Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Samling og drift af en acoustofluidic enhed til forbedret levering af molekylære forbindelser til celler

Published: January 21, 2021 doi: 10.3791/62035
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 2, 3, 2, 1
1Department of Bioengineering, University of Louisville, 2School of Medicine, University of Louisville, 3Department of Biology, University of Louisville

Summary

Denne protokol beskriver samling og drift af en billig acoustofluidic enhed til hurtig molekylær levering til celler via sonoporation induceret af ultralyd kontrast agenter.

Abstract

Effektiv intracellulær levering af biomolekyler er nødvendig for en bred vifte af biomedicinsk forskning og cellebaserede terapeutiske anvendelser. Ultralyd-medieret sonoporation er en ny teknik til hurtig intracellulær levering af biomolekyler. Sonoporation opstår, når kavitation af gasfyldte mikrobobler danner forbigående porer i nærliggende cellemembraner, hvilket muliggør hurtig optagelse af biomolekyler fra den omgivende væske. Nuværende teknikker til in vitro sonoporation af celler i suspension er begrænset af langsom gennemløb, variation i ultralyd eksponering betingelser for hver celle, og høje omkostninger. For at løse disse begrænsninger er der udviklet en billig acoustofluidic enhed, som integrerer en ultralydtransducer i en PDMS-baseret fluidic enhed for at fremkalde konsekvent sonoporation af celler, når de strømmer gennem kanalerne i kombination med ultralydkontraststoffer. Enheden fremstilles ved hjælp af standard fotolitografiteknikker til fremstilling af den PDMS-baserede fluidic chip. En ultralyd piezo disk transducer er knyttet til enheden og drevet af en mikrocontroller. Samlingen kan integreres i en 3D-printet kasse for ekstra beskyttelse. Celler og mikrobobler skubbes gennem enheden ved hjælp af en sprøjtepumpe eller en peristaltisk pumpe, der er forbundet til PVC-slanger. Forbedret levering af biomolekyler til humane T-celler og lungekræftceller demonstreres med dette acoustofluidic system. Sammenlignet med bulkbehandlingsmetoder øger dette acoustofluidic system gennemstrømningen og reducerer variationen, hvilket kan forbedre cellebehandlingsmetoder til biomedicinske forskningsformål og fremstilling af cellebaseret terapi.

Introduction

Virale og ikke-virale platforme er blevet brugt til at forbedre molekylær levering til celler. Viral levering (transduktion) er en almindelig teknik, der anvendes i cellebaserede terapier, der kræver genomisk modifikation. Begrænsninger med viral levering omfatter potentiel insertional mutagenesis, begrænset transgen kapacitet og uønsket mangfoldighed af infektion1,2. Derfor er ikke-virale molekylære leveringsteknikker under udvikling til en bred vifte af biomedicinske og forskningsmæssige anvendelser. Almindelige teknikker omfatter mekaniske, elektriske, hydrodynamiske, eller brugen af laser-baseret energi til at øge optagelsen af biomolekyler i celler 3. Elektroporation er en almindeligt anvendt ikke-viral molekylær leveringsplatform, som har evnen til at fremkalde forbigående perforering i plasmamembranen til intracellulær levering af molekylære forbindelser4,5,6,7,8,9. Den forbigående perforering af plasmamembranen er imidlertid en stokastisk proces, og molekylær optagelse via elektroporation er generelt afhængig af passiv diffusion på tværs af de forbigående membranporer4,7,8.

En alternativ metode er brugen af ultralyd til forbedret intracellulær molekylær levering via kavitation af ultralydkontrastmidler (dvs. gasfyldte mikrobobler). Mikrobubble cavitation fremkalder mikrostrømseffekter i de omgivende medier, som kan forårsage forbigående perforering af nærliggende plasmamembraner ("sonoporation"), hvilket muliggør hurtig intracellulær optagelse af biomolekyler via passive eller aktive transportmekanismer10,11,12. Sonoporation er en effektiv teknik til hurtig molekylær levering til celler, men denne tilgang kræver ofte dyrt udstyr og bulkbehandlingsmetoder, som er begrænset af lavere gennemløb og højere variation i ultralydseksponeringsbetingelser13. For at løse disse begrænsninger er acoustofluidic enheder, som muliggør konsekvent sonoporation af celler i suspension, i øjeblikket under udvikling.

Acoustofluidics er et ekspanderende felt, der integrerer ultralyd og mikrofluidiske teknologier til en lang række applikationer. Denne fremgangsmåde har tidligere været anvendt til partikelseparation ved at anvende kontinuerlig ultralydsenergi til at fremkalde stående akustiske bølger i de fluidiske kanaler14,15,16,17. Partikler sorteres mod forskellige dele af enheden baseret på en række egenskaber, f.eks. Acoustofluidic teknologier er også under udvikling for at muliggøre hurtig molekylær levering til en række celletyper til forskningsapplikationer og fremstilling af celleterapier18. For nylig demonstrerede vi forbedret molekylær levering til erythrocytter ved hjælp af en PDMS-baseret acoustofluidic enhed19. I acoustofluidic platform, celle og mikroboble dynamik kan manipuleres til at fremkalde fysiske interaktioner, der muliggør øget levering af biomolekyler. Effektiviteten og konsistensen af intracellulær molekylær levering kan potentielt øges ved at optimere afstanden mellem celler og mikrobobler.

