Summary
Este protocolo descreve a montagem e o funcionamento de um dispositivo acoustofluido de baixo custo para rápida entrega molecular às células através de sonoporação induzida por agentes de contraste de ultrassom.
Abstract
A entrega intracelular eficiente de biomoléculas é necessária para uma ampla gama de pesquisas biomédicas e aplicações terapêuticas baseadas em células. Sonoporação mediada por ultrassom é uma técnica emergente para rápida entrega intracelular de biomoléculas. A sonoporação ocorre quando a cavitação de microbolhas cheias de gás forma poros transitórios em membranas celulares próximas, o que permite a absorção rápida de biomoléculas do fluido circundante. As técnicas atuais de sonoporção in vitro de células em suspensão são limitadas pelo rendimento lento, variabilidade nas condições de exposição ao ultrassom para cada célula e alto custo. Para lidar com essas limitações, foi desenvolvido um dispositivo acoustofluido de baixo custo que integra um transdutor de ultrassom em um dispositivo fluido baseado em PDMS para induzir a sonoporação consistente das células à medida que elas fluem pelos canais em combinação com agentes de contraste de ultrassom. O dispositivo é fabricado usando técnicas de fotolitografia padrão para produzir o chip fluido baseado em PDMS. Um transdutor de disco de ultrassom piezo é anexado ao dispositivo e conduzido por um microcontrolador. O conjunto pode ser integrado dentro de uma caixa impressa em 3D para proteção adicional. As células e microbolhas são empurradas através do dispositivo usando uma bomba de seringa ou uma bomba peristáltica conectada à tubulação de PVC. A entrega aprimorada de biomoléculas para células T humanas e células cancerígenas de pulmão é demonstrada com este sistema acoustofluido. Em comparação com as abordagens de tratamento em massa, este sistema acoustofluidic aumenta o rendimento e reduz a variabilidade, o que pode melhorar os métodos de processamento celular para aplicações de pesquisa biomédica e fabricação de terapêuticas baseadas em células.
Introduction
Plataformas virais e não virais têm sido utilizadas para melhorar a entrega molecular às células. A entrega viral (transdução) é uma técnica comum utilizada em terapias baseadas em células que requerem modificação genômica. As limitações com a entrega viral incluem mutagênese insercional potencial, capacidade transgênica limitada e multiplicidade indesejada de infecção1,2. Portanto, técnicas de entrega molecular não viral estão em desenvolvimento para uma ampla gama de aplicações biomédicas e de pesquisa. Técnicas comuns incluem mecânica, elétrica, hidrodinâmica ou o uso de energia baseada a laser para melhorar a absorção de biomoléculas nas células 3. A eletroporação é uma plataforma de entrega molecular não viral comumente utilizada que tem a capacidade de induzir perfuração transitória na membrana plasmática para a entrega intracelular dos compostos moleculares4,5,6,7,8,9. No entanto, a perfuração transitória da membrana plasmática é um processo estocástico e a absorção molecular via eletroporação é geralmente dependente da difusão passiva através dos poros da membrana transitória4,7,8.
Um método alternativo é a utilização de ultrassom para melhor entrega molecular intracelular através da cavitação de agentes de contraste de ultrassom (ou seja, microbolhas cheias de gás). A cavitação de microbolhas induz efeitos de microstreaming na mídia circundante que podem causar perfuração transitória de membranas plasmáticas próximas ("sonoporação") permitindo a rápida absorção intracelular de biomoléculas através de mecanismos de transporte passivos ou ativos10,11,12. A sonoporação é uma técnica eficaz para a rápida entrega molecular às células, mas essa abordagem muitas vezes requer equipamentos caros e métodos de tratamento em massa que são limitados por menor rendimento e maior variabilidade nas condições de exposição ao ultrassom13. Para lidar com essas limitações, os dispositivos aoustofluidos, que permitem a sonoporação consistente das células em suspensão, estão atualmente em desenvolvimento.
Acoustofluidics é um campo em expansão que integra tecnologias de ultrassom e microfluidic para uma ampla variedade de aplicações. Esta abordagem tem sido usada anteriormente para a separação de partículas, aplicando energia contínua de ultrassom para induzir ondas acústicas permanentes dentro dos canais fluidos14,15,16,17. As partículas são classificadas em diferentes partes do dispositivo com base em uma variedade de propriedades, como tamanho de partícula, densidade e compressão em relação ao médio16. Tecnologias acoustofluídicas também estão em desenvolvimento para permitir a entrega molecular rápida a uma variedade de tipos de células para aplicações de pesquisa e fabricação de terapias celulares18. Recentemente, demonstramos uma entrega molecular aprimorada para eritrócitos usando um dispositivo acoustofluido baseado em PDMS19. Na plataforma acoustofluidic, a dinâmica celular e microbolhas pode ser manipulada para induzir interações físicas que permitem uma entrega aprimorada de biomoléculas. A eficiência e consistência da entrega molecular intracelular pode potencialmente ser aumentada otimizando a distância entre células e microbolhas.
Uma aplicação importante para a sonoporação mediada por aoustofluidic envolve o transporte de biomoléculas para células T humanas primárias. Imunoterápicos baseados na transferência de células T adotivas, como a terapia de células T do Receptor de Antígeno Quimérico (CAR T), estão surgindo rapidamente para o tratamento de várias doenças, incluindo câncer e vírus como o HIV20. A terapia CAR T tem sido particularmente eficaz em pacientes com leucemia linfoblástica aguda pediátrica (LLA), com taxas de remissão completas de 70-90%21. No entanto, a fabricação de células T para essas terapias geralmente depende da transdução viral, que é limitada por mutagênese insercional potencial, longos tempos de processamento e desafios de fornecer biomoléculas não genéticas, como proteínas ou pequenas moléculas1. Métodos de entrega molecular mediados por acoustofluidic podem potencialmente superar essas limitações e melhorar a fabricação de terapias celulares T.
Outra aplicação importante para a sonoporação mediada por austofluidic envolve a entrega intracelular de compostos conservantes, como o trehalose, que protegem as células durante o congelamento e a dessecação. O trehalose é produzido por alguns organismos na natureza e os ajuda a tolerar congelamento e dessacação protegendo suas membranas celulares22,23. No entanto, o trehalose não é produzido por células mamíferas e é impermeável às membranas celulares de mamíferos. Portanto, técnicas eficazes de entrega molecular, como a sonoporação, são necessárias para alcançar níveis suficientes de trehalose intracelular necessários para proteger membranas celulares internas. Esta abordagem está atualmente em desenvolvimento para preservação seca de vários tipos de células.
Este protocolo fornece uma descrição detalhada da montagem e operação de um sistema aoustofluido relativamente de baixo custo conduzido por um microcontrolador. Os agentes de contraste do ultrassom são utilizados para induzir a sonoporação dentro dos canais fluidos e permitir a entrega molecular rápida para vários tipos de células, incluindo células T e células cancerosas. Este sistema acoustofluidic pode ser usado para uma variedade de aplicações de pesquisa e também pode ser útil como um sistema protótipo para avaliar métodos de sonoporação para melhores processos de fabricação de terapia celular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Doações de sangue foram coletadas de doadores saudáveis seguindo protocolos aprovados pelo conselho de revisão institucional da Universidade de Louisville.
1. Fabricação de dispositivo acoustofluido
- Obtenha uma fotomasmamama com um design espiral concêntrico contendo canais com um diâmetro de 500 μm. Um arquivo CAD é fornecido nos arquivos suplementares como exemplo. Uma máscara personalizada pode ser encomendada de um fornecedor comercial ou padronizada usando um escritor de máscaras.
- Prepare um molde do design em espiral concêntrico em um wafer de silício revestido de fotoresistista usando técnicas de fotolitografia padrão.
- Adicione aproximadamente 2 Colheres de Sopa (~30 mL) de SU-8 2100 a um wafer de silício de 100 mm.
- Gire o wafer em um spinner a uma velocidade de 150 rpm por 30 s para espalhar o fotoresist, em seguida, aumentar a velocidade para 1.200 rpm para 60 s para produzir uma espessura de 200 μm.
- Cure o wafer revestido de fotoresistista em um forno a vácuo de poliimida com uma rampa de 30 minutos para cima e 30 min residir a 115 °C, depois descer por 30 min.
- Exponha o wafer revestido de fotoresist para 130 s usando um alinhador de máscara com a máscara da etapa 1.1.
- Asse o wafer após a exposição após o mesmo processo descrito na etapa 1.2.3.
- Desenvolva o fotoresist na solução de desenvolvedor SU-8 por aproximadamente 8 minutos.
ATENÇÃO: Use apenas a solução do desenvolvedor em um capô de fumaça química bem ventilado.
- Silanize o molde para tornar a superfície mais hidrofóbica. Coloque o wafer revestido de fotoresistista em um dessecator e adicione uma gota de 20 μL de cloroilano (C8H4Cl3F13Si). Aplique vácuo na câmara por 30 s, depois sele a câmara e saia durante a noite.
ATENÇÃO: A cloroilana é muito perigosa e inflamável. A exposição causa queimaduras graves e danos oculares. - Combine 54 g de base de polidimethsiloxano (PDMS) e 6 g de agente de cura em um copo e misture vigorosamente e completamente com uma espátula por pelo menos 1 min.
- Coloque o copo contendo a solução PDMS em um dessecador por aproximadamente 30 minutos ou até que as bolhas de ar remanescentes sejam removidas da solução.
- Coloque wafer revestido de fotoresistista com os padrões voltados para cima em uma placa de Petri de 150 mm.
- Despeje a solução PDMS sobre o molde dentro da placa de Petri de 150 mm.
- Se necessário, coloque a placa de Petri de 150 mm dentro de um desiccador e aplique vácuo até que as bolhas de ar remanescentes desapareçam.
- Transfira a placa de Petri de 150 mm para um forno de laboratório e asse por 2h a 60 °C para curar o PDMS.
- Após a cura, remova cuidadosamente o PDMS da placa de Petri, cortando as bordas do wafer usando uma lâmina de barbear.
- Corte cada dispositivo individual usando uma faca ou lâmina de barbear.
- Faça furos nas portas de entrada e saída de cada dispositivo usando um soco de biópsia de 2,5 mm.
- Coloque cada dispositivo PDMS em um asher de plasma com canais expostos (voltados para cima). Aplique tratamento de plasma de oxigênio (100 W para 45 s, 500 mbar O2) e coloque imediatamente cada dispositivo PDMS em um slide de microscópio de vidro de limão de soda limpo (75 mm x 25 mm x 1 mm) com canais voltados para a superfície do vidro.
- Deixe os dispositivos se unirem durante a noite à temperatura ambiente.
- Aplique suavemente silicone na superfície do transdutor piezo de 1 cm de diâmetro com uma espessura de ~1-2mm, depois alinhe cuidadosamente o transdutor com a espiral concêntrica e pressione-o suavemente na parte inferior do slide do microscópio de vidro (lado oposto do dispositivo PDMS).
2. Montagem e operação do sistema acoustofluidic
- Conecte um microcontrolador a um computador usando um cabo USB A a B. Um indicador LED de energia verde (rotulado PWR) deve acender.
- Use o programa associado no computador para carregar um programa que gera um sinal de 8 MHz. Um programa de exemplo é fornecido nos F iles suplementares . Após o upload do programa, ele será armazenado na memória do microprocessador e não precisará ser carregado novamente.
- Soldar um fio de 1" 22G até a extremidade de cada fio no transdutor PZT.
- Conecte o fio terminal negativo (preto) do transdutor PZT a um pino GND através do fio soldado.
- Conecte o fio terminal positivo (vermelho) do transdutor PZT ao pino de saída (#9 no programa de exemplo fornecido) através do fio soldado.
- Opcionalmente, monte o dispositivo acoustofluidic e o microcontrolador em uma caixa impressa em 3D. Os arquivos CAD são fornecidos nos Files upplemental Scomo exemplos. Fios adicionais podem ser conectados a outros pinos microcontroladores para controlar um indicador LED externo e botão de pressão liga/desliga, se desejar.
- Corte seções de 3-6" do tubo de plástico macio tygon PVC (1/16" ID, 1/8" OD) e empurre a tubulação para as portas de entrada e saída. Pode ser necessário girar a tubulação enquanto aplica pressão até que se encaixe na abertura. Opcionalmente, após inserir o tubo em cada porta, a cola pode ser aplicada na junção para unir o PDMS e a tubulação.
- Monte o reservatório microfluido de acordo com as instruções do fabricante.
- Corte uma seção de 3-6" do tubo de plástico macio tygon PVC (1/16" ID, 1/8" OD) e empurre a tubulação sobre a tubulação de 1/32" de ID da tubulação de saída do reservatório microfluido. Opcionalmente, enrole a junção com filme de parafina para evitar vazamentos.
- Encha uma seringa de 60 mL com ar ambiente (opcionalmente, filtre o ar com um filtro de 0,2-μm) e conecte-o à tubulação de PVC tygon (1/16" ID, 1/8" OD) na lateral do reservatório microfluido.
- Ajuste a bomba de seringa a uma taxa de 200 mL/h para empurrar as soluções do agente de contraste celular/ultrassom através do dispositivo acoustofluidic a uma taxa de fluxo volumoso de 50 mL/h e colete as amostras da saída do dispositivo acoustofluidic em um tubo de centrífuga de 50mL. Opcionalmente, enxágue o canal antes do tratamento acoustofluido com 15 mL de solução de 70% de etanol para aumentar a esterilidade dos canais fluidos. Além disso, os canais podem ser enxaguados com 15 mL de água desionizada para remover etanol residual no dispositivo antes de bombear células através do sistema.
3. Preparação de agentes de contraste de ultrassom
NOTA: Os agentes de contraste do ultrassom aumentam significativamente a entrega acoustofluidic de compostos moleculares, aumentando transitoriamente a permeabilização das membranas celulares próximas19. A entrega molecular é muito limitada sem agentes de contraste de ultrassom neste sistema.
- Prepare uma solução fosfolipílica em um frasco de cintilação de 20mL contendo a seguinte mistura:
- Adicione 25 mg de 1,2-distearoyl-sn-gliceo-3-fosfocholina (DSPC).
- Adicione 11,6 mg de 1,2-distearoyl-sn-gliceo-3-etilfosforcholina (DSEPC).
- Adicione 0,26 mg de 1,2-distearoyl-sn-gliceo-3-fosfoglycerol (DSPG).
- Adicione 0,88 mg de estearato de polioximetileno40.
- Adicione clorofórmio até que todos os fosfolipídios sejam dissolvidos (por exemplo, 3 mL de clorofórmio).
- Evaporar clorofórmio em um desiccator por 48 h para formar uma película lipídica seca (evaporação sob argônio ou com um evaporador rotativo pode ser usado para acelerar o processo de secagem).
- Reidratar o filme lipídico com 10 mL de soro fisiológico estéril tamponado com fosfato (PBS).
- Sonicar a solução lipídica por 3 min a 40% de amplitude para formar uma solução micelar cônica.
- Após a sonicação armazenar a solução fosfolipídida a 2-6 °C por até 1 mês.
- Para preparar os agentes de contraste de ultrassom, adicione 200 μL de solução micelar cônica e 600 μL de PBS estéril a um frasco de septo de vidro de 2 mL.
- Sele o frasco acariciando a tampa.
- Use uma agulha de 1,5" 20G para encher o espaço da cabeça do frasco com gás decafluorobutano para 30 s.
- Amalgamar o frasco para 45 s a 4.350 cpm para formar agentes de contraste de ultrassom cheios de gás perfluorobutano.
- Adicione 25 μL de solução de agente de contraste de ultrassom por 1 mL de solução celular imediatamente antes de bombear a mistura de agente de contraste combinado/célula através do dispositivo acoustofluidic. A solução celular pode ser modificada conforme desejado pelo usuário, mas em nossos estudos a solução celular consistiu em células T primárias na etapa 4.21, e células cancerígenas pulmonares A549 na etapa 5.7, respectivamente.
4. Preparação de Tcélulas primárias
- Isole as células mononucleares periféricas (PBMCs) de soluções de sangue inteiros e armazene a -150 °C. A separação de gradiente de densidade contendo um substrato é comumente utilizada para separar os PBMCs do sangue inteiro24,25,26.
- Descongele o frasco congelado em banho-maria de 37 °C.
- PbMCs descongelados diluídos 1:10 com PBS em um tubo de centrífuga de 15mL. Cada frasco 1mL contém aproximadamente 10 milhões de PBMCs.
- A centrífugas diluídas PBMCs a 580 x g para 11 min a 4 °C.
- Aspire o supernasciente e adicione 13 mL de MACs executando buffer para resuspensar as células.
- Conte os PBMCs com um contador celular automatizado ou hemócito.
- Centrifugar os PBMCs novamente a 580 x g por 11 min a 4 °C e aspirar o supernasciente.
- Adicione 40 μL de tampão de corrida refrigerado por 10 milhões de PBMCs.
- Para isolar as células T, adicione 10 μL de Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail por 10 milhões de PBMCs.
- Agitar suavemente os PBMCs e armazenar a solução a 4 °C por 5 min por 10 milhões de células.
- Adicione 30 μL de buffer de corrida e 20 μL de Pan T-Cell MicroBead Cocktail por 10 milhões de PBMCs.
- Misture os PBMCs e as contas completamente e incubar por mais 15 min a 4 °C.
- Adicione buffer de execução para atingir um volume total de 500 μL.
- Separe as células T primárias com um instrumento de classificação magnética de bancada comercialmente disponível usando a configuração de "separação esgota" seguindo o protocolo do fabricante. Esta etapa deve render entre 5-10 milhões de células T após a classificação celular.
- Conte células T usando um contador celular automatizado ou hemótmetro.
- Diluir células T em 10 mL de PBS estéril e centrífuga a 580 x g por 10 min a 4 °C para pelotar as células.
- Aspire as células T supernascidas e resuspend em 1 mL de PBS.
- Conte células T usando um contador celular automatizado ou hemócitometro e alíquota de 1 milhão/mL para experimentos.
- Prepare uma solução de fluoresceína de 1 mg/mL em PBS.
- Adicione 100 μL de solução de fluoresceína de 1 mg/mL por solução celular T de 1 mL (concentração final de fluoresceína = 100 μg/mL) imediatamente antes do processamento.
- Adicione 25 μL de solução de agente de contraste de ultrassom, conforme descrito anteriormente na etapa 3.11.
- Processe alíquotas 1mL de células usando o sistema acoustofluido (ver etapas 2.10-2.11). Esta etapa aumenta a entrega de fluoresceína em células T primárias.
- Imediatamente após o tratamento, lave as células três vezes via centrifugação a 580 x g por 10 min com 500 μL de PBS para remover fluoresceína extracelular. As células devem ser lavadas dentro de 10 minutos após a adição de solução de fluoresceína.
- Após a etapa final de lavagem, resuspend as células em 250 μL de PBS e mede a fluorescência no citômetro de fluxo.
5. Preparação de células cancerígenas de pulmão A549
- Cultura A549 (epitelial basal adenocarcinomômico humano) células em mídia DMEM completa (10% soro bovino fetal, 1% penicilina/estreptomicina) a 37 °C e 5% CO2 em um frasco de cultura de tecido de fundo plano.
- Colher células A549 quando atingirem 70-90% de confluência. Aspirar a mídia do frasco e lavar as células uma vez com PBS para remover proteínas séricos.
- Adicione trippsina (0,25%) EDTA ao frasco e incubar por 5 min a 37 °C. Trippsina é uma enzima digestiva que faz com que as células se desprendem da superfície inferior do frasco de cultura tecidual.
- Transfira a solução trypsin para um tubo de centrífuga de 15mL e neutralize-o adicionando mídia DMEM completa a uma proporção de 1:3.
- Pelota as células via centrifugação a 1.500 x g por 5 min a 4 °C.
- Aspire o supernasal e resuspenha a pelota em uma concentração de 100.000/mL em solução PBS contendo trehalose de 200 mM em frasco cônico de 15 mL.
- Adicione 25 μL de solução de agente de contraste de ultrassom, conforme descrito anteriormente na etapa 3.11.
- Processe alíquotas 1mL de células usando o sistema acoustofluido (ver etapas 2.10-2.11). Esta etapa aumenta a entrega de trehalose em células cancerígenas de pulmão A549.
- Imediatamente após o tratamento, lave as células três vezes via centrifugação com 500 μL de PBS para remover trehalose extracelular. As células devem ser lavadas dentro de 10 minutos após a adição de solução de trehalose.
- Após a etapa final de lavagem, resuspend as células em 100 μL de PBS.
- Adicione 11 μL de solução Triton X-100 de 1% às células de lise e solte trehalose intracelular.
- Vórtice para 15 s, em seguida, incubar por 30 minutos em temperatura ambiente.
- Vórtice novamente para 15 s, em seguida, medir a concentração de trehalose usando ensaio de trehalose comercialmente disponível seguindo a recomendação do fabricante.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uma imagem do sistema acoustofluido montado dentro de uma caixa impressa em 3D é mostrada na Figura 1. Este protocolo produz um sistema acoustofluido que pode ser usado para melhorar a entrega molecular intracelular em múltiplas linhas celulares usando agentes de contraste de ultrassom.
Figura 2 demonstra maior entrega intracelular de um composto fluorescente, fluoresceína, para células T humanas primárias com tratamento acoustofluido em comparação com um grupo de controle não tratado(p<0,05, n=3/grupo). As células T foram suspensas a uma concentração de 1 milhão/mL em PBS com solução de fluoresceína de 100 μg/mL e solução de agente de contraste de ultrassom de 25 μL/mL, e a mistura foi transmitida através do dispositivo acoustofluidic para tratamento de ultrassom. A entrega de fluoresceína intracelular e a viabilidade celular foram medidas com citometria de fluxo após a lavagem de células via centrifugação para remover fluoresceína extracelular. As células T do grupo de controle não tratado também foram suspensas a 1 milhão/mL em PBS com solução de fluoresceína de 100 μg/mL, mas a solução do agente de contraste de ultrassom não foi adicionada e as células não foram transmitidas através do dispositivo acoustofluidic. A intensidade da fluorescência das células T aumentou 5 vezes após o tratamento acoustofluido em relação à intensidade de fluorescência das células T no grupo de controle não tratado, indicando maior entrega de fluoresceína. A viabilidade celular diminuiu ligeiramente após o tratamento acoustofluido, mas permaneceu acima de 80% (p<0,05, n=3/grupo).
A Figura 3 demonstra maior entrega intracelular de um composto conservante, trehalose, para células de carcinoma pulmonar A549 humanos com tratamento acoustofluidic comparado apenas ao fluxo (sem agentes de contraste de ultrassom ou exposição ao ultrassom) e comparado com células do grupo de controle não tratado (ANOVA p<0,05, n=3/grupo). As células A549 foram suspensas a uma concentração de 100.000/mL em PBS com solução de trehalose de 200 mM e solução de agente de contraste de ultrassom de 25 μL/mL, e a mistura foi passada através do dispositivo acoustofluidic para tratamento de ultrassom. As células A549 nos grupos de controle ("Somente fluxo" e "Sem Tratamento") também foram suspensas a 100.000/mL em PBS com trehalose de 200 mM, mas a solução do agente de contraste de ultrassom não foi adicionada e as células não foram expostas ao tratamento de ultrassom. O trehalose intracelular foi quantificado usando um kit de ensaio de trehalose e normalizado para o grupo de controle não tratado. A viabilidade celular foi medida com ensaio azul trypan. Não houve diferença estatística na viabilidade celular entre os grupos (n=3-7/grupo).
Figura 1: Foto do sistema acoustofluidic. O sistema de fluxo acoustofluido contém uma câmara de fluxo baseada em PDMS com um transdutor PZT integrado conduzido por um microcontrolador. Uma caixa impressa em 3D com um indicador LED e um botão de pressão liga/desliga são recursos adicionais opcionais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O tratamento acoustofluido melhora aentrega de fluoresceína às células T humanas. (A) A intensidade da fluorescência nas células T primárias aumentou após o tratamento acoustofluidic com fluoresceína em comparação com o grupo de controle não tratado (sem acoustofluidics e sem microbolhas) (p<0,05, n=3/grupo). (B) A viabilidade celular diminuiu ligeiramente após o tratamento acoustofluido, mas permaneceu acima de 80% medida pela citometria de fluxo(p<0,05, n=3/grupo). (C) Histograma de citometria de fluxo representativo indicando maior fluorescência no grupo de tratamento acoustofluido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O tratamento acoustofluido melhora oparto derehalose para células cancerígenas de pulmão humanas. (A) A absorção de trehalose aumentou em células de carcinoma pulmonar A549 em comparação apenas com o fluxo (sem ultrassom e sem microbolhas) e no grupo de controle não tratado (ANOVA p<0,05, n=3/grupo). (B) A viabilidade celular permaneceu acima de 90% após o tratamento acoustofluido medido pelo ensaio azul trypan (n=3-7/grupo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivos suplementares. Clique aqui para baixar este arquivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este protocolo descreve a montagem e o funcionamento de um sistema acoustofluido de baixo custo que melhora a entrega intracelular de biomoléculas para aplicações de pesquisa. Existem vários fatores importantes a serem considerados na montagem e operação deste sistema. O dispositivo acoustofluido é fabricado em PDMS, que é um material biocompatível que pode ser facilmente moldado com dimensões de canal consistentes27. Os canais do dispositivo podem ser enxaguados com 15 mL de solução de 70% de etanol antes do processamento acoustofluido, a fim de aumentar a esterilidade ao trabalhar com células cultivadas. Após a limpeza do etanol, 15 mL de água desionizada podem ser usados para enxaguar o dispositivo para remover o etanol residual dos canais antes de adicionar soluções celulares. Pequenos canais acoustofluidos podem facilmente ser bloqueados por detritos ou agregados celulares, tornando isso uma limitação para o uso frequente do dispositivo. Enxaguar completamente os canais entre cada amostra ajudará a evitar problemas com o bloqueio do canal. Além disso, vários dispositivos PDMS podem ser fabricados em cada lote para que os dispositivos possam ser rapidamente substituídos, se necessário. Para aplicações baseadas em ultrassom, é importante produzir dispositivos PDMS com uma espessura consistente, pois diferenças na espessura do PDMS podem afetar as pressões de ultrassom dentro dos canais fluidos. As ondas de ultrassom se propagam continuamente através do dispositivo e as ondas transmitidas interagem com ondas refletidas para formar padrões de ondas acústicas permanentes que são muito sensíveis às diferenças na espessura do PDMS17. A espessura do PDMS é determinada principalmente pela quantidade de PDMS adicionada ao molde (etapa 1.7) e este protocolo produz uma espessura PDMS de 3,5 mm.
A frequência máxima de saída do microcontrolador (8 MHz) foi selecionada para produzir o menor comprimento de onda acústico dentro do canal fluido. A saída do microcontrolador é tipicamente uma onda quadrada, mas as medidas do osciloscópio revelaram que a saída a 8 MHz se torna mais semelhante a uma forma de onda sinusoide devido a limitações de taxa de slew. Uma limitação deste sistema é que a saída máxima de tensão do microcontrolador é de 5V e um amplificador RF externo é necessário se forem desejadas saídas de tensão mais altas. A saída de pressão de campo livre do transdutor neste sistema foi de 18 kPa a 1 cm medida com um hidrofone de agulha (Precision Acoustics, Dorchester, Reino Unido). Embora essa pressão seja relativamente baixa, ondas de pé dentro dos canais podem aumentar as pressões acústicas a que as amostras são expostas à medida que passam pelo feixe de ultrassom.
Os agentes de contraste do ultrassom são usados para nuclear cavitação acústica dentro dos canais acoustofluidos que aumenta a entrega de biomoléculas através das membranas celulares28,29. Este protocolo descreve a síntese de microbolhas cheias de gás perfluorocarboneto encapsuladas por uma membrana fosfolipílica cônica. Como descrito anteriormente, esta formulação consiste em microbolhas principalmente entre 1-3 μm de diâmetro30. A superfície positivamente carregada dos microbolhas os atrai para membranas celulares negativamente carregadas, o que aumenta a distribuição molecular mediada pela sonoporção quando as microbolhas e células estão próximas. A concentração de microbolhas na solução celular é um fator crítico que pode influenciar a eficiência da entrega molecular e da viabilidade celular após o tratamento austofluido, e a concentração ideal de microbolhas pode ser específica para cada célula tipo 19. A concentração de microbolhas cheias de gás com uma casca lipídica pode diminuir ao longo do tempo após a síntese, de modo que os agentes de contraste de ultrassom devem ser usados dentro de algumas horas após a síntese.
Demonstramos a entrega de um composto fluorescente (fluoresceína) em células T humanas não ativadas primárias usando o sistema acoustofluido neste protocolo. É importante notar que o estado de ativação das células T humanas primárias pode afetar a eficiência da entrega molecular intracelular. As propriedades de fluorescência da fluoresceína permitem detecção intracelular sensível com citometria de fluxo, mas outros compostos solúveis também podem ser entregues em células usando este sistema aoustofluido. Por exemplo, demonstramos a entrega acoustofluida de trehalose em células cancerígenas de pulmão humanas. A entrega acoustofluidic de trehalose em células pode permitir um aumento da recuperação após o armazenamento congelado e seco, o que pode ter impactos significativos em uma gama de aplicações biomédicas e de pesquisa 19.
A entrega acoustofluida de outras biomoléculas, como proteínas ou plasmídeos de DNA, também é possível, embora uma limitação deste sistema seja que a eficiência da entrega molecular pode ser menor para compostos maiores18,31. A otimização da taxa de fluxo acoustofluidic, concentrações de agentes de contraste de ultrassom, concentrações celulares e mídia podem ser necessárias para a entrega de outras biomoléculas. Além disso, parâmetros ideais podem variar entre diferentes tipos de células devido a fatores como diâmetro celular, morfologia, propriedades de membrana e fenótipo.
O sistema acoustofluidic descrito neste protocolo pode ser facilmente montado e operado a um custo relativamente baixo. Além disso, este sistema pode ser personalizado para outras aplicações conectando outras fontes de sinal ou transdutores de ultrassom para gerar pressões e frequências específicas de saída32,33,34. Além disso, o sistema de bomba de seringa descrito neste protocolo pode ser substituído por bombas peristálticas, se desejar. A uma vazão de 50 mL/h, o tempo de residência para as células dentro do feixe de ultrassom à medida que passam pelo canal acoustofluidic é de aproximadamente 1 s, mas este tempo de residência pode ser modificado conforme necessário para aplicações específicas, ajustando a taxa de fluxo de fluidos.
Ao contrário de outras técnicas comuns de transfecção, as biomoléculas podem ser entregues em células em minutos em vez de horas e este sistema não requer equipamentos especializados e caros. Além disso, este sistema é compatível com uma ampla gama de mídias de cultura celular comumente usadas ou outros buffers. Em resumo, este sistema acoustofluidic permite a entrega rápida de biomoléculas às células, o que pode ser útil para uma ampla gama de aplicações de pesquisa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os coautores MAM e JAK possuem propriedade na DesiCorp que podem se beneficiar financeiramente de produtos relacionados a esta pesquisa.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado, em parte, por meio de financiamento da Fundação Nacional de Ciência (#1827521, #1827521, #1450370) e dos Institutos Nacionais de Saúde (U01HL127518). Os serviços de fotolitografia foram prestados pelo Centro de Tecnologia Micro/Nano da Universidade de Louisville.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabrication of Acoustofluidic Device | |||
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 (SKU) | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Harris Uni-Core (2.5 mm) | Electron Microscopy Sciences | 69039-25 | |
| Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube - S (2/4 port) | Darwin Microfluidics | LVF-KPT-S-2 (SKU) | https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port |
| Microscope Slide | VWR | 16004-430 | https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium |
| trichlorosilane | Gelest | 105732-02-3 (Cas. No.) | Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage. |
| Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD) | McMaster-Carr | 5233K51 (Part #) | https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/ |
| Assembly of Acoustofluidic System | |||
| Arduino Uno | Arduino | 7630049200050 (Barcode) | https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3 |
| Preparation of Ultrasound Contrast Agents | |||
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) | Avanti Lipids | 890703P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/890703 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Lipids | 850365P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/850365 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) | Avanti Lipids | 840465P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/840465 |
| APF-140HP (decafluorobutate gas) | FlouroMed | 355-25-9 (Cas No.) | http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/ |
| DB-338 Amalgamators | COXO | https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/ | |
| polyoxyethylene 40 stearate | Sigma-Aldrich | P3440-250G (SKU) | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB |
| Q125 Sonicator | Qsonica | Q125-110 (Ref.) | https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r |
| Preparation of Primarty T Cells | |||
| autoMACs running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref |
| Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail) | Miltenyi Biotec | 130-096-535 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535 |
| magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator) | Miltenyi Biotec | 130-092-545 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545 |
| Preparation of A549 Lung Cancer Cells | |||
| Trehalose Assay Kit | Megazyme | K-TREH (Cat. No.) | https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit |
| Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile) | VWR | 97063-702 (Cat. No.) | https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile |
References
- Gardlik, R., et al. Vectors and delivery systems in gene therapy. Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).
- Wahlers, A., et al. Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vector-mediated gene expression in hematopoietic cells. Gene Therapy. 8 (6), 477-486 (2001).
- Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Advanced Biomedical Research. 1, 27 (2012).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Medical & Biological Engineering & Computing. 44 (1-2), 5-14 (2006).
- Gehl, J. Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiologica Scandinavica. 177 (4), 437-447 (2003).
- Lin, Y. C., Li, M., Wu, C. C. Simulation and experimental demonstration of the electric field assisted electroporation microchip for in vitro gene delivery enhancement. Lab on a Chip. 4 (2), 104-108 (2004).
- Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophysical Chemistry. 19 (3), 211-225 (1984).
- Weaver, J. C. Electroporation: a general phenomenon for manipulating cells and tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 51 (4), 426-435 (1993).
- Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
- Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
- Klibanov, A. L., Shevchenko, T. I., Raju, B. I., Seip, R., Chin, C. T. Ultrasound-triggered release of materials entrapped in microbubble-liposome constructs: a tool for targeted drug delivery. Journal of Controlled Release. 148 (1), 13-17 (2010).
- Fan, Z., Kumon, R. E., Deng, C. X. Mechanisms of microbubble-facilitated sonoporation for drug and gene delivery. Therapeutic Delivery. 5 (4), 467-486 (2014).
- Secomski, W., et al. In vitro ultrasound experiments: Standing wave and multiple reflections influence on the outcome. Ultrasonics. 77, 203-213 (2017).
- Gedge, M., Hill, M. Acoustofluidics 17: theory and applications of surface acoustic wave devices for particle manipulation. Lab on a Chip. 12 (17), 2998-3007 (2012).
- Shi, J., et al. Acoustic tweezers: patterning cells and microparticles using standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (20), 2890-2895 (2009).
- Shi, J., Huang, H., Stratton, Z., Huang, Y., Huang, T. J. Continuous particle separation in a microfluidic channel via standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (23), 3354-3359 (2009).
- Shields, C. W. t, Cruz, D. F., Ohiri, K. A., Yellen, B. B., Lopez, G. P. Fabrication and operation of acoustofluidic devices supporting bulk acoustic standing waves for sheathless focusing of particles. Journal of Visualized Experiments. (109), e53861 (2016).
- Belling, J. N., et al. Acoustofluidic sonoporation for gene delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (20), 10976-10982 (2020).
- Centner, C. S., et al. Ultrasound-induced molecular delivery to erythrocytes using a microfluidic system. Biomicrofluidics. 14 (2), 024114 (2020).
- Qi, J., Ding, C., Jiang, X., Gao, Y. Advances in developing CAR T-cell therapy for HIV cure. Frontiers in Immunology. 11, 361 (2020).
- Annesley, C. E., Summers, C., Ceppi, F., Gardner, R. A. The evolution and future of CAR T cells for B-Cell Acute lymphoblastic leukemia. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (4), 591-598 (2018).
- Hand, S. C., Menze, M. A. Molecular approaches for improving desiccation tolerance: insights from the brine shrimp Artemia franciscana. Planta. 242 (2), 379-388 (2015).
- Zhang, M., et al. Freeze-drying of mammalian cells using trehalose: preservation of DNA integrity. Scientific Reports. 7 (1), 6198 (2017).
- Grievink, H. W., Luisman, T., Kluft, C., Moerland, M., Malone, K. E. Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: Cell recovery and viability, population composition, and cell functionality. Biopreserv Biobank. 14 (5), 410-415 (2016).
- Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Current Protocol in Stem Cell Biology. , Chapter 2, Unit 2A 1 (2007).
- Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on Percoll. Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), 9983-9988 (2016).
- Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).
- Kopechek, J. A., et al. Ultrasound targeted microbubble destruction-mediated delivery of a transcription factor decoy inhibits STAT3 signaling and tumor growth. Theranostics. 5 (12), 1378-1387 (2015).
- Bhutto, D. F., et al. Effect of molecular weight on sonoporation-mediated uptake in human cells. Ultrasound in Medical Biology. 44 (12), 2662-2672 (2018).
- Forbes, M. M., Steinberg, R. L., O'Brien, W. D. Frequency-dependent evaluation of the role of definity in producing sonoporation of Chinese hamster ovary cells. Journal of Ultrasound in Medicine. 30 (1), 61-69 (2011).
- Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (36), 9983-9988 (2016).
- Miller, D. L., Bao, S., Morris, J. E. Sonoporation of cultured cells in the rotating tube exposure system. Ultrasound in Medical Biology. 25 (1), 143-149 (1999).
