Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Montering og drift av en acoustofluidisk enhet for forbedret levering av molekylære forbindelser til celler

Published: January 21, 2021 doi: 10.3791/62035
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 2, 3, 2, 1
1Department of Bioengineering, University of Louisville, 2School of Medicine, University of Louisville, 3Department of Biology, University of Louisville

Summary

Denne protokollen beskriver montering og drift av en rimelig acoustofluidic enhet for rask molekylær levering til celler via sonoporasjon indusert av ultralydkontrastmidler.

Abstract

Effektiv intracellulær levering av biomolekyler er nødvendig for et bredt spekter av biomedisinsk forskning og cellebaserte terapeutiske anvendelser. Ultralydmediert sonoporasjon er en ny teknikk for rask intracellulær levering av biomolekyler. Sonoporasjon oppstår når kavitasjon av gassfylte mikrobobler danner forbigående porer i nærliggende cellemembraner, noe som muliggjør rask opptak av biomolekyler fra den omkringliggende væsken. Dagens teknikker for in vitro sonoporation av celler i suspensjon er begrenset av langsom gjennomstrømning, variasjon i ultralydeksponeringsforholdene for hver celle og høye kostnader. For å løse disse begrensningene er det utviklet en rimelig acoustofluidisk enhet som integrerer en ultralydtransduser i en PDMS-basert fluidisk enhet for å indusere konsistent sonoporasjon av celler når de strømmer gjennom kanalene i kombinasjon med ultralydkontrastmidler. Enheten er fremstilt ved hjelp av standard fotolittografiteknikker for å produsere den PDMS-baserte fluidbrikken. En ultralyd piezo disktransduser er festet til enheten og drevet av en mikrokontroller. Monteringen kan integreres inne i et 3D-trykt etui for ekstra beskyttelse. Celler og mikrobobler skyves gjennom enheten ved hjelp av en sprøytepumpe eller en peristaltisk pumpe koblet til PVC-rør. Forbedret levering av biomolekyler til humane T-celler og lungekreftceller er demonstrert med dette acoustofluidiske systemet. Sammenlignet med bulkbehandlingsmetoder øker dette acoustofluidiske systemet gjennomstrømning og reduserer variasjon, noe som kan forbedre cellebehandlingsmetoder for biomedisinske forskningsapplikasjoner og produksjon av cellebaserte terapeutiske midler.

Introduction

Virale og ikke-virale plattformer har blitt brukt til å forbedre molekylær levering til celler. Viral levering (transduksjon) er en vanlig teknikk som brukes i cellebaserte terapier som krever genomisk modifikasjon. Begrensninger med viral levering inkluderer potensiell innsettingsmutagenese, begrenset transgen kapasitet og uønsket multiplisitet av infeksjon1,2. Derfor er ikke-virale molekylære leveringsteknikker under utvikling for et bredt spekter av biomedisinske og forskningsapplikasjoner. Vanlige teknikker inkluderer mekanisk, elektrisk, hydrodynamisk eller bruk av laserbasert energi for å forbedre opptaket av biomolekyler i celle 3. Elektroporasjon er en vanlig brukt ikke-viral molekylær leveringsplattform som har evnen til å indusere forbigående perforering i plasmamembranen for intracellulær levering av molekylære forbindelser4,5,6,7,8,9. Imidlertid er den forbigående perforeringen av plasmamembranen en stokastisk prosess, og molekylært opptak via elektroporasjon er generelt avhengig av passiv diffusjon over de forbigående membranporene4,7,8.

En alternativ metode er utnyttelse av ultralyd for forbedret intracellulær molekylær levering via kavitasjon av ultralydkontrastmidler (dvs. gassfylte mikrobobler). Mikroboblekavitasjon induserer mikrostreamingeffekter i de omkringliggende mediene som kan forårsake forbigående perforering av nærliggende plasmamembraner ("sonoporasjon") som tillater rask intracellulært opptak av biomolekyler via passive eller aktive transportmekanismer10,11,12. Sonoporasjon er en effektiv teknikk for rask molekylær levering til celler, men denne tilnærmingen krever ofte dyrt utstyr og bulkbehandlingsmetoder som er begrenset av lavere gjennomstrømning og høyere variasjon i ultralydeksponeringsforhold13. For å løse disse begrensningene er acoustofluidic enheter, som muliggjør konsekvent sonoporasjon av celler i suspensjon, for tiden under utvikling.

Acoustofluidics er et ekspanderende felt som integrerer ultralyd og mikrofluidisk teknologi for et bredt spekter av applikasjoner. Denne tilnærmingen har tidligere blitt brukt til partikkelseparasjon ved å bruke kontinuerlig ultralydenergi for å indusere stående akustiske bølger i de fluidiske kanalene14,15,16,17. Partikler sorteres mot ulike deler av enheten basert på en rekke egenskaper, for eksempel partikkelstørrelse, tetthet og komprimerbarhet i forhold til medium16. Acoustofluidic teknologier er også i utvikling for å muliggjøre rask molekylær levering til en rekke celletyper for forskningsapplikasjoner og produksjon av celleterapier18. Nylig demonstrerte vi forbedret molekylær levering til erytrocytter ved hjelp av en PDMS-basert acoustofluidisk enhet19. I den acoustofluidiske plattformen kan celle- og mikrobobbledynamikk manipuleres for å indusere fysiske interaksjoner som muliggjør forbedret levering av biomolekyler. Effektiviteten og konsistensen av intracellulær molekylær levering kan potensielt økes ved å optimalisere avstanden mellom celler og mikrobobler.

En viktig anvendelse for acoustofluidisk mediert sonoporasjon innebærer transport av biomolekyler til primære menneskelige T-celler. Immunterapier basert på adoptiv T-celleoverføring, som Chimeric Antigen Receptor T-celle (CAR T) terapi, dukker raskt opp for behandling av ulike sykdommer, inkludert kreft og virus som HIV20. CAR T-behandling har vært spesielt effektiv hos pediatriske akutte lymfoblastiske leukemipasienter (ALL), med en fullstendig remisjonsrate på 70-90%21. T-celleproduksjon for disse terapiene avhenger imidlertid generelt av viral transduksjon som er begrenset av potensiell innsettingsmutagenese, lange behandlingstider og utfordringer med å levere ikke-genetiske biomolekyler som proteiner eller småmolekyler 1. Acoustofluidic-medierte molekylære leveringsmetoder kan potensielt overvinne disse begrensningene og forbedre produksjonen av T-celleterapier.

En annen viktig anvendelse for acoustofluidic-mediert sonoporation innebærer intracellulær levering av konserveringsmidler, for eksempel trehalose, som beskytter celler under frysing og desiccation. Trehalose produseres av noen organismer i naturen og hjelper dem med å tolerere frysing og uttørking ved å beskytte sine cellulære membraner22,23. Trehalose produseres imidlertid ikke av pattedyrceller og er ugjennomtrengelig for pattedyrcellemembraner. Derfor er effektive molekylære leveringsteknikker, som sonoporasjon, nødvendige for å oppnå tilstrekkelige intracellulære trehalosenivåer som kreves for å beskytte interne cellulære membraner. Denne tilnærmingen er for tiden under utvikling for tørr bevaring av ulike celletyper.

Denne protokollen gir en detaljert beskrivelse av montering og drift av et relativt rimelig acoustofluidisk system drevet av en mikrokontroller. Ultralydkontrastmidler brukes til å indusere sonoporasjon i de fluidiske kanalene og muliggjør rask molekylær levering til ulike celletyper, inkludert T-celler og kreftceller. Dette acoustofluidiske systemet kan brukes til en rekke forskningsapplikasjoner og kan også være nyttig som et prototypesystem for å evaluere sonoporasjonsmetoder for forbedrede celleterapiproduksjonsprosesser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hele bloddonasjoner ble samlet inn fra friske givere etter protokoller godkjent av institusjonsstyret ved University of Louisville.

1. Fabrikasjon av acoustofluidic enhet

  1. Få en fotomaske med konsentrisk spiraldesign som inneholder kanaler med en diameter på 500 μm. En CAD-fil finnes i tilleggsfilene som et eksempel. En egendefinert fotomaske kan bestilles fra en kommersiell leverandør eller mønstres ved hjelp av en maskeskriver.
  2. Forbered en form av konsentrisk spiraldesign på en fotoresistbelagt silisiumskive ved hjelp av standard fotolittografiteknikker.
    1. Tilsett ca. 2 ss (~30 ml) SU-8 2100 til en 100 mm silisiumskive.
    2. Spin-coat waferen på en spinner med en hastighet på 150 rpm i 30 s for å spre ut fotoresisten, og øk deretter hastigheten til 1200 rpm i 60 s for å gi en tykkelse på 200 μm.
    3. Herd den fotoresistbelagte skiven i en polyimidvakuumovn med en 30 min rampe opp og 30 min bor ved 115 °C, og ramp deretter ned i 30 minutter.
    4. Eksponer den fotoresistbelagte skiven i 130 s med en maskejustering med fotomasken fra trinn 1.1.
    5. Stek skiven etter eksponering etter samme prosess som er beskrevet i trinn 1.2.3.
    6. Utvikle fotoresisten i SU-8 utviklerløsning i ca. 8 minutter.
      FORSIKTIG: Bruk kun utviklerløsningen i en godt ventilert kjemisk avtrekkshette.
  3. Silaniser formen for å gjøre overflaten mer hydrofob. Plasser den fotoresistbelagte skiven i en tørkemiddel og tilsett en 20 μL dråpe klorosilane (C8H4Cl3F13Si). Påfør vakuum på kammeret i 30 s, forsegle deretter kammeret og la over natten.
    FORSIKTIG: Klorosilane er svært farlig og brannfarlig. Eksponering forårsaker alvorlige brannskader og øyeskader.
  4. Kombiner 54 g polydimethsiloksan (PDMS) base og 6 g herdemiddel i en kopp og bland kraftig og grundig med en slikkepott i minst 1 min.
  5. Plasser koppen som inneholder PDMS-oppløsningen i en tørkemiddel i ca. 30 minutter eller til rester av luftbobler fjernes fra oppløsningen.
  6. Plasser fotoresistbelagt skive med mønstrene vendt oppover i en 150 mm Petri-tallerken.
  7. Hell PDMS-oppløsningen over formen inne i petriskålen på 150 mm.
  8. Om nødvendig, plasser 150 mm Petri-parabolen inne i en desiccator og påfør vakuum til rester av luftbobler forsvinner.
  9. Overfør 150 mm Petri-retten til en labovn og stek i 2 timer ved 60 °C for å kurere PDMS.
  10. Etter herding, fjern PDMS forsiktig fra Petri-parabolen ved å kutte rundt kantene på skiven ved hjelp av et barberblad.
  11. Klipp ut hver enkelt enhet med en kniv eller barberblad.
  12. Hull hull gjennom innløps- og utløpsportene på hver enhet ved hjelp av en 2,5 mm biopsistans.
  13. Plasser hver PDMS-enhet i en plasmaskive med eksponerte kanaler (vendt oppover). Påfør oksygenplasmabehandling (100 W i 45 s, 500 mbar O2) og plasser deretter umiddelbart hver PDMS-enhet på et rent soda limeglassmikroskopsklie (75 mm x 25 mm x 1 mm) med kanaler som vender mot glassoverflaten.
  14. La enhetene binde seg over natten ved romtemperatur.
  15. Påfør silikon forsiktig på overflaten av piezo-svingeren med en diameter på 1 cm ved en tykkelse på ~ 1-2 mm, juster deretter transduseren forsiktig med den konsentriske spiralen og trykk den forsiktig på bunnen av glassmikroskopet (motsatt side fra PDMS-enheten).

2. Montering og drift av acoustofluidisk system

  1. Koble en mikrokontroller til en datamaskin ved hjelp av en USB A til B-kabel. En grønn LED-indikator (merket PWR) skal lyse.
  2. Bruk det tilknyttede programmet på datamaskinen til å laste opp et program som genererer et 8 MHz-signal. Et eksempelprogram finnes i Tillegg Files. Etter å ha lastet opp programmet, vil det bli lagret i mikroprosessorminne og trenger ikke å lastes opp igjen.
  3. Lodd en 1" 22G ledning til enden av hver ledning på PZT-svingeren.
  4. Koble den negative (svarte) terminalledningen til PZT-svingeren til en GND-pinne via loddet ledning.
  5. Koble den positive (røde) terminalledningen til PZT-svingeren til utgangspinnen (#9 i det medfølgende eksempelprogrammet) via loddet ledning.
  6. Du kan eventuelt montere den acoustofluidiske enheten og mikrokontrolleren i et 3D-trykt etui. CAD-filer er gitt i Supplemental Files som eksempler. Ytterligere ledninger kan kobles til andre mikrokontrollerpinner for å kontrollere en ekstern LED-indikator og av/ på-knapp om ønskelig.
  7. Klipp 3-6" deler av tygon PVC myke plastrør (1/16" ID, 1/8" OD) og skyv slangen inn i innløps- og utløpsportene. Det kan være nødvendig å rotere slangen mens du legger trykk til den passer i åpningen. Eventuelt, etter å ha satt slangen inn i hver port, kan lim påføres ved krysset for å binde PDMS og slangen sammen.
  8. Monter det mikrofluidiske reservoaret i henhold til produsentens anvisninger.
  9. Klipp en 3-6" del av tygon PVC myke plastrør (1/16" ID, 1/8" OD) og skyv slangen over 1/32" ID-slangen fra det mikrofluidiske reservoarutgangsslangen. Eventuelt, pakk krysset med parafinfilm for å forhindre lekkasje.
  10. Fyll en 60 ml sprøyte med omgivelsesluft (filtrer eventuelt luften med et filter på 0,2 μm) og koble den til tygon PVC-rør (1/16" ID, 1/8" OD) på siden av det mikrofluidiske reservoaret.
  11. Sett sprøytepumpen i en hastighet på 200 ml/t for å skyve celle-/ultralydkontrastmiddelløsningene gjennom den acoustofluidiske enheten med en volumetrisk strømningshastighet på 50 ml/t og samle prøvene fra utgangen av den acoustofluidiske enheten i et sentrifugerør på 50 ml. Skyll eventuelt kanalen før acoustofluidisk behandling med 15 ml 70 % etanoloppløsning for å øke steriliteten til fluidiske kanaler. I tillegg kan kanaler skylles med 15 ml avionisert vann for å fjerne gjenværende etanol i enheten før pumping av celler gjennom systemet.

3. Fremstilling av ultralydkontrastmidler

MERK: Ultralydkontrastmidler forbedrer acoustofluidisk tilførsel av molekylære forbindelser betydelig ved forbigående økende permeabilisering av nærliggende cellulære membraner19. Molekylær levering er svært begrenset uten ultralydkontrastmidler i dette systemet.

  1. Forbered en fosfolipidoppløsning i et 20 ml scintillasjonshette hetteglass som inneholder følgende blanding:
    1. Tilsett 25 mg 1,2-distearoyl-sn-glysero-3-fosfokolin (DSPC).
    2. Tilsett 11,6 mg 1,2-distearoyl-sn-glysero-3-etylfosfokolin (DSEPC).
    3. Tilsett 0,26 mg 1,2-distearoyl-sn-glysero-3-fosfoglyserol (DSPG).
    4. Tilsett 0,88 mg polyoksyetylen40stearat.
  2. Tilsett kloroform til alle fosfolipider er oppløst (f.eks. 3 ml kloroform).
  3. Fordamp kloroform i en desiccator i 48 timer for å danne en tørr lipidfilm (fordampning under argon eller med en roterende fordamper kan brukes til å akselerere tørkeprosessen).
  4. Rehydrer lipidfilmen med 10 ml steril fosfatbufret saltvann (PBS).
  5. Soniker lipidoppløsningen i 3 min ved 40% amplitude for å danne en kationisk micellarløsning.
  6. Etter sonikering lagre fosfolipidoppløsningen ved 2-6 °C i opptil 1 måned.
  7. For å forberede ultralydkontrastmidler, tilsett 200 μL kationisk micellaroppløsning og 600 μL steril PBS til et 2 ml glass septum hetteglass.
  8. Forsegle hetteglasset ved å krympe hetten.
  9. Bruk en 1,5" 20G nål for å fylle hetteglassets hodeplass med decafluorobutane gass i 30 s.
  10. Amalgamat hetteglasset i 45 s ved 4350 cpm for å danne perfluorobutane gassfylte ultralydkontrastmidler.
  11. Tilsett 25 μL ultralydkontrastmiddelløsning per 1 ml celleoppløsning umiddelbart før du pumper det kombinerte kontrastmiddelet/celleblandingen gjennom den acoustofluidiske enheten. Celleløsningen kan endres etter ønske av brukeren, men i våre studier besto celleløsningen av primære T-celler i henholdsvis trinn 4.21 og A549 lungekreftceller i trinn 5.7.

4. Utarbeidelse av primære Tcells

  1. Isoler perifere mononukleære celler i blodet (PBMCer) fra fullblodsløsninger og oppbevar ved -150 °C. Tetthet gradient separasjon som inneholder et substrat, brukes vanligvis til å skille PBMCer fra hele blodet24,25,26.
  2. Tine frossent hetteglass i 37 °C vannbad.
  3. Fortynn opptinte PBMCer 1:10 med PBS i et 15 ml sentrifugerør. Hvert 1 ml hetteglass inneholder omtrent 10 millioner PBMCer.
  4. Sentrifuge fortynnet PBMCs ved 580 x g i 11 min ved 4 °C.
  5. Aspirer supernatanten og legg til 13 ml MACer som kjører buffer for å resuspendere cellene.
  6. Tell PBMCene med en automatisert celleteller eller hemocytometer.
  7. Sentrifuger PBMCene igjen ved 580 x g i 11 minutter ved 4 °C og aspirer supernatanten.
  8. Tilsett 40 μL kjølt løpebuffer per 10 millioner PBMCer.
  9. For å isolere T-celler, tilsett 10 μL Pan T-Cell Biotin Antistoffcocktail per 10 millioner PBMCer.
  10. Rør PBMCene forsiktig og oppbevar oppløsningen ved 4 °C i 5 minutter per 10 millioner celler.
  11. Legg til 30 μL løpebuffer og 20 μL Pan T-Cell MicroBead Cocktail per 10 millioner PBMCer.
  12. Bland PBMC-ene og perlene grundig og inkuber i ytterligere 15 minutter ved 4 °C.
  13. Legg til løpebuffer for å nå et totalt volum på 500 μL.
  14. Skill primære T-celler med et kommersielt tilgjengelig magnetisk sorteringsinstrument på benken ved hjelp av innstillingen "tømmer separasjon" etter produsentens protokoll. Dette trinnet skal gi mellom 5-10 millioner T-celler etter cellesortering.
  15. Tell T-celler ved hjelp av en automatisert celleteller eller hemocytometer.
  16. Fortynn T-celler i 10 ml steril PBS og sentrifuge ved 580 x g i 10 min ved 4 °C for å pellet cellene.
  17. Aspirer de supernatante og resuspend T-cellene i 1 ml PBS.
  18. Tell T-celler ved hjelp av en automatisert celleteller eller hemocytometer og aliquot 1 million / ml for eksperimenter.
  19. Forbered en 1 mg/ml fluoresceinoppløsning i PBS.
  20. Tilsett 100 μL 1 mg/ml fluoresceinoppløsning per 1 ml T-celleoppløsning (endelig fluoresceinkonsentrasjon = 100 μg/ml) umiddelbart før behandling.
  21. Tilsett 25 μL ultralydkontrastmiddelløsning som tidligere beskrevet i trinn 3.11.
  22. Behandle 1 ml aliquots av celler ved hjelp av det acoustofluidiske systemet (se trinn 2.10-2.11). Dette trinnet forbedrer leveringen av fluorescein i primære T-celler.
  23. Umiddelbart etter behandling, vask celler tre ganger via sentrifugering ved 580 x g i 10 min med 500 μL PBS for å fjerne ekstracellulær fluorescein. Celler skal vaskes innen 10 minutter etter tilsetning av fluoresceinoppløsning.
  24. Etter siste vasketrinn, resuspend celler i 250 μL AV PBS og måle fluorescens på strømning cytometer.

5. Fremstilling av A549 lungekreftceller

  1. Kultur A549 (adenokarcinomisk human alveolar basal epitelial) celler i komplette DMEM media (10% foster bovint serum, 1% penicillin / streptomycin) ved 37 ° C og 5% CO2 i en flatbunns vev kultur kolbe.
  2. Høst A549 celler når de når 70-90% samløp. Aspirere medier fra kolben og vask cellene en gang med PBS for å fjerne serumproteiner.
  3. Tilsett trypsin (0,25%) EDTA i kolben og inkuber i 5 min ved 37 °C. Trypsin er et fordøyelsesenzym som får cellene til å løsne fra bunnen av vevskulturflasken.
  4. Overfør trypsinløsning til et 15 ml sentrifugerør og nøytraliser det ved å legge til komplette DMEM-medier med et 1:3-forhold.
  5. Pellet cellene via sentrifugering ved 1500 x g i 5 min ved 4 °C.
  6. Aspirer supernatanten og resuspender pellet i en konsentrasjon på 100 000/ml i PBS-oppløsning som inneholder 200 mM trehalose i 15 ml konisk hetteglass.
  7. Tilsett 25 μL ultralydkontrastmiddelløsning som tidligere beskrevet i trinn 3.11.
  8. Behandle 1 ml aliquots av celler ved hjelp av det acoustofluidiske systemet (se trinn 2.10-2.11). Dette trinnet forbedrer leveringen av trehalose i A549 lungekreftceller.
  9. Umiddelbart etter behandling, vask celler tre ganger via sentrifugering med 500 μL PBS for å fjerne ekstracellulær trehalose. Celler skal vaskes innen 10 minutter etter tilsetning av trehaloseoppløsning.
  10. Etter siste vasketrinn, resuspend celler i 100 μL av PBS.
  11. Tilsett 11 μL 1% Triton X-100-oppløsning til lyseceller og frigjør intracellulær trehalose.
  12. Virvel i 15 s, deretter inkubere i 30 min ved romtemperatur.
  13. Virvel igjen i 15 s, deretter måle trehalose konsentrasjon ved hjelp av kommersielt tilgjengelig trehalose analyse etter produsentens anbefaling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et bilde av det acoustofluidiske systemet som er montert inne i et 3D-trykt etui, vises i figur 1. Denne protokollen produserer et acoustofluidisk system som kan brukes til å forbedre intracellulær molekylær levering i flere cellelinjer ved hjelp av ultralydkontrastmidler.

Figur 2   viser forbedret intracellulær tilførsel av en fluorescerende forbindelse, fluorescein, til primære humane T-celler med acoustofluidisk behandling sammenlignet med en ubehandlet kontrollgruppe (p<0,05, n = 3 /gruppe). T-celler ble suspendert i en konsentrasjon på 1 million /ml i PBS med 100 μg/ml fluoresceinoppløsning og 25 μL/ml ultralydkontrastmiddelløsning, og blandingen ble passert gjennom den acoustofluidiske enheten for ultralydbehandling. Intracellulær fluorescein levering og celle levedyktighet ble målt med strømning cytometri etter vasking av celler via sentrifugering for å fjerne ekstracellulær fluorescein. T-celler i den ubehandlede kontrollgruppen ble også suspendert ved 1 million/ml i PBS med 100 μg/ml fluoresceinoppløsning, men ultralydkontrastmiddelløsning ble ikke tilsatt og cellene ble ikke passert gjennom den acoustofluidiske enheten. Fluorescensintensiteten til T-celler økte med 5 ganger etter acoustofluidisk behandling i forhold til fluorescensintensiteten til T-celler i den ubehandlede kontrollgruppen, noe som indikerer forbedret levering av fluorescein. Celle levedyktigheten gikk litt ned etter acoustofluidisk behandling, men forble over 80% (p<0,05, n = 3 / gruppe).

Figur 3 viser forbedret intracellulær tilførsel av konserveringsmiddelforbindelse, trehalose, til humane A549 lungekarsinomceller med acoustofluidisk behandling sammenlignet med strømning alene (ingen ultralydkontrastmidler eller ultralydeksponering) og sammenlignet med celler i den ubehandlede kontrollgruppen (ANOVA p<0,05, n =3/gruppe). A549 celler ble suspendert i en konsentrasjon på 100.000/ml i PBS med 200 mM trehaloseoppløsning og 25 μL/ml ultralydkontrastmiddelløsning, og blandingen ble passert gjennom den acoustofluidiske enheten for ultralydbehandling. A549 celler i kontrollgruppene ("Kun flyt" og "Ingen behandling") ble også suspendert ved 100.000/ml i PBS med 200 mM trehalose, men ultralydkontrastmiddelløsning ble ikke tilsatt og celler ble ikke utsatt for ultralydbehandling. Intracellulær trehalose ble kvantifisert ved hjelp av et trehaloseanalysesett og normalisert til den ubehandlede kontrollgruppen. Celle levedyktighet ble målt med trypan blå analyse. Det var ingen statistisk forskjell i celle levedyktighet mellom grupper (n = 3-7 / gruppe).

Figure 1
Figur 1: Bilde av acoustofluidisk system. Det acoustofluidiske strømningssystemet inneholder et PDMS-basert strømningskammer med en integrert PZT-svinger drevet av en mikrokontroller. Et 3D-trykt etui med LED-indikator og av/på-knapp er valgfrie tilleggsfunksjoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Acoustofluidic behandling forbedrer fluorescein levering til humane T-celler. (A) Fluorescensintensiteten i primære T-celler økte etter acoustofluidisk behandling med fluorescein sammenlignet med den ubehandlede kontrollgruppen (ingen acoustofluidics og ingen mikrobobler) (p<0,05, n = 3/gruppe). (B) Celle levedyktigheten gikk litt ned etter acoustofluidisk behandling, men holdt seg over 80% målt ved strømningscytometri (p<0,05, n = 3 / gruppe). (C) Representativ strømningscytometri histogram som indikerer høyere fluorescens i den acoustofluidiske behandlingsgruppen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Acoustofluidic behandling forbedrer trehalose levering til humane lungekreftceller. (A) Trehaloseopptaket økte i A549 lungekarsinomceller sammenlignet med bare strømning (ingen ultralyd og ingen mikrobobler) og den ubehandlede kontrollgruppen (ANOVA p<0,05, n = 3 / gruppe). (B) Celle levedyktigheten forble over 90% etter acoustofluidic behandling målt ved trypan blå analyse (n = 3-7 / gruppe). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfiler. Klikk her for å laste ned denne filen. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver montering og drift av et rimelig acoustofluidisk system som forbedrer intracellulær levering av biomolekyler for forskningsapplikasjoner. Det er flere viktige faktorer du må vurdere når du monterer og bruker dette systemet. Den acoustofluidiske enheten er fremstilt i PDMS, som er et biokompatibelt materiale som enkelt kan formes med konsistente kanaldimensjoner27. Enhetskanalene kan skylles med 15 ml 70% etanoloppløsning før acoustofluidisk behandling for å øke steriliteten når du arbeider med dyrkede celler. Etter etanolrengjøring kan 15 ml avionisert vann brukes til å skylle enheten for å fjerne gjenværende etanol fra kanalene før du legger til celleløsninger. Små acoustofluidic kanaler kan lett bli blokkert av rusk eller celleaggregater, noe som gjør dette til en begrensning for hyppig bruk av enheten. Grundig skylling av kanalene mellom hver prøve vil bidra til å forhindre problemer med kanalblokkering. I tillegg kan flere PDMS-enheter fremstilles i hver batch, slik at enheter raskt kan byttes ut om nødvendig. For ultralydbaserte applikasjoner er det viktig å produsere PDMS-enheter med jevn tykkelse, da forskjeller i PDMS-tykkelse kan påvirke ultralydtrykket i de fluidiske kanalene. Ultralydbølger forplanter seg kontinuerlig gjennom enheten og overførte bølger samhandler med reflekterte bølger for å danne stående akustiske bølgemønstre som er svært følsomme for forskjeller iPDMS-tykkelse 17. PDMS-tykkelsen bestemmes hovedsakelig av mengden PDMS som legges til formen (trinn 1.7), og denne protokollen gir en PDMS-tykkelse på 3,5 mm.

Mikrokontrollerens maksimale utgangsfrekvens (8 MHz) ble valgt for å produsere den minste akustiske bølgelengden i den fluidiske kanalen. Mikrokontrollerutgangen er vanligvis en firkantet bølge, men oscilloskopmålinger viste at utgangen på 8 MHz blir mer lik en sinusoid bølgeform på grunn av svinghastighetsbegrensninger. En begrensning i dette systemet er at mikrokontrollerens maksimale spenningseffekt er 5V og en ekstern RF-forsterker er nødvendig hvis høyere spenningsutganger ønskes. Transduserens frie trykkeffekt i dette systemet var 18 kPa ved 1 cm målt med en nålhydrofon (Precision Acoustics, Dorchester, Storbritannia). Selv om dette trykket er relativt lavt, kan stående bølger i kanalene øke det akustiske trykket som prøver blir utsatt for når de passerer gjennom ultralydstrålen.

Ultralydkontrastmidler brukes til å nukleere akustisk kavitasjon i de acoustofluidiske kanalene som forbedrer leveransen av biomolekyler på tvers av cellemembraner28,29. Denne protokollen beskriver syntese av perfluorokarbon gassfylte mikrobobler innkapslet av en kationisk fosfolipidmembran. Som tidligere beskrevet består denne formuleringen av mikrobobler primært mellom 1-3 μm i diameter30. Den positivt ladede overflaten av mikroboblene tiltrekker dem mot negativt ladede cellemembraner, noe som øker sonoporasjonsmediert molekylær levering når mikrobobler og celler er i nærheten. Konsentrasjonen av mikrobobler i celleløsningen er en kritisk faktor som kan påvirke effektiviteten av molekylær levering og celle levedyktighet etter acoustofluidisk behandling, og den optimale mikroboblekonsentrasjonen kan være spesifikk for hver celletype 19. Konsentrasjonen av gassfylte mikrobobler med lipidskall kan avta over tid etter syntese, slik at ultralydkontrastmidler bør brukes innen få timer etter syntese.

Vi demonstrerte levering av en fluorescerende forbindelse (fluorescein) til primære ikke-aktiverte humane T-celler ved hjelp av det acoustofluidiske systemet i denne protokollen. Det er viktig å merke seg at aktiveringsstatusen til primære menneskelige T-celler kan påvirke effektiviteten av intracellulær molekylær levering. Fluorescensegenskapene til fluorescein muliggjør sensitiv intracellulær deteksjon med strømningscytometri, men andre oppløselige forbindelser kan også leveres inn i celler ved hjelp av dette acoustofluidiske systemet. For eksempel demonstrerte vi acoustofluidisk levering av trehalose i humane lungekreftceller. Acoustofluidic levering av trehalose i celler kan muliggjøre økt utvinning etter frossen og tørr lagring, noe som kan ha betydelige konsekvenser for en rekke biomedisinske og forskningsapplikasjoner 19.

Acoustofluidisk levering av andre biomolekyler, som proteiner eller DNA-plasmider, er også mulig, selv om en begrensning i dette systemet er at effektiviteten av molekylær levering kan være lavere for større forbindelser18,31. Optimalisering av acoustofluidic strømningshastighet, konsentrasjoner av ultralydkontrastmidler, cellekonsentrasjoner og medier kan være nødvendig for levering av andre biomolekyler. I tillegg kan optimale parametere variere mellom forskjellige celletyper på grunn av faktorer som cellediameter, morfologi, membranegenskaper og fenotype.

Det acoustofluidiske systemet som er beskrevet i denne protokollen, kan enkelt monteres og betjenes til relativt lave kostnader. I tillegg kan dette systemet tilpasses for andre applikasjoner ved å koble til andre signalkilder eller ultralydtransdusere for å generere spesifikke utgangstrykk og frekvenser32,33,34. I tillegg kan sprøytepumpesystemet som er beskrevet i denne protokollen erstattes med peristaltiske pumper om ønskelig. Ved en strømningshastighet på 50 ml/t er oppholdstiden for celler i ultralydstrålen når de passerer gjennom den acoustofluidiske kanalen ca. 1 s, men denne oppholdstiden kan endres etter behov for spesifikke bruksområder ved å justere væskestrømningshastigheten.

I motsetning til andre vanlige transfeksjonsteknikker kan biomolekyler leveres i celler i løpet av få minutter i stedet for timer, og dette systemet krever ikke spesialisert og dyrt utstyr. I tillegg er dette systemet kompatibelt med et bredt spekter av ofte brukte cellekulturmedier eller andre buffere. Oppsummert muliggjør dette acoustofluidiske systemet rask levering av biomolekyler til celler, noe som kan være nyttig for et bredt spekter av forskningsapplikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Medforfatterne MAM og JAK har eierskap i DesiCorp som økonomisk kan dra nytte av produkter relatert til denne forskningen.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble delvis støttet av midler fra National Science Foundation (#1827521, #1827521, #1450370) og National Institutes of Health (U01HL127518). Fotolittografitjenester ble levert av University of Louisville Micro/Nano Technology Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fabrication of Acoustofluidic Device
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT Ellsworth Adhesives 4019862 (SKU) https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/
Harris Uni-Core (2.5 mm) Electron Microscopy Sciences 69039-25
Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube - S (2/4 port) Darwin Microfluidics LVF-KPT-S-2 (SKU) https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port
Microscope Slide VWR 16004-430 https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium
trichlorosilane Gelest 105732-02-3 (Cas. No.) Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage. 
Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD) McMaster-Carr 5233K51 (Part #) https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/
Assembly of Acoustofluidic System
Arduino Uno Arduino 7630049200050 (Barcode) https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3
Preparation of Ultrasound Contrast Agents
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) Avanti Lipids 890703P-25mg (SKU) https://avantilipids.com/product/890703
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) Avanti Lipids 850365P-25mg (SKU) https://avantilipids.com/product/850365
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) Avanti Lipids 840465P-25mg (SKU) https://avantilipids.com/product/840465
APF-140HP (decafluorobutate gas) FlouroMed 355-25-9 (Cas No.) http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/
DB-338 Amalgamators  COXO https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/
polyoxyethylene 40 stearate  Sigma-Aldrich P3440-250G (SKU) https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en&region=US&gclid=
Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj
Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS
vID64X-1KbO3LUKGjVUwb
PDAaAqvOEALw_wcB
Q125 Sonicator Qsonica Q125-110 (Ref.) https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r
Preparation of Primarty T Cells
autoMACs running buffer Miltenyi Biotec 130-091-221 (Order No.) https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref
Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail)  Miltenyi Biotec 130-096-535 (Order No.) https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535
magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator) Miltenyi Biotec 130-092-545 (Order No.) https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545
Preparation of A549 Lung Cancer Cells
Trehalose Assay Kit  Megazyme K-TREH (Cat. No.) https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit
Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile) VWR 97063-702 (Cat. No.) https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gardlik, R., et al. Vectors and delivery systems in gene therapy. Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).
  2. Wahlers, A., et al. Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vector-mediated gene expression in hematopoietic cells. Gene Therapy. 8 (6), 477-486 (2001).
  3. Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Advanced Biomedical Research. 1, 27 (2012).
  4. Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Medical & Biological Engineering & Computing. 44 (1-2), 5-14 (2006).
  5. Gehl, J. Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiologica Scandinavica. 177 (4), 437-447 (2003).
  6. Lin, Y. C., Li, M., Wu, C. C. Simulation and experimental demonstration of the electric field assisted electroporation microchip for in vitro gene delivery enhancement. Lab on a Chip. 4 (2), 104-108 (2004).
  7. Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophysical Chemistry. 19 (3), 211-225 (1984).
  8. Weaver, J. C. Electroporation: a general phenomenon for manipulating cells and tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 51 (4), 426-435 (1993).
  9. Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
  10. Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
  11. Klibanov, A. L., Shevchenko, T. I., Raju, B. I., Seip, R., Chin, C. T. Ultrasound-triggered release of materials entrapped in microbubble-liposome constructs: a tool for targeted drug delivery. Journal of Controlled Release. 148 (1), 13-17 (2010).
  12. Fan, Z., Kumon, R. E., Deng, C. X. Mechanisms of microbubble-facilitated sonoporation for drug and gene delivery. Therapeutic Delivery. 5 (4), 467-486 (2014).
  13. Secomski, W., et al. In vitro ultrasound experiments: Standing wave and multiple reflections influence on the outcome. Ultrasonics. 77, 203-213 (2017).
  14. Gedge, M., Hill, M. Acoustofluidics 17: theory and applications of surface acoustic wave devices for particle manipulation. Lab on a Chip. 12 (17), 2998-3007 (2012).
  15. Shi, J., et al. Acoustic tweezers: patterning cells and microparticles using standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (20), 2890-2895 (2009).
  16. Shi, J., Huang, H., Stratton, Z., Huang, Y., Huang, T. J. Continuous particle separation in a microfluidic channel via standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (23), 3354-3359 (2009).
  17. Shields, C. W. t, Cruz, D. F., Ohiri, K. A., Yellen, B. B., Lopez, G. P. Fabrication and operation of acoustofluidic devices supporting bulk acoustic standing waves for sheathless focusing of particles. Journal of Visualized Experiments. (109), e53861 (2016).
  18. Belling, J. N., et al. Acoustofluidic sonoporation for gene delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (20), 10976-10982 (2020).
  19. Centner, C. S., et al. Ultrasound-induced molecular delivery to erythrocytes using a microfluidic system. Biomicrofluidics. 14 (2), 024114 (2020).
  20. Qi, J., Ding, C., Jiang, X., Gao, Y. Advances in developing CAR T-cell therapy for HIV cure. Frontiers in Immunology. 11, 361 (2020).
  21. Annesley, C. E., Summers, C., Ceppi, F., Gardner, R. A. The evolution and future of CAR T cells for B-Cell Acute lymphoblastic leukemia. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (4), 591-598 (2018).
  22. Hand, S. C., Menze, M. A. Molecular approaches for improving desiccation tolerance: insights from the brine shrimp Artemia franciscana. Planta. 242 (2), 379-388 (2015).
  23. Zhang, M., et al. Freeze-drying of mammalian cells using trehalose: preservation of DNA integrity. Scientific Reports. 7 (1), 6198 (2017).
  24. Grievink, H. W., Luisman, T., Kluft, C., Moerland, M., Malone, K. E. Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: Cell recovery and viability, population composition, and cell functionality. Biopreserv Biobank. 14 (5), 410-415 (2016).
  25. Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Current Protocol in Stem Cell Biology. , Chapter 2, Unit 2A 1 (2007).
  26. Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on Percoll. Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).
  27. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
  28. Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), 9983-9988 (2016).
  29. Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).
  30. Kopechek, J. A., et al. Ultrasound targeted microbubble destruction-mediated delivery of a transcription factor decoy inhibits STAT3 signaling and tumor growth. Theranostics. 5 (12), 1378-1387 (2015).
  31. Bhutto, D. F., et al. Effect of molecular weight on sonoporation-mediated uptake in human cells. Ultrasound in Medical Biology. 44 (12), 2662-2672 (2018).
  32. Forbes, M. M., Steinberg, R. L., O'Brien, W. D. Frequency-dependent evaluation of the role of definity in producing sonoporation of Chinese hamster ovary cells. Journal of Ultrasound in Medicine. 30 (1), 61-69 (2011).
  33. Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (36), 9983-9988 (2016).
  34. Miller, D. L., Bao, S., Morris, J. E. Sonoporation of cultured cells in the rotating tube exposure system. Ultrasound in Medical Biology. 25 (1), 143-149 (1999).

Tags

Bioingeniør Utgave 167 acoustofluidics ultralyd kontrastmidler molekylær levering sonoporasjon celler
Montering og drift av en acoustofluidisk enhet for forbedret levering av molekylære forbindelser til celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Centner, C. S., Murphy, E. M.,… More

Centner, C. S., Murphy, E. M., Stamp, B. F., Priddy, M. C., Moore, J. T., Bates, P. J., Menze, M. A., Yaddanapudi, K., Kopechek, J. A. Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells. J. Vis. Exp. (167), e62035, doi:10.3791/62035 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter