Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Estimering av krystallinsk celluloseinnhold av plantebiomasse ved hjelp av Updegraff-metoden

Published: May 15, 2021 doi: 10.3791/62031
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Plant and Soil Science, Texas Tech University, 2Fiber and Biopolymer Research Institute (FBRI), Department of Plant and Soil Science, Texas Tech University

Summary

Updegraff-metoden er den mest brukte metoden for celluloseestimering. Hovedformålet med denne demonstrasjonen er å gi en detaljert Updegraff-protokoll for estimering av celluloseinnhold i plantebiomasseprøver.

Abstract

Cellulose er den mest tallrike polymeren på jorden generert av fotosyntese og den viktigste bærende komponenten av cellevegger. Celleveggen spiller en viktig rolle i plantevekst og utvikling ved å gi styrke, stivhet, hastighet og retning av cellevekst, vedlikehold av celleformer og beskyttelse mot biotiske og abiotiske stressfaktorer. Celleveggen består hovedsakelig av cellulose, lignin, hemicellulose og pektin. Nylig har plantecellevegger blitt målrettet for andre generasjons biodrivstoff- og bioenergiproduksjon. Spesielt brukes cellulosekomponenten til plantecelleveggen til produksjon av cellulosisk etanol. Estimering av celluloseinnhold i biomasse er avgjørende for grunnleggende og anvendt celleveggforskning. Updegraff-metoden er enkel, robust og den mest brukte metoden for estimering av krystallinsk celluloseinnhold av plantebiomasse. Den alkoholløselige råcelleveggfraksjonen ved behandling med Updegraff-reagens eliminerer hemicellulose- og ligninfraksjonene. Senere blir Updegraff reagensresistent cellulosefraksjon utsatt for svovelsyrebehandling for å hydrolysere cellulose homopolymeren i monomeriske glukoseenheter. En regresjonslinje er utviklet ved hjelp av ulike konsentrasjoner av glukose og brukes til å estimere mengden glukose som frigjøres ved cellulosehydrolyse i eksperimentelle prøver. Til slutt er celluloseinnholdet estimert basert på mengden glukosemonomerer ved kolorimetrisk antronanalyse.

Introduction

Cellulose er den primære bærende komponenten av cellevegger, som finnes i både primære og sekundære cellevegger. Celleveggen er en ekstracellulær matrise som omgir planteceller og hovedsakelig består av cellulose, lignin, hemicellulose, pektin og matriseproteiner. Omtrent en tredjedel av plantene biomasse er cellulose1 og det spiller betydelige roller i plantevekst og utvikling ved å gi styrke, stivhet, hastighet og retning av cellevekst, vedlikehold av celleform og beskyttelse mot biotiske og abiotiske stressfaktorer. Bomullsfiber inneholder 95% cellulose2 innhold, mens trær inneholder 40% til 50% av cellulose avhengig av plantearter og organtyper3. Cellulosen består av gjentatte enheter av cellobiose, et disakkarid av glukoserester forbundet med β-1,4 glykosidiske bindinger4. Cellulosisk etanol produseres fra glukose avledet fra cellulosen som er tilstede i plantecelleveggene5. Cellulosisk fiber består av flere mikrofibriler der hver mikrofibril fungerer som kjerneenhet med 500-15000 glukosemonomerer1,6. Cellulose homopolymer syntetiseres av plasmamembran innebygde cellulosesyntasekomplekser (CSC)1,7. Individuelle cellulosesyntase A (CESA) proteiner syntetiserer glukankjeder og de tilstøtende glukankjedene er forbundet med hydrogenbindinger for å danne krystallinsk cellulose1,8. Cellulose finnes i flere krystallinske former med to dominerende former, cellulose Iα og cellulose Iβ som opprinnelige former9. I høyere planter finnes cellulose i cellulose Iβ-form mens lavere plantecellulose eksisterer i Iα form10,11. Totalt sett spiller cellulosen en betydelig rolle i å gi styrke og stivhet til plantecelleveggene.

Første generasjons biodrivstoff produseres hovedsakelig fra maisstivelse, sukkerrør og betesukker, som er matkilder, mens andre generasjons biodrivstoff fokuserer på biodrivstoffproduksjonen fra biomassemateriale fra ikke-matplantebiomassecelleveggmateriale12. Nøyaktig estimering av krystallinsk celluloseinnhold er ikke bare viktig for grunnleggende forskning på cellulosebiosyntese og celleveggdynamikk, men også for anvendt biodrivstoff- og bioproduktforskning. Ulike metoder er utviklet og optimalisert for estimering av cellulose i plantebiomassen, og Updegraff-metoden er den mest brukte metoden for celluloseestimering. Den første rapporterte metoden for celluloseestimering var av Cross og Bevan i 190813. Metoden var basert på prinsippet om alternativ klorering og ekstraksjon ved natriumsulfat. Cellulosen oppnådd av den opprinnelige så vel som modifiserte protokoller av Cross og Bevan-metoden viste imidlertid forurensning av små brøkdeler av lignin i tillegg til en betydelig mengde xylans og mannans14. Til tross for flere modifikasjoner for å fjerne lignin og hemicelluloses fra cellulosefraksjonen, beholdt Cross-Bevan-metoden en betydelig mengde mannans sammen med cellulose. Senere ble Kurschners metode utviklet ved å bruke salpetersyre og etanol for å trekke ut cellulose15. Denne metoden uttalte at total lignin og 75% av pentosanene ble fjernet, men de sanne celluloseresultatene var de samme som de som ble estimert ved kloreringsmetoden Cross og Bevan. En annen metode (Norman og Jenkins) ble utviklet ved å bruke metanol-benzen, natriumsulfat og natriumhypokloritt for å trekke ut cellulose16. Denne metoden beholdt også en brøkdel av lignin (3%) og betydelige mengder pentosaner som fører til nøyaktig estimering av cellulose. Senere brukte Kiesel og Semiganowsky en annen tilnærming til hydrolysert cellulose ved hjelp av 80% konsentrert svovelsyre, og de hydrolyserte reduserte sukkerene ble estimert av Bertrands metode17. De to metodene, Waksman's og Stevens18 og Salo14,19 som ble utviklet basert på Kiesel og Semiganowskys metode, ga også 4-5% mindre celluloseinnhold sammenlignet med tidligere metoder20.

Updegraff-metoden er den mest brukte metoden for estimering av krystallinsk celluloseinnhold. Denne metoden ble først beskrevet av Updegraff for måling av cellulose i 196921. Updegraff-metoden integrerer Kurschner-metoden (bruk av salpetersyre), Kiesel- og Seminowsky-metoder (hydrolyse av cellulose i glukosemonomerer ved hjelp av svovelsyre) med noen modifikasjoner, og antronanalysen av Viles og Silverman for enkel kolorimetrisk estimering av glukose og krystallinsk celluloseinnhold22. Prinsippet for denne metoden er bruk av eddiksyre og salpetersyre (Updegraff reagens) for å eliminere hemicellulose og lignin fra det homogeniserte plantevevet, som etterlater eddiksyre / salpetersyreresistent cellulose for videre behandling og estimering15. Den eddiksyreresistente cellulosen behandles med 67% svovelsyre for å bryte cellulosen i glukosemonomerer, og de frigjorte glukosemonomerene er estimert av antronanalyse21,23. Flere modifikasjoner av den opprinnelige Updegraff-metoden ble brukt til å forenkle prosedyren og celluloseestimering ved antronanalyse24. Generelt kan denne metoden deles inn i fem faser. I den første fasen fremstilles plantematerialet. I den andre fasen er råcelleveggen skilt fra den totale biomassen, da cellulose er nøkkelkomponenten i plantecellevegger. Senere, i tredje fase, er cellulosen skilt fra de ikke-cellulosecelleveggkomponentene ved behandling med Updegraff-reagens. I fjerde fase brytes den eddiksyreresistente cellulosen inn i glukosemonomerer ved svovelsyrebehandling. Svovelsyrebehandling av cellulose resulterer i dannelse av 5-hydroksymetylfurfuralforbindelser fra reaksjonen av glukosemonomerer med svovelsyre. Til slutt, i den siste fasen, genererer anthronen et grønt blått kompleks ved å koke med furfuralforbindelsen generert i forrige fase25. Denne antronbaserte kolorimetriske metoden ble først brukt i 1942 av Dreywood. Anthron er et fargestoff som identifiserer furfuralforbindelser av pentose og heksose dehydrerte produkter som 5-hydroksymetylfurfural, under sure forhold. Reaksjon med heksose gir en intens farge og bedre respons sammenlignet med pentoser25. Mengden bundet glukose måles ved spektrofotometerabsorbering ved 620 nm og intensiteten av det grønne blå komplekset er direkte proporsjonal med mengden sukker i prøven. De målte absorbansverdiene ble sammenlignet med en glukosestandard regresjonslinje for å beregne glukosekonsentrasjonen av prøven. Det målte glukoseinnholdet ble brukt til å estimere celluloseinnholdet i plantebiomassen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Eksperimentell forberedelse

  1. Grind tørket plantemateriale i et fint pulver.
  2. Protein Solubilization Buffer (PSB): Klargjør lagerløsninger på 1 M Tris (pH 8,8), 0,5 M etylendimintetraketisk syre (EDTA) (pH 8,0) og autoklaver dem. Lag fersk PSB-buffer fra disse lagerløsningene med endelige konsentrasjoner på 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA og 10% natrium dodecylsulfat (SDS) i sterilt vann.
  3. Forbered 100 ml 70% etanol (v / v): 70 ml 100% etanol og 30 ml sterilt vann.
  4. Forbered 100 ml metanol: kloroform i et 1:1-forhold (50 ml metanol og 50 ml kloroform).
  5. Forbered 82,5 ml Updegraff-reagens. Tilsett 75 ml eddiksyre til 7,5 ml salpetersyre slik at det ultimate forholdet mellom vann: eddiksyre: salpetersyre er i 2:8:1 (v/v). For å forberede 80% eddiksyre, oppløs 80 ml iseddiksyre i 20 ml sterilt vann (v / v).
  6. Forbered et ferskt lager av 1 mg / ml glukoseoppløsning. Løs opp 10 mg glukose i 10 ml vann (m/v).
  7. For å forberede 100 ml 67% svovelsyre (v / v), tilsett 67 ml konsentrert svovelsyre til 33 ml vann. Bruk alltid en glassflaske og tilsett syre sakte til vannet. Dette trinnet er eksotermisk (frigjør varme). Forbered derfor denne løsningen på is og avkjøl i kjøleskapet i minst 2 timer før bruk.
  8. Forbered ferske 0,2% anthrone (w / v) for hver batch av eksperimentelle prøver. Vei 0,2 g antron og oppløs i 100 ml forkjølet konsentrert svovelsyre i en glassflaske innpakket med aluminiumsfolie. Oppbevar i kjøleskap i 1-2 timer før bruk.
    MERK: Forkjølende konsentrert svovelsyre i kjøleskapet på eksperimentets dag, og fersk tilberedning av antron anbefales på det sterkeste for nøyaktig estimering av glukoseinnhold.

2. Fremstilling av plantebiomassemateriale

  1. Samle plantebiomasseprøver fra 2 måneder gamle bomullseks eksperimentelle linjer dyrket i drivhuset med samme vekstforhold, samme utviklingsstadium, samme posisjon av plantene og samme type vev (blad / stamme / rot).
    MERK: Samle minst tre biologiske replikeringer for hver prøve. Vask dem grundig med vann for å fjerne alt smuss fra rotvevet.
  2. Lufttørk rotvev i 2 dager på papirhåndklær ved romtemperatur for å fjerne fuktighetsinnholdet (Figur 1).
    MERK: Lufttørk ønsket vev for celluloseestimering for å forhindre soppforurensning.
  3. Plasser rotprøvene i individuelle beholdere. Merk deretter og tørk dem i inkubatoren ved 49 °C i 10 dager (Materialbord).
    MERK: Alternativt kan en frysetørker brukes til å tørke plantevevet på kortere tid (1 eller 2 dager) uten å forårsake kjemiske endringer i plantebiomassematerialet.
  4. Klipp de tørkede prøvene i små biter, frys dem i flytende nitrogen og slip i jevnt fint pulver ved hjelp av mørtel og pestle, en frysemølle eller en biomassekvern (figur 1).
    MERK: Frysefabrikken ble brukt med en hastighet på 10 cps i 3 sykluser.
  5. Samle det jordede vevet (figur 2) og fortsett med celleveggutvinningen.
    MERK: Prosessen kan settes på pause på dette tidspunktet ved å lagre prøvene i lufttette beholdere ved romtemperatur.

3. Utvinning av råcellevegger fra plantebiomasse

MERK: Plantecelleveggene inneholder cellulose, lignin, ikke-cellulosekomponenter, pektin, matriseproteiner, fenolforbindelser og vann26. Siden cellulose er til stede i cellevegger, er det første trinnet å skille celleveggkomponenten fra ikke-celleveggkomponenter i plantebiomassen26.

  1. Merk og vei individuelle blanke 2 ml rør før du starter cellevegguttrekkingsprosessen.
  2. Noter tomme rørvekter i en lab-bærbar PC før du fortsetter videre.
  3. Vei 20 mg pulverisert vev fra trinn 2.5 og overfør det til forhåndsveide 2 ml rør og merk dem.
  4. Tilsett 1 ml protein-solubiliseringsbuffer (PSB) (50 mM Tris hydroklorid (HCl) buffer pH 8,8, 0,5 mM EDTA og 10 % natriumdidesulfat (SDS) for å løse proteiner. Virvel og sentrifuge ved 25 200 x g i 5 min ved romtemperatur (RT). Etter sentrifugering, kast supernatanten og lagre pelletsen.
    MERK: Supernatanten kan lagres hvis proteinkomponenten må analyseres.
  5. Gjenta trinn 3.4 to ganger til.
  6. Til den beholdt pellets, tilsett 1 ml destillert vann og virvel. Sentrifuge ved 25 200 x g i 5 min ved romtemperatur (RT) og fjern supernatanten.
  7. Gjenta trinn 3.6 to ganger til.
  8. Tilsett 1 ml 70% etanol til den lagrede pellet, virvelen og varm den ved 70 °C i 1 time i et vannbad/varmeblokk for å fjerne løselige komponenter og stivelse fra prøvene. Virvel og sentrifuge ved 25 200 x g i 5 minutter ved RT. Kast supernatanten og lagre pelletsen.
  9. Gjenta trinn 3.8 en gang til.
  10. Til pellets tilsett 1 ml 100% metanol og virvel. Sentrifuge ved 25 200 x g i 5 min ved romtemperatur (RT) og fjern supernatanten.
  11. Tilsett 1 ml kloroform/metanol (kloroform og metanol i 1:1-forhold) til pellets og virvel. Sentrifuge ved 25 200 x g i 5 minutter ved RT og fjern supernatanten. Tilsetningen av metanol og kloroform løsningsmiddel løser seg og fjerner lipidfraksjonen fra biomassen27.
  12. Til pellets, tilsett 1 ml 100% aceton og virvel. Inkuber ved romtemperatur i 5 min. Sentrifuge ved 25 200 x g i 5 minutter ved RT og fjern supernatanten. Aceton fjerner pigmenter som klorofyll og frie fettsyrer fra biomassen28,29.
  13. Tørk pelletsen ved 37 °C over natten eller fortsett videre ved vakuumtørking.
    MERK: Den tørkede pelletsen er råcelleveggen som brukes til krystallinsk celluloseestimering. Prosessen kan settes på pause på dette tidspunktet eller fortsette videre ved hjelp av vakuumtørker for tørking av prøver.

4. Behandling med Updegraff reagens (eddiksyre og salpetersyre) for å fjerne ikke-cellulosiske komponenter

MERK: Protokollen innebærer bruk av syrer og andre kjemikalier. Bruk personlig verneutstyr (PVU) gjennom hele prosessen.

  1. Mål 5 mg av den tørkede råcelleveggpelletsen i et friskt 2 ml skruekappet rør. Legg merke til den nøyaktige vekten (figur 3)30.
  2. Inkluder en positiv kontroll på dette tidspunktet. Bruk 2 mg filterpapir (Materialliste) som en positiv kontroll som gir 80 % celluloseinnhold.
  3. Tilsett 1,5 ml updegraff-reagens til det veide 5 mg celleveggekstraktet og positiv kontroll. Bland ved virveling.
    MERK: Den positive kontrollen bør behandles på samme måte som de eksperimentelle prøvene fra dette trinnet og fremover. Dette trinnet skal utføres i avtrekkshetten med riktig personlig verneutstyr (PVU).
    FORSIKTIG: Dette trinnet bør utføres i skruehettrør for å forhindre sprut av prøve og popping av rørene. Tre biologiske replikeringer av hver prøve sammen med tre replikeringer for positiv kontroll bør inkluderes.
  4. Varm opp fjæringen ved 100 °C i 30 minutter i et kokende vannbad og avkjøl på en benk i 10 minutter. Sentrifuge ved 25 200 x g i 10 min ved RT. Fjern supernatanten ved sentrifugering og lagre pelletsen.
    MERK: Avfallet som genereres skal samles separat for organiske løsemidler, svovelsyre og Updegraff-reagens (eddiksyre og salpetersyre). Avfall med eddiksyre og salpetersyre bør holdes ved kjølige temperaturer med ventilerte hetter og aldri blandes med andre organiske løsningsmidler og andre syrer for å forhindre eksplosjon.
  5. Tilsett 1 ml vann til pelletsen. Sentrifuge ved 25 200 x g i 10 min ved RT. Fjern 500 μL av supernatanten og tilsett 1 ml aceton til røret.
  6. Sentrifuge ved 25 200 x g i 5 min ved RT. Fjern 1 ml supernatant, og tilsett 1 ml aceton til røret og sentrifugen ved 25 200 x g i 5 minutter ved RT.
  7. Etter sentrifugering, fjern all supernatant og suspendere pellet i 1 ml aceton. Inkuber rørene ved romtemperatur i 5 min og spinn på 25,200 x g i 5 min ved RT.
  8. Kast supernatanten og lagre pelletsen. Tørk pelletsen ved 37 °C over natten (Figur 3).
    MERK: Prosessen kan settes på pause på dette punktet eller fortsette å bruke vakuumtørker til tørking og gå videre til neste trinn.

5. Hydrolyse av cellulose etter syre for å produsere glukosemonomerenheter

  1. Tilsett 1 ml 67% svovelsyre til den tørkede pelletsen. Virvel for å blande pellet helt i syren.
  2. Rist rørene ved romtemperatur i 1 time for å oppløse cellulosepellet i 67% svovelsyre.
    MERK: Som et alternativ kan solubilisering av cellulosepellets i 67% svovelsyre forbedres ved sonikering av hver prøve i 10 minutter etter 30 min inkubasjon i shakeren. Etter sonikering kan prøver inkuberes i shakeren på RT. Vi observerte imidlertid fullstendig løselighet av cellulosepellet uten sonikering når vi starter med 5 mg råcelleveggekstrakt (figur 3). Denne prosedyren fungerte bra for ulike plantebiomasseprøver3.

6. Måling av glukoseinnhold ved antronanalyse og estimering av celluloseinnhold

  1. På dette stadiet er cellulosen i form av frie glukosemonomerer. Bestem mengden cellulose ved å måle mengden glukose som er tilstede i prøven ved spektrofotometri.
  2. Ta 10 μL av prøven fra trinn 5 og legg den til 490 μL sterilt destillert vann for å gjøre en fortynning av hver prøve til 500 μL. Vortex den fortynnede blandingen av prøve og vann i 10 sekunder.
  3. Tilsett 1 ml 0,2% nytilberedt anthronreagens til hvert rør og bland umiddelbart ved virveling.
  4. Kok opp prøver ved 100 °C i 10 minutter og avkjøl rørene på is i 5 minutter. Overfør 200 μL av hver prøve i tre brønner med en 96 brønnplate. Legg 96 brønnplaten i et spektrofotometer for å måle absorbansen ved 620 nm.
    MERK: For koking ved høy temperatur, bruk skrue kappede rør for å forhindre sprut av skadelige kjemikalier og for å unngå tap av prøver.

7. Tilberedning av glukosestandardkurve

  1. For å forberede glukosestandard, lag et friskt lager på 1 mg / ml glukose ved å oppløse 10 mg glukose i 10 ml sterilt destillert vann. Tilsett denne lagerløsningen på 1 mg/ml i trinn på 20 μL (0, 20, 40, 60, 80 100 120 140, 160, 180 μL) til sterilt destillert vann (totalt volum 1 ml) for å forberede glukosestandarder fra 0 μg til 180 μg/ml konsentrasjoner (figur 3). Virvel hver glukosestandard etter tilsetning av sterilt vann.
  2. Fra disse 10 forskjellige konsentrasjonene, aliquot 500 μL av hver glukosekonsentrasjon til et friskt 2 ml skruekappet rør.
  3. Tilsett 1 ml nytilberedt 0,2% antron til hvert rør og bland umiddelbart ved virveling. Inkuber på is og kok ved 100 °C i 10 minutter etterfulgt av inkubasjon på is i 5 min23.
  4. Overfør 200 μL av hver standard til tre brønner i en mikrotitratorplate på 96 brønner for tre tekniske repliker og mål absorbansen ved 620 nm (figur 3).
  5. Utvikle en standard glukosekurve ved å plotte forskjellige glukosekonsentrasjoner (0 til 180 μg/ml) mot normaliserte absorbansverdier ved 620 nm (figur 7). Bruk regresjonslinjen Y= mx+c generert fra absorbansverdiene for å beregne celluloseinnholdet i de forberedte prøvene.
    MERK: Glukosestandarder må være nytilberedt for hvert sett med eksperimenter. Konsentrasjonen av glukose bør økes hvis OD-verdiene er for høye / lave, slik at disse verdiene faller innenfor området av standard kurveabsorberingsverdier. Regresjonslinjen genererer forskjellige m- og c-verdier basert på glukosestandardene som brukes for hver gruppe prøver. Bland rør umiddelbart etter tilsetning av anthron23. Anthrone, fortynnede prøver og forberedte standarder ble alltid holdt kalde til antronanalysen ble utført på grunn av den eksotermiske karakteren av denne reaksjonen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bomullsplanter dyrket i det grønne huset ble valgt ut til denne studien. To forskjellige eksperimentelle linjer av bomull ble valgt for komparativ analyse av celluloseinnhold. For hver eksperimentell linje ble rotvevet samlet inn fra tre biologiske repliker. Totalt 500 mg vev ble homogenisert og 20 mg av det ble brukt til råcelleveggutvinning. Senere ble 5 mg råcellet veggekstrakt brukt til Updegraff reagensbehandling for å fjerne hemicellulose og lignin fra cellulose. Den rensede cellulosen ble hydrolysert ved svovelsyrebehandling for å bryte ned cellulosen i glukoseenheter. Resultatene av absorbansavlesninger ved 620 nm (Supplerende tabell 1) ble brukt til å måle glukosekonsentrasjon og estimere celluloseinnhold ved antronanalysen. De gjennomsnittlige absorbansverdiene til tre tekniske repliker ble normalisert ved å trekke fra den tomme absorbansverdien av 0 μg glukosekonsentrasjonen. Standardkurven for glukose ble generert ved hjelp av en spredt stolpediagram (figur 4).

Den resulterende regresjonslinjen, y = mx + c fra denne standardkurven, brukes til å beregne en ukjent glukosekonsentrasjon i de ekstraherte testprøvene ved hjelp av normaliserte absorbansavlesninger. For å beregne x (den ukjente glukosekonsentrasjonen i μg/μL) ble formelen (x = normalisert absorbans-c/m) brukt. C- og m-verdiene fra regresjonslinjen i standard glukosekurve (R2 = 0,99) ble brukt til å måle glukosekonsentrasjonen i μg/μL. Deretter er denne verdien delt på en fortynningsfaktor på 2 da det endelige volumet er 500 μL og videre delt på et 10 μL prøvevolum for å måle glukosekonsentrasjonen i μg / μL. Siden den beregnede verdien er for 5 mg celleveggekstrakt, er den videre delt på 5 eller med den respektive råcelleveggvekten som brukes til hver eksperimentell prøve for å få glukosekonsentrasjon per mg. Verdien er videre delt på 1,1 for å kompensere for vannet som oppnås i hydrolyseprosessen (glukose har en molekylvekt på 180 og et vannmolekyl har en molekylvekt på 18 og dermed ble vannet som genereres i ferd med å frigjøre glukosemonomerer fjernet ved å dele fuktighetsfaktoren, 1,1). Den resulterende verdien multipliseres med 100 for å beregne det krystallinske celluloseinnholdet i prosent (Supplerende tabell 1).

Resultatene av celluloseinnholdet viser at de er konsistente blant de biologiske replikeringene, noe som tyder på den tekniske nøyaktigheten til Updegraff-metoden. Videre ble forskjellene plottet inn ved hjelp av 2D-grafer. Disse resultatene viste celluloseinnholdsforskjellene i de sammenlignede eksperimentelle utvalgstallene 1 og 2 (Figur 4). Eksempel 1 viser 43,4 % mens utvalg 2 viser 28,12 %, noe som tyder på at denne metoden kan skille forskjeller mellom de eksperimentelle prøvene. En Student t-test ble brukt på 95% signifikansnivå for å teste deres signifikante forskjeller.

Figure 1
Figur 1: Fremstilling av bomullsplantebiomasse for celluloseinnholdsestimering i røtter. (A) Drivhusplanter ble forsiktig trukket fra jorda og vasket grundig med vann. Planterotvevet ble separert, holdt på papirhåndklærne og tillatt å lufttørke i 2 dager. (B) Deretter ble rotvevet overført til individuelt merkede beholdere og tillatt å tørke i inkubatoren ved 49 °C i -10 dager. (C) Det tørkede vevet ble kuttet i små biter, frosset i flytende nitrogen, lastet i slipehettene og jordet i fint pulver ved hjelp av frysemølle. (D) Finmalt vevspulver ble samlet inn i 50 ml-røret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Flytskjema over hovedtrinnene som er involvert i Updegraff-metoden. (A) Billedlig fremstilling av viktige trinn i protokollen. (B) Forklarer kritiske trinn som ble vist i panelet (A). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Fremstilling av ulike konsentrasjoner av glukose for standardkurven. (A) Forbered lagerløsningen av glukose ved å oppløse 10 mg glukose i 10 ml sterilt destillert vann slik at den endelige konsentrasjonen av lageret er 1 mg / ml. Tilsett lageroppløsning på 1 mg/ml glukose i trinn på 20 μL til et endelig volum på 1 ml sterilt destillert vann for å forberede forskjellige konsentrasjoner av glukose fra 0 μg til 180 μg/ml. (B) Tabell som viser mengden 1 mg/ml glukose og sterilt destillert vann som skal tilsettes for å gjøre forskjellige konsentrasjoner av glukose. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Glukosestandardkurve generert ved hjelp av absorbansverdier av forskjellige glukosekonsentrasjoner ved 620 nm. (A) Tabell som viser forskjellige konsentrasjoner av glukose fra 0 til 180 μg /ml med de respektive normaliserte absorbansverdiene ved 620 nm. (B) Glukose standardkurve generert ved hjelp av et punktdiagram fra absorbansverdiene (A). (C) Stolpediagram som viser forskjeller i krystallinsk celluloseinnhold i de eksperimentelle prøvene 1 og 2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende tabell 1: Estimering av celluloseinnhold i de eksperimentelle prøvene. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bomullsfibre er naturlige fibre produsert av bomullsseed. Bomullsfiber er en enkelt celle med ~ 95% celluloseinnhold2 med høyt krystallinsk celluloseinnhold med omfattende applikasjoner i tekstilindustrien31. Som, bomullsfiber inneholder ~ 95% cellulose, har vi brukt bomull rotvev for demonstrasjon av estimering av krystallinsk celluloseinnhold. Bomullsrotvev er moderat rik på krystallinsk celluloseinnhold og representerer en vanlig tilgjengelig plantebiomasse. Mengden total cellevegg som kreves for det krystallinske celluloseinnholdet er bare 5 mg, og derfor kan denne metoden brukes til å estimere krystallinsk celluloseinnhold i ulike utviklingsstadier / vevsspesifikk celluloseinnholdsestimering. Prosentandelen svovelsyre (67 %) spiller også en kritisk rolle i å bryte cellulose i glukosemonomerer og oppløse cellulose helt23 uten behov for sonikering. Prøvetap er vanlig etter Updegraff-behandlingen, da den krystallinske cellulosepelletsen ikke er solid på bunnen av røret på forskjellige trinn i estimeringsprosessen. Dette kan minimeres ved å fjerne små mengder supernatant i hvert trinn av vann- og acetonvask etter Updegraff-behandling. Videre spiller umiddelbar virveling av utvalget og standardene med antron betydelige roller i fargeutvikling og økt nøyaktighet av standardene, noe som fører til 99,5% bestemmelseskoeffisient (R2) verdier (figur 3). Glukosestandardkurven er nøkkelen til å bestemme glukosekonsentrasjonen, som igjen brukes til å estimere det krystallinske celluloseinnholdet. Derfor kan konsentrasjonene av glukose justeres i henhold til det nødvendige spekteret av konsentrasjoner. Avhengig av verdiområdet som passer til eksperimentelle verdier, kan standardkurven variere fra 0 til 100 μg / ml eller 0 til 200 μg / ml opp til 1000 μg / ml konsentrasjoner av glukose; Dette endrer ytterligere regresjonsverdiene c og m, noe som forbedrer nøyaktigheten av krystallinsk celluloseestimering. Det er viktig å alltid lage friske 0,2% anthrone for både prøver og for standarden. R-kvadrat, et statistisk mål, representerer variasjonen av alle datapunktene på regresjonslinjen. Det er viktig å koke både standarder og prøver etter å ha lagt til antron i samme tid. Det er alltid viktig å inkludere en positiv kontroll med et kjent celluloseinnhold. For effektiv datareroduserbarhet må hele prosedyren følges nøyaktig, inkludert løsningsforberedelse (standarder, standardkurve og Updegraff-reagens).

Nylig er cellulose utforsket for ikke-tekstilapplikasjoner som cellulose aerosoler, datadeler og cellulosisk etanol32,33; Derfor vil denne metoden ha brede applikasjoner i fremtiden. Vitenskapelig fremgang gjøres gjennom inkrementell fremgang i å forstå begreper, foreslå alternative hypoteser og gi / motbevise eksisterende kunnskap. Lignende fremgang kan ses i utviklingen av en pålitelig metode for estimering av celluloseinnhold i plantebiomassen. Celleveggen er en kompleks matrise, og Updegraff-metoden eliminerer ikke-cellulosefraksjoner fra ren cellulose på en sekvensiell måte, noe som fører til nøyaktig estimering av celluloseinnholdet i plantebiomassen. Videre gjorde den enkle kolorimetriske metoden utviklet for estimering av celluloseinnhold ved å måle glukosekonsentrasjonen denne metoden svært tilpasningsdyktig og mye brukt. I den nåværende studien var cellulosedataene konsistente blant forskjellige biologiske replikeringer av prøvene samlet inn fra en enkelt linje. Dermed antyder det at dataene som produseres av denne metoden er konsistente, pålitelige, reproduserbare og enkle å måle celluloseinnholdet ved enkel kolorimetrisk analyse.

Updegraff-metoden er den mest brukte metoden for celluloseestimering. Med nylig utvidelse av den industrielle anvendelsen av cellulose som mat, tre, papir, fibre, biodrivstoff, klær, kosmetikk og legemidler, er nøyaktig estimering av celluloseinnhold i plantebiomassen avgjørende for ulike bruksområder. Selv om dette er den mest brukte metoden for celluloseestimering, er det viktig å ta flere forholdsregler for å få reproduserbare data. Biomasseprøvene bør males i samme størrelse for å oppnå presis og reproduserbar estimering av celluloseinnholdet. Forsiktighet bør tas mens du genererer glukosestandardkurven. Glukosestandarder som brukes til glukosestandardkurvepreparatet, bør økes eller reduseres basert på prøveabsorberingsavlesningene, slik at de ukjente konsentrasjonene faller innenfor området glukosekonsentrasjoner som brukes til å forberede standardkurven. Hvis ikke, kan m- og c-verdier variere, noe som resulterer i unøyaktig estimering av krystallinsk celluloseinnhold. Fersk forberedelse av 0,2 % antron for hver prøvegruppe er et annet kritisk trinn i Updegraff-metoden. Det er viktig å bruke nylaget 0,2 % antron for nøyaktig estimering av celluloseinnholdet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi takker Institutt for plante- og jordvitenskap og bomull inc. for deres delvise støtte til denne studien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Chemical A18-500 Used in the protocol
Anthrone Sigma Aldrich 90-44-8 For colorimetric assay
Centrifuge Eppendorf 5424 For centrifugation
Chloroform Mallinckrodt 67-66-3 Used in the protocol
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich 6381-92-6 Used in the protocol
Ethanol Millipore Sigma EM-EX0276-4S Used in the protocol
Filter paper Whatman 1004-090 Positive control
Glacial acetic acid Sigma SKU A6283 Used in the protocol
Heat block/ ThermoMixer F1.5 Eppendorf 13527550 For controlled temperatures
Incubator Fisherbrand 150152633 Used for drying plant sample
Measuring Scale Mettler Toledo 30243386 For specific quantities
Methanol 100 % Fisher Chemical A412-500 Used in the protocol
Microplate (96 well) Evergreen Scientific 222-8030-01F For anthrone assay
Nitric acid Sigma Aldrich 695041 Used in the protocol
Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes BioSpec Products 10831 For high temperatures
Spectrophotometer(Multimode Detector) Beckmancoulter DTX880 1000814 For measuring absorbances
Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill Spex Sample Prep 68-701-15 For grinding plant tissues into fine powder
Sulphuric acid J.T.Baker 02-004-382 Used in the protocol
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma Aldrich 151-21-3 Used in the PSB buffer
Tubes (2 mL) Fisher Scientific 05-408-138 Used in the protocol
Tris Hydrochloride Sigma Aldrich  1185-53-1 Used in the PSB buffer
Ultrapure distilled water Invitrogen 10977 Used in the protocol
Vacuum dryer (vacufuge plus) Eppendorf 22820001 For drying samples
Vortex mixer Fisherbrand 14-955-151 For mixing
Waterbath Thermoscientific TSGP02PM05 For temperature controlled conditions at specific steps
Weighing Paper Fisher Scientific 09-898-12A Used in the protocol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Somerville, C. Cellulose synthesis in higher plants. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 53-78 (2006).
  2. Balasubramanian, V. K., Rai, K. M., Thu, S. W., Hii, M. M., Mendu, V. Genome-wide identification of multifunctional laccase gene family in cotton (Gossypium spp.); expression and biochemical analysis during fiber development. Scientific Reports. 6, 34309 (2016).
  3. Mendu, V., et al. Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production. Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).
  4. Kraszkiewicz, A., Kachel-Jakubowska, M., Lorencowicz, E., Przywara, A. Influence of cellulose content in plant biomass on selected qualitative traits of pellets. Agriculture and Agricultural Science Procedia. 7, 125-130 (2015).
  5. Jordan, D. B., et al. Plant cell walls to ethanol. Biochemical Journal. 442, 241-252 (2012).
  6. Brett, C. T. Cellulose microfibrils in plants: biosynthesis, deposition, and integration into the cell wall. International Review of Cytology. 199, 161-199 (2000).
  7. Li, S., et al. Cellulose synthase complexes act in a concerted fashion to synthesize highly aggregated cellulose in secondary cell walls of plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 11348-11353 (2016).
  8. Polko, J. K., Kieber, J. J. The regulation of cellulose biosynthesis in plants. The Plant Cell. 31, 282-296 (2019).
  9. Brown, R. M. The biosynthesis of cellulose. Journal of Macromolecular Science, Part A. 33, 1345-1373 (1996).
  10. Gautam, S. P., Bundela, P. S., Pandey, A. K., Jamaluddin, M. K., Sarsaiya, A., Sarsaiya, S. A review on systematic study of cellulose. Journal of Applied and Natural Science. 2, (2010).
  11. Coughlan, M. P. Enzymic hydrolysis of cellulose: An overview. Bioresource Technology. 39, 107-115 (1992).
  12. Robak, K., Balcerek, M. Review of second generation bioethanol production from residual biomass. Food Technology and Biotechnology. 56, 174-187 (2018).
  13. Cross, C. F., Bevan, E. J. Cellulose and chemical industry. Journal of the Society of Chemical Industry. 27, 1187-1193 (1908).
  14. Paloheimo, L., Eine, H., Kero, M. L. A method for cellulose determination. Agricultural and Food Science. 34, (1962).
  15. Kurschner, K., Hanak, A., Diese, Z. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung. 59, 448-485 (1930).
  16. Norman, A. G., Jenkins, S. A new method for the determination of cellulose, based upon observations on the removal of lignin and other encrusting materials. Biochemical Journalournal. 27, (1933).
  17. Kiesel, A., Semiganowsky, N. Cellulose-Bestimmung durch quantitative verzuckerung. Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft (A and B Series). 60, 333-338 (1927).
  18. Waksman, S. A. S., et al. A system of proximate chemical analysis of plant materials. Industrial Engineering Chemistry and Analytical Edition. 2, 167-173 (1930).
  19. Salo, M. -L. Determination of carbohydrates in animal foods as seven fractions. Agricultural and Food Science. , 32-38 (1961).
  20. Giger-Reverdin, S. Review of the main methods of cell wall estimation: interest and limits for ruminants. Animal Feed Science and Technology. 55, 295-334 (1995).
  21. Updegraff, D. M. Semimicro determination of cellulose inbiological materials. Analytical Biochemistry. 32, 420-424 (1969).
  22. Viles, F. J., Silverman, L. Determination of starch and cellulose with anthrone. Analytical Chemistry. 21, 950-953 (1949).
  23. Scott, T. A., Melvin, E. H. Determination of dextran with anthrone. Analytical Chemistry. 25, 1656-1661 (1953).
  24. Kumar, M., Turner, S. Protocol: a medium-throughput method for determination of cellulose content from single stem pieces of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 11, 46 (2015).
  25. Yemm, E. W., Willis, A. J. The estimation of carbohydrates in plant extractsby anthrone. Biochemical Journal. 57, 508-514 (1954).
  26. Houston, K., Tucker, M. R., Chowdhury, J., Shirley, N., Little, A. The plant cell wall: A complex and dynamic structure as revealed by the responses of genes under Stress conditions. Frontiers in Plant Science. 7, (2016).
  27. Jiang, G., et al. Biomass extraction using non-chlorinated solvents for biocompatibility improvement of polyhydroxyalkanoates. Polymers. 10, 731 (2018).
  28. Li, T., et al. A saponification method for chlorophyll removal from microalgae biomass as oil feedstock. Marine Drugs. 14, 162 (2016).
  29. Wiltshire, K. H., Boersma, M., Möller, A., Buhtz, H. Extraction of pigments and fatty acids from the green alga Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae). Aquatic Ecology. 34, 119-126 (2000).
  30. Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. Comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part II: carbohydrates. Journal of Visualized Experiments. (1837), (2010).
  31. Haigler, C., Betancur, L., Stiff, M., Tuttle, J. Cotton fiber: a powerful single-cell model for cell wall and cellulose research. Frontiers in Plant Science. 3, (2012).
  32. Spirk, S., Nypelö, T., Kontturi, E. Editorial: Biopolymer thin films and coatings. Frontiers in Chemistry. 7, (2019).
  33. Long, L. -Y., Weng, Y. -X., Wang, Y. -Z. Cellulose aerogels: Synthesis, applications, and prospects. Polymers. 10, 623 (2018).

Tags

Miljøvitenskap Utgave 171 Cellevegg biomasse cellulose hemicellulose lignin hemicellulose og anthronanalyse
Estimering av krystallinsk celluloseinnhold av plantebiomasse ved hjelp av Updegraff-metoden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dampanaboina, L., Yuan, N., Mendu,… More

Dampanaboina, L., Yuan, N., Mendu, V. Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method. J. Vis. Exp. (171), e62031, doi:10.3791/62031 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter