis of plant materials. Industrial Engineering Chemistry and Analytical Edition. 2, 167-173 (1930).
- Salo, M. -L. Determination of carbohydrates in animal foods as seven fractions. Agricultural and Food Science. , 32-38 (1961).
- Giger-Reverdin, S. Review of the main methods of cell wall estimation: interest and limits for ruminants. Animal Feed Science and Technology. 55, 295-334 (1995).
- Updegraff, D. M. Semimicro determination of cellulose inbiological materials. Analytical Biochemistry. 32, 420-424 (1969).
- Viles, F. J., Silverman, L. Determination of starch and cellulose with anthrone. Analytical Chemistry. 21, 950-953 (1949).
- Scott, T. A., Melvin, E. H. Determination of dextran with anthrone. Analytical Chemistry. 25, 1656-1661 (1953).
- Kumar, M., Turner, S. Protocol: a medium-throughput method for determination of cellulose content from single stem pieces of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 11, 46 (2015).
- Yemm, E. W., Willis, A. J. The estimation of carbohydrates in plant extractsby anthrone. Biochemical Journal. 57, 508-514 (1954).
- Houston, K., Tucker, M. R., Chowdhury, J., Shirley, N., Little, A. The plant cell wall: A complex and dynamic structure as revealed by the responses of genes under Stress conditions. Frontiers in Plant Science. 7, (2016).
- Jiang, G., et al. Biomass extraction using non-chlorinated solvents for biocompatibility improvement of polyhydroxyalkanoates. Polymers. 10, 731 (2018).
- Li, T., et al. A saponification method for chlorophyll removal from microalgae biomass as oil feedstock. Marine Drugs. 14, 162 (2016).
- Wiltshire, K. H., Boersma, M., Möller, A., Buhtz, H. Extraction of pigments and fatty acids from the green alga Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae). Aquatic Ecology. 34, 119-126 (2000).
- Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. Comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part II: carbohydrates. Journal of Visualized Experiments. (1837), (2010).
- Haigler, C., Betancur, L., Stiff, M., Tuttle, J. Cotton fiber: a powerful single-cell model for cell wall and cellulose research. Frontiers in Plant Science. 3, (2012).
- Spirk, S., Nypelö, T., Kontturi, E. Editorial: Biopolymer thin films and coatings. Frontiers in Chemistry. 7, (2019).
- Long, L. -Y., Weng, Y. -X., Wang, Y. -Z. Cellulose aerogels: Synthesis, applications, and prospects. Polymers. 10, 623 (2018).
