Summary
שיטת Updegraff היא השיטה הנפוצה ביותר להערכת תאית. המטרה העיקרית של הדגמה זו היא לספק פרוטוקול Updegraff מפורט להערכת תכולת תאית בדגימות ביומסה צמחית.
Abstract
תאית היא הפולימר הנפוץ ביותר על פני כדור הארץ שנוצר על ידי פוטוסינתזה והמרכיב העיקרי נושא העומס של קירות התא. קיר התא ממלא תפקיד משמעותי בצמיחה ובהתפתחות הצמח על ידי מתן כוח, קשיחות, קצב וכיוון של צמיחת תאים, תחזוקת צורת תאים והגנה מפני לחצים ביוטיים ואביוטיים. דופן התא מורכבת בעיקר תאית, ליגנין, hemicellulose ופקטין. לאחרונה קירות תאי הצמח היו ממוקדים לייצור דלק ביולוגי וביו-אנרגיה מהדור השני. באופן ספציפי, רכיב תאית של דופן התא הצמח משמש לייצור אתנול צלולוסי. הערכה של תוכן תאית של ביומסה היא קריטית למחקר בסיסי ויישומי של דופן התא. שיטת Updegraff היא פשוטה, חזקה, ואת השיטה הנפוצה ביותר להערכת תוכן תאית גבישית של ביומסה צמחית. האלכוהול מסיסים תאים גולמיים החלק על הטיפול עם ריאגנט Updegraff מבטל את שברי hemicellulose ו ליגנין. מאוחר יותר, חלק תאית עמיד ריאגנט Updegraff נתון לטיפול חומצה גופרתית כדי הידרוליזה הומופולימר תאית ליחידות גלוקוז מונומרי. קו רגרסיה מפותח באמצעות ריכוזים שונים של גלוקוז ומשמש להערכת כמות הגלוקוז המשתחרר על הידרוליזה תאית בדגימות הניסוי. לבסוף, התוכן תאית מוערך בהתבסס על כמות מונומרים גלוקוז על ידי בדיקת אנתרון צבעוני.
Introduction
תאית היא המרכיב העיקרי נושא העומס של קירות התא, אשר קיים הן בקירות התא הראשי והן בקירות התא המשני. דופן התא היא מטריצה חוץ-תאית המקיפה תאי צמחים ומורכבת בעיקר מחלבוני תאית, ליגנין, המיצלולוז, פקטין ומטריצה. כשליש מהביומסה של הצמחים היא תאית1 והיא ממלאת תפקידים משמעותיים בצמיחה ובהתפתחות הצמח על ידי מתן כוח, קשיחות, קצב וכיוון של צמיחת תאים, תחזוקת צורת תאים והגנה מפני גורמי לחץ ביוטיים ואביוטיים. סיבי כותנה מכילים 95% תאית2 תוכן, בעוד עצים מכילים 40% עד 50% של תאית בהתאם למין הצמח וסוגי איברים3. התאית מורכבת מיחידות חוזרות של צ'לוביוז, מפרק של שאריות גלוקוז המחוברות על ידי β-1,4 קשרים גליקופידיים4. אתנול צלולוסי מופק מן הגלוקוז נגזר תאית נוכח בקירות תא הצמח5. סיבים צלולוסיים מורכבים ממספר סיבי מיקרו שבהם כל סיב מיקרו פועל כיחידת ליבה עם מונומרים גלוקוז 500-150001,6. homopolymer תאית מסונתז על ידי קרום פלזמה מוטבע קומפלקסים סינתאז תאית (CSC)1,7. חלבוני סינתאז תאית בודדים A (CESA) מסנתזים שרשראות גלוקן ושרשראות הגלוקן הסמוכות מחוברות באמצעות קשרי מימן ליצירת תאית גבישית1,8. תאית קיימת במספר צורות גבישיות עם שתי צורות דומיננטיות, תאית Iα ו תאית Iβ כצורות מקוריות9. בצמחים גבוהים יותר, תאית קיימת בצורת תאית Iβ בעוד תאית הצמח התחתון קיים בצורת Iα10,11. בסך הכל, התאית ממלאת תפקיד משמעותי בהקניית כוח ונוקשות לקירות תאי הצמח.
דלקים ביולוגיים מהדור הראשון מיוצרים בעיקר מעמילן תירס, סוכרי קנים וסוכרי סלק, שהם מקורות מזון, ואילו דלקים ביולוגיים מהדור השני מתמקדים בייצור דלק ביולוגי מחומר קיר תא ביומסה שאינו מזון12. הערכה מדויקת של תכולת תאית גבישית חשובה לא רק למחקר בסיסי על ביוסינתזה תאית ודינמיקה של דופן התא, אלא גם למחקר יישומי של דלק ביולוגי ומוצרי ביו. שיטות שונות פותחו ואופטימיזציה להערכת תאית בביומסה הצמחית, ושיטת Updegraff היא השיטה הנפוצה ביותר להערכת תאית. השיטה המדווחת הראשונה להערכת תאית הייתה על ידי קרוס ובבן בשנת 190813. השיטה התבססה על העיקרון של כלור חלופי ומיצוי על ידי נתרן גופרתי. עם זאת, תאית שהושגה על ידי המקורי, כמו גם פרוטוקולים שונה של שיטת קרוס בוואן הראה זיהום של שברים קטנים של ליגנין בנוסף כמות משמעותית של xylans ו mannans14. למרות מספר שינויים להסרת ליגנין והמיצלולוזים מהשבר התאי, שיטת Cross-Bevan שמרה על כמות ניכרת של מנאנים יחד עם תאית. מאוחר יותר, השיטה של Kurschner פותחה על ידי שימוש בחומצה חנקתית ואתנול כדי לחלץ תאית15. שיטה זו קבעה כי סך ליגנין ו 75% של pentosans הוסרו אבל התוצאות תאית האמיתית היו זהים לאלה המוערכים על ידי שיטת כלור של קרוס בוואן. שיטה נוספת (נורמן וג'נקינס) פותחה על ידי שימוש במתנול-בנזן, נתרן סולפט ונתרן היפוכלוריט לחילוץ תאית16. שיטה זו גם שמרה על חלק קטן של ליגנין (3%) וכמויות משמעותיות של פנטוסנים המובילות להערכת תאית מדויקת. מאוחר יותר, Kiesel ו Semiganowsky השתמשו בגישה שונה כדי הידרוליזה תאית באמצעות 80% מרוכז חומצה גופרתית, ואת סוכרים מופחתים הידרוליזה הוערכו על ידי השיטה של ברטרנד17. שתי השיטות, של וקסמן וסטיבנס18 וסאלו14,19 שפותחו על בסיס השיטה של קיזל וסמיגנובסקי, הניבו גם 4-5% פחות תוכן תאית בהשוואה לשיטותקודמות 20.
שיטת Updegraff היא השיטה הנפוצה ביותר להערכת תכולת תאית גבישית. שיטה זו תוארה לראשונה על ידי Updegraff למדידת תאית בשנת 196921. שיטת Updegraff משלבת את שיטת קורשנר (שימוש בחומצה חנקתית), שיטות קיזל וסמינובסקי (הידרוליזה של תאית לתוך מונומרים של גלוקוז באמצעות חומצה גופרתית) עם כמה שינויים, ואת מבחני האנתרון של ויילס וסילברמן להערכת צבעים פשוטה של גלוקוז ותכולת תאית גבישית22. העיקרון של שיטה זו הוא השימוש בחומצה אצטית וחומצה חנקתית (מגיב Updegraff) כדי לחסל hemicellulose ו ליגנין מרקמות הצמח הומוגנית, אשר משאיר תאית עמידה חומצה אצטית / חנקתית לעיבוד נוסף והערכת15. תאית עמידה חומצה אצטית / חנקתית מטופלת עם 67% חומצה גופרתית כדי לשבור את תאית לתוך מונומרים גלוקוז מונומרים גלוקוז שוחרר מוערך על ידי anthrone assay21,23. מספר שינויים בשיטת Updegraff המקורית שימשו כדי לפשט את ההליך ואת הערכת תאית על ידי anthrone assay24. באופן כללי, ניתן לחלק שיטה זו לחמישה שלבים. בשלב הראשון, החומר הצמחי מוכן. בשלב השני, קיר התא הגולמי מופרד מן הביומסה הכוללת, כמו תאית היא המרכיב העיקרי של קירות התא הצמח. מאוחר יותר, בשלב השלישי, התאית מופרדת מרכיבי דופן התא הלא צלולוסי על ידי טיפול עם ריאגנט Updegraff. בשלב הרביעי, תאית עמידה חומצה אצטית / חנקתית מחולק מונומרים גלוקוז על ידי טיפול חומצה גופרתית. טיפול חומצה גופרתית של תוצאות תאית היווצרות של תרכובות 5-hydroxymethylfurfural מהתגובה של מונומרים גלוקוז עם חומצה גופרתית. לבסוף, בשלב האחרון, האנתרון יוצר קומפלקס כחול ירקרק על ידי רותחים עם תרכובת furfural שנוצר בשלב הקודם25. שיטה קוורימטרית מבוססת אנתרון זו שימשה לראשונה בשנת 1942 על ידי דרייווד. אנתרון הוא צבע המזהה תרכובות פורפורליות של מוצרים מיובשים פנטוז ו hexose כגון 5-hydroxymethylfurfural, בתנאים חומציים. תגובה עם הקסוס מייצרת צבע אינטנסיבי ותגובה טובה יותר בהשוואה pentoses25. כמות הגלוקוז המאוגד נמדדת על ידי ספיגת ספקטרופוטומטר ב 620 ננומטר ואת עוצמת קומפלקס כחול ירקרק הוא פרופורציונלי ישירות לכמות הסוכר במדגם. ערכי הספיגה הנמדדים הושוו לקו רגרסיה של עקומת גלוקוז סטנדרטית לחישוב ריכוז הסוכר של המדגם. תכולת הגלוקוז הנמדדת שימשה להערכת תכולת תאית של ביומסה הצמח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה ניסיונית
- טוחנים חומר צמחי מיובש לאבקה דקה.
- מאגר סולובליזציה של חלבונים (PSB): הכינו פתרונות מלאי של 1 M Tris (pH 8.8), 0.5 M חומצה אתילנדיאמיאנטטראקטית (EDTA) (pH 8.0) ומובלעת אותן אוטומטית. הפוך מאגר PSB טרי מפתרונות מלאי אלה עם ריכוזים סופיים של 50 mM Tris, 0.5 מ"מ EDTA ו 10% נתרן דודציל סולפט (SDS) במים סטריליים.
- הכן 100 מ"ל של 70% אתנול (v / v): 70 מ"ל של 100% אתנול ו 30 מ"ל של מים סטריליים.
- הכינו 100 מ"ל של מתנול: כלורופורם ביחס של 1:1 (מתנול 50 מ"ל ו-50 מ"ל כלורופורם).
- הכן 82.5 מ"ל של ריאגנט Updegraff. הוסף 75 מ"ל של 80% חומצה אצטית ל 7.5 מ"ל של חומצה חנקתית, כך היחס האולטימטיבי של מים: חומצה אצטית: חומצה חנקתית היא 2:8:1 (v / v). כדי להכין 80% חומצה אצטית, להמיס 80 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית ב 20 מ"ל של מים סטריליים (v / v).
- הכינו מלאי טרי של תמיסת גלוקוז 1 מ"ג/מ"ל. ממיסים 10 מ"ג ג גלוקוז ב-10 מ"ל מים (w/v).
- כדי להכין 100 מ"ל של 67% חומצה גופרתית (v / v), להוסיף 67 מ"ל של חומצה גופרתית מרוכזת ל 33 מ"ל של מים. תמיד להשתמש בבקבוק זכוכית ולהוסיף חומצה לאט למים. שלב זה הוא אקסותרמי (משחרר חום). לפיכך, להכין פתרון זה על קרח להתקרר במקרר לפחות 2 שעות לפני השימוש.
- הכינו אנתרון טרי של 0.2% (w/v) לכל אצווה של דגימות ניסיוניות. שוקלים 0.2 גרם של אנתרון ומתמוססים ב-100 מ"ל של חומצה גופרתית מרוכזת ומצוננת מראש בבקבוק זכוכית עטוף בנייר אלומיניום. יש לשמור במקרר למשך 1-2 שעות לפני השימוש.
הערה: חומצה גופרתית מרוכזת ומצמררת מראש במקרר ביום הניסוי, והכנה טרייה של אנתרון מומלצת מאוד להערכה מדויקת של תכולת הגלוקוז.
2. הכנת חומר ביומסה צמחית
- לאסוף דגימות ביומסה צמחית מקווי ניסוי כותנה בני חודשיים הגדלים בחממה עם אותם תנאי צמיחה, אותו שלב התפתחות, אותה תנוחה של הצמחים ואותו סוג של רקמה (עלה /גזע/שורש).
הערה: לאסוף מינימום של שלושה משכפלים ביולוגיים עבור כל מדגם. לשטוף אותם ביסודיות עם מים כדי להסיר את כל הלכלוך מרקמת השורש. - רקמת שורש יבשה באוויר למשך יומיים על מגבות נייר בטמפרטורת החדר להסרת תכולת הלחות (איור 1).
הערה: רקמות רצויות יבשות לאוויר להערכת תאית למניעת זיהום פטרייתי. - מקם את דגימות הבסיס במיכלים בודדים. ואז לתייג ולייבש אותם באינקובטור ב 49 °C (69 °F) במשך 10 ימים(שולחן החומרים).
הערה: לחלופין, מייבש הקפאה יכול לשמש לייבוש רקמת הצמח בפחות זמן (1 או 2 ימים) מבלי לגרום לשינויים כימיים בחומר הביומסה של הצמח. - חותכים את הדגימות המיובשות לחתיכות קטנות, מקפיאים אותן בחנקן נוזלי וטוחנים לאבקה דקה אחידה באמצעות מרגמה ועלי, טחנת מקפיא או מטחנת ביומסה(איור 1).
הערה: טחנת המקפיא שימשה בקצב של 10 cps במשך 3 מחזורים. - לאסוף את הרקמה המוארקת (איור 2) ולהמשיך עם חילוץ דופן התא.
הערה: ניתן להשהות את התהליך בשלב זה על ידי אחסון הדגימות במיכלים אטומים בטמפרטורת החדר.
3. הפקת קירות תאים גולמיים מביומסה צמחית
הערה: קירות תאי הצמח מכילים תאית, ליגנין, רכיבים שאינם תאית, פקטין, חלבוני מטריצה, תרכובות פנוליות ומים26. מאז תאית קיים בקירות התא, הצעד הראשון הוא להפריד רכיב קיר התא מרכיבי קיר שאינם תאים של ביומסה הצמח26.
- תווית ולשקול בודדים ריקים 2 צינורות מ"ל לפני תחילת תהליך החילוץ קיר התא.
- רשום לעצמך משקולות צינור ריקות במחברת מעבדה לפני שתמשיך הלאה.
- שוקלים 20 מ"ג של אבקת רקמה משלב 2.5 ומעבירים אותה לצינורות 2 מ"ל שקלו מראש ומתייגים אותם.
- יש להוסיף 1 מ"ל של מאגר סולובליזציה של חלבונים (PSB) (50 מ"מ טריס הידרוכלוריד (HCl) pH חיץ 8.8, 0.5 מ"מ EDTA ו-10% נתרן דודציל סולפט (SDS) כדי לסלוביליזציה של חלבונים. מערבולת וצנטריפוגה ב 25,200 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant ולשמור את גלולה.
הערה: ניתן לשמור את ה-supernatant אם יש צורך לנתח את רכיב החלבון. - חזור על שלב 3.4 פעמיים נוספות.
- לכדור השמור, מוסיפים 1 מ"ל של מים מזוקקים ומערבולת. צנטריפוגה ב 25,200 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ולהסיר את supernatant.
- חזור על שלב 3.6 פעמיים נוספות.
- הוסף 1 מ"ל של 70% אתנול גלולה הציל, מערבולת לחמם אותו ב 70 מעלות צלזיוס במשך 1 שעות באמבט מים / בלוק חום כדי להסיר רכיבים מסיסים עמילן מן הדגימות. וורטקס וצנטריפוגה ב 25,200 x g במשך 5 דקות ב RT. להשליך את supernatant ולשמור את גלולה.
- חזור על שלב 3.8 פעם נוספת.
- לכדור להוסיף 1 מ"ל של 100% מתנול ומערבולת. צנטריפוגה ב 25,200 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ולהסיר את supernatant.
- הוסף 1 מ"ל של כלורופורם / מתנול (כלורופורם ומתנול ביחס 1:1) לכדור ומערבולת. צנטריפוגה ב 25,200 x g במשך 5 דקות ב RT ולהסיר את supernatant. התוספת של מתנול וכלורופורם ממס solubilizes ומסיר את שבר השומנים מן הביומסה27.
- לכדור, להוסיף 1 מ"ל של 100% אצטון ומערבולת. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. צנטריפוגה ב 25,200 x g במשך 5 דקות ב RT ולהסיר את supernatant. אצטון מסיר פיגמנטים כגון כלורופיל וחומצות שומן חופשיות מהביומסה28,29.
- יבש את גלולה ב 37 מעלות צלזיוס לילה או להמשיך עוד יותר על ידי ייבוש ואקום.
הערה: גלולה מיובשת היא קיר התא הגולמי המשמש להערכת תאית גבישית. ניתן להשהות את התהליך בשלב זה או להמשיך הלאה באמצעות מייבש ואקום לייבוש דגימות.
4. טיפול עם ריאגנט Updegraff (חומצה אצטית וחנקתית) כדי להסיר רכיבים שאינם צלולוסיים
הערה: הפרוטוקול כולל שימוש בחומצות וכימיקלים אחרים. ללבוש ציוד מגן אישי (PPE) לאורך כל התהליך.
- למדוד 5 מ"ג של גלולת קיר תא גולמי מיובש לתוך צינור טרי 2 מ"ל בורג כתרים. שימו לב למשקל המדויק (איור 3)30.
- כלול פקד חיובי בשלב זה. השתמש 2 מ"ג של נייר מסנן (טבלה של חומרים) כפקד חיובי המניב 80% תוכן תאית.
- הוסף 1.5 מ"ל של מגיב Updegraff ל 5 מ"ג שקל של תמצית דופן התא ושליטה חיובית. מערבבים על ידי מערבולת.
הערה: יש לעבד את הפקד החיובי באותו אופן כמו דגימות הניסוי משלב זה ואילך. צעד זה צריך להתבצע מכסה המנוע אדים עם ציוד מגן אישי נאות (PPE).
התראה: שלב זה צריך להתבצע בצינורות כובע בורג כדי למנוע התזה של מדגם ו popping של הצינורות. יש לכלול שלושה משכפלים ביולוגיים של כל דגימה יחד עם שלושה שכפולים לשליטה חיובית. - מחממים את ההשעיה ב 100 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות באמבט מים רותחים ומצננים על ספסל במשך 10 דקות. צנטריפוגה ב 25,200 x g במשך 10 דקות ב RT. הסר את supernatant על ידי צנטריפוגה ולשמור את גלולה.
הערה: הפסולת שנוצרת צריכה להיאסף בנפרד עבור ממיסים אורגניים, חומצה גופרתית, ריאגנט Updegraff (חומצה אצטית וחומצה חנקתית). פסולת עם חומצה אצטית וחומצה חנקתית צריכה להישמר בטמפרטורות קרירות עם כובעים מאווררים ומעולם לא מעורבב עם כל ממיסים אורגניים אחרים וחומצות אחרות כדי למנוע כל פיצוץ. - מוסיפים 1 מ"ל מים לכדור. צנטריפוגה ב 25,200 x g במשך 10 דקות ב RT. להסיר 500 μL של supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של אצטון לצינור.
- צנטריפוגה ב 25,200 x g במשך 5 דקות ב RT. הסר 1 מ"ל של supernatant, ולהוסיף 1 מ"ל של אצטון לצינור וצנטריפוגה ב 25,200 x g במשך 5 דקות ב RT.
- לאחר צנטריפוגה, להסיר את כל supernatant ולהשעות את גלולה ב 1 מ"ל של אצטון. דגירה את הצינורות בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות להסתובב ב 25,200 x g במשך 5 דקות ב RT.
- להשליך את supernatant ולשמור את גלולה. יבש את גלולה ב 37 °C (60 °F) לילה (איור 3).
הערה: ניתן להשהות את התהליך בשלב זה או להמשיך להשתמש ביובש ואקום לייבוש ולהמשיך לשלב הבא.
5. הידרוליזה של תאית על ידי חומצה כדי לייצר יחידות מונומר גלוקוז
- מוסיפים 1 מ"ל של 67% חומצה גופרתית לכדור המיובש. וורטקס לערבב את גלולה לחלוטין בחומצה.
- לנער צינורות בטמפרטורת החדר במשך 1 שעות כדי להמיס את גלולת תאית ב 67% חומצה גופרתית.
הערה: כחלופה, solubilization של גלולת תאית ב 67% חומצה גופרתית ניתן לשפר על ידי sonication של כל מדגם במשך 10 דקות לאחר 30 דקות של דגירה בשייקר. לאחר sonication, דגימות ניתן לדגיר מחדש בשייקר ב RT. עם זאת, ראינו מסיסות מוחלטת של גלולה תאית ללא sonication כאשר אנו מתחילים עם 5 מ"ג של תמצית דופן התא הגס (איור 3). הליך זה עבד היטב עבור דגימות ביומסה צמחית שונות3.
6. מדידת תכולת הגלוקוז על ידי בדיקת אנתרון והערכת תכולת תאית
- בשלב זה, התאית היא בצורה של מונומרים גלוקוז חינם. לקבוע את כמות תאית על ידי מדידת כמות הגלוקוז הנוכחי במדגם על ידי ספקטרופוטומיה.
- קח 10 μL של המדגם משלב 5 ולהוסיף אותו 490 μL של מים מזוקקים סטריליים כדי להפוך דילול של כל מדגם ל 500 μL. וורטקס תערובת מדוללת של מדגם ומים במשך 10 שניות.
- מוסיפים 1 מ"ל של 0.2% ריאגנט אנתרון טרי מוכן לכל צינור ומערבבים מיד על ידי מערבולת.
- מרתיחים דגימות ב 100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ומצננים את הצינורות על הקרח במשך 5 דקות. העבר 200 μL של כל מדגם בשלוש בארות של צלחת 96 גם. טען את צלחת הבאר 96 לתוך ספקטרופוטומטר כדי למדוד את הספיגה ב 620 ננומטר.
הערה: לרתיחה בטמפרטורה גבוהה, יש להשתמש בצינורות מכוסי בורג כדי למנוע התזת כימיקלים מזיקים ולמנוע אובדן דגימות.
7. הכנת עקומת גלוקוז סטנדרטית
- להכנת תקן גלוקוז, הכינו מלאי טרי של 1 מ"ג/מ"ל גלוקוז על ידי המסת 10 מ"ג גלוקוז ב-10 מ"ל מים מזוקקים סטריליים. הוסף פתרון מלאי זה של 1 מ"ג / מ"ל במרווחים μL 20 (0, 20, 40, 60, 80,100,120,140, 160, 180 μL) למים מזוקקים סטריליים (נפח כולל 1 מ"ל) להכנת תקני גלוקוז הנעים בין 0 מיקרוגרם ל-180 מיקרוגרם/מ"ל ריכוזים(איור 3). וורטקס כל תקן גלוקוז לאחר הוספת מים סטריליים.
- מתוך אלה 10 ריכוזים שונים, aliquot 500 μL של כל ריכוז גלוקוז לתוך צינור טרי 2 מ"ל בורג כתרים.
- מוסיפים 1 מ"ל של אנתרון טרי מוכן 0.2% לכל צינור ומערבבים מיד על ידי מערבולת. דגירה על קרח ומרתיחים ב 100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ואחריו דגירה על הקרח במשך 5 דקות23.
- העבר 200 μL של כל תקן לשלוש בארות בצלחת 96 באר מיקרו טיטר לשלושה שכפולים טכניים ומדוד את הספיגה ב-620 ננומטר(איור 3).
- פיתח עקומת גלוקוז סטנדרטית על-ידי התוויית ריכוזי גלוקוז שונים (0 עד 180 מיקרוגרם/מ"ל) כנגד ערכי ספיגה מנורמלים ב- 620 ננומטר (איור 7). השתמש בקו הרגרסיה Y= mx+c שנוצר מערכי הספיגה כדי לחשב את תוכן התאית בדוגמאות המוכנות.
הערה: תקני גלוקוז חייבים להיות מוכנים טריים לכל קבוצה של ניסויים. יש להגדיל את ריכוז הגלוקוז אם ערכי ה- OD גבוהים מדי / נמוכים מדי, כך שערכים אלה נמצאים בטווח של ערכי ספיגת העקומה הסטנדרטיים. קו הרגרסיה יוצר ערכי m ו- c שונים בהתבסס על תקני הסוכר המשמשים עבור כל אצווה של דגימות. מערבבים צינורות מיד לאחר התוספת של אנתרון23. אנתרון, דגימות מדוללות וסטנדרטים מוכנים תמיד נשמרו קרים עד שמדרון האנתרון בוצע בגלל האופי האקסותרמי של תגובה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
צמחים כותנה גדל בבית הירוק נבחרו למחקר זה. שני קווים ניסיוניים שונים של כותנה נבחרו לניתוח השוואתי של תכולת תאית. עבור כל קו ניסיוני, רקמת השורש נאספה משלושה משכפלים ביולוגיים. סך של 500 מ ג של רקמה היה הומוגני ו 20 מ ג של זה שימש להפקת דופן התא הגולמי. מאוחר יותר, 5 מ"ג של תמצית דופן התא הגולמי שימש לטיפול ריאגנט Updegraff כדי להסיר hemicellulose ו ליגנין מן תאית. התאית המטוהרת עברה הידרוליזה על ידי טיפול בחומצה גופרתית כדי לפרק את התאית ליחידות גלוקוז. התוצאות של קריאות ספיגה ב 620 ננומטר (טבלה משלימה 1) שימשו למדידת ריכוז גלוקוז ולהערכת תוכן תאית על ידי מבחני האנתרון. ערכי הספיגה הממוצעים של שלושה משכפלים טכניים נורמלו על ידי חיסור ערך הספיגה הריק של ריכוז הגלוקוז 0 מיקרוגרם. עקומת תקן הסוכר נוצרה באמצעות גרף עמודות מפוזר (איור 4).
קו הרגרסיה וכתוצאה מכך, y = mx + c מעקום סטנדרטי זה, משמש לחישוב ריכוז גלוקוז לא ידוע בדגימות הבדיקה שחולצו באמצעות קריאות הספיגה המנורמלות. לחישוב x (ריכוז הגלוקוז הלא ידוע ב- μg/μL), נעשה שימוש בנוסחה (x = ספיגה מנורמלת-c/m). ערכי c ו- m מקו הרגרסיה של עקומת הגלוקוז הסטנדרטית (R2 = 0.99) שימשו למדידת ריכוז הגלוקוז ב מיקרוגרם / μL. לאחר מכן ערך זה מחולק על ידי גורם דילול של 2 כמו נפח הסופי הוא 500 μL ומחולק עוד יותר על ידי נפח מדגם 10 μL כדי למדוד את ריכוז הגלוקוז מיקרוגרם / μL. מאז הערך המחושב הוא עבור 5 מ"ג של תמצית דופן התא, הוא מחולק עוד יותר על ידי 5 או עם משקל דופן התא הגולמי בהתאמה המשמש עבור כל מדגם ניסיוני כדי לקבל ריכוז גלוקוז לכל מ"ג. הערך מחולק עוד יותר על ידי 1.1 כדי לפצות על המים שנרכשו בתהליך של הידרוליזה (גלוקוז יש משקל מולקולרי של 180 מולקולת מים יש משקל מולקולרי של 18 ומכאן המים שנוצרו בתהליך של שחרור מונומרים גלוקוז הוסר על ידי חלוקת גורם הלחות, 1.1). הערך המתוצא יוכפל ב- 100 כדי לחשב את התוכן התאי הגבישי באחוזים (טבלה משלימה 1).
התוצאות של התוכן תאית להראות כי הם עקביים בין השכפולים הביולוגיים, מה שמרמז על הדיוק הטכני של שיטת Updegraff. יתר על כן, ההבדלים הותוו באמצעות גרפים דו-מימדיים. תוצאות אלו הראו את הבדלי התוכן התאיים במספרי המדגם הניסיוניים בהשוואה 1 ו- 2 (איור 4). מדגם 1 מראה 43.4% בעוד מדגם 2 מראה 28.12%, דבר המצביע על כך ששיטה זו יכולה להבחין בהבדלים בין הדגימות הניסיוניות. מבחן T לתלמידים יושם ברמת 95% משמעות כדי לבחון את ההבדלים המשמעותיים ביניהם.
איור 1: הכנת ביומסה של צמח הכותנה להערכת תכולת תאית בשורשים. (A)צמחי חממה שגודלו נמשכו בעדינות מהאדמה ונשטפו ביסודיות במים. רקמת השורש של הצמח הופרדה, נשמרה על מגבות הנייר והורשה להתייבש באוויר במשך יומיים. לאחרמכן רקמת השורש הועברה למכלים המסומנים בנפרד והורשה להתייבש באינקובטור ב-49 מעלות צלזיוס למשך -10 ימים. (ג)הרקמה המיובשת נחתכה לחתיכות קטנות, קפואה בחנקן נוזלי, טעונה בבקבוקונים הטחינה, ומרוסקת לאבקה דקה באמצעות טחנת מקפיא. (D)אבקת רקמה מקורקעת דק נאספה בצינור 50 מ"ל. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תרשים זרימה של השלבים העיקריים המעורבים בשיטת Updegraff. (א)ייצוג ציורי של שלבי מפתח בפרוטוקול. (B) מסביר שלבים קריטיים שהוצגו בלוח (A). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הכנת ריכוזים שונים של גלוקוז לעקומה הסטנדרטית. (A) הכן את תמיסת המלאי של גלוקוז על ידי המסת 10 מ"ג גלוקוז ב 10 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים, כך הריכוז הסופי של המניה הוא 1 מ"ג / מ"ל. הוסף תמיסת מלאי של 1 מ"ג / מ"ל גלוקוז במרווחים של 20 μL לנפח סופי של 1 מ"ל עם מים מזוקקים סטריליים כדי להכין ריכוזים שונים של גלוקוז מ 0 מיקרוגרם ל 180 מיקרוגרם / מ"ל. (B) טבלה המציגה כמות של 1 מ"ג / מ"ל גלוקוז ומים מזוקקים סטריליים להתווסף כדי להפוך ריכוזים שונים של גלוקוז. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: עקומת תקן גלוקוז שנוצרת באמצעות ערכי ספיגה של ריכוזי גלוקוז שונים ב- 620 ננומטר( A)טבלה המציגה ריכוזים שונים של גלוקוז הנעים בין 0 ל- 180 מיקרוגרם למ"ל עם ערכי הספיגה המנורמלים המתאימים ב- 620 ננומטר. (B) עקומה סטנדרטית של גלוקוז שנוצרה באמצעות תרשים פיזור מערכי הספיגה (A). (C) גרף עמודות המציג הבדלי תוכן תאית גבישיים בדגימות הניסיוניות 1 ו- 2. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה משלימה 1: הערכת תכולת תאית בדגימות הניסוי. לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
סיבי כותנה הם סיבים טבעיים המיוצרים מן זרעי הכותנה. סיבי כותנה הוא תא יחיד עם ~ 95% תוכן תאית2 עם תוכן תאית גבישי גבוה עם יישומים נרחבים בתעשיית הטקסטיל31. כמו, סיבי כותנה מכיל ~ 95% תאית, השתמשנו ברקמות שורש כותנה להדגמה של הערכת תוכן תאית גבישית. רקמות שורש כותנה עשירות במידה בינונית בתכולת תאית גבישית ומייצגות ביומסה צמחית זמינה בדרך כלל. כמות דופן התא הכולל הנדרש עבור התוכן תאית גבישית היא רק 5 מ"ג ולכן שיטה זו ניתן להשתמש להערכת תוכן תאית גבישי בשלבים התפתחותיים שונים / הערכת תוכן תאית ספציפית רקמה. אחוז החומצה גופרתית (67%) גם ממלא תפקיד קריטי בשבירת תאית לתוך מונומרים גלוקוז והמסת תאית לחלוטין23 ללא צורך sonication. אובדן מדגם נפוץ לאחר הטיפול Updegraff כמו גלולה תאית גבישית אינה מוצקה בתחתית הצינור בשלבים שונים בתהליך ההערכה. זה יכול להיות ממוזער על ידי הסרת כמויות קטנות של supernatant בכל שלב של מים אצטון שוטף לאחר טיפול Updegraff. יתר על כן, מערבולת מיידית של המדגם והסטנדרטים עם האנתרון ממלאים תפקידים משמעותיים בפיתוח צבעים ודיוק מוגבר של הסטנדרטים, מה שמוביל ל-99.5% מקדם נחישות (R2)ערכים (איור 3). עקומת תקן הגלוקוז היא המפתח בקביעת ריכוז הגלוקוז, אשר בתורו משמש להערכת התוכן התאי הגבישי. לפיכך, ניתן להתאים את ריכוזי הגלוקוז בהתאם לטווח הריכוזים הנדרש. בהתאם לטווח הערכים שיתאימו לערכים הניסיוניים, העקומה הסטנדרטית יכולה לנוע בין 0 ל -100 מיקרוגרם / מ"ל או 0 עד 200 מיקרוגרם / מ"ל עד 1000 מיקרוגרם / מ"ל ריכוזי גלוקוז; זה משנה עוד יותר את ערכי הרגרסיה c ו- m, ומשפר את הדיוק של הערכת תאית גבישית. חשוב תמיד לעשות טרי 0.2% אנתרון עבור שתי דגימות, כמו גם עבור התקן. ריבוע R, מדידה סטטיסטית, מייצג את השונות של כל נקודות הנתונים בקו הרגרסיה. חשוב להרתיח הן סטנדרטים ודגימות לאחר הוספת אנתרון לאותה כמות של זמן. חשוב תמיד לכלול פקד חיובי עם תוכן תאית ידוע. לשחזור נתונים יעיל, יש לעקוב במדויק אחר ההליך כולו, כולל הכנת פתרונות (תקנים, עקומה סטנדרטית וריאגנט Updegraff).
לאחרונה, תאית נחקרת עבור יישומים שאינם טקסטיל כגון אירוסולים צלולוסיים, חלקי מחשב ואתנול צלולוסי32,33; לפיכך, שיטה זו תהיה יישומים רחבים בעתיד. ההתקדמות המדעית נעשית באמצעות התקדמות מצטברת בהבנת מושגים, הצעת השערות חלופיות ומתן/הפרת הידע הקיים. התקדמות דומה ניתן לראות בפיתוח של שיטה אמינה להערכת תוכן תאית בביומסה הצמח. דופן התא היא מטריצה מורכבת ושיטת Updegraff מבטלת שברים שאינם תאית מתאית טהורה באופן רציף, מה שמוביל ל הערכה מדויקת של תכולת תאית בביומסה הצמחית. יתר על כן, השיטה הצבעונית הפשוטה שפותחה להערכת תכולת תאית על ידי מדידת ריכוז הגלוקוז הפכה שיטה זו להתאמה גבוהה ול בשימוש נרחב. במחקר הנוכחי, נתוני תאית היה עקבי בין משכפלים ביולוגיים שונים של הדגימות שנאספו משורה אחת. לכן, הוא מציע כי הנתונים המיוצרים על ידי שיטה זו הוא עקבי, אמין, לשחזור, וקל למדוד את התוכן תאית על ידי בדיקה צבעונית פשוטה.
שיטת Updegraff היא השיטה הנפוצה ביותר להערכת תאית. עם ההתרחבות האחרונה של היישום התעשייתי של תאית כגון מזון, עץ, נייר, סיבים, דלקים ביולוגיים, בגדים, קוסמטיקה ותרופות, הערכה מדויקת של תוכן תאית של ביומסה הצמח חיוני עבור יישומים שונים. למרות שזו השיטה הנפוצה ביותר להערכת תאית, חשוב לנקוט מספר אמצעי זהירות כדי להשיג נתונים לשחזור. דגימות הביומסה צריך להיות הקרקע לאותו גודל כדי לקבל הערכה מדויקת לשחזור של התוכן תאית. יש להקפיד תוך יצירת עקומת תקן הגלוקוז. יש להגדיל או להקטין את תקני הסוכר המשמשים להכנת עקומת הגלוקוז בהתבסס על קריאות ספיגת הדגימה, כך שהריכוזים הלא ידועים ייפלו בטווח ריכוזי הסוכר המשמשים להכנת העקומה הסטנדרטית. אם לא, ערכי m ו- c עשויים להשתנות, וכתוצאה מכך ההערכה הלא מדויקת של תוכן תאית גבישית. הכנה טרייה של 0.2 % אנתרון עבור כל אצווה של דגימות היא צעד קריטי נוסף של שיטת Updegraff. זה חיוני כדי להשתמש טרי מוכן 0.2 % אנתרון להערכת מדויק של התוכן תאית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד עניינים.
Acknowledgments
אנו מודים למחלקה למדעי הקרקע והכותנה בע"מ על תמיכתם החלקית במחקר זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Fisher Chemical | A18-500 | Used in the protocol |
| Anthrone | Sigma Aldrich | 90-44-8 | For colorimetric assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | For centrifugation |
| Chloroform | Mallinckrodt | 67-66-3 | Used in the protocol |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | 6381-92-6 | Used in the protocol |
| Ethanol | Millipore Sigma | EM-EX0276-4S | Used in the protocol |
| Filter paper | Whatman | 1004-090 | Positive control |
| Glacial acetic acid | Sigma | SKU A6283 | Used in the protocol |
| Heat block/ ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 13527550 | For controlled temperatures |
| Incubator | Fisherbrand | 150152633 | Used for drying plant sample |
| Measuring Scale | Mettler Toledo | 30243386 | For specific quantities |
| Methanol 100 % | Fisher Chemical | A412-500 | Used in the protocol |
| Microplate (96 well) | Evergreen Scientific | 222-8030-01F | For anthrone assay |
| Nitric acid | Sigma Aldrich | 695041 | Used in the protocol |
| Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes | BioSpec Products | 10831 | For high temperatures |
| Spectrophotometer(Multimode Detector) | Beckmancoulter DTX880 | 1000814 | For measuring absorbances |
| Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill | Spex Sample Prep | 68-701-15 | For grinding plant tissues into fine powder |
| Sulphuric acid | J.T.Baker | 02-004-382 | Used in the protocol |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | 151-21-3 | Used in the PSB buffer |
| Tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | Used in the protocol |
| Tris Hydrochloride | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | Used in the PSB buffer |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977 | Used in the protocol |
| Vacuum dryer (vacufuge plus) | Eppendorf | 22820001 | For drying samples |
| Vortex mixer | Fisherbrand | 14-955-151 | For mixing |
| Waterbath | Thermoscientific | TSGP02PM05 | For temperature controlled conditions at specific steps |
| Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12A | Used in the protocol |
References
- Somerville, C. Cellulose synthesis in higher plants. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 53-78 (2006).
- Balasubramanian, V. K., Rai, K. M., Thu, S. W., Hii, M. M., Mendu, V. Genome-wide identification of multifunctional laccase gene family in cotton (Gossypium spp.); expression and biochemical analysis during fiber development. Scientific Reports. 6, 34309 (2016).
- Mendu, V., et al. Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production. Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).
- Kraszkiewicz, A., Kachel-Jakubowska, M., Lorencowicz, E., Przywara, A. Influence of cellulose content in plant biomass on selected qualitative traits of pellets. Agriculture and Agricultural Science Procedia. 7, 125-130 (2015).
- Jordan, D. B., et al. Plant cell walls to ethanol. Biochemical Journal. 442, 241-252 (2012).
- Brett, C. T. Cellulose microfibrils in plants: biosynthesis, deposition, and integration into the cell wall. International Review of Cytology. 199, 161-199 (2000).
- Li, S., et al. Cellulose synthase complexes act in a concerted fashion to synthesize highly aggregated cellulose in secondary cell walls of plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 11348-11353 (2016).
- Polko, J. K., Kieber, J. J. The regulation of cellulose biosynthesis in plants. The Plant Cell. 31, 282-296 (2019).
- Brown, R. M. The biosynthesis of cellulose. Journal of Macromolecular Science, Part A. 33, 1345-1373 (1996).
- Gautam, S. P., Bundela, P. S., Pandey, A. K., Jamaluddin, M. K., Sarsaiya, A., Sarsaiya, S. A review on systematic study of cellulose. Journal of Applied and Natural Science. 2, (2010).
- Coughlan, M. P. Enzymic hydrolysis of cellulose: An overview. Bioresource Technology. 39, 107-115 (1992).
- Robak, K., Balcerek, M. Review of second generation bioethanol production from residual biomass. Food Technology and Biotechnology. 56, 174-187 (2018).
- Cross, C. F., Bevan, E. J. Cellulose and chemical industry. Journal of the Society of Chemical Industry. 27, 1187-1193 (1908).
- Paloheimo, L., Eine, H., Kero, M. L. A method for cellulose determination. Agricultural and Food Science. 34, (1962).
- Kurschner, K., Hanak, A., Diese, Z. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung. 59, 448-485 (1930).
- Norman, A. G., Jenkins, S. A new method for the determination of cellulose, based upon observations on the removal of lignin and other encrusting materials. Biochemical Journalournal. 27, (1933).
- Kiesel, A., Semiganowsky, N. Cellulose-Bestimmung durch quantitative verzuckerung. Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft (A and B Series). 60, 333-338 (1927).
- Waksman, S. A. S., et al. A system of proximate chemical analysis of plant materials. Industrial Engineering Chemistry and Analytical Edition. 2, 167-173 (1930).
- Salo, M. -L. Determination of carbohydrates in animal foods as seven fractions. Agricultural and Food Science. , 32-38 (1961).
- Giger-Reverdin, S. Review of the main methods of cell wall estimation: interest and limits for ruminants. Animal Feed Science and Technology. 55, 295-334 (1995).
- Updegraff, D. M. Semimicro determination of cellulose inbiological materials. Analytical Biochemistry. 32, 420-424 (1969).
- Viles, F. J., Silverman, L. Determination of starch and cellulose with anthrone. Analytical Chemistry. 21, 950-953 (1949).
- Scott, T. A., Melvin, E. H. Determination of dextran with anthrone. Analytical Chemistry. 25, 1656-1661 (1953).
- Kumar, M., Turner, S. Protocol: a medium-throughput method for determination of cellulose content from single stem pieces of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 11, 46 (2015).
- Yemm, E. W., Willis, A. J. The estimation of carbohydrates in plant extractsby anthrone. Biochemical Journal. 57, 508-514 (1954).
- Houston, K., Tucker, M. R., Chowdhury, J., Shirley, N., Little, A. The plant cell wall: A complex and dynamic structure as revealed by the responses of genes under Stress conditions. Frontiers in Plant Science. 7, (2016).
- Jiang, G., et al. Biomass extraction using non-chlorinated solvents for biocompatibility improvement of polyhydroxyalkanoates. Polymers. 10, 731 (2018).
- Li, T., et al. A saponification method for chlorophyll removal from microalgae biomass as oil feedstock. Marine Drugs. 14, 162 (2016).
- Wiltshire, K. H., Boersma, M., Möller, A., Buhtz, H. Extraction of pigments and fatty acids from the green alga Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae). Aquatic Ecology. 34, 119-126 (2000).
- Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. Comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part II: carbohydrates. Journal of Visualized Experiments. (1837), (2010).
- Haigler, C., Betancur, L., Stiff, M., Tuttle, J. Cotton fiber: a powerful single-cell model for cell wall and cellulose research. Frontiers in Plant Science. 3, (2012).
- Spirk, S., Nypelö, T., Kontturi, E. Editorial: Biopolymer thin films and coatings. Frontiers in Chemistry. 7, (2019).
- Long, L. -Y., Weng, Y. -X., Wang, Y. -Z. Cellulose aerogels: Synthesis, applications, and prospects. Polymers. 10, 623 (2018).
