Summary
Updegraff 방법은 셀룰로오스 추정에 가장 널리 사용되는 방법입니다. 이 데모의 주요 목적은 식물 바이오매스 샘플에서 셀룰로오스 함량을 추정하기 위한 상세한 Updegraff 프로토콜을 제공하는 것입니다.
Abstract
셀룰로오스는 광합성및 세포벽의 주요 하중 베어링 성분에 의해 생성되는 지구상에서 가장 풍부한 폴리머이다. 세포벽은 세포 성장의 강도, 강성, 속도 및 방향, 세포 모양 유지 보수 및 생체 및 무생물 스트레스요인으로부터의 보호를 제공함으로써 식물 성장 및 개발에 중요한 역할을 합니다. 세포벽은 주로 셀룰로오스, 리그닌, 헤미셀룰로오스 및 펙틴으로 구성됩니다. 최근 식물 세포벽은 2세대 바이오 연료 및 바이오 에너지 생산을 목표로 하고 있습니다. 구체적으로, 식물 세포벽의 셀룰로오스 성분은 셀룰로오스 에탄올의 생산에 사용된다. 바이오매스의 셀룰로오스 함량의 추정은 기본 및 적용 된 세포 벽 연구에 매우 중요합니다. Updegraff 방법은 간단하고 견고하며 식물 바이오매스의 결정성 셀룰로오스 함량을 추정하기 위한 가장 널리 사용되는 방법입니다. Updegraff 시약으로 치료시 알코올 불용성 조세포 벽 분획은 헤미셀룰로오스와 리그닌 분획을 제거합니다. 나중에, Updegraff 시약 저항하는 셀룰로오스 분획은 단황 포도당 단위로 셀룰로오스 균합고를 가수분해하기 위하여 황산 처리를 실시한다. 회귀 라인은 포도당의 다양한 농도를 사용하여 개발되고 실험 샘플에서 셀룰로오스 가수 분해시 방출되는 포도당의 양을 추정하는 데 사용된다. 마지막으로, 셀룰로오스 함량은 색칠성 앙위 분석에 의한 포도당 단량의 양을 기준으로 추정된다.
Introduction
셀룰로오스는 1차 세포벽과 이차 세포벽 모두에 존재하는 세포벽의 1차 하중 베어링 성분입니다. 세포벽은 식물 세포를 포위하는 세포외 매트릭스이며 주로 셀룰로오스, 리그닌, 헤미셀룰로오스, 펙틴 및 매트릭스 단백질로 구성됩니다. 식물 바이오매스의 약 1/3은 셀룰로오스1이며, 세포 성장의 강도, 강성, 속도 및 방향, 세포 모양 유지 보수 및 바이오틱 및 무생물 스트레스요인으로부터의 보호를 제공함으로써 식물 성장과 개발에 중요한 역할을 합니다. 면 섬유는 95% 셀룰로오스2 함량을 포함하고 있으며, 나무는 식물 종 및 장기 유형에 따라 셀룰로오스의 40 %에서 50 %를 함유하고있습니다3. 셀룰로오스는 β-1,4 글리코시딕 본드4에의해 연결된 포도당 잔류물의 불협화기인 셀로바이오제의 반복 단위로 구성된다. 셀룰로오스 에탄올은 식물 세포벽5에존재하는 셀룰로오스로부터 유래된 포도당으로부터 생산된다. 셀룰로오스 섬유는 각 마이크로 피브릴이 500-15000 포도당 단량제1,6을가진 코어 단위로 작용하는 몇몇 마이크로 피브릴로 구성됩니다. 셀룰로오스 모합합체는 플라즈마 멤브레인 임베디드 셀룰로오스 신타스 복합체(CSC)1,7에의해 합성된다. 개별 셀룰로오스 신타제 A(CESA) 단백질은 글루칸 사슬을 합성하고 인접한 글루칸 사슬은 수소 결합에 의해 연결되어 결정성 셀룰로오스1,8을형성한다. 셀룰로오스는 2개의 우세한 형태, 셀룰로오스 Iα 및 셀룰로오스 Iβ를 네이티브 형태9로여러 결정 형태로 존재한다. 더 높은 식물에서 셀룰로오스는 셀룰로오스 Iβ 형태로 존재하며, 낮은 식물 셀룰로오스는 Iα 형태10,11에존재한다. 전반적으로, 셀룰로오스는 식물 세포벽에 강도와 강성을 부여하는 데 중요한 역할을한다.
1세대 바이오 연료는 주로 옥수수 전분, 지팡이 설탕 및 사탕무 설탕에서 생산되며, 2세대 바이오 연료는 비식품 식물바이오매스 세포벽재료(12)의바이오 연료 생산에 주력하고 있다. 결정성 셀룰로오스 함량의 정확한 추정은 셀룰로오스 생합성 및 세포벽 역학에 대한 근본적인 연구뿐만 아니라 적용 된 바이오 연료 및 바이오 제품 연구에도 중요합니다. 식물 바이오매스의 셀룰로오스 추정에 최적화된 다양한 방법이 개발되고 최적화되어 있으며, Updegraff 방법은 셀룰로오스 추정에 가장 널리 사용되는 방법입니다. 셀룰로오스 추정을 위한 첫번째 보고된 방법은 1908년13년에십자가와 베반에 의해 이었습니다. 이 방법은 황산나트륨에 의한 대체 염소화 및 추출 원리에 기초하였다. 그러나, 원래의 변형된 프로토콜뿐만 아니라 크로스 및 베반 방법의 변형된 프로토콜에 의해 얻어진 셀룰로오스는 상당한 양의 자일란과만난(14)에더하여 리그닌의 작은 분수의 오염을 보였다. 셀룰로오스 분획에서 리그닌과 헤미셀룰로스를 제거하기 위한 몇 가지 수정에도 불구하고, 크로스 베반 방법은 셀룰로오스와 함께 상당한 양의 만란을 유지했습니다. 나중에, 쿠르슈너의 방법은 셀룰로오스(15)를추출하기 위해 질산과 에탄올을 사용하여 개발되었다. 이 방법은 총 리그닌과 펜토산의 75%가 제거되었지만 진정한 셀룰로오스 결과는 크로스와 베반의 염소화 방법에 의해 추정된 것과 동일하다고 명시하였다. 또 다른 방법(Norman 및 Jenkins)은셀룰로오스(16)를추출하기 위해 메탄올 벤젠, 황산나트륨 및 하이포염소산나트륨을 사용하여 개발되었다. 이 방법은 또한 리그닌의 일부 일부를 유지 (3%) 그리고 셀룰로오스의 정확한 추정으로 이어지는 펜토산의 상당한 금액. 나중에, 키젤과 Semiganowsky는 80% 농축 황산을 사용하여 셀룰로오스에 다른 접근 법을 사용했으며, 가수 분해 감소 된 설탕은 버트 랜드의 방법에 의해 추정되었다17. 두 가지 방법, 왁스맨스와 스티븐스18 과 살로14,19 키셀과 세미 가노우스키의 방법에 따라 개발 된, 또한 이전 방법에 비해 4-5 % 적은 셀룰로오스 함량을 산출20.
Updegraff 방법은 결정성 셀룰로오스 함량의 추정을 위해 가장 널리 사용되는 방법입니다. 이 방법은 1969년21년셀룰로오스의 측정을 위해 Updegraff에 의해 처음 기술되었다. Updegraff 방법은 쿠르슈너 방법 (질산 사용), 키셀 및 세미노프스키 방법 (황산을 사용하여 포도당 모노머로 셀룰로오스의 가수 분해)를 통합하고, 포도당 및 결정 셀룰로오스 함량22의간단한 색소 추정을위한 빌스와 실버맨의 반위 분석법을 통합합니다. 이 방법의 원리는 아세트산과 질산(Updegraff 시약)을 사용하여 균질화된 식물 조직에서 헤미셀룰로오스와 리그닌을 제거하는 것으로, 아세트/질산 내성 셀룰로오스를 더 처리 및 추정을 위한 세포산내성 셀룰로오스를잎입니다(15) 아세트/질산 내성 셀룰로오스는 셀룰로오스를 포도당 단량체로 분해하기 위해 67%의 황산으로 처리되며, 방출된 포도당 단량제는 안계학적 분석21,23에의해 추정된다. 원래 Updegraff 방법의 몇 가지 수정은 anthrone분석서 (24)에의해 절차 및 셀룰로오스 추정을 단순화하는 데 사용되었다. 광범위하게 이 메서드는 5단계로 나눌 수 있습니다. 1단계에서는 식물 재료가 제조됩니다. 제2상에서, 조세포벽은 식물 세포벽의 핵심 성분이기 때문에 총 바이오매스로부터 분리된다. 나중에, 제 3 단계에서, 셀룰로오스는 Updegraff 시약으로 처리하여 비 셀룰로오스 세포벽 성분으로부터 분리된다. 네 번째 단계에서, 아세트/질산 내성 셀룰로오스는 황산 치료에 의해 포도당 단량체로 분해된다. 셀룰로오스의 황산 치료는 황산을 가진 포도당 단량제의 반응에서 5-하이드록시메틸푸르랄 화합물의 형성을 초래한다. 마지막으로, 마지막 단계에서, 왕좌는 이전 단계25에서생성된 모피 화합물로 끓여 서 녹색 의 푸른 복합체를 생성한다. 이 왕좌 기반 색법 방법은 드레이우드에 의해 1942 년에 처음 사용되었습니다. Anthrone는 산성 조건하에서 5-하이드록시메틸푸르랄과 같은 펜토스 및 헥소스 탈수 제품의 furfural 화합물을 식별하는 염료입니다. 헥소스를 가진 반응은 펜토스25에비해 강렬한 색상과 더 나은 반응을 생성합니다. 결합된 포도당의 양은 620nm에서 분광계 흡광도에 의해 측정되고 녹색 파란색 복합체의 강도는 시료의 설탕 양에 직접적으로 비례한다. 측정된 흡광도 값은 샘플의 포도당 농도를 계산하기 위해 포도당 표준 곡선 회귀 라인과 비교하였다. 측정된 포도당 함량은 식물 바이오매스의 셀룰로오스 함량을 추정하기 위해 사용되었다.
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Protocol
1. 실험 준비
- 말린 식물 재료를 미세 한 분말로 갈아 넣습니다.
- 단백질 용해화 버퍼 (PSB): 1 M 트리 (pH 8.8), 0.5 M 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) (pH 8.0)의 스톡 솔루션을 준비하고 오토클레이브. 멸균 물에 50mM Tris, 0.5mM EDTA 및 10% 나트륨 도데실 황산염(SDS)의 최종 농도로 이러한 스톡 솔루션에서 신선한 PSB 버퍼를 만듭니다.
- 70% 에탄올(v/v)의 100mL준비: 100% 에탄올 70mL, 멸균수 30mL를 준비한다.
- 메탄올 100mL 준비: 클로로폼은 1:1 비율(50mL 메탄올 및 50mL 클로로폼)으로 준비한다.
- Updegraff 시약의 82.5 mL을 준비합니다. 75mL의 아세트산을 7.5mL의 질산에 추가하여 물의 궁극적인 비율인 아세트산: 질산은 2:8:1(v/v)에 있습니다. 80% 아세트산을 제조하려면 멸균수(v/v)의 20mL에 빙하 아세트산 80mL를 용해하십시오.
- 1 mg/mL 포도당 용액의 신선한 육수를 준비하십시오. 10mL의 물 (w /v)에 포도당 10 mg을 녹입니다.
- 67% 황산(v/v)의 100mL를 준비하려면 67mL의 농축 황산을 33mL의 물에 추가하십시오. 항상 유리 병을 사용하고 물에 천천히 산을 추가합니다. 이 단계는 외재 (열을 방출)입니다. 따라서, 얼음에이 솔루션을 준비하고 사용하기 전에 적어도 2 시간 동안 냉장고에서 냉각.
- 실험 샘플의 각 배치에 대해 신선한 0.2 %의 왕좌 (w /v)를 준비하십시오. 무게 0.2 g의 왕좌와 알루미늄 호일로 싸여 유리 병에 미리 냉장 농축 황산의 100 mL에 용해. 사용하기 전에 1-2 시간 동안 냉장고에 보관하십시오.
참고: 실험 당일 냉장고에 농축된 황산이 미리 들어있으며, 포도당 함량을 정확하게 추정하기 위해 새로운 안장 제제를 권장합니다.
2. 식물 바이오매스 재료의 준비
- 동일한 성장 조건, 동일한 발달 단계, 식물의 동일한 위치 및 조직의 동일한 유형 (잎 / 줄기 / 뿌리)와 온실에서 성장 2 개월 된 면 실험 라인에서 식물 바이오 매스 샘플을 수집합니다.
참고: 각 샘플에 대해 최소 3개의 생물학적 복제를 수집합니다. 뿌리 조직에서 모든 먼지를 제거하기 위해 물로 철저히 씻으십시오. - 실온에서 종이 타월에 2일 동안 공기 건조 루트 조직을 사용하여 수분 함량을 제거합니다(도1).
참고: 곰팡이 오염을 방지하기 위해 셀룰로오스 추정을 위한 공기 건조 원하는 조직. - 루트 샘플을 개별 컨테이너에 넣습니다. 그런 다음 라벨을 부착하고 10일 동안 49°C에서인큐베이터로 건조시다(재료표).
참고: 또는, 동결 건조기는 식물 바이오매스 물질에 화학적 변화를 일으키지 않고 공장 조직을 1~2일 이내에 건조시키는 데 사용할 수 있다. - 말린 샘플을 작은 조각으로 자르고 액체 질소로 동결하고 박격포와 유봉, 냉동고 공장 또는 바이오 매스 분쇄기(그림 1)를사용하여 균일 한 미세 분말로 갈아냅니다.
참고: 냉동고 공장은 3사이클동안 10cps의 속도로 사용되었습니다. - 접지조직(도 2)을수집하고 세포벽 추출을 진행한다.
참고: 샘플을 실온의 밀폐 용기에 저장하여 이 시점에서 프로세스를 일시 중지할 수 있습니다.
3. 식물 바이오매스에서 조세포벽 추출
참고: 식물 세포벽에는 셀룰로오스, 리그닌, 비셀룰로오스 성분, 펙틴, 매트릭스 단백질, 페놀 화합물 및물(26)이함유되어 있다. 셀룰로오스가 세포벽에 존재하기 때문에, 첫 번째 단계는 식물바이오매스(26)의비세포벽 성분으로부터 세포벽 성분을 분리하는 것입니다.
- 세포벽 추출 공정을 시작하기 전에 개별 빈 2mL 튜브를 라벨및 계량합니다.
- 더 진행하기 전에 실험실 노트북에 빈 튜브 가중치를 기록하십시오.
- 무게 20 단계에서 분말 조직의 mg 2.5 미리 무게 2 mL 튜브에 전송 하 고 그들을 레이블.
- 단백질 용해화 완충제(PSB) (50mM Tris 염산염(HCl) 완충 pH 8.8, 0.5mM EDTA, 10% 나트륨 도데실 황산염(SDS)을 첨가하여 단백질을 용해시켰다. 소용돌이와 원심분리기는 실온(RT)에서 5분 동안 25,200 x g의 소용돌이. 원심 분리 후, 상체를 버리고 펠릿을 저장합니다.
참고: 단백질 성분을 분석해야 하는 경우 상체를 저장할 수 있습니다. - 3.4 단계를 두 번 더 반복합니다.
- 유지 된 펠릿에 증류수와 소용돌이 1 mL을 추가하십시오. 실온(RT)에서 5분 동안 25,200 x g의 원심분리기와 상류체를 제거합니다.
- 3.6 단계를 두 번 더 반복합니다.
- 저장된 펠릿, 소용돌이에 70% 에탄올 1mL을 넣고 수조/열 블록에 70°C에서 1시간 동안 가열하여 샘플에서 수용성 성분과 전분을 제거합니다. RT에서 5 분 동안 25,200 x g의 소용돌이와 원심 분리기.
- 3.8 단계를 한 번 더 반복합니다.
- 펠릿에 1mL의 100% 메탄올과 소용돌이를 추가합니다. 실온(RT)에서 5분 동안 25,200 x g의 원심분리기와 상류체를 제거합니다.
- 펠릿과 소용돌이에 클로로폼/메탄올 1mL(클로로폼 및 메탄올 1:1 비율)를 넣습니다. RT에서 5 분 동안 25,200 x g의 원심 분리기와 상체를 제거하십시오. 메탄올 및 클로로폼 용매를 첨가하여바이오매스(27)로부터지질 분획을 용해시키고 제거한다.
- 펠릿에 1mL의 100% 아세톤과 소용돌이를 넣습니다. 실온에서 5분 동안 배양하십시오. RT에서 5 분 동안 25,200 x g의 원심 분리기와 상체를 제거하십시오. 아세톤은 바이오매스28,29에서엽록소 및 자유 지방산과 같은 안료를 제거한다.
- 하룻밤 사이에 37°C에서 펠릿을 말리거나 진공 건조에 의해 더 진행하십시오.
참고: 말린 펠릿은 결정성 셀룰로오스 추정에 사용되는 조세포벽입니다. 이 시점에서 공정을 일시 중지하거나 건조 시료를 위한 진공 건조기사용으로 더 진행할 수 있습니다.
4. Updegraff 시약 (아세트 및 질산)으로 치료하여 비 셀룰로오스 성분을 제거합니다.
참고: 이 프로토콜에는 산 및 기타 화학 물질의 사용이 포함됩니다. 프로세스 전반에 걸쳐 개인 보호 장비(PPE)를 착용하십시오.
- 말린 조세포 벽 펠릿 5 mg을 신선한 2mL 나사 캡튜브에 넣습니다. 정확한중량(그림 3)30을참고하십시오.
- 이 시점에서 양수 컨트롤을 포함합니다. 80% 셀룰로오스 함량을 산출하는 양수 제어로 필터 용지 2mg(재료 표)을사용하십시오.
- 무게가 있는 5 mg의 세포벽 추출물과 양수 조절에 Updegraff 시약의 1.5mL를 추가합니다. 소용돌이에 의해 혼합.
참고: 양수 제어는 이 단계의 실험 샘플과 동일한 방식으로 처리되어야 합니다. 이 단계는 적절한 개인 보호 장비 (PPE)와 연기 후드에서 수행해야합니다.
주의: 이 단계는 샘플의 튀기고 튜브의 터지는 것을 방지하기 위해 나사 캡 튜브에서 수행되어야합니다. 양수 제어를 위한 3개의 복제와 더불어 각 견본의 3개의 생물학 복제는 포함되어야 합니다. - 현탁액을 끓는 수조에서 30분 동안 100°C로 가열하고 벤치에서 10분 동안 식힙니다. RT에서 10 분 동안 25,200 x g의 원심 분리기. 원심 분리에 의해 상체를 제거하고 펠릿을 저장합니다.
참고: 생성된 폐기물은 유기 용매, 황산 및 Updegraff 시약(아세트산 및 질산)을 위해 별도로 수거해야 합니다. 아세트산과 질산을 가진 폐기물은 통풍이 잘 되는 캡으로 시원한 온도에서 보관되어야 하며 폭발을 방지하기 위해 다른 유기 용매 및 기타 산과 혼합해서는 안 됩니다. - 펠릿에 1mL의 물을 넣습니다. RT에서 10분 동안 25,200 x g의 원심분리기는 수퍼나티의 500 μL을 제거하고 튜브에 아세톤 1mL을 추가합니다.
- RT에서 5 분 동안 25,200 x g의 원심 분리기는 1 mL의 상퍼를 제거하고 RT에서 5 분 동안 25,200 x g에서 튜브및 원심 분리기에 1 mL의 아세톤을 추가합니다.
- 원심 분리 후, 모든 상체를 제거하고 아세톤의 1 mL에서 펠릿을 중단합니다. 실온에서 5분 동안 튜브를 배양하고 RT에서 5분 동안 25,200 x g에서 회전합니다.
- 상체를 버리고 펠릿을 저장합니다. 펠릿을 하룻밤 사이에 37°C에서 건조시키십시오(그림3).
참고: 이 시점에서 공정을 일시 중지하거나 건조를 위해 진공 건조기를 사용하여 계속 하고 다음 단계로 진행할 수 있습니다.
5. 포도당 단량체 단위를 생성하는 산에 의한 셀룰로오스의 가수 분해
- 말린 펠릿에 67% 황산 1mL를 넣습니다. 소용돌이는 산에 완전히 펠릿을 혼합합니다.
- 실온에서 튜브를 1시간 동안 흔들어 셀룰로오스 펠릿을 67% 황산으로 녹입니다.
참고: 대안으로, 67% 황산에서 셀룰로오스 펠릿의 용용화는 셰이커에서 잠복식 30분 후 10분 동안 각 시료의 초음파 처리에 의해 개선될 수 있다. 초음파 처리 후, 샘플은 RT에서 셰이커에서 다시 배양 할 수 있습니다. 그러나, 우리는 우리가 원유 세포벽 추출물의 5 mg으로 시작할 때 초음파 처리없이 셀룰로오스 펠릿의 완전한 용해도를 관찰(도 3). 이 절차는 다양한 식물 바이오 매스 샘플3에적합했다.
6. 셀룰로오스 함량의 반위 분석 및 추정에 의한 포도당 함량 측정
- 이 단계에서 셀룰로오스는 무료 포도당 단조량의 형태입니다. 분광측법에 의해 시료에 존재하는 포도당의 양을 측정하여 셀룰로오스의 양을 결정한다.
- 5단계에서 시료의 10μL을 복용하여 멸균 증류수 490μL에 추가하여 각 시료를 500 μL로 희석시켰다.
- 0.2%의 1mL을 각 튜브에 새로 준비한 앙위원 시약을 넣고 소용돌이에 섞어서 즉시 섞습니다.
- 샘플을 100°C에서 10분간 끓이고 얼음에서 튜브를 5분간 식힙니다. 각 샘플의 200 μL을 96 웰 플레이트의 3개의 우물에 옮기. 96 웰 플레이트를 분광광계에 적재하여 620 nm에서 흡광도를 측정합니다.
참고: 고온에서 끓는 경우 나사로 덮인 튜브를 사용하여 유해한 화학 물질의 튀는 것을 방지하고 시료 손실을 방지하십시오.
7. 포도당 표준 곡선의 준비
- 포도당 표준을 준비하려면 10 mg의 포도당을 10 mL의 멸균 증류수에 용해하여 1 mg / mL 포도당의 신선한 육수를 만듭니다. 이 스톡 용액은 20 μL 증분(0, 20, 40, 60, 80,100,120,140, 160, 180 μL)에 1 mg/mL의 이 스톡 용액을 첨가하여 0μg에서 180 μg/mL농도까지의 포도당 기준을 준비합니다(총 부피 1mL). 멸균 수를 첨가한 후 각 포도당 기준을 소용돌이시다.
- 이 10개의 다른 농도에서, 신선한 2 mL 나사 덮인 튜브로 각 포도당 농도의 알리쿼트 500 μL.
- 각 튜브에 갓 준비된 0.2%의 1mL을 넣고 소용돌이에 섞어 바로 섞습니다. 얼음에 배양하고 100 °C에서 10 분 동안 끓인 다음 5 분23동안 얼음에 인큐베이션이 있습니다.
- 각 표준의 200 μL을 96개의 마이크로 티터 플레이트에 3개의 기술 복제를 위해 3개의 우물로 옮기고 620 nm(그림3)에서흡광도를 측정한다.
- 620 nm(도7)에서정규화된 흡광도 값에 대해 상이한 포도당 농도(0~180 μg/mL)를 플로팅하여 표준 포도당 곡선을 개발한다. 흡광도 값에서 생성된 회귀 라인 Y= mx+c를 사용하여 준비된 샘플의 셀룰로오스 함량을 계산합니다.
참고: 포도당 표준은 실험의 각 세트에 대해 갓 준비해야합니다. 이러한 값이 표준 곡선 흡수도 값의 범위 내에 속할 수 있도록 OD 값이 너무 높으면 포도당의 농도가 증가되어야 한다. 회귀 라인은 샘플의 각 배치에 사용되는 포도당 표준에 따라 다른 m 및 c 값을 생성합니다. 왕좌 를 추가 한 직후 튜브를 혼합(23). 이 반응의 외신적 특성 때문에 왕좌 분석이 수행 될 때까지 왕좌, 희석 된 샘플 및 준비 된 표준은 항상 차갑게 유지되었습니다.
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Representative Results
녹색 집에서 자란 면화 식물은이 연구를 위해 선택되었다. 두 개의 상이한 실험 용 회선은 셀룰로오스 함량의 비교 분석을 위해 선택되었다. 각 실험 라인에 대해, 루트 조직은 세 가지 생물학적 복제로부터 수집되었다. 총 500 mg의 조직이 균질화되었고 20 mg의 조세포 벽 추출에 사용되었습니다. 나중에, 5 mg의 조세포벽 추출물은 셀룰로오스로부터 헤미셀룰로오스와 리그닌을 제거하기 위해 Updegraff 시약 치료에 사용되었습니다. 정제 된 셀룰로오스는 셀룰로오스를 포도당 단위로 분해하기 위해 황산 치료에 의해 가수 분해되었습니다. 620 nm(보충 표 1)에서흡광도 판독의 결과는 포도당 농도를 측정하고 상보 분석에 의한 셀룰로오스 함량을 추정하는 데 사용되었다. 3개의 기술 복제의 평균 흡광도 값은 0 μg 포도당 농도의 빈 흡광도 값을 빼서 정규화되었다. 포도당 표준 곡선은 산란된 막대그래프(도 4)를사용하여 생성되었다.
본 표준 곡선으로부터의 결과회귀 라인, y =mx + c는 정규화된 흡광도 판독값을 사용하여 추출된 시험 샘플에서 알 수 없는 포도당 농도를 계산하는 데 사용된다. x(μg/μL에서 알려지지 않은 포도당 농도)를 계산하기 위해, 수식(x= 정규화된 흡광도-c/m)이 사용되었다. 표준 포도당 곡선의 회귀 선으로부터c 및 m 값(R2 = 0.99)은 μg/μL에서 포도당 농도를 측정하는 데 사용되었다. 이어서 이 값은 최종 부피가 500 μL이기 때문에 2의 희석계수로 나뉘며, 10μL 샘플 부피로 더 나누어 μg/μL에서 포도당 농도를 측정한다. 계산된 값은 5 mg의 세포벽 추출물이기 때문에, mg당 포도당 포도당 농도를 얻기 위해 각 실험시에 사용되는 각각의 조세포벽 중량으로 5 mg으로 더 나뉜다. 값은 가수분해 과정에서 얻은 물을 보상하기 위해 1.1로 더 나뉘며(포도당은 분자량이 180이고 수분자는 분자량이 18의 분자량을 가지므로 따라서 포도당 단량체방출 과정에서 생성된 물은 수분 인자를 분할하여 제거하였다, 1.1). 결과값은 100을 곱하여 결정성 셀룰로오스 함량을 백분율로계산합니다(보충표 1).
셀룰로오스 함량의 결과는 그들이 생물학적 복제 중 일관되다는 것을 보여 주며 Updegraff 방법의 기술적 정확성을 시사합니다. 또한 2D 그래프를 사용하여 차이점을 플로팅했습니다. 이들 결과는 비교된 실험 샘플 번호 1 및2(도 4)에서셀룰로오스 함량 차이를 나타냈다. 샘플 1은 43.4%를 나타내고 샘플 2는 28.12%를 나타내며, 이 방법은 실험 샘플 간의 차이를 구별할 수 있음을 시사한다. 학생 t-테스트는 중요한 차이점을 테스트하기 위해 95% 중요 수준에서 적용되었습니다.
그림 1: 뿌리에서 셀룰로오스 함량 추정을위한 면식물 바이오 매스의 준비. (A)온실 재배 식물은 토양에서 부드럽게 당겨물로 철저히 세척하였다. 식물 뿌리 조직은 분리되었고, 종이 타월에 보관하고 2 일 동안 공기 건조를 허용했습니다. (B)루트 조직은 개별적으로 표지된 용기로 옮겨져 -10일 동안 49°C에서 인큐베이터에서 건조할 수 있게 하였다. (C)건조된 조직은 작은 조각으로 절단되어 액체 질소로 냉동되고, 분쇄 유리병에 적재하고, 냉동고 밀을 사용하여 미세 분말로 접지하였다. (D)미세하게 접지된 조직 분말은 50mL 튜브에서 수집하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: Updegraff 방법에 관련된 주요 단계의 흐름 차트. (A)프로토콜의 주요 단계의 그림 표현. (B)패널(A)에표시된 중요한 단계를 설명합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 표준 곡선에 대한 포도당의 상이한 농도의 제제. (A)10mL의 포도당을 10mL의 멸균 증류수로 용해하여 포도당의 재고 용액을 준비하여 주식의 최종 농도가 1 mg/mL입니다. 멸균 증류수1mL의 최종 부피에 20 μL 증분에 1 mg/mL 의 스톡 용액을 추가하여 0 μg에서 180 μg/mL까지 다양한 농도의 포도당을 준비합니다. (B)포도당의 다른 농도를 만들기 위해 첨가할 1 mg/mL 포도당 및 멸균 증류수의 양을 나타내는 표. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 620 nm에서 상이한 포도당 농도의 흡광도 값을 사용하여 생성된 포도당 표준 곡선(A) 표는 620nm에서 각각 의 정규화된 흡광도 값을 가진 0에서 180 μg/mL에 이르는 포도당의 다양한 농도를 나타내고 있다. (b)흡광도값(A)으로부터산란 차트를 사용하여 생성된 포도당 표준 곡선. (C)실험 샘플 1 및 2에서 결정성 셀룰로오스 함량 차이를 나타내는 바 그래프. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 실험 샘플에서 셀룰로오스 함량추정. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
면 섬유는 면씨에서 생산 된 천연 섬유입니다. 면섬유는 섬유 산업에서 광범위한 응용 분야와 높은 결정 셀룰로오스 함량을 가진 ~ 95 % 셀룰로오스 함량2를 가진 단일 셀입니다31. 면 섬유에는 ~95% 셀룰로오스가 함유되어 있으므로, 결정성 셀룰로오스 함량의 추정을 시연하기 위해 면 뿌리 조직을 사용했습니다. 면 뿌리 조직은 결정성 셀룰로오스 함량이 적당히 풍부하며 일반적으로 이용 가능한 식물 바이오매스를 나타냅니다. 결정성 셀룰로오스 함량에 필요한 총 세포벽의 양은 5 mg에 불과하므로 이 방법은 상이한 발달 단계/조직 별 셀룰로오스 함량 추정에서 결정성 셀룰로오스 함량을 추정하기 위해 사용될 수 있다. 황산 비율 (67%) 또한 셀룰로오스를 포도당 모노머로 깨고 초음파 처리없이 셀룰로오스를 완전히23으로 용해시키는 데 중요한 역할을합니다. 시료 손실은 결정성 셀룰로오스 펠릿이 추정 과정에서 다른 단계에서 튜브의 바닥에 고체되지 않기 때문에 Updegraff 치료 후 일반적이다. 이는 Updegraff 처리 후 물과 아세톤 세체의 각 단계에서 소량의 상체체를 제거하여 최소화될 수 있습니다. 또한, 표본과 상반신을 가진 표준의 즉각적인 소용돌이는 색 개발및 표준의 정확도 향상에 중요한 역할을 하며, 결단력(R2)값(그림 3)의 계수(그림3)로이어진다. 포도당 표준 곡선은 포도당 농도를 결정하는 데 핵심이며, 이는 차례로 결정성 셀룰로오스 함량을 추정하는 데 사용된다. 따라서, 포도당의 농도는 농도의 요구 범위에 따라 조정될 수 있다. 실험값에 맞는 값의 범위에 따라 표준 곡선은 0에서 100 μg/mL 또는 0에서 200 μg/mL까지 최대 1000μg/mL 의 포도당 농도까지 다양할 수 있습니다. 이렇게 하면 회귀 값 c와 m이 추가로 변경되어 결정성 셀룰로오스 추정의 정확도가 향상됩니다. 항상 샘플과 표준모두에 대해 신선한 0.2%의 왕좌를 만드는 것이 중요합니다. 통계 측정인 R-square는 회귀 라인의 모든 데이터 점의 가변성을 나타냅니다. 동일한 시간 동안 왕좌를 추가한 후 표준과 샘플을 모두 끓이는 것이 중요합니다. 알려진 셀룰로오스 함량을 가진 긍정적 인 제어를 포함하는 것이 항상 중요합니다. 효과적인 데이터 재현성을 위해 솔루션 준비(표준, 표준 곡선 및 Updegraff 시약)를 포함하여 전체 절차를 정확하게 수행해야 합니다.
최근에는 셀룰로오스 에어로졸, 컴퓨터 부품 및 셀룰로오스에탄올(32,33)과같은 비섬유 응용 분야에 대해 셀룰로오스가 탐구되고 있다. 따라서 이 메서드는 향후 광범위한 응용 프로그램을 갖게 됩니다. 과학적 발전은 개념을 이해하고, 대체 가설을 제안하고, 기존 지식을 제공/반증하는 점진적 진전을 통해 이루어집니다. 유사한 진행은 식물 바이오매스내셀룰로오스 함량의 추정을 위한 신뢰할 수 있는 방법의 개발에서 볼 수 있다. 상기 세포벽은 복잡한 매트릭스이며 Updegraff 방법은 순셀룰로오스로부터 비셀룰로오스 분획을 순차적으로 제거하여 식물 바이오매스의 셀룰로오스 함량을 정확하게 추정한다. 또한, 포도당 농도를 측정하여 셀룰로오스 함량의 추정을 위해 개발된 간단한 착색 방법은 이 방법을 높게 적응하고 널리 사용되었다. 현재 연구에서는, 셀룰로오스 데이터는 한 줄에서 수집된 견본의 다른 생물학 복제 사이에서 일관되었습니다. 따라서, 이 방법에 의해 생성된 데이터는 단순 색법 분석법에 의해 셀룰로오스 함량을 일관되고 안정적이며 재현가능하며 쉽게 측정할 수 있음을 시사한다.
Updegraff 방법은 셀룰로오스 추정에 가장 널리 사용되는 방법입니다. 최근 식품, 목재, 종이, 섬유, 바이오 연료, 의류, 화장품 및 의약품과 같은 셀룰로오스의 산업 적용이 확대됨에 따라 식물 바이오매스의 셀룰로오스 함량의 정확한 추정이 다양한 응용 분야에 매우 중요합니다. 이것은 셀룰로오스 추정에 가장 널리 사용되는 방법이지만 재현 가능한 데이터를 얻기 위해 몇 가지 예방 조치를 취하는 것이 중요합니다. 바이오매스 샘플은 셀룰로오스 함량의 정확하고 재현 가능한 추정을 얻기 위해 동일한 크기로 접지되어야 합니다. 포도당 표준 곡선을 생성하는 동안주의해야 한다. 포도당 표준 곡선 제제에 사용되는 포도당 표준은 시료 흡광도 판독값에 기초하여 증가 또는 감소되어야 하므로 알 수 없는 농도가 표준 곡선을 준비하는 데 사용되는 포도당 농도의 범위 내에 속하도록 한다. 그렇지 않은 경우 m 및 c 값이 다를 수 있으므로 결정성 셀룰로오스 함량을 부정확한 추정이 초래할 수 있습니다. 샘플의 각 배치에 대해 0.2 %의 새로운 준비는 Updegraff 방법의 또 다른 중요한 단계입니다. 셀룰로오스 함량의 정확한 추정을 위해 갓 준비된 0.2 %의 반위를 사용하는 것이 필수적입니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구의 부분적인 지원에 대해 식물및 토양 과학 및 면학과에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Fisher Chemical | A18-500 | Used in the protocol |
| Anthrone | Sigma Aldrich | 90-44-8 | For colorimetric assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | For centrifugation |
| Chloroform | Mallinckrodt | 67-66-3 | Used in the protocol |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | 6381-92-6 | Used in the protocol |
| Ethanol | Millipore Sigma | EM-EX0276-4S | Used in the protocol |
| Filter paper | Whatman | 1004-090 | Positive control |
| Glacial acetic acid | Sigma | SKU A6283 | Used in the protocol |
| Heat block/ ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 13527550 | For controlled temperatures |
| Incubator | Fisherbrand | 150152633 | Used for drying plant sample |
| Measuring Scale | Mettler Toledo | 30243386 | For specific quantities |
| Methanol 100 % | Fisher Chemical | A412-500 | Used in the protocol |
| Microplate (96 well) | Evergreen Scientific | 222-8030-01F | For anthrone assay |
| Nitric acid | Sigma Aldrich | 695041 | Used in the protocol |
| Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes | BioSpec Products | 10831 | For high temperatures |
| Spectrophotometer(Multimode Detector) | Beckmancoulter DTX880 | 1000814 | For measuring absorbances |
| Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill | Spex Sample Prep | 68-701-15 | For grinding plant tissues into fine powder |
| Sulphuric acid | J.T.Baker | 02-004-382 | Used in the protocol |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | 151-21-3 | Used in the PSB buffer |
| Tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | Used in the protocol |
| Tris Hydrochloride | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | Used in the PSB buffer |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977 | Used in the protocol |
| Vacuum dryer (vacufuge plus) | Eppendorf | 22820001 | For drying samples |
| Vortex mixer | Fisherbrand | 14-955-151 | For mixing |
| Waterbath | Thermoscientific | TSGP02PM05 | For temperature controlled conditions at specific steps |
| Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12A | Used in the protocol |
References
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