En vigtig ansøgning om encoustofluidic-medieret sonoporation indebærer transport af biomolekyler i primære menneskelige T-celler. Immunterapier baseret på adoptiv T-celleoverførsel, såsom Chimeric Antigen Receptor T-celle (CAR T) terapi, er hurtigt ved at opstå til behandling af forskellige sygdomme, herunder kræft og vira som HIV20. CAR T terapi har været særligt effektiv i pædiatrisk akut lymfoblastisk leukæmi (ALL) patienter, med fuldstændig remission på 70-90%21. Men, T celle fremstilling for disse behandlinger generelt afhænger af viral transduktion, som er begrænset af potentielle insertional mutagenesis, lange behandlingstider, og udfordringer med at levere ikke-genetiske biomolekyler såsom proteiner eller små molekyler1. Acoustofluidic-medierede molekylære leveringsmetoder kan potentielt overvinde disse begrænsninger og forbedre fremstillingen af T-celleterapier.

En anden vigtig anvendelse for acoustofluidic-medieret sonoporation indebærer intracellulær levering af konserveringsmidler forbindelser, såsom trehalose, som beskytter celler under frysning og udtørring. Trehalose produceres af nogle organismer i naturen og hjælper dem med at tolerere frysning og udtørring ved at beskytte deres cellulære membraner22,23. Trehalose produceres imidlertid ikke af pattedyrceller og er uigennemtrængelig for pattedyrscellemembraner. Derfor er effektive molekylære leveringsteknikker, såsom sonoporation, nødvendige for at opnå tilstrækkelige intracellulære trehaloseniveauer, der kræves for at beskytte interne cellulære membraner. Denne tilgang er i øjeblikket under udvikling for tør konservering af forskellige celletyper.

Denne protokol giver en detaljeret beskrivelse af samling og drift af et relativt billigt acoustofluidic system drevet af en mikrocontroller. Ultralyd kontrast agenter udnyttes til at fremkalde sonoporation inden for de fluidiske kanaler og muliggøre hurtig molekylær levering til forskellige celletyper, herunder T-celler og kræftceller. Dette acoustofluidic system kan bruges til en række forskellige forskningsapplikationer og kan også være nyttigt som et prototypesystem til evaluering af sonoporationsmetoder til forbedrede fremstillingsprocesser for celleterapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Fuldblodsdonationer blev indsamlet fra raske donorer efter protokoller godkendt af den institutionelle review board ved University of Louisville.

1. Fremstilling af encoustofluidic anordning

  1. Få en fotomaske med et koncentrisk spiraldesign, der indeholder kanaler med en diameter på 500 μm. En CAD-fil findes i de supplerende filer som et eksempel. En brugerdefineret fotomaske kan bestilles hos en kommerciel leverandør eller mønstres ved hjælp af en maskeforfatter.
  2. Forbered en form af koncentrisk spiral design på en fotoresist-belagt silicium wafer ved hjælp af standard fotolitografi teknikker.
    1. Tilsæt ca. 2 spsk (~30 mL) SU-8 2100 til en 100 mm siliciumskiver.
    2. Spin-coat wafer på en spinner med en hastighed på 150 omdrejninger i minuttet for 30 s at sprede ud fotoresist, derefter øge hastigheden til 1.200 rpm for 60 s at give en tykkelse på 200 μm.
    3. Den fotoresistbelagte wafer i en polyimidvakuumovn hærdes med en rampe på 30 minutters stigning og 30 minutters ophold ved 115 °C, og rampen derefter ned i 30 min.
    4. Udsæt den fotoresistbelagte wafer i 130 s ved hjælp af en maske aligner med fotomasken fra trin 1.1.
    5. Waferen bages efter eksponering efter den samme proces, der er beskrevet i trin 1.2.3.
    6. Udvikl fotoresisten i SU-8 udviklerløsning i ca. 8 min.
      ADVARSEL: Brug kun udvikleropløsning i en godt ventileret kemisk røghætte.
  3. Silanize formen for at gøre overfladen mere hydrofobisk. Den fotoresistbelagte wafer anbringes i en ekssikkator, og der tilsættes en 20 μL dråbe chlorosilane (C8H4Cl3F13Si). Påfør vakuum på kammeret i 30 s, luk derefter kammeret og lad natten over.
    ADVARSEL: Klorosilane er meget farligt og brandfarligt. Eksponering forårsager alvorlige forbrændinger og øjenskader.
  4. Kombiner 54 g polydimethsiloxan (PDMS) base og 6 g hærdningsmiddel i en kop og bland kraftigt og grundigt med en spatel i mindst 1 min.
  5. Placer koppen, der indeholder PDMS-opløsningen, i en ekssikkator i ca. 30 minutter, eller indtil restluftbobler fjernes fra opløsningen.
  6. Placer fotoresistbelagt wafer med mønstrene opad i en 150 mm petriskål.
  7. Hæld PDMS-opløsningen over formen inde i 150 mm petriskålen.
  8. Hvis det er nødvendigt, skal du placere 150 mm petriskålen i en ekssikkator og påføre vakuum, indtil rester af luftbobler forsvinder.
  9. 150 mm petriskålen overføres til en laboratorieovn og bages i 2 timer ved 60 °C for at hærde PDMS' et.
  10. Efter hærdning skal du forsigtigt fjerne PDMS fra petriskålen ved at skære rundt om kanterne af waferen ved hjælp af et barberblad.
  11. Klip hver enkelt enhed ud med en kniv eller et barberblad.
  12. Punch huller gennem indløb og udløbsporte på hver enhed ved hjælp af en 2,5 mm biopsi punch.
  13. Placer hver PDMS-enhed i en plasmakonher med kanaler udsat (opad). Påfør iltplasmabehandling (100 W for 45 s, 500 mbar O2), og placer derefter straks hver PDMS-enhed på en ren sodavandskalkglasmikroskop (75 mm x 25 mm x 1 mm) med kanaler, der vender mod glasoverfladen.
  14. Lad enheder binde natten over ved stuetemperatur.
  15. Påfør forsigtigt silikone på overfladen af piezotransduceren med en diameter på 1 cm i en tykkelse på ~ 1-2 mm, juster derefter forsigtigt transduceren med den koncentriske spiral og tryk den forsigtigt på bunden af glasmikroskoprutschebanen (modsat side fra PDMS-enheden).

2. Samling og drift af etcoustofluidic system

  1. Tilslut en mikrocontroller til en computer ved hjælp af et USB A til B-kabel. En grøn effekt LED-indikator (mærket PWR) skal lyse.
  2. Brug det tilknyttede program på computeren til at overføre et program, der genererer et 8 MHz-signal. Et eksempel program er fastsat i supplerende Files. Efter upload af programmet, vil det blive gemt i mikroprocessor hukommelse og behøver ikke at blive uploadet igen.
  3. Lodde en 1 "22G ledning til slutningen af hver ledning på PZT transducer.
  4. Tilslut den negative (sorte) terminalledning af PZT-transducer til en GND-nål via den loddede ledning.
  5. Tilslut den positive (røde) terminalledning af PZT-transducer til udgangsstiften (#9 i det medfølgende eksempelprogram) via loddetråden.
  6. Monteres eventuelt den acoustofluidic enhed og mikrocontrolleren i en 3D-printet kasse. CAD-filer findes iS-upplemental Files som eksempler. Yderligere ledninger kan tilsluttes andre mikrocontrollerstifter for at styre en ekstern LED-indikator og tænd/ sluk-knap, hvis det ønskes.
  7. Skær 3-6 "sektioner af tygon PVC blød plast slange (1 / 16 " ID, 1 / 8 "OD) og skubbe slangen ind i indløb og udløb porte. Det kan være nødvendigt at rotere slangen, mens der trykkes, indtil den passer ind i åbningen. Når slangen er indsat i hver port, kan der eventuelt påføres lim ved krydset for at binde PDMS og slangen sammen.
  8. Saml det mikrofluidiske reservoir i henhold til producentens anvisninger.
  9. Skær en 3-6 "del af tygon PVC blød plast slange (1 / 16 " ID, 1 / 8 "OD) og skubbe slangen over 1 / 32 "ID-slange fra mikrofluidic reservoir output slange. Du kan også pakke krydset ind med paraffinfilm for at forhindre lækage.
  10. Fyld en 60-mL sprøjte med omgivende luft (eventuelt filtrere luften med et 0,2-μm filter) og tilslut den til tygon PVC-slange (1/16" ID, 1/8" OD) på siden af det mikrofluidiske reservoir.
  11. Sæt sprøjtepumpen til en hastighed på 200 mL/h for at skubbe celle-/ultralydskontrastmiddelopløsningerne gennem den acoustofluidiske enhed med en volumetrisk strømningshastighed på 50 mL/h og indsamle prøverne fra acoustofluidic-enhedens output i et 50 mL centrifugerør. Eventuelt skylles kanal før acoustofluidic behandling med 15 ml 70% ethanolopløsning for at øge steriliteten af fluidiske kanaler. Derudover kan kanaler skylles med 15 mL deioniseret vand for at fjerne resterende ethanol i enheden, før der pumpes celler gennem systemet.

3. Forberedelse af ultralyd kontrast agenter

BEMÆRK: Ultralydkontraststoffer forbedrer acoustofluidic levering af molekylære forbindelser betydeligt ved forbigående stigende gennemtrængning af nærliggende cellulære membraner19. Molekylær levering er meget begrænset uden ultralyd kontrast agenter i dette system.

  1. Der fremstilles en fosforopløsning i et 20 mL scintillationsglas, der indeholder følgende blanding:
    1. Der tilsættes 25 mg 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DSPC).
    2. Der tilsættes 11,6 mg 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin (DSEPC).
    3. Der tilsættes 0,26 mg 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG).
    4. Der tilsættes 0,88 mg polyoxyethylen40 stearit.
  2. Der tilsættes kloroform, indtil alle fosfolipider er opløst (f.eks. 3 ml kloroform).
  3. Fordamp kloroform i en desiccator i 48 timer for at danne en tør lipidfilm (fordampning under argon eller med en roterende fordamper kan bruges til at fremskynde tørringsprocessen).
  4. Rehydrer lipidfilmen med 10 mL steril fosfatbufferet saltvand (PBS).
  5. Sonicate lipidopløsningen i 3 minutter ved 40% amplitude for at danne en kationisk micellaropløsning.
  6. Efter sonikering opbevares fosforopløsningen ved 2-6 °C i op til 1 måned.
  7. For at forberede ultralydkontrastmidler tilsættes 200 μL kationisk micellaropløsning og 600 μL steril PBS til et 2 ml glas septumglas.
  8. Forsegl hætteglasset ved at presse hætten.
  9. Brug en 1,5" 20G nål til at fylde hætteglassets hovedplads med decafluorobutane gas i 30 s.
  10. Amalgamat hætteglasset i 45 s ved 4.350 cpm til at danne perfluorobutane gasfyldt ultralyd kontrast agenter.
  11. Der tilsættes 25 μL ultralydskontrastmiddelopløsning pr. 1 ml celleopløsning umiddelbart før pumpning af det kombinerede kontrastmiddel/celleblanding gennem den acoustofluidiske enhed. Celleopløsningen kan ændres efter ønske af brugeren, men i vores undersøgelser bestod celleopløsningen af primære T-celler i trin 4.21 og A549 lungekræftceller i henholdsvis trin 5.7.

4. Forberedelse af primære Tcells

  1. Perifere mononukleare blodceller (PBMCs) isoleres fra fuldblodsopløsninger og opbevares ved -150 °C. Tæthed gradient adskillelse indeholder et substrat er almindeligt anvendt til at adskille PBMCs fra fuldblod24,25,26.
  2. Optø frosset hætteglas i 37 °C vandbad.
  3. Optøede PBMCs fortyndes 1:10 med PBS i et 15mL centrifugerør. Hvert 1mL hætteglas indeholder ca. 10 millioner PBMCs.
  4. Centrifuge fortyndede PBMC'er ved 580 x g i 11 minutter ved 4 °C.
  5. Aspirér supernatanten, og tilføj 13 mL MPC'er, der kører buffer, for at genbruge cellerne.
  6. Tæl PBMCs med en automatiseret celletæller eller hæmocytometer.
  7. PBMC'erne centrifugeres igen ved 580 x g i 11 minutter ved 4 °C, og supernatanten aspireres.
  8. Der tilsættes 40 μL kølet løbebuffer pr. 10 millioner PBMC'er.
  9. For at isolere T-celler tilsættes 10 μL Pan T-Cell Biotin Antistofcocktail pr. 10 millioner PBMCs.
  10. Omrør forsigtigt PBMCs og opbevar opløsningen ved 4 °C i 5 min pr. 10 millioner celler.
  11. Der tilsættes 30 μL løbebuffer og 20 μL Pan T-Cell MicroBead Cocktail pr. 10 millioner PBMCs.
  12. PBMC'erne blandes grundigt og inkuberes i yderligere 15 minutter ved 4 °C.
  13. Tilføj løbebuffer for at nå et samlet volumen på 500 μL.
  14. Adskil primære T-celler med et kommercielt tilgængeligt magnetisk sorteringsinstrument på bænken ved hjælp af indstillingen "nedbryder adskillelse" efter producentens protokol. Dette trin skal give mellem 5-10 millioner T-celler efter cellesortering.
  15. T-celler ved hjælp af en automatiseret celletæller eller hæmocytometer.
  16. T-celler fortyndes i 10 mL steril PBS og centrifuge ved 580 x g i 10 minutter ved 4 °C for at pellete cellerne.
  17. Aspirere supernatant og genopstudttede T-celler i 1 mL PBS.
  18. T-celler, der bruger en automatiseret celletæller eller hæmocytometer og aliquot 1 million/mL til eksperimenter.
  19. Der fremstilles en 1 mg/mL fluorescerende opløsning i PBS.
  20. Der tilsættes 100 μL 1 mg/mL fluorescceinopløsning pr. 1 ml T-celleopløsning (endelig fluorescerende koncentration = 100 μg/ml) umiddelbart før forarbejdning.
  21. Der tilsættes 25 μL ultralydkontrastmiddelopløsning som tidligere beskrevet i trin 3.11.
  22. 1mL-celler, der anvender det acoustofluide system (se trin 2.10-2.11). Dette trin forbedrer leveringen af fluorescen i primære T-celler.
  23. Umiddelbart efter behandlingen vaskes celler tre gange via centrifugering ved 580 x g i 10 minutter med 500 μL PBS for at fjerne ekstracellulær fluorescein. Cellerne skal vaskes inden for 10 minutter efter tilsætning af fluoresceinopløsning.
  24. Efter det sidste vasketrin opsuspendes cellerne i 250 μL PBS, og fluorescensen måles på flowcytometeret.

5. Forberedelse af A549 lungekræftceller

  1. Kultur A549 (adenocarcinomic human alveolar basal epitel) celler i komplette DMEM-medier (10% føtalt kvægserum, 1% penicillin/streptomycin) ved 37 °C og 5% CO2 i en fladbundet vævskulturkolbe.
  2. Høst A549 celler, når de når 70-90% sammenløb. Aspirat medier fra kolben og vask cellerne en gang med PBS for at fjerne serumproteiner.
  3. Trypsin (0,25%) EDTA til kolben tilsættes og inkuberes i 5 min ved 37 °C. Trypsin er et fordøjelsesenzym, der får cellerne til at løsne sig fra bunden af vævskulturkolben.
  4. Overfør trypsinopløsning til et 15 mL centrifugerør, og neutraliser det ved at tilføje komplette DMEM-medier i et 1:3-forhold.
  5. Cellerne pellets via centrifugering ved 1.500 x g i 5 min ved 4 °C.
  6. Supernatanten aspireres og opsuspendes pellet ved en koncentration på 100.000/mL i PBS-opløsning, der indeholder 200 mM trehalose i 15 mL konisk hætteglas.
  7. Der tilsættes 25 μL ultralydkontrastmiddelopløsning som tidligere beskrevet i trin 3.11.
  8. 1mL-celler, der anvender det acoustofluide system (se trin 2.10-2.11). Dette trin forbedrer leveringen af trehalose til A549 lungekræftceller.
  9. Umiddelbart efter behandlingen vaskes celler tre gange via centrifugering med 500 μL PBS for at fjerne ekstracellulær trehalose. Cellerne skal vaskes inden for 10 minutter efter tilsætning af trehaloseopløsning.
  10. Efter det sidste vasketrin opsuspendes cellerne i 100 μL PBS.
  11. Der tilsættes 11 μL 1% Triton X-100 opløsning til lyse celler og frigiver intracellulær trehalose.
  12. Vortex i 15 s, derefter inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur.
  13. Vortex igen for 15 s, derefter måle trehalose koncentration ved hjælp af kommercielt tilgængelige trehalose assay efter fabrikantens anbefaling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et billede af det acoustofluidiske system, der er samlet i en 3D-printet kasse, er vist i figur 1. Denne protokol producerer et acoustofluidic system, der kan bruges til at forbedre intracellulær molekylær levering i flere cellelinjer ved hjælp af ultralyd kontrast agenter.

Figur 2   demonstrerer forbedret intracellulær levering af en fluorescerende forbindelse, fluorescen, til primære humane T-celler med acoustofluidic behandling sammenlignet med en ubehandlet kontrolgruppe (p<0,05, n =3/group). T-celler blev suspenderet ved en koncentration på 1 million/mL i PBS med 100 μg/mL fluoresceinopløsning og 25 μL/mL ultralydskontrastmiddelopløsning, og blandingen blev passeret gennem acoustofluidic-enheden til ultralydsbehandling. Intracellulær fluorescerende levering og cellelevedygtighed blev målt med flowcytometry efter vask af celler via centrifugering for at fjerne ekstracellulær fluorescein. T-celler i den ubehandlede kontrolgruppe blev også suspenderet ved 1 million/mL i PBS med 100 μg/mL fluoresceinopløsning, men der blev ikke tilsat ultralydkontrastmiddelopløsning, og cellerne blev ikke passeret gennem den acoustofluidic enhed. Fluorescensintensiteten af T-celler steg med 5 gange efter acoustofluid behandling i forhold til fluorescensintensiteten af T-celler i den ubehandlede kontrolgruppe, hvilket indikerer øget levering af fluorescen. Celle levedygtighed faldt en smule efter acoustofluidic behandling, men forblev over 80% (p<0,05, n = 3/group).

Figur 3 viser forbedret intracellulær levering af en konserveringsforbindelse, trehalose, til humane A549 lungekarcinomceller med acoustofluid behandling sammenlignet med flow alene (ingen ultralydkontrastmidler eller ultralydeksponering) og sammenlignet med celler i den ubehandlede kontrolgruppe (ANOVA p<0,05, n =3/group). A549 celler blev suspenderet i en koncentration på 100.000/mL i PBS med 200 mM trehaloseopløsning og 25 μL/mL ultralydskontrastmiddelopløsning, og blandingen blev passeret gennem acoustofluidic-enheden til ultralydbehandling. A549 celler i kontrolgrupperne ("Flow Only" og "No Treatment") blev også suspenderet ved 100.000/mL i PBS med 200 mM trehalose, men ultralyd kontrast agent opløsning blev ikke tilføjet, og celler blev ikke udsat for ultralyd behandling. Intracellulær trehalose blev kvantificeret ved hjælp af en trehalose assay kit og normaliseret til ubehandlet kontrolgruppe. Celle levedygtighed blev målt med trypan blå analyse. Der var ingen statistisk forskel i celle levedygtighed mellem grupper (n = 3-7/group).

Figure 1
Figur 1: Foto af etcoustofluidic system. Det acoustofluidic flow system indeholder en PDMS-baseret flow kammer med en integreret PZT transducer drevet af en mikrocontroller. En 3D-printet kasse med en LED-indikator og on/off-trykknap er valgfrie ekstra funktioner. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Acoustofluidic behandling øger fluorescein levering til menneskelige T-celler. (A) Fluorescensintensiteten i primær-T-cellerne steg efter encoustofluid behandling med fluorescin sammenlignet med den ubehandlede kontrolgruppe (ingen acoustofluidics og ingen mikrobobler) (p<0,05, n=3/group). (B) Celles levedygtighed faldt en smule efter encoustofluid behandling, men forblev over 80% målt ved flowcytometri (p<0,05, n=3/group). (C) Repræsentativt cytometri histogram med angivelse af højere fluorescens i den acoustofluidiske behandlingsgruppe. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Acoustofluidic behandling øger trehalose levering til menneskelige lungekræftceller. (A) Trehaloseoptagelsen steg i A549-lungekarcinomceller sammenlignet med kun flow (ingen ultralyd og ingen mikrobobler) og den ubehandlede kontrolgruppe (ANOVA p<0,05, n=3/group). (B) Celle levedygtighed forblev over 90% efter acoustofluidic behandling målt ved trypan blå analyse (n = 3-7/group). Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende filer. Klik her for at hente denne fil. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver samling og drift af et billigt acoustofluidic system, der forbedrer intracellulær levering af biomolekyler til forskningsformål. Der er flere vigtige faktorer at overveje, når du samler og bruger dette system. Den acoustofluidic enhed er fremstillet i PDMS, som er et biokompatibelt materiale, der let kan formes med konsekventkanaldimensioner 27. Enheden kanaler kan skylles med 15 ml 70% ethanolopløsning forud for acoustofluidic behandling for at øge steriliteten, når du arbejder med dyrkede celler. Efter ethanolrensning kan 15 mL deioniseret vand bruges til at skylle enheden for at fjerne restethanol fra kanalerne, før der tilsættes celleopløsninger. Små acoustofluidic kanaler kan nemt blive blokeret af snavs eller celle aggregater, hvilket gør dette til en begrænsning for hyppig brug af enheden. En grundig skylning af kanalerne mellem hver prøve vil hjælpe med at forhindre problemer med kanalblokering. Derudover kan flere PDMS-enheder fremstilles i hvert parti, så enheder hurtigt kan udskiftes, hvis det er nødvendigt. Til ultralydsbaserede applikationer er det vigtigt at producere PDMS-enheder med en ensartet tykkelse, da forskelle i PDMS-tykkelse kan påvirke ultralydstrykket inden for de fluidiske kanaler. Ultralydbølger formerer sig kontinuerligt gennem enheden, og transmitterede bølger interagerer med reflekterede bølger for at danne stående akustiske bølgemønstre, der er meget følsomme over for forskelle iPDMS-tykkelse 17. PDMS-tykkelsen bestemmes primært af mængden af PDMS, der føjes til formen (trin 1.7), og denne protokol giver en PDMS-tykkelse på 3,5 mm.

Mikrocontrollerens maksimale udgangsfrekvens (8 MHz) blev valgt til at producere den mindste akustiske bølgelængde inden for den fluidiske kanal. Mikrocontrolleren output er typisk en firkantet bølge, men oscilloskop målinger viste, at produktionen på 8 MHz bliver mere ligner en sinusoid bølgeform på grund af dræbte sats begrænsninger. En begrænsning af dette system er, at mikrocontrollerens maksimale spændingseffekt er 5V, og der kræves en ekstern RF-forstærker, hvis der ønskes højere spændingsudgange. Transducerens trykeffekt i dette system var 18 kPa ved 1 cm målt med en nålehydrofon (Precision Acoustics, Dorchester, Storbritannien). Selvom dette tryk er relativt lavt, kan stående bølger i kanalerne øge det akustiske tryk, som prøver udsættes for, når de passerer gennem ultralydsstrålen.

Ultralyd kontrast agenter bruges til at nukleere akustisk kavitation inden for acoustofluidic kanaler, som forbedrer leveringen af biomolekyler på tværs af cellemembraner28,29. Denne protokol beskriver syntesen af perfluorcarbongasfyldte mikrobobler indkapslet af en kationisk fosfolipidmembran. Som tidligere beskrevet består denne formulering af mikrobobler primært mellem 1-3 μm i diameter30. Mikroboblernes positivt ladede overflade tiltrækker dem mod negativt ladede cellemembraner, hvilket øger sonoporationsmedieret molekylær levering, når mikroboblerne og cellerne er i umiddelbar nærhed. Koncentrationen af mikrobobler i celleopløsningen er en kritisk faktor, der kan påvirke effektiviteten af molekylær levering og cellelevedygtighed efter acoustofluidic behandling, og den optimale mikrobubblekoncentration kan være specifik for hver celletype 19. Koncentrationen af gasfyldte mikrobobler med en lipidskal kan falde over tid efter syntese, så ultralydkontrastmidler bør anvendes inden for få timer efter syntesen.

Vi demonstrerede levering af en fluorescerende forbindelse (fluorescein) til primære ikke-aktiverede menneskelige T-celler ved hjælp af det acoustofluidiske system i denne protokol. Det er vigtigt at bemærke, at aktiveringsstatus for primære humane T-celler kan påvirke effektiviteten af intracellulær molekylær levering. Fluorescensegenskaberne for fluorescin muliggør følsom intracellulær detektion med flowcytometry, men andre opløselige forbindelser kan også leveres til celler ved hjælp af dette acoustofluidic system. For eksempel demonstrerede vi acoustofluidic levering af trehalose i menneskelige lungekræftceller. Acoustofluidic levering af trehalose til celler kan muliggøre øget genopretning efter frossen og tør opbevaring, hvilket kan have betydelige konsekvenser for en række biomedicinske og forskningsmæssige anvendelser 19.

Acoustofluidic levering af andre biomolekyler, såsom proteiner eller DNA plasmider, er også muligt, selv om en begrænsning af dette system er, at effektiviteten af molekylær levering kan være lavere for større forbindelser18,31. Optimering af acoustofluidic flow rate, koncentrationer af ultralyd kontrast agenter, cellekoncentrationer, og medier kan være nødvendige for levering af andre biomolekyler. Derudover kan optimale parametre variere mellem forskellige celletyper på grund af faktorer som cellediameter, morfologi, membranegenskaber og fænotype.

Det acoustofluidic system, der er beskrevet i denne protokol, kan let samles og betjenes til relativt lave omkostninger. Derudover kan dette system tilpasses til andre applikationer ved at forbinde andre signalkilder eller ultralydtransducere for at generere specifikke udgangstryk og frekvenser32,33,34. Derudover kan sprøjtepumpesystemet, der er beskrevet i denne protokol, udskiftes med peristaltiske pumper, hvis det ønskes. Ved en strømningshastighed på 50 mL/t er opholdstiden for celler i ultralydsstrålen, når de passerer gennem den acoustofluidic kanal, ca. 1 s, men denne opholdstid kan ændres efter behov til specifikke anvendelser ved at justere væskeflowhastigheden.

I modsætning til andre almindelige transfektteknikker kan biomolekyler leveres til celler inden for få minutter i stedet for timer, og dette system kræver ikke specialiseret og dyrt udstyr. Derudover er dette system kompatibelt med en lang række almindeligt anvendte cellekulturmedier eller andre buffere. Sammenfattende muliggør dette acoustofluidic system hurtig levering af biomolekyler til celler, hvilket kan være nyttigt til en lang række forskningsapplikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Medforfattere MAM og JAK ejer ejerskab i DesiCorp, som kan drage økonomisk fordel af produkter relateret til denne forskning.

Acknowledgments

Dette arbejde blev delvist støttet af midler fra National Science Foundation (#1827521, #1827521, #1450370) og National Institutes of Health (U01HL127518). Fotolithography tjenester blev leveret af University of Louisville Micro / Nano Technology Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fabrication of Acoustofluidic Device
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT Ellsworth Adhesives 4019862 (SKU) https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/
Harris Uni-Core (2.5 mm) Electron Microscopy Sciences 69039-25
Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube - S (2/4 port) Darwin Microfluidics LVF-KPT-S-2 (SKU) https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port
Microscope Slide VWR 16004-430 https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium
trichlorosilane Gelest 105732-02-3 (Cas. No.) Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage. 
Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD) McMaster-Carr 5233K51 (Part #) https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/
Assembly of Acoustofluidic System
Arduino Uno Arduino 7630049200050 (Barcode) https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3
Preparation of Ultrasound Contrast Agents
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) Avanti Lipids 890703P-25mg (SKU) https://avantilipids.com/product/890703
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) Avanti Lipids 850365P-25mg (SKU) https://avantilipids.com/product/850365
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) Avanti Lipids 840465P-25mg (SKU) https://avantilipids.com/product/840465
APF-140HP (decafluorobutate gas) FlouroMed 355-25-9 (Cas No.) http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/
DB-338 Amalgamators  COXO https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/
polyoxyethylene 40 stearate  Sigma-Aldrich P3440-250G (SKU) https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en&region=US&gclid=
Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj
Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS
vID64X-1KbO3LUKGjVUwb
PDAaAqvOEALw_wcB
Q125 Sonicator Qsonica Q125-110 (Ref.) https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r
Preparation of Primarty T Cells
autoMACs running buffer Miltenyi Biotec 130-091-221 (Order No.) https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref
Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail)  Miltenyi Biotec 130-096-535 (Order No.) https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535
magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator) Miltenyi Biotec 130-092-545 (Order No.) https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545
Preparation of A549 Lung Cancer Cells
Trehalose Assay Kit  Megazyme K-TREH (Cat. No.) https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit
Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile) VWR 97063-702 (Cat. No.) https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gardlik, R., et al. Vectors and delivery systems in gene therapy. Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).
  2. Wahlers, A., et al. Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vector-mediated gene expression in hematopoietic cells. Gene Therapy. 8 (6), 477-486 (2001).
  3. Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Advanced Biomedical Research. 1, 27 (2012).
  4. Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Medical & Biological Engineering & Computing. 44 (1-2), 5-14 (2006).
  5. Gehl, J. Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiologica Scandinavica. 177 (4), 437-447 (2003).
  6. Lin, Y. C., Li, M., Wu, C. C. Simulation and experimental demonstration of the electric field assisted electroporation microchip for in vitro gene delivery enhancement. Lab on a Chip. 4 (2), 104-108 (2004).
  7. Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophysical Chemistry. 19 (3), 211-225 (1984).
  8. Weaver, J. C. Electroporation: a general phenomenon for manipulating cells and tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 51 (4), 426-435 (1993).
  9. Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
  10. Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
  11. Klibanov, A. L., Shevchenko, T. I., Raju, B. I., Seip, R., Chin, C. T. Ultrasound-triggered release of materials entrapped in microbubble-liposome constructs: a tool for targeted drug delivery. Journal of Controlled Release. 148 (1), 13-17 (2010).
  12. Fan, Z., Kumon, R. E., Deng, C. X. Mechanisms of microbubble-facilitated sonoporation for drug and gene delivery. Therapeutic Delivery. 5 (4), 467-486 (2014).
  13. Secomski, W., et al. In vitro ultrasound experiments: Standing wave and multiple reflections influence on the outcome. Ultrasonics. 77, 203-213 (2017).
  14. Gedge, M., Hill, M. Acoustofluidics 17: theory and applications of surface acoustic wave devices for particle manipulation. Lab on a Chip. 12 (17), 2998-3007 (2012).
  15. Shi, J., et al. Acoustic tweezers: patterning cells and microparticles using standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (20), 2890-2895 (2009).
  16. Shi, J., Huang, H., Stratton, Z., Huang, Y., Huang, T. J. Continuous particle separation in a microfluidic channel via standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (23), 3354-3359 (2009).
  17. Shields, C. W. t, Cruz, D. F., Ohiri, K. A., Yellen, B. B., Lopez, G. P. Fabrication and operation of acoustofluidic devices supporting bulk acoustic standing waves for sheathless focusing of particles. Journal of Visualized Experiments. (109), e53861 (2016).
  18. Belling, J. N., et al. Acoustofluidic sonoporation for gene delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (20), 10976-10982 (2020).
  19. Centner, C. S., et al. Ultrasound-induced molecular delivery to erythrocytes using a microfluidic system. Biomicrofluidics. 14 (2), 024114 (2020).
  20. Qi, J., Ding, C., Jiang, X., Gao, Y. Advances in developing CAR T-cell therapy for HIV cure. Frontiers in Immunology. 11, 361 (2020).
  21. Annesley, C. E., Summers, C., Ceppi, F., Gardner, R. A. The evolution and future of CAR T cells for B-Cell Acute lymphoblastic leukemia. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (4), 591-598 (2018).
  22. Hand, S. C., Menze, M. A. Molecular approaches for improving desiccation tolerance: insights from the brine shrimp Artemia franciscana. Planta. 242 (2), 379-388 (2015).
  23. Zhang, M., et al. Freeze-drying of mammalian cells using trehalose: preservation of DNA integrity. Scientific Reports. 7 (1), 6198 (2017).
  24. Grievink, H. W., Luisman, T., Kluft, C., Moerland, M., Malone, K. E. Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: Cell recovery and viability, population composition, and cell functionality. Biopreserv Biobank. 14 (5), 410-415 (2016).
  25. Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Current Protocol in Stem Cell Biology. , Chapter 2, Unit 2A 1 (2007).
  26. Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on Percoll. Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).
  27. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
  28. Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), 9983-9988 (2016).
  29. Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).
  30. Kopechek, J. A., et al. Ultrasound targeted microbubble destruction-mediated delivery of a transcription factor decoy inhibits STAT3 signaling and tumor growth. Theranostics. 5 (12), 1378-1387 (2015).
  31. Bhutto, D. F., et al. Effect of molecular weight on sonoporation-mediated uptake in human cells. Ultrasound in Medical Biology. 44 (12), 2662-2672 (2018).
  32. Forbes, M. M., Steinberg, R. L., O'Brien, W. D. Frequency-dependent evaluation of the role of definity in producing sonoporation of Chinese hamster ovary cells. Journal of Ultrasound in Medicine. 30 (1), 61-69 (2011).
  33. Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (36), 9983-9988 (2016).
  34. Miller, D. L., Bao, S., Morris, J. E. Sonoporation of cultured cells in the rotating tube exposure system. Ultrasound in Medical Biology. 25 (1), 143-149 (1999).

Tags

Bioengineering Problem 167 acoustofluidics ultralyd kontraststoffer molekylær levering sonoporation celler
Samling og drift af en acoustofluidic enhed til forbedret levering af molekylære forbindelser til celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Centner, C. S., Murphy, E. M.,… More

Centner, C. S., Murphy, E. M., Stamp, B. F., Priddy, M. C., Moore, J. T., Bates, P. J., Menze, M. A., Yaddanapudi, K., Kopechek, J. A. Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells. J. Vis. Exp. (167), e62035, doi:10.3791/62035 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter