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Bioengineering

कोशिकाओं को आणविक यौगिकों के उन्नत वितरण के लिए एक Acoustofluidic डिवाइस का असेंबली और संचालन

Published: January 21, 2021 doi: 10.3791/62035
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 2, 3, 2, 1
1Department of Bioengineering, University of Louisville, 2School of Medicine, University of Louisville, 3Department of Biology, University of Louisville

Summary

यह प्रोटोकॉल अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंटों द्वारा प्रेरित सोनोपोरेशन के माध्यम से कोशिकाओं को तेजी से आणविक वितरण के लिए कम लागत वाले एसीटोफ्लुइडिक डिवाइस की असेंबली और संचालन का वर्णन करता है।

Abstract

जैव अणुओं की कुशल इंट्रासेलुलर डिलीवरी जैव चिकित्सा अनुसंधान और सेल आधारित चिकित्सीय अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए आवश्यक है। अल्ट्रासाउंड-मध्यस्थता सोनोपोरेशन बायोमॉलिक्यूल्स के तेजी से इंट्रासेलुलर डिलीवरी के लिए एक उभरती हुई तकनीक है। सोनोपोरेशन तब होता है जब गैस से भरे माइक्रोबबल्स का कैविटेशन पास के कोशिका झिल्ली में क्षणिक छिद्र बनाता है, जो आसपास के तरल पदार्थ से जैव अणुओं के तेजी से तेज करने में सक्षम बनाता है। निलंबन में कोशिकाओं के इन विट्रो सोनोपोरेशन के लिए वर्तमान तकनीक धीमी थ्रूपुट, प्रत्येक कोशिका के लिए अल्ट्रासाउंड जोखिम स्थितियों में परिवर्तनशीलता, और उच्च लागत से सीमित हैं। इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, एक कम लागत वाला एसीटोफ्लुइडिक डिवाइस विकसित किया गया है जो पीडीएमएस-आधारित तरल उपकरण में अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर को एकीकृत करता है ताकि कोशिकाओं के लगातार सोनोरेशन को प्रेरित किया जा सके क्योंकि वे अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंटों के संयोजन में चैनलों के माध्यम से प्रवाहित होते हैं। डिवाइस पीडीएमएस आधारित तरल चिप का उत्पादन करने के लिए मानक फोटोलिथोग्राफी तकनीकों का उपयोग करके निर्मित है। एक अल्ट्रासाउंड पीजो डिस्क ट्रांसड्यूसर डिवाइस से जुड़ा होता है और माइक्रोकंट्रोलर द्वारा संचालित होता है। असेंबली को अतिरिक्त सुरक्षा के लिए 3 डी-मुद्रित मामले के अंदर एकीकृत किया जा सकता है। कोशिकाओं और माइक्रोबबल्स को सिरिंज पंप या पीवीसी ट्यूबिंग से जुड़े पेरिस्टाल्टिक पंप का उपयोग करके डिवाइस के माध्यम से धक्का दिया जाता है। मानव टी कोशिकाओं और फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं को जैव अणुओं की बढ़ी हुई डिलीवरी इस एसीटोफ्लुइडिक सिस्टम के साथ प्रदर्शित की जाती है। थोक उपचार दृष्टिकोणों की तुलना में, यह एसी्टोफ्लुइडिक सिस्टम थ्रूपुट बढ़ाता है और परिवर्तनशीलता को कम करता है, जो जैव चिकित्सा अनुसंधान अनुप्रयोगों और सेल आधारित चिकित्सीय के विनिर्माण के लिए सेल प्रसंस्करण विधियों में सुधार कर सकता है।

Introduction

कोशिकाओं को आणविक वितरण को बढ़ाने के लिए वायरल और गैर-वायरल प्लेटफार्मों का उपयोग किया गया है। वायरल डिलीवरी (ट्रांसडक्शन) एक आम तकनीक है जो कोशिका-आधारित उपचारों में उपयोग की जाती है जिसमें जीनोमिक संशोधन की आवश्यकता होती है। वायरल डिलीवरी के साथ सीमाओं में संभावित सम्मिलनीय म्यूटेनेसिस, सीमित ट्रांसजेनिक क्षमता, और संक्रमण की अवांछित बहुलता1,2शामिल हैं। इसलिए, गैर वायरल आणविक वितरण तकनीक जैव चिकित्सा और अनुसंधान अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए विकास में हैं। सामान्य तकनीकों में यांत्रिक, विद्युत, हाइड्रोडायनामिक, या कोशिकाओं में जैव अणुओं के तेज को बढ़ाने के लिए लेजर-आधारित ऊर्जा का उपयोग शामिल है 3। इलेक्ट्रोपॉलपेशन एक आमतौर पर उपयोग किया जाने वाला गैर- वायरल आणविक वितरण मंच है जिसमें आणविक यौगिकों 4 ,5 ,6,7,8,9केइंट्रासेलुलर डिलीवरी के लिए प्लाज्मा झिल्ली में क्षणिक छिद्र को प्रेरित करने की क्षमता है। हालांकि, प्लाज्मा झिल्ली का क्षणिक छिद्र एक स्टोचस्टिक प्रक्रिया है और इलेक्ट्रोपॉशन के माध्यम से आणविक तेज आम तौर पर क्षणिक झिल्ली छिद्रों में निष्क्रिय प्रसार पर निर्भर करता है4,7,8.

एक वैकल्पिक विधि अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंटों (यानी गैस से भरे माइक्रोबबल्स) के कैविटेशन के माध्यम से बढ़ी हुई इंट्रासेलुलर आणविक वितरण के लिए अल्ट्रासाउंड का उपयोग है। माइक्रोबबल कैविटेशन आसपास के मीडिया में माइक्रोस्ट्रीमिंग प्रभाव पैदा करता है जो पास के प्लाज्मा झिल्ली ("सोनोपोरेशन") के क्षणिक छिद्र का कारण बन सकता है, जिससेनिष्क्रिय या सक्रिय परिवहन तंत्र10, 11,12के माध्यम से जैव अणुओं के तेजी से अंतरकोशिकीय तेज होने की अनुमति मिल सकती है। सोनोपोरेशन कोशिकाओं को तेजी से आणविक वितरण के लिए एक प्रभावी तकनीक है, लेकिन इस दृष्टिकोण में अक्सर महंगे उपकरण और थोक उपचार विधियों की आवश्यकता होती है जो कम थ्रूपुट और अल्ट्रासाउंड एक्सपोजर स्थितियों में उच्च परिवर्तनशीलता से सीमित हैं13। इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, एसीओस्टोफ्लुइडिक उपकरण, जो निलंबन में कोशिकाओं के लगातार सोनोपोरेशन को सक्षम करते हैं, वर्तमान में विकास में हैं।

Acoustofluidics एक विस्तार क्षेत्र है जो विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोगों के लिए अल्ट्रासाउंड और माइक्रोफ्लुइडिक प्रौद्योगिकियों को एकीकृत करता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग पहले कण पृथक्करण के लिए किया जाता रहा है ताकितरलचैनलों 14 , 15, 16,17के भीतर खड़ी ध्वनिक तरंगों को प्रेरित करने के लिए निरंतर अल्ट्रासाउंड ऊर्जा लागू की जा सके । कणों को विभिन्न गुणों जैसे कणों के आकार, घनत्व और मध्यम16के सापेक्ष संपीड़न के आधार पर डिवाइस के विभिन्न हिस्सों की ओर क्रमबद्ध किया जाता है। 18अनुसंधान अनुप्रयोगों और सेल चिकित्सा के निर्माण के लिए विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों में तेजी से आणविक वितरण को सक्षम करने के लिए एसीटोफ्लुइडिक प्रौद्योगिकियों का भी विकास हो रहा है । हाल ही में, हमने पीडीएमएस-आधारित एसीस्टोफ्लुइडिक डिवाइस19का उपयोग करके एरिथ्रोसाइट्स को बढ़ी हुई आणविक वितरण का प्रदर्शन किया। एसीओस्टोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म में, सेल और माइक्रोबबल गतिशीलता को शारीरिक बातचीत के लिए प्रेरित करने के लिए हेरफेर किया जा सकता है जो बायोमॉलिक्यूल्स के उन्नत वितरण को सक्षम करता है। कोशिकाओं और माइक्रोबबल्स के बीच की दूरी को अनुकूलित करके इंट्रासेलुलर आणविक वितरण की दक्षता और स्थिरता को संभावित रूप से बढ़ाया जा सकता है।

एसीटोफ्लुइडिक-मध्यस्थता सोनोपोरेशन के लिए एक महत्वपूर्ण आवेदन में प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं में जैव अणुओं का परिवहन शामिल है। दत्तक टी सेल हस्तांतरण पर आधारित इम्यूनोथेरपी, जैसे चिमरिक एंटीजन रिसेप्टर टी सेल (कार टी) थेरेपी, कैंसर और एचआईवी20जैसे वायरस सहित विभिन्न बीमारियों के उपचार के लिए तेजी से उभर रहे हैं । कार टी थेरेपी बाल चिकित्सा तीव्र लिंफोब्लास्टिक ल्यूकेमिया (सभी) रोगियों में विशेष रूप से प्रभावी रहा है, 70-90%21की पूरी छूट दर के साथ । हालांकि, इन उपचारों के लिए टी सेल विनिर्माण आम तौर पर वायरल ट्रांसडक्शन पर निर्भर करता है जो संभावित सम्मिलनीय म्यूटेनेसिस, लंबे प्रसंस्करण समय और प्रोटीन या छोटे अणुओं जैसे गैर-आनुवंशिक जैव अणुओं को वितरित करने की चुनौतियों से सीमित है1। Acoustofluidic-मध्यस्थता आणविक वितरण विधियों संभावित इन सीमाओं को दूर करने और टी सेल चिकित्सा के निर्माण में सुधार कर सकते हैं ।

एसी्टोस्टिविक-मध्यस्थता सोनोपोरेशन के लिए एक अन्य महत्वपूर्ण आवेदन में परिरक्षक यौगिकों की इंट्रासेलर डिलीवरी शामिल है, जैसे ट्रेहालोस, जो ठंड और डिसिकेशन के दौरान कोशिकाओं की रक्षा करते हैं। ट्रेहलोज प्रकृति के कुछ जीवों द्वारा उत्पन्न होता है और वे अपनी सेलुलर झिल्ली की रक्षा करके ठंड और आनंद को सहन करने में मदद करता है22,23. हालांकि, ट्रेहलोस स्तनधारी कोशिकाओं द्वारा उत्पादित नहीं होता है और स्तनधारी कोशिका झिल्ली के लिए अभेद्य है। इसलिए, आंतरिक सेलुलर झिल्ली की रक्षा के लिए आवश्यक पर्याप्त इंट्रासेलुलर ट्रेहलोस स्तर प्राप्त करने के लिए सोनोपोरेशन जैसी प्रभावी आणविक वितरण तकनीकें आवश्यक हैं। यह दृष्टिकोण वर्तमान में विभिन्न सेल प्रकारों के शुष्क संरक्षण के लिए विकास में है।

यह प्रोटोकॉल एक माइक्रोकंट्रोलर द्वारा संचालित अपेक्षाकृत कम लागत वाली एसीओटोफ्लुइडिक प्रणाली के असेंबली और संचालन का विस्तृत विवरण प्रदान करता है। अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंटों का उपयोग तरल चैनलों के भीतर सोनोपोरेशन को प्रेरित करने और टी कोशिकाओं और कैंसर कोशिकाओं सहित विभिन्न सेल प्रकारों में तेजी से आणविक वितरण को सक्षम करने के लिए किया जाता है। इस एसीटोफ्लुइडिक सिस्टम का उपयोग विभिन्न प्रकार के शोध अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है और बेहतर सेल थेरेपी विनिर्माण प्रक्रियाओं के लिए सोनोपोरेशन विधियों का मूल्यांकन करने के लिए प्रोटोटाइप प्रणाली के रूप में भी उपयोगी हो सकता है।

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Protocol

लुइसविले विश्वविद्यालय में संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के बाद स्वस्थ दाताओं से पूरे रक्तदान एकत्र किए गए थे ।

1. एसीटोफ्लुइडिक डिवाइस का निर्माण

  1. 500 माइक्रोन के व्यास वाले चैनलों वाले गाढ़ा सर्पिल डिजाइन के साथ एक फोटोमास्क प्राप्त करें। एक उदाहरण के रूप में पूरक फाइलों में सीएडी फ़ाइल प्रदान की जाती है। एक कस्टम फोटोमास्क एक वाणिज्यिक विक्रेता से आदेश दिया जा सकता है या एक मुखौटा लेखक का उपयोग कर नमूनों ।
  2. मानक फोटोलिथोग्राफी तकनीकों का उपयोग करके फोटोरेसिस्ट-लेपित सिलिकॉन वेफर पर गाढ़ा सर्पिल डिजाइन का एक मोल्ड तैयार करें।
    1. 100 मिमी सिलिकॉन वेफर में एसयू-8 2100 के लगभग 2 बड़े चम्मच (~ 30 एमएल) जोड़ें।
    2. स्पिन-कोट फोटोरेसिस्ट को फैलाने के लिए 30 एस के लिए 150 आरपीएम की गति से एक स्पिनर पर वेफर, फिर 200 माइक्रोन की मोटाई पैदा करने के लिए 60 एस के लिए 1,200 आरपीएम तक की गति बढ़ाएं।
    3. एक पॉलीमाइड वैक्यूम ओवन में फोटोरेसिस्ट-लेपित वेफर को 30 मिनट रैंप पर और 30 मिनट 115 डिग्री सेल्सियस पर बसता है, फिर 30 मिनट के लिए नीचे रैंप का इलाज करें।
    4. चरण 1.1 से फोटोमास्क के साथ मास्क एलाइनर का उपयोग करके 130 एस के लिए फोटोरेसिस्ट-लेपित वेफर का पर्दाफाश करें।
    5. चरण 1.2.3 में वर्णित एक ही प्रक्रिया के बाद एक्सपोजर के बाद वेफर बेक करें।
    6. लगभग 8 मिनट के लिए एसयू-8 डेवलपर समाधान में फोटोरेसिस्ट विकसित करें।
      सावधानी: केवल एक अच्छी तरह से हवादार रासायनिक धुएं हुड में डेवलपर समाधान का उपयोग करें।
  3. सतह को अधिक हाइड्रोफोबिक बनाने के लिए मोल्ड को सीलनाइज करें। फोटोरेसिस्ट-लेपित वेफर को एक डेसीकेटर में रखें और क्लोरोसिलीन (सी 8 एच4सीएल 3एफ13एसआई) की 20 माइक्रोल ड्रॉप जोड़ें। 30 एस के लिए कक्ष में वैक्यूम लागू करें, फिर कक्ष को सील करें और रात भर छोड़ दें।
    सावधानी: क्लोरोसिलेन बहुत खतरनाक और ज्वलनशील है। एक्सपोजर गंभीर जलने और आंखों को नुकसान पहुंचाता है।
  4. एक कप में 54 ग्राम पॉलीडिमेथसिलोकेन (पीडीएमएस) बेस और 6 ग्राम इलाज एजेंट को मिलाएं और कम से कम 1 मिनट के लिए एक स्पैटुला के साथ सख्ती और अच्छी तरह से मिलाएं।
  5. पीडीएमएस समाधान वाले कप को लगभग 30 मिनट के लिए एक डिसिकेटर में रखें या जब तक अवशेष हवा के बुलबुले समाधान से हटा नहीं दिए जाते हैं।
  6. 150-मिमी पेट्री डिश में ऊपर की ओर आने वाले पैटर्न के साथ फोटोरेसिस्ट-लेपित वेफर रखें।
  7. 150 मिमी पेट्री डिश के अंदर मोल्ड के ऊपर पीडीएमएस समाधान डालो।
  8. यदि आवश्यक हो, तो 150-मिमी पेट्री डिश को एक डिसिकेटर के अंदर रखें और अवशेष हवा के बुलबुले गायब होने तक वैक्यूम लागू करें।
  9. 150 मिमी पेट्री डिश को लैब ओवन में स्थानांतरित करें और पीडीएमएस को ठीक करने के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए बेक करें।
  10. इलाज के बाद, एक रेजर ब्लेड का उपयोग करके वेफर के किनारों के चारों ओर काटकर पेट्री डिश से पीडीएमएस को ध्यान से हटा दें।
  11. चाकू या रेजर ब्लेड का उपयोग करके प्रत्येक व्यक्तिगत डिवाइस को काट लें।
  12. 2.5-मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग करके प्रत्येक डिवाइस के इनलेट और आउटलेट बंदरगाहों के माध्यम से पंच छेद।
  13. प्रत्येक पीडीएमएस डिवाइस को प्लाज्मा आशेर में उजागर चैनलों (ऊपर की ओर सामना करना) के साथ रखें। ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार (45 एस, 500 mbar O2के लिए 100 डब्ल्यू) लागू करें तो तुरंत एक साफ सोडा चूने ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड (75 मिमी x 25 मिमी x 1 मिमी) कांच की सतह का सामना करना पड़ चैनलों के साथ एक साफ सोडा चूने ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर प्रत्येक पीडीएमएस डिवाइस जगह है।
  14. उपकरणों को कमरे के तापमान पर रात भर बांड दें।
  15. धीरे-धीरे सिलिकॉन को ~ 1-2 मिमी की मोटाई पर 1-सेमी व्यास पीजो ट्रांसड्यूसर की सतह पर लागू करें, फिर ध्यान से ट्रांसड्यूसर को गाढ़ा सर्पिल के साथ संरेखित करें और धीरे-धीरे इसे ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड (पीडीएमएस डिवाइस से विपरीत पक्ष) के नीचे दबाएं।

2. विधानसभा और एसीओटोफ्लुइडिक प्रणाली का संचालन

  1. यूएसबी ए से बी केबल का उपयोग करके कंप्यूटर से माइक्रोकंट्रोलर कनेक्ट करें। एक हरे रंग की शक्ति एलईडी संकेतक (लेबल पीडब्ल्यूआर) रोशन करना चाहिए।
  2. 8 मेगाहर्ट्ज सिग्नल उत्पन्न करने वाले प्रोग्राम को अपलोड करने के लिए कंप्यूटर पर संबंधित प्रोग्राम का उपयोग करें। पूरक एफआईल्समें एक उदाहरण कार्यक्रम प्रदान किया जाता है। प्रोग्राम अपलोड करने के बाद इसे माइक्रोप्रोसेसर मेमोरी में स्टोर किया जाएगा और इसे दोबारा अपलोड करने की जरूरत नहीं होगी।
  3. मिलाप PZT ट्रांसड्यूसर पर प्रत्येक तार के अंत में एक 1 "22G तार।
  4. PZT ट्रांसड्यूसर के नकारात्मक (काले) टर्मिनल तार को सोल्डर तार के माध्यम से जीएनडी पिन से कनेक्ट करें।
  5. टांका तार के माध्यम से PZT ट्रांसड्यूसर के सकारात्मक (लाल) टर्मिनल तार को आउटपुट पिन (प्रदान किए गए उदाहरण कार्यक्रम में #9) से कनेक्ट करें।
  6. वैकल्पिक रूप से, 3डी-मुद्रित मामले में एसीओस्टोफ्लुइडिक डिवाइस और माइक्रोकंट्रोलर को माउंट करें। उदाहरण के रूप में एसअपप्लेमेंटल एफआई एल्स में सीएडी फाइलें प्रदान की जाती हैं। यदि वांछित हो तो बाहरी एलईडी संकेतक और ऑन/ऑफ पुश बटन को नियंत्रित करने के लिए अतिरिक्त तारों को अन्य माइक्रोकंट्रोलर पिनों से जोड़ा जा सकता है।
  7. कट 3-6 "tygon पीवीसी नरम प्लास्टिक ट्यूबिंग के वर्गों (1/16" आईडी, 1/8 "आयुध डिपो) और प्रवेश और आउटलेट बंदरगाहों में टयूबिंग धक्का । जब तक यह खोलने में फिट नहीं बैठता तब तक दबाव डालते समय टयूबिंग घुमाना आवश्यक हो सकता है। वैकल्पिक रूप से, प्रत्येक बंदरगाह में टयूबिंग डालने के बाद, गोंद को पीडीएमएस को बॉन्ड करने और एक साथ टयूबिंग करने के लिए जंक्शन पर लागू किया जा सकता है।
  8. निर्माता के निर्देशों के अनुसार माइक्रोफ्लुइडिक जलाशय को इकट्ठा करें।
  9. एक 3-6 "tygon पीवीसी नरम प्लास्टिक ट्यूबिंग के अनुभाग में कटौती (1/16" आईडी, 1/8 "आयुध डिपो) और 1/32 "आईडी ट्यूबिंग माइक्रोफ्लुइडिक जलाशय उत्पादन टयूबिंग से पर टयूबिंग धक्का । वैकल्पिक रूप से, रिसाव को रोकने के लिए जंक्शन को पैराफिन फिल्म के साथ लपेटें।
  10. परिवेशी हवा के साथ एक 60-एमएल सिरिंज भरें (वैकल्पिक रूप से, 0.2-माइक्रोन फिल्टर के साथ हवा को फ़िल्टर करें और इसे माइक्रोफ्लुइडिक जलाशय के किनारे टायगॉन पीवीसी ट्यूबिंग (1/16"आईडी, 1/8" ओडी से कनेक्ट करें।
  11. सिरिंज पंप को ५० एमएल/एच की वॉल्यूमेट्रिक फ्लो रेट पर एसीओस्टोफ्लुइडिक डिवाइस के माध्यम से सेल/अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट समाधानों को पुश करने के लिए २०० एमएल/एच की दर से सेट करें और 50mL सेंट्रलाइज ट्यूब में एसीटोफ्लुइडिक डिवाइस के आउटपुट से नमूने एकत्र करें । वैकल्पिक रूप से, तरल चैनलों की बंध्यता बढ़ाने के लिए 70% इथेनॉल समाधान के 15 एमएल के साथ एसीस्टोफ्लुइडिक उपचार से पहले चैनल कुल्ला। इसके अतिरिक्त, सिस्टम के माध्यम से पंपिंग कोशिकाओं से पहले डिवाइस में अवशिष्ट इथेनॉल को हटाने के लिए चैनलों को 15 एमएल डिओनाइज्ड पानी के साथ धोया जा सकता है।

3. अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंटों की तैयारी

नोट: अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट आसपास के सेलुलर झिल्ली19के पारमेबिलाइजेशन में तेजी से वृद्धि करके आणविक यौगिकों के प्रकाश काल के वितरण में काफी वृद्धि करते हैं । आणविक वितरण इस प्रणाली में अल्ट्रासाउंड विपरीत एजेंटों के बिना बहुत सीमित है।

  1. निम्नलिखित मिश्रण युक्त 20mL प्रस्फुटन शीशी में एक फॉस्फोलिपिड समाधान तैयार करें:
    1. 1,2-डिटेरोइल-एसएन-ग्लाइसेरो-3-फॉस्फोकोलिन (डीएसपीसी) के 25 मिलीग्राम जोड़ें।
    2. 1,2-डिटेरोइल-एसएन-ग्लाइसेरो-3-एथिलफोस्फोचोलिन (डीएसईपीसी) के 11.6 मिलीग्राम जोड़ें।
    3. 1,2-डिटेरोसाइल-एसएन-ग्लाइसेरो-3-फॉस्फोग्लिसेरोल (डीएसपीजी) के 0.26 मिलीग्राम जोड़ें।
    4. इसमें 0.88 मिलीग्राम पॉलीऑक्सीथीन40 स्टेरेट डालें।
  2. क्लोरोफॉर्म जोड़ें जब तक कि सभी फॉस्फोलिपिड भंग न हो जाएं (उदाहरण के लिए, क्लोरोफॉर्म का 3 एमएल)।
  3. एक सूखी लिपिड फिल्म बनाने के लिए 48 घंटे के लिए एक डिसिकेटर में वाष्पित क्लोरोफॉर्म (आर्गन के तहत वाष्पीकरण या रोटरी वाष्पीकरण के साथ सुखाने की प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए उपयोग किया जा सकता है)।
  4. बाँझ फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 10 एमएल के साथ लिपिड फिल्म को रीहाइड्रेट करें।
  5. एक cationic micellar समाधान बनाने के लिए 40% आयाम पर 3 मिनट के लिए लिपिड समाधान सोनीकेट।
  6. सोनीशन के बाद 1 महीने तक 2-6 डिग्री सेल्सियस पर फॉस्फोलिपिड समाधान स्टोर करें।
  7. अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट तैयार करने के लिए, 200 माइक्रोन ईटीसी मिसेलर समाधान और बाँझ पीबीएस के 600 माइक्रोन को 2 एमएल ग्लास पट शीशी में जोड़ें।
  8. टोपी को समेटकर शीशी को सील करें।
  9. 30 एस के लिए डेकाफ्लोरोबुटेन गैस के साथ शीशी सिर अंतरिक्ष को भरने के लिए एक 1.5 "20G सुई का उपयोग करें।
  10. परफ्लोरोबुटेन गैस से भरे अल्ट्रासाउंड विपरीत एजेंटों के रूप में 4,350 सीपीएम में 45 एस के लिए शीशी को मिलाना।
  11. एसीटोफ्लुइडिक डिवाइस के माध्यम से संयुक्त कंट्रास्ट एजेंट/सेल मिश्रण को पंप करने से तुरंत पहले सेल समाधान के 1 एमएल प्रति अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट समाधान के 25 माइक्रोन जोड़ें। सेल समाधान उपयोगकर्ता द्वारा वांछित के रूप में संशोधित किया जा सकता है, लेकिन हमारे अध्ययनों में सेल समाधान में चरण 4.21 में प्राथमिक टी कोशिकाएं और क्रमशः चरण 5.7 में A549 फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाएं शामिल थीं।

4. प्राथमिक Tcells की तैयारी

  1. पूरे रक्त समाधान से परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) को अलग करें और -150 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। सब्सट्रेट युक्त घनत्व ढाल पृथक्करण का उपयोग आमतौर पर पीबीएमसी को पूरे रक्त24 , 25,26से अलग करने के लिए कियाजाताहै ।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में जमे शीशी गल।
  3. तनु गल पीबीएमसीएस 1:10 पीबीएस के साथ 15mL सेंट्रलाइज ट्यूब में । प्रत्येक 1mL शीशी में लगभग 10 मिलियन पीबीएमसी होते हैं।
  4. सेंट्रलाइज पतला पीबीएमसी 580 एक्स ग्राम पर 11 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  5. सुपरनेट को एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को फिर से खर्च करने के लिए बफर चलाने वाले एमएसीएस के 13 एमएल जोड़ें।
  6. एक स्वचालित सेल काउंटर या हीमोसाइटोमीटर के साथ पीबीएमसी की गणना करें।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 11 मिनट के लिए 580 x g पर फिर से पीबीएमसी को सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को एस्पिरेट करें।
  8. प्रति 10 मिलियन पीबीएमसी 40 माइक्रोन ठंडा चल बफर जोड़ें।
  9. टी कोशिकाओं को अलग करने के लिए, पैन टी-सेल बायोटिन एंटीबॉडी कॉकटेल के 10 मिलियन पीबीएमसी प्रति 10 माइक्रोन जोड़ें।
  10. धीरे-धीरे पीबीएमसी को उत्तेजित करें और समाधान को 5 मिनट प्रति 10 मिलियन कोशिकाओं के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  11. 10 मिलियन पीबीएमसी में 30 माइक्रोल रनिंग बफर और पैन टी-सेल माइक्रोबीड कॉकटेल के 20 माइक्रोल जोड़ें।
  12. पीबीएमसी और मोतियों को अच्छी तरह से मिलाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  13. 500 माइक्रोन की कुल मात्रा तक पहुंचने के लिए रनिंग बफर जोड़ें।
  14. निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद "कम पृथक्करण" सेटिंग का उपयोग करके व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बेंचटॉप चुंबकीय छंटाई उपकरण के साथ अलग प्राथमिक टी कोशिकाएं। इस चरण को सेल छंटाई के बाद 5-10 मिलियन टी कोशिकाओं के बीच उपज चाहिए।
  15. स्वचालित सेल काउंटर या हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके टी कोशिकाओं की गणना करें।
  16. कोशिकाओं को गोली मारने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए बाँझ पीबीएस और अपकेंद्रित्र के 580 x ग्राम पर 580 x ग्राम में पतला टी कोशिकाओं।
  17. पीबीएस के 1 एमएल में सुपरनेट और रिसिपेंड टी सेल्स को एस्पिरेट करें।
  18. प्रयोगों के लिए एक स्वचालित सेल काउंटर या हीमोसाइटोमीटर और एलिकोट 1 मिलियन/एमएल का उपयोग करके टी कोशिकाओं की गणना करें।
  19. पीबीएस में 1 मिलीग्राम/एमएल फ्लोरोसेइन सॉल्यूशन तैयार करें ।
  20. प्रसंस्करण से तुरंत पहले टी सेल समाधान (अंतिम फ्लोरोसेइन एकाग्रता = 100 माइक्रोग्राम/एमएल) के प्रति 1 मिलीग्राम/एमएल फ्लोरोसेइन समाधान के 100 माइक्रोन जोड़ें।
  21. अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट समाधान के 25 माइक्रोन जोड़ें जैसा कि पहले चरण 3.11 में वर्णित है।
  22. एसीटोफ्लुइडिक सिस्टम का उपयोग करके कोशिकाओं की प्रक्रिया 1mL aliquots (चरण 2.10-2.11 देखें)। यह कदम प्राथमिक टी कोशिकाओं में फ्लोरोसिन की डिलीवरी को बढ़ाता है।
  23. उपचार के तुरंत बाद, एक्सट्रासेलुलर फ्लोरोसेइन को हटाने के लिए पीबीएस के 500 माइक्रोन के साथ 10 मिनट के लिए 580 x ग्राम पर अपकेंद्री के माध्यम से कोशिकाओं को तीन बार धोएं। फ्लोरोसिन समाधान जोड़ने के बाद कोशिकाओं को 10 मिनट के भीतर धोया जाना चाहिए।
  24. अंतिम धोने के कदम के बाद, पीबीएस के 250 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से उठाया जाता है और प्रवाह साइटोमीटर पर फ्लोरेसेंस को मापता है।

5. A549 फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं की तैयारी

  1. संस्कृति A549 (adenocarcinomic मानव alveolar बेसल एपिथेलियल) कोशिकाओं में पूरा DMEM मीडिया (10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन) में ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 एक फ्लैट नीचे ऊतक संस्कृति फ्लास्क में ।
  2. हार्वेस्ट A549 कोशिकाओं जब वे 70-90% की नरमी तक पहुंचने । फ्लास्क से मीडिया को एस्पिरेट करें और सीरम प्रोटीन को हटाने के लिए पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धोएं।
  3. फ्लास्क में ट्राइप्सिन (0.25%) ईडीटीए जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। ट्रिप्सिन एक पाचन एंजाइम है जो कोशिकाओं को ऊतक संस्कृति फ्लास्क की निचली सतह से अलग करने का कारण बनता है।
  4. 15mL अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए ट्रिप्सिन समाधान स्थानांतरित करें और 1:3 अनुपात में पूर्ण डीएमईएम मीडिया जोड़कर इसे बेअसर करें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,500 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र के माध्यम से कोशिकाओं को गोली।
  6. सुपरनेटेंट को एस्पिरेट करें और पीबीएस समाधान में 100,000/एमएल की एकाग्रता पर गोली को फिर से खर्च करें जिसमें 15-एमएल शंकुशीली शीशी में 200 mm ट्रेहलोज होता है।
  7. अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट समाधान के 25 माइक्रोन जोड़ें जैसा कि पहले चरण 3.11 में वर्णित है।
  8. एसीटोफ्लुइडिक सिस्टम का उपयोग करके कोशिकाओं की प्रक्रिया 1mL aliquots (चरण 2.10-2.11 देखें)। यह कदम A549 फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं में ट्रेहालोज की डिलीवरी को बढ़ाता है।
  9. उपचार के तुरंत बाद, एक्सट्रासेलुलर ट्रेहलोस को हटाने के लिए पीबीएस के 500 माइक्रोन के साथ अपकेंद्री के माध्यम से कोशिकाओं को तीन बार धोएं। कोशिकाओं को ट्रेहलोस समाधान जोड़ने के बाद 10 मिनट के भीतर धोया जाना चाहिए।
  10. अंतिम वाशिंग चरण के बाद, पीबीएस के 100 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से उठाया जाता है।
  11. lyse कोशिकाओं के लिए 1% ट्राइटन एक्स-100 समाधान के 11 माइक्रोल जोड़ें और इंट्रासेलुलर ट्रेहलोस जारी करें।
  12. 15 एस के लिए भंवर, फिर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  13. भंवर फिर से 15 एस के लिए, तो निर्माता की सिफारिश के बाद व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ट्रेहालोस परख का उपयोग कर trehalose एकाग्रता को मापने ।

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Representative Results

3डी-प्रिंटेड केस के अंदर इकट्ठे हुए एसीओस्टोफ्लुइडिक सिस्टम की एक छवि चित्र 1में दिखाई गई है। यह प्रोटोकॉल एक एसी्टोस्टोफ्लुइडिक सिस्टम का उत्पादन करता है जिसका उपयोग अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंटों का उपयोग करके कई सेल लाइनों में इंट्रासेलुलर आणविक वितरण को बढ़ाने के लिए किया जा सकता है।

अंक 2   एक अनुपचारित नियंत्रण समूह(पी<0.05, एन = 3/समूह) की तुलना में एसी्टोस्टोफ्लुइडिक उपचार के साथ प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं के लिए फ्लोरोसेंट यौगिक, फ्लोरोसेसिन की बढ़ी हुई इंट्रासेलर डिलीवरी को दर्शाता है। टी कोशिकाओं को १०० μg/mL फ्लोरोसेइन समाधान और 25 μL/mL अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट समाधान के साथ PBS में १,०००,०/एमएल की एकाग्रता पर निलंबित कर दिया गया था, और मिश्रण अल्ट्रासाउंड उपचार के लिए acoustofluidic डिवाइस के माध्यम से पारित किया गया था । इंट्रासेलुलर फ्लोरोसेइन डिलीवरी और सेल फिजिबिलिटी को एक्सट्रासेलुलर फ्लोरोसेइन को हटाने के लिए सेंट्रलाइजेशन के जरिए सेल्स को धोने के बाद फ्लो साइटोमेट्री के साथ मापा गया । अनुपचारित नियंत्रण समूह में टी कोशिकाओं को भी १०० μg/mL फ्लोरोसीन समाधान के साथ PBS में १,०००,०/एमएल पर निलंबित कर दिया गया था, लेकिन अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट समाधान नहीं जोड़ा गया था और कोशिकाओं को एसी्टोफ्लुइडिक डिवाइस के माध्यम से पारित नहीं किया गया । अनुपचारित नियंत्रण समूह में टी कोशिकाओं की फ्लोरेसेंस तीव्रता के सापेक्ष ध्वनिकदुत्व उपचार के बाद टी कोशिकाओं की फ्लोरेसेंस तीव्रता में 5 गुना वृद्धि हुई, जो फ्लोरोसेइन की बढ़ी हुई डिलीवरी का संकेत है। सेल व्यवहार्यता acoustofluidic उपचार के बाद थोड़ा कम हो गया, लेकिन ८०% (पी<०.०५, n = 3/समूह) से ऊपर रहे ।

चित्रा 3 अकेले प्रवाह (कोई अल्ट्रासाउंड विपरीत एजेंट या अल्ट्रासाउंड एक्सपोजर) की तुलना में acoustofluidic उपचार के साथ मानव A549 फेफड़ों कार्सिनोमा कोशिकाओं के लिए एक परिरक्षक यौगिक, ट्रेहलोस, के बढ़ाया इंट्रासेलर वितरण को दर्शाता है और अनुपचारित नियंत्रण समूह में कोशिकाओं की तुलना में (ANOVA पी<0.05, n = 3/समूह) । A549 कोशिकाओं को २०० mm trehalose समाधान और 25 μL/mL अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट समाधान के साथ PBS में 100,000/एमएल की एकाग्रता पर निलंबित कर दिया गया था, और मिश्रण अल्ट्रासाउंड उपचार के लिए एसी्टोफ्लुइडिक डिवाइस के माध्यम से पारित किया गया था । नियंत्रण समूहों में A549 कोशिकाओं ("केवल प्रवाह" और "कोई उपचार") भी २०० mm trehalose के साथ PBS में 100,000/mL पर निलंबित कर दिया गया था, लेकिन अल्ट्रासाउंड विपरीत एजेंट समाधान नहीं जोड़ा गया था और कोशिकाओं अल्ट्रासाउंड उपचार के संपर्क में नहीं थे । इंट्रासेलुलर ट्रेहलोस को ट्रेहलोस परख किट का उपयोग करके निर्धारित किया गया था और अनुपचारित नियंत्रण समूह में सामान्यीकृत किया गया था। सेल व्यवहार्यता ट्राइपैन नीले परख के साथ मापा गया था। समूहों (n= 3-7/समूह) के बीच सेल व्यवहार्यता में कोई सांख्यिकीय अंतर नहीं था ।

Figure 1
चित्रा 1:एसीटोफ्लुइडिक सिस्टम की तस्वीर। एसीटोफ्लुइडिक प्रवाह प्रणाली में एक पीडीएमएस-आधारित प्रवाह कक्ष होता है जिसमें एक एकीकृत पीजेडटी ट्रांसड्यूसर एक माइक्रोकंट्रोलर द्वारा संचालित होता है। एलईडी इंडिकेटर और ऑन/ऑफ पुश बटन के साथ 3डी-प्रिंटेड केस वैकल्पिक अतिरिक्त फीचर्स हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एक्सोस्टोफ्लुइडिक उपचार मानव टी कोशिकाओं के लिए एफलुओर्सीइन डिलीवरी को बढ़ाता है। (क)प्राथमिक टी कोशिकाओं में फ्लोरेसेंस तीव्रता अनुपचारित नियंत्रण समूह (कोई एकोसोफ्लुइडिक्स और नो माइक्रोबबल्स)(पी<0.05, एन = 3/समूह) की तुलना में फ्लोरोसेसिन के साथ फ्लोरोसीडिक उपचार के बाद बढ़ी। (ख)एसीओ्टोफ्लुइडिक उपचार के बाद सेल व्यवहार्यता में थोड़ी कमी आई लेकिन प्रवाह साइटोमेट्री(पी<005, एन = 3/समूह) द्वारा मापा गया 80% से ऊपर रहा। (ग)एंक्यूस्टोफ्लुइडिक ट्रीटमेंट ग्रुप में उच्च फ्लोरेसेंस का संकेत देने वाले प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री हिस्टोग्राम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: Acoustofluidic उपचार मानव फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं के लिए टीrehalose प्रसव को बढ़ाता है। (ए)ट्रेहलोस तेज केवल प्रवाह (कोई अल्ट्रासाउंड और कोई माइक्रोबबल) और अनुपचारित नियंत्रण समूह (ANOVA पी<०.०५, n = 3/समूह) की तुलना में A549 फेफड़ों कार्सिनोमा कोशिकाओं में वृद्धि हुई । (ख)ट्राइपैन ब्लू परख (n=3-7/समूह) द्वारा मापा गया एसीओटोफ्लुइडिक उपचार के बाद सेल व्यवहार्यता 90% से ऊपर रही। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल एक कम लागत वाली एसीकोफ्लुइडिक प्रणाली के असेंबली और संचालन का वर्णन करता है जो अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए जैव अणुओं के इंट्रासेलुलर डिलीवरी को बढ़ाता है। इस प्रणाली को कोडांतरण और संचालित करते समय विचार करने के लिए कई महत्वपूर्ण कारक हैं। एसीस्टोफ्लुइडिक डिवाइस पीडीएमएस में निर्मित है, जो एक जैव संगत सामग्री है जिसे आसानी से लगातार चैनलआयामों 27के साथ ढाला जा सकता है। सुसंस्कृत कोशिकाओं के साथ काम करते समय बंध्यता बढ़ाने के लिए डिवाइस चैनलों को 70% इथेनॉल प्रसंस्करण से पहले 15 एमएल के साथ धोया जा सकता है। इथेनॉल सफाई के बाद, सेल समाधान जोड़ने से पहले चैनलों से अवशिष्ट इथेनॉल को हटाने के लिए डिवाइस को कुल्ला करने के लिए 15 एमएल डिओनाइज्ड पानी का उपयोग किया जा सकता है। छोटे एसीओस्टोफ्लुइडिक चैनल आसानी से मलबे या सेल समुच्चय द्वारा अवरुद्ध हो सकते हैं, जिससे यह डिवाइस के लगातार उपयोग के लिए एक सीमा बन जाती है। प्रत्येक नमूने के बीच चैनलों को अच्छी तरह से कुल्ला करने से चैनल रुकावट के साथ समस्याओं को रोकने में मदद मिलेगी। इसके अलावा, प्रत्येक बैच में कई पीडीएमएस उपकरणों को गढ़ा जा सकता है ताकि यदि आवश्यक हो तो उपकरणों को जल्दी से बदला जा सके। अल्ट्रासाउंड-आधारित अनुप्रयोगों के लिए, लगातार मोटाई के साथ पीडीएमएस उपकरणों का उत्पादन करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि पीडीएमएस मोटाई में अंतर तरल चैनलों के भीतर अल्ट्रासाउंड दबाव को प्रभावित कर सकता है। अल्ट्रासाउंड तरंगें डिवाइस के माध्यम से लगातार प्रचारित होती हैं और प्रेषित तरंगें खड़ी ध्वनिक तरंग पैटर्न बनाने के लिए परावर्तित तरंगों के साथ बातचीत करती हैं जो पीडीएमएसमोटाई 17में अंतर के प्रति बहुत संवेदनशील हैं । पीडीएमएस मोटाई मुख्य रूप से मोल्ड (चरण 1.7) में जोड़े गए पीडीएमएस की मात्रा से निर्धारित होती है और यह प्रोटोकॉल 3.5 मिमी की पीडीएमएस मोटाई देता है।

तरल चैनल के भीतर सबसे छोटी ध्वनिक तरंगदैर्ध्य का उत्पादन करने के लिए माइक्रोकंट्रोलर (8 मेगाहर्ट्ज) की अधिकतम उत्पादन आवृत्ति का चयन किया गया था। माइक्रोकंट्रोलर आउटपुट आमतौर पर एक वर्ग तरंग होता है लेकिन ऑसिलोस्कोप माप से पता चला है कि 8 मेगाहर्ट्ज पर आउटपुट कई दर सीमाओं के कारण साइनसॉयड तरंग के समान हो जाता है। इस प्रणाली की एक सीमा यह है कि माइक्रोकंट्रोलर का अधिकतम वोल्टेज आउटपुट 5V है और यदि उच्च वोल्टेज आउटपुट वांछित हैं तो बाहरी आरएफ एम्पलीफायर की आवश्यकता होती है। इस प्रणाली में ट्रांसड्यूसर का मुक्त क्षेत्र दबाव उत्पादन सुई हाइड्रोफोन (सटीक ध्वनिकी, डोरचेस्टर, यूनाइटेड किंगडम) के साथ मापा गया 1 सेमी पर 18 केपीए था। हालांकि यह दबाव अपेक्षाकृत कम है, चैनलों के भीतर खड़ी तरंगें ध्वनिक दबाव बढ़ा सकती हैं जो नमूने अल्ट्रासाउंड बीम से गुजरते समय सामने आते हैं।

अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंटों का उपयोग ध्वनिक कैविटेशन को ध्वनिक चैनलों के भीतर नाभिित करने के लिए किया जाता है जो28,29को कोशिका झिल्ली में जैव अणुओं के वितरण को बढ़ाता है। यह प्रोटोकॉल एक cationic फॉस्फोलिपिड झिल्ली द्वारा समझाया परफ्लोरोकार्बन गैस से भरे माइक्रोबबल के संश्लेषण का वर्णन करता है। जैसा कि पहले वर्णित है, इस फॉर्मूलेशन में मुख्य रूप से व्यास30में 1-3 माइक्रोन के बीच माइक्रोबबल होते हैं। माइक्रोबबल्स की सकारात्मक आवेशित सतह उन्हें नकारात्मक रूप से चार्ज कोशिका झिल्ली की ओर आकर्षित करती है, जो माइक्रोबबल और कोशिकाओं के करीब निकटता में होने पर सोनोपोरेशन-मध्यस्थता आणविक वितरण को बढ़ाती है। सेल समाधान में माइक्रोबबल की एकाग्रता एक महत्वपूर्ण कारक है जो एसी्टोफ्लुइडिक उपचार के बाद आणविक वितरण और कोशिका व्यवहार्यता की दक्षता को प्रभावित कर सकता है, और इष्टतम माइक्रोबबल एकाग्रता प्रत्येक सेल प्रकार 19के लिए विशिष्ट हो सकती है। एक लिपिड खोल के साथ गैस से भरे माइक्रोबबल की एकाग्रता संश्लेषण के बाद समय के साथ कम हो सकती है इसलिए अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंटों का संश्लेषण के बाद कुछ घंटों के भीतर उपयोग किया जाना चाहिए।

हमने इस प्रोटोकॉल में एसीटोफ्लुइडिक सिस्टम का उपयोग करके प्राथमिक गैर-सक्रिय मानव टी कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट यौगिक (फ्लोरोसेसिन) की डिलीवरी का प्रदर्शन किया। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं की सक्रियता की स्थिति इंट्रासेलुलर आणविक वितरण की दक्षता को प्रभावित कर सकती है। फ्लोरोसीइन के फ्लोरेसेंस गुण प्रवाह साइटोमेट्री के साथ संवेदनशील इंट्रासेलुलर डिटेक्शन को सक्षम करते हैं, लेकिन अन्य घुलनशील यौगिकों को भी इस आहार प्रणाली का उपयोग करके कोशिकाओं में वितरित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हमने मानव फेफड़ों के कैंसर कोशिकाओं में ट्रेहारोस की आकस्मिक डिलीवरी का प्रदर्शन किया। कोशिकाओं में ट्रेहलोस की एक्सोस्टोफ्लुइडिक डिलीवरी जमे हुए और शुष्क भंडारण के बाद बढ़ी हुई वसूली को सक्षम कर सकती है, जिसका बायोमेडिकल और अनुसंधान अनुप्रयोगों की एक श्रृंखला पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ सकता है 19।

प्रोटीन या डीएनए प्लाज्मिड जैसे अन्य जैव अणुओं की एक्टोस्टोफ्लुइडिक डिलीवरी भी संभव है, हालांकि इस प्रणाली की एक सीमा यह है कि आणविक वितरण की दक्षता बड़े यौगिकों के लिए कम हो सकती है18,31। अन्य जैव अणुओं के वितरण के लिए एसीओस्टोफ्लुइडिक प्रवाह दर, अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंटों की सांद्रता, सेल सांद्रता और मीडिया का अनुकूलन आवश्यक हो सकता है। इसके अलावा, सेल व्यास, आकृति विज्ञान, झिल्ली गुण और फेनोटाइप जैसे कारकों के कारण इष्टतम पैरामीटर विभिन्न सेल प्रकारों के बीच भिन्न हो सकते हैं।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित एसीओस्टोफ्लुइडिक सिस्टम को अपेक्षाकृत कम लागत पर आसानी से इकट्ठा और संचालित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, इस प्रणाली को अन्य सिग्नल स्रोतों या अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसरों को जोड़कर अन्य अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ताकि विशिष्ट उत्पादन दबाव और आवृत्तियां उत्पन्न की जा सकें32,33,34. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में वर्णित सिरिंज पंप प्रणाली को वांछित होने पर पेरिस्टाल्टिक पंपों से बदला जा सकता है। 50 एमएल/एच की प्रवाह दर पर अल्ट्रासाउंड बीम के भीतर कोशिकाओं के लिए निवास समय के रूप में वे acoustofluidic चैनल के माध्यम से गुजरती हैं लगभग 1 एस है, लेकिन इस निवास समय के रूप में तरल पदार्थ प्रवाह दर को समायोजित करके विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक संशोधित किया जा सकता है ।

अन्य सामान्य ट्रांसफैक्शन तकनीकों के विपरीत, बायोमॉलिक्यूल्स को घंटों के बजाय मिनटों के भीतर कोशिकाओं में वितरित किया जा सकता है और इस प्रणाली को विशेष और महंगे उपकरणों की आवश्यकता नहीं होती है। इसके अलावा, यह प्रणाली आमतौर पर उपयोग की जाने वाली सेल संस्कृति मीडिया या अन्य बफ़र्स की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ संगत है। संक्षेप में, यह एसीस्टोफ्लुइडिक सिस्टम कोशिकाओं को बायोमॉलिक्यूल्स की तेजी से डिलीवरी करने में सक्षम बनाता है, जो अनुसंधान अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयोगी हो सकता है।

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Disclosures

सह-लेखक एमएएम और जेके ने DesiCorp में स्वामित्व धारण किया है जो इस शोध से संबंधित उत्पादों से आर्थिक रूप से लाभान्वित हो सकता है।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल साइंस फाउंडेशन (#1827521, #1827521, #1450370) और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (U01HL127518) से फंडिंग करके भाग में समर्थन दिया गया था । यूनिवर्सिटी ऑफ लुइसविले माइक्रो/नैनो टेक्नोलॉजी सेंटर द्वारा फोटोलिथोग्राफी सेवाएं प्रदान की गईं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fabrication of Acoustofluidic Device
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT Ellsworth Adhesives 4019862 (SKU) https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/
Harris Uni-Core (2.5 mm) Electron Microscopy Sciences 69039-25
Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube - S (2/4 port) Darwin Microfluidics LVF-KPT-S-2 (SKU) https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port
Microscope Slide VWR 16004-430 https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium
trichlorosilane Gelest 105732-02-3 (Cas. No.) Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage. 
Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD) McMaster-Carr 5233K51 (Part #) https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/
Assembly of Acoustofluidic System
Arduino Uno Arduino 7630049200050 (Barcode) https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3
Preparation of Ultrasound Contrast Agents
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) Avanti Lipids 890703P-25mg (SKU) https://avantilipids.com/product/890703
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) Avanti Lipids 850365P-25mg (SKU) https://avantilipids.com/product/850365
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) Avanti Lipids 840465P-25mg (SKU) https://avantilipids.com/product/840465
APF-140HP (decafluorobutate gas) FlouroMed 355-25-9 (Cas No.) http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/
DB-338 Amalgamators  COXO https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/
polyoxyethylene 40 stearate  Sigma-Aldrich P3440-250G (SKU) https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en&region=US&gclid=
Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj
Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS
vID64X-1KbO3LUKGjVUwb
PDAaAqvOEALw_wcB
Q125 Sonicator Qsonica Q125-110 (Ref.) https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r
Preparation of Primarty T Cells
autoMACs running buffer Miltenyi Biotec 130-091-221 (Order No.) https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref
Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail)  Miltenyi Biotec 130-096-535 (Order No.) https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535
magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator) Miltenyi Biotec 130-092-545 (Order No.) https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545
Preparation of A549 Lung Cancer Cells
Trehalose Assay Kit  Megazyme K-TREH (Cat. No.) https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit
Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile) VWR 97063-702 (Cat. No.) https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile

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बायोइंजीनियरिंग अंक 167 एकोसोफफ्लुइडिक्स अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट आणविक वितरण सोनोपोरेशन कोशिकाएं
कोशिकाओं को आणविक यौगिकों के उन्नत वितरण के लिए एक Acoustofluidic डिवाइस का असेंबली और संचालन
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Centner, C. S., Murphy, E. M.,… More

Centner, C. S., Murphy, E. M., Stamp, B. F., Priddy, M. C., Moore, J. T., Bates, P. J., Menze, M. A., Yaddanapudi, K., Kopechek, J. A. Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells. J. Vis. Exp. (167), e62035, doi:10.3791/62035 (2021).

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