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Bioengineering

Montaje Y Operación De Un Dispositivo Acoustofluidic Para La Entrega Mejorada De Compuestos Moleculares A Las Células

Published: January 21, 2021 doi: 10.3791/62035
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 2, 3, 2, 1
1Department of Bioengineering, University of Louisville, 2School of Medicine, University of Louisville, 3Department of Biology, University of Louisville

Summary

Este protocolo describe el montaje y la operación de un dispositivo acoustofluidic de bajo costo para la entrega molecular rápida a las células vía el sonoporation inducido por los agentes del contraste del ultrasonido.

Abstract

La entrega intracelular eficiente de biomoléculas es necesaria para una amplia gama de investigaciones biomédicas y aplicaciones terapéuticas basadas en células. el sonoporation Ultrasonido-mediado es una técnica emergente para la entrega intracelular rápida de biomoléculas. La sonoporación se produce cuando la cavitación de microburbujas llenas de gas forma poros transitorios en las membranas celulares cercanas, lo que permite una rápida absorción de biomoléculas del fluido circundante. Las técnicas actuales para la sonoporación in vitro de células en suspensión están limitadas por el rendimiento lento, la variabilidad en las condiciones de exposición al ultrasonido para cada célula y el alto costo. Para abordar estas limitaciones, se ha desarrollado un dispositivo acoustofluidic de bajo costo que integra un transductor de ultrasonido en un dispositivo fluídico basado en PDMS para inducir la sonoporación constante de las células a medida que fluyen a través de los canales en combinación con agentes de contraste de ultrasonido. El dispositivo se fabrica utilizando técnicas de fotolitografía estándar para producir el chip fluídico basado en PDMS. Un transductor de disco piezoelécrico de ultrasonido está conectado al dispositivo y accionado por un microcontrolador. El conjunto se puede integrar dentro de una caja impresa en 3D para mayor protección. Las células y las microburbujas se empujan a través del dispositivo utilizando una bomba de jeringa o una bomba peristáltica conectada a tubos de PVC. La entrega aumentada de biomoléculas a las células de T humanas y a las células cancerosas del pulmón se demuestra con este sistema acoustofluidic. En comparación con los enfoques de tratamiento a granel, este sistema acoustofluidic aumenta el rendimiento y reduce la variabilidad, lo que puede mejorar los métodos de procesamiento celular para aplicaciones de investigación biomédica y la fabricación de terapias basadas en células.

Introduction

Las plataformas virales y no virales se han utilizado para mejorar la entrega molecular a las células. La entrega viral (transducción) es una técnica común utilizada en terapias basadas en células que requieren modificación genómica. Las limitaciones con la entrega viral incluyen mutagénesis de inserción potencial, capacidad transgénica limitada, y multiplicidad no deseada de infección1,2. Por lo tanto, las técnicas de administración molecular no viral están en desarrollo para una amplia gama de aplicaciones biomédicas y de investigación. Las técnicas comunes incluyen mecánica, eléctrica, hidrodinámica, o el uso de energía basada en láser para mejorar la absorción de biomoléculas en las células 3. La electroporación es una plataforma de administración molecular no viral de uso común que tiene la capacidad de inducir perforación transitoria en la membrana plasmática para la entrega intracelular de compuestos moleculares4,5,6,7,8,9. Sin embargo, la perforación transitoria de la membrana plasmática es un proceso estocástico y la absorción molecular a través de la electroporación es generalmente dependiente de la difusión pasiva a través de los poros transitorios de la membrana4,7,8.

Un método alternativo es la utilización del ultrasonido para la entrega molecular intracelular aumentada vía la cavitación de los agentes del contraste del ultrasonido (es decir, microburbujas gas-llenadas). La cavitación de microburbujas induce efectos de microflujo en los medios circundantes que pueden causar perforación transitoria de membranas plasmáticas cercanas ("sonoporación") permitiendo una rápida absorción intracelular de biomoléculas a través de mecanismos de transporte pasivos o activos10,11,12. La sonoporación es una técnica eficaz para la entrega molecular rápida a las células, pero este enfoque a menudo requiere equipos costosos y métodos de tratamiento a granel que están limitados por un menor rendimiento y una mayor variabilidad en las condiciones de exposición al ultrasonido13. Para abordar estas limitaciones, los dispositivos acoustofluidic, que permiten la sonoporación constante de células en suspensión, están actualmente en desarrollo.

Acoustofluidics es un campo en expansión que integra tecnologías de ultrasonido y microfluídica para una amplia variedad de aplicaciones. Este enfoque se ha utilizado previamente para la separación de partículas mediante la aplicación de energía de ultrasonido continuo para inducir ondas acústicas estacionarias dentro de los canales fluídicos14,15,16,17. Las partículas se clasifican hacia diferentes partes del dispositivo en función de una variedad de propiedades, como el tamaño de partícula, la densidad y la compresibilidad en relación con el medio16. También se están elaborando tecnologías acostofluídicas que permiten la rápida entrega molecular a una variedad de tipos de células para aplicaciones de investigación y fabricación de terapias celulares18. Recientemente, demostramos una mayor entrega molecular a los eritrocitos utilizando un dispositivo acoustofluidic basado en PDMS19. En la plataforma acoustofluidic, la dinámica de la célula y de la microburbuja se puede manipular para inducir las interacciones físicas que permiten la entrega mejorada de biomoléculas. La eficiencia y la consistencia de la entrega molecular intracelular pueden aumentarse potencialmente optimizando la distancia entre las células y las microburbujas.

Un uso importante para el sonoporation acoustofluidic-mediado implica el transporte de biomoléculas en las células de T humanas primarias. Las inmunoterapias basadas en la transferencia adoptiva de células T, como la terapia con células T del receptor de antígeno quimérico (CAR T), están surgiendo rápidamente para el tratamiento de diversas enfermedades, incluido el cáncer y virus como el VIH20. La terapia CON T Y HA SIDO particularmente eficaz en pacientes pediátricos con leucemia linfoblástica aguda (LLA), con tasas de remisión completa del 70-90%21. Sin embargo, la fabricación de células T para estas terapias generalmente depende de la transducción viral, que está limitada por la mutagénesis de inserción potencial, los largos tiempos de procesamiento y los desafíos de la entrega de biomoléculas no genéticas como proteínas o moléculas pequeñas1. Los métodos moleculares mediados por Acoustofluidic pueden potencialmente superar estas limitaciones y mejorar la fabricación de terapias de células T.

Otra aplicación importante para la sonoporación mediada por acoustofluidic implica la entrega intracelular de compuestos conservantes, como la trehalosa, que protegen las células durante la congelación y la desecación. La trehalosa es producida por algunos organismos en la naturaleza y les ayuda a tolerar la congelación y la desecación protegiendo sus membranas celulares22,23. Sin embargo, la trehalosa no es producida por células de mamíferos y es impermeable a las membranas celulares de los mamíferos. Por lo tanto, las técnicas moleculares eficaces de la entrega, tales como sonoporation, son necesarias para alcanzar los suficientes niveles intracelulares de la trehalosa requeridos para proteger las membranas celulares internas. Este enfoque está actualmente en desarrollo para la preservación seca de varios tipos de células.

Este protocolo proporciona una descripción detallada del montaje y funcionamiento de un sistema acoustofluidic de costo relativamente bajo impulsado por un microcontrolador. Los agentes del contraste del ultrasonido se utilizan para inducir el sonoporation dentro de los canales fluídicos y para permitir entrega molecular rápida a los varios tipos de la célula, incluyendo las células de T y las células cancerosas. Este sistema acoustofluidic se puede utilizar para una variedad de aplicaciones de la investigación y puede también ser útil como sistema del prototipo para evaluar métodos de la sonoporación para los procesos de fabricación mejorados de la terapia celular.

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Protocol

Las donaciones de sangre entera se recogieron de donantes sanos siguiendo los protocolos aprobados por la junta de revisión institucional de la Universidad de Louisville.

1. Fabricación de un dispositivo acoustofluidic

  1. Obtener una fotomáscara con un diseño en espiral concéntrico que contiene canales con un diámetro de 500 μm. Se proporciona un archivo CAD en los archivos complementarios como ejemplo. Una máscara fotográfica personalizada se puede pedir a un proveedor comercial o estampada utilizando un escritor de máscaras.
  2. Prepare un molde del diseño en espiral concéntrico en una oblea de silicio recubierta de fotorresister utilizando técnicas de fotolitografía estándar.
    1. Agregue aproximadamente 2 cucharadas (~ 30 mL) de SU-8 2100 a una oblea de silicio de 100 mm.
    2. Girar-recubrir la oblea en un hilandero a una velocidad de 150 rpm durante 30 s para extender el fotorresistente, a continuación, aumentar la velocidad a 1.200 rpm para 60 s para producir un espesor de 200 μm.
    3. Cure la oblea recubierta de fotorresistida en un horno de vacío de poliimida con una rampa de 30 minutos hacia arriba y una permanencia de 30 minutos a 115 ° C, luego rampa hacia abajo durante 30 min.
    4. Exponga la oblea recubierta de fotorresistería durante 130 s utilizando un alineador de máscara con la fotomáscara del paso 1.1.
    5. Hornear la oblea después de la exposición siguiendo el mismo proceso descrito en el paso 1.2.3.
    6. Desarrolle la solución de desarrollo fotorresist en SU-8 durante aproximadamente 8 min.
      PRECAUCIÓN: Utilice solamente la solución del revelador en una campana química bien ventilada de los humos.
  3. Silanizar el molde para hacer la superficie más hidrofóbica. Coloque la oblea recubierta de fotorresister en un desecador y agregue una gota de 20 μL de clorossilano (C8H4Cl3F13Si). Aplique vacío a la cámara durante 30 s, luego selle la cámara y déjela durante la noche.
    PRECAUCIÓN: Chlorosilane es muy peligroso e inflamable. La exposición causa quemaduras graves y daño ocular.
  4. Combine 54 g de base de polidimetsiloxano (PDMS) y 6 g de agente de curado en una taza y mezcle vigorosa y a fondo con una espátula durante al menos 1 min.
  5. Coloque la taza que contiene la solución de PDMS en un desecador durante aproximadamente 30 minutos o hasta que se eliminen las burbujas de aire remanentes de la solución.
  6. Coloque la oblea recubierta de fotorresistencia con los patrones mirando hacia arriba en una placa de Petri de 150 mm.
  7. Vierta la solución PDMS sobre el molde dentro de la placa de Petri de 150 mm.
  8. Si es necesario, coloque la placa de Petri de 150 mm dentro de un desecador y aplique vacío hasta que desaparezcan las burbujas de aire remanentes.
  9. Transfiera la placa de Petri de 150 mm a un horno de laboratorio y hornee durante 2 h a 60 °C para curar el PDMS.
  10. Después de curar, retire cuidadosamente el PDMS de la placa de Petri cortando alrededor de los bordes de la oblea con una cuchilla de afeitar.
  11. Corte cada dispositivo individual con un cuchillo o una cuchilla de afeitar.
  12. Perforar orificios a través de los puertos de entrada y salida de cada dispositivo utilizando un punzón de biopsia de 2,5 mm.
  13. Coloque cada dispositivo PDMS en un asher de plasma con canales expuestos (mirando hacia arriba). Aplique el tratamiento con plasma de oxígeno (100 W durante 45 s, 500 mbar O2)y luego coloque inmediatamente cada dispositivo PDMS en un portaobjetos de microscopio de vidrio de cal de soda limpia (75 mm x 25 mm x 1 mm) con canales que dan a la superficie del vidrio.
  14. Deje que los dispositivos se unan durante la noche a temperatura ambiente.
  15. Aplique suavemente silicona a la superficie del transductor piezoelécico de 1 cm de diámetro a un espesor de ~ 1-2 mm, luego alinee cuidadosamente el transductor con la espiral concéntrica y presione suavemente en la parte inferior de la diapositiva del microscopio de vidrio (lado opuesto del dispositivo PDMS).

2. Montaje y funcionamiento del sistema acoustofluidic

  1. Conecte un microcontrolador a una computadora con un cable USB A a B. Un indicador LED de alimentación verde (etiquetado pwr) debe iluminar.
  2. Utilice el programa asociado en el ordenador para cargar un programa que genera una señal de 8 MHz. Un programa de ejemplo se proporciona en los Files suplementarios. Después de cargar el programa, se almacenará en la memoria del microprocesador y no será necesario volver a cargarlo.
  3. Suerda un cable 1" 22G al final de cada cable en el transductor PZT.
  4. Conecte el cable terminal negativo (negro) del transductor PZT a un pin GND a través del cable soldado.
  5. Conecte el cable terminal positivo (rojo) del transductor PZT al pin de salida (#9 en el programa de ejemplo proporcionado) a través del cable soldado.
  6. Opcionalmente, monte el dispositivo acoustofluidic y el microcontrolador en una caja impresa en 3D. Los archivos CAD se proporcionan en losSupplemental Files como ejemplos. Se pueden conectar cables adicionales a otros pines del microcontrolador para controlar un indicador LED externo y un botón de encendido / apagado si se desea.
  7. Corte las secciones de 3-6 " de la tubería de plástico blando de PVC tygon (1/16 " ID, 1/8 " OD) y empuje la tubería en los puertos de entrada y salida. Puede ser necesario rotar el tubo mientras se aplica presión hasta que encaje en la abertura. Opcionalmente, después de insertar el tubo en cada puerto, se puede aplicar pegamento en la unión para unir el PDMS y el tubo juntos.
  8. Monte el depósito de microfluídico de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  9. Corte una sección de 3-6 " de tubo de plástico blando de PVC tígono (1/16 " ID, 1/8 " OD) y empuje el tubo sobre el tubo de 1/32 " ID del tubo de salida del depósito microfluídico. Opcionalmente, envuelva la unión con película de parafina para evitar fugas.
  10. Llene una jeringa de 60 ml con aire ambiente (opcionalmente, filtre el aire con un filtro de 0,2 μm) y conéctelo a un tubo de PVC tygon (1/16" ID, 1/8" OD) en el lado del depósito microfluídico.
  11. Ajuste la bomba de la jeringuilla a una velocidad de 200 mL/h para empujar las soluciones del agente de contraste de la célula/del ultrasonido a través del dispositivo acoustofluidic en un caudal volumétrico de 50 mL/h y recoja las muestras de la salida del dispositivo acoustofluidic en un tubo de la centrífuga de 50mL. Opcionalmente, enjuague el canal antes del tratamiento acoustofluidic con 15 mL de solución de etanol al 70% para aumentar la esterilidad de los canales fluídicos. Además, los canales se pueden enjuagar con 15 mL de agua desionizada para eliminar el etanol residual en el dispositivo antes de bombear las células a través del sistema.

3. Preparación de agentes de contraste de ultrasonido

NOTA: Los agentes de contraste ecográfico mejoran significativamente la entrega acoustofluídica de compuestos moleculares al aumentar transitoriamente la permeabilización de las membranas celulares cercanas19. La entrega molecular es muy limitada sin agentes de contraste de ultrasonido en este sistema.

  1. Prepare una solución de fosfolípidos en un vial de centelleo de 20 ml que contenga la siguiente mezcla:
    1. Añadir 25 mg de 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC).
    2. Añadir 11,6 mg de 1,2-distearoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DSEPC).
    3. Añadir 0,26 mg de 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (DSPG).
    4. Añadir 0,88 mg de estearato de polioxietileno40.
  2. Añadir cloroformo hasta que se disuelvan todos los fosfolípidos (por ejemplo, 3 mL de cloroformo).
  3. Evaporar el cloroformo en un desecador durante 48 h para formar una película lipídica seca (la evaporación bajo argón o con un evaporador rotatorio se puede utilizar para acelerar el proceso de secado).
  4. Rehidrate la película lipídica con 10 mL de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS).
  5. Sonicar la solución lipídica durante 3 min al 40% de amplitud para formar una solución micelar catiónica.
  6. Después de la sonicación, almacene la solución de fosfolípidos a 2-6 ° C durante un mes hasta 1.
  7. Para preparar agentes de contraste de ultrasonido, agregue 200 μL de solución micelar catiónica y 600 μL de PBS estéril a un vial de tabique de vidrio de 2 ml.
  8. Selle el vial engarzando la tapa.
  9. Use una aguja de 1.5" 20G para llenar el espacio de la cabeza del vial con gas decafluorobutano durante 30 s.
  10. Amalgamar el vial durante 45 s a 4.350 cpm para formar agentes de contraste de ultrasonido llenos de gas perfluorobutano.
  11. Añadir 25 μL de solución de agente de contraste de ultrasonido por 1 mL de solución celular inmediatamente antes de bombear la mezcla combinada de agente de contraste/célula a través del dispositivo acoustofluidic. La solución de la célula se puede modificar según lo deseado por el usuario, pero en nuestros estudios la solución de la célula consistió en las células de T primarias en el paso 4.21, y las células cancerosas del pulmón A549 en el paso 5.7, respectivamente.

4. Preparación de Tcells primarias

  1. Aísle las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de soluciones de sangre entera y guárdelas a -150 °C. La separación del gradiente de densidad que contiene un sustrato se utiliza comúnmente para separar los PBMCs de la sangre entera24,25,26.
  2. Descongelar vial congelado en baño de agua de 37 °C.
  3. Diluir PBMCs descongelados 1:10 con PBS en un tubo de centrífuga de 15mL. Cada vial de 1 ml contiene aproximadamente 10 millones de PBMCs.
  4. Centrífuga diluida PBMCs a 580 x g durante 11 min a 4 °C.
  5. Aspirar el sobrenadante y añadir 13 mL de MAC que ejecutan buffer para resuspend las células.
  6. Cuente los PBMCs con un contador automatizado de la célula o un hemocytometer.
  7. Centrifugar los PBMCs de nuevo a 580 x g durante 11 min a 4 °C y aspirar el sobrenadante.
  8. Agregue 40 μL de búfer de funcionamiento refrigerado por cada 10 millones de PBMCs.
  9. Para aislar las células T, agregue 10 μL de pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail por cada 10 millones de PBMCs.
  10. Agitar suavemente los PBMCs y almacenar la solución a 4 °C durante 5 min por cada 10 millones de células.
  11. Agregue 30 μL de tampón en funcionamiento y 20 μL de Pan T-Cell MicroBead Cocktail por cada 10 millones de PBMCs.
  12. Mezcle bien los PBMCs y las cuentas e incube durante 15 min adicionales a 4 °C.
  13. Agregue el búfer en ejecución para alcanzar un volumen total de 500 μL.
  14. Separe las células T primarias con un instrumento de clasificación magnética de sobremesa disponible en el comercio utilizando el ajuste "agota la separación" siguiendo el protocolo del fabricante. Este paso debe producir entre 5-10 millones de células T después de la clasificación celular.
  15. Cuente las células de T usando un contador automatizado de la célula o un hemocytometer.
  16. Diluya las células T en 10 mL de PBS estéril y la centrífuga a 580 x g durante 10 min a 4 °C para peletizar las células.
  17. Aspirar las células T sobrenadantes y resuspensantes en 1 mL de PBS.
  18. Cuente las células de T usando un contador automatizado de la célula o el hemocytometer y alícuota 1 millón/mL para los experimentos.
  19. Prepare una solución de fluoresceína de 1 mg/mL en PBS.
  20. Añadir 100 μL de 1 mg/mL de solución de fluoresceína por 1 mL de solución de células T (concentración final de fluoresceína = 100 μg/mL) inmediatamente antes del procesamiento.
  21. Añadir 25 μL de solución de agente de contraste de ultrasonido como se describió anteriormente en el paso 3.11.
  22. Procesar alícuotas de 1 mL de células utilizando el sistema acoustofluidic (ver pasos 2.10-2.11). Este paso mejora la entrega de fluoresceína en las células T primarias.
  23. Inmediatamente después del tratamiento, lave las células tres veces por centrifugación a 580 x g durante 10 min con 500 μL de PBS para eliminar la fluoresceína extracelular. Las células deben lavarse dentro de 10 min después de agregar la solución de fluoresceína.
  24. Después de la etapa final de lavado, resuspend las células en 250 μL de PBS y medir la fluorescencia en el citómetro de flujo.

5. Preparación de células cancerosas de pulmón A549

  1. Cultivo de células A549 (adenocarcinomic humano alveolar basal epithelial) en medios dmem completos (10% suero fetal bovino, 1% penicilina/estreptomicina) a 37 °C y 5% CO2 en un matraz de cultivo de tejido de fondo plano.
  2. Cosechar las células A549 cuando alcanzan el 70-90% de confluencia. Aspirar los medios del matraz y lavar las células una vez con PBS para eliminar las proteínas séricas.
  3. Añadir tripsina (0,25%) EDTA al matraz e incubar durante 5 min a 37 °C. La tripsina es una enzima digestiva que hace que las células se desprendan de la superficie inferior del matraz de cultivo de tejidos.
  4. Transfiera la solución de tripsina a un tubo centrífugo de 15 mL y neutralícalo agregando medios DMEM completos en una proporción de 1:3.
  5. Pellet de las células a través de la centrifugación a 1.500 x g durante 5 min a 4 °C.
  6. Aspirar el sobrenadante y resuspend el pellet a una concentración de 100.000/mL en solución de PBS que contiene 200 mM de trehalosa en vial cónico de 15 ml.
  7. Añadir 25 μL de solución de agente de contraste de ultrasonido como se describió anteriormente en el paso 3.11.
  8. Procesar alícuotas de 1 mL de células utilizando el sistema acoustofluidic (ver pasos 2.10-2.11). Este paso mejora la administración de trehalosa en las células de cáncer de pulmón A549.
  9. Inmediatamente después del tratamiento, lave las células tres veces a través de la centrifugación con 500 μL de PBS para eliminar la trehalosa extracelular. Las células deben lavarse dentro de los 10 minutos después de agregar la solución de trehalosa.
  10. Después de la etapa final de lavado, resuspend las células en 100 μL de PBS.
  11. Añadir 11 μL de solución de Triton X-100 al 1% para lisear las células y liberar trehalosa intracelular.
  12. Vórtice durante 15 s, luego incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
  13. Vórtice de nuevo durante 15 s, luego mida la concentración de trehalosa utilizando el ensayo de trehalosa disponible en el comercio siguiendo la recomendación del fabricante.

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Representative Results

Una imagen del sistema acoustofluidic montado dentro de una caja impresa en 3D se muestra en la Figura 1. Este protocolo produce un sistema acoustofluidic que se pueda utilizar para aumentar entrega molecular intracelular en variedades de células múltiples usando agentes del contraste del ultrasonido.

Figura 2   demuestra la entrega intracelular aumentada de un compuesto fluorescente, fluoresceína, a las células de T humanas primarias con el tratamiento acoustofluidic comparado a un grupo de control no tratado(p<0,05, n=3/group). Las células T se suspendieron a una concentración de 1 millón/mL en PBS con solución de fluoresceína de 100 μg/mL y 25 μL/mL de solución de agente de contraste de ultrasonido, y la mezcla se pasó a través del dispositivo acoustofluidic para el tratamiento de ultrasonido. La entrega intracelular de la fluoresceína y la viabilidad de la célula fueron medidas con cytometry de flujo después de lavar las células vía la centrifugación para quitar la fluoresceína extracelular. Las células T en el grupo de control no tratado también fueron suspendidas en 1 millón/mL en PBS con la solución de la fluoresceína de 100 μg/mL, pero la solución del agente del contraste del ultrasonido no fue agregada y las células no fueron pasadas a través del dispositivo acoustofluidic. La intensidad de la fluorescencia de las células de T aumentó en el doblez 5 después del tratamiento acoustofluidic en relación con la intensidad de la fluorescencia de las células de T en el grupo de control no tratado, indicando la entrega aumentada de la fluoresceína. La viabilidad de la célula disminuyó levemente después del tratamiento acoustofluidic pero permanecía sobre el 80% (p<0,05, n=3/group).

La Figura 3 demuestra una mayor entrega intracelular de un compuesto conservante, la trehalosa, a células humanas de carcinoma pulmonar A549 con tratamiento acustofluídico en comparación con el flujo solo (sin agentes de contraste de ultrasonido o exposición a ultrasonido) y en comparación con las células del grupo de control no tratado (ANOVA p<0.05, n = 3 / grupo). Las células A549 se suspendieron a una concentración de 100.000/mL en PBS con solución de trehalosa de 200 mM y solución de agente de contraste de ultrasonido de 25 μL/mL, y la mezcla se pasó a través del dispositivo acoustofluidic para el tratamiento de ultrasonido. Las células A549 en los grupos de control ("flujo solamente" y "ningún tratamiento") también fueron suspendidas en 100.000/mL en PBS con la trehalosa de 200 milímetros, pero la solución del agente del contraste del ultrasonido no fue agregada y las células no fueron expuestas al tratamiento del ultrasonido. La trehalosa intracelular fue cuantificada usando un kit del análisis de la trehalosa y normalizada al grupo de control no tratado. La viabilidad de la célula fue medida con análisis azul del trypan. No hubo diferencia estadística en la viabilidad celular entre los grupos (n=3-7/grupo).

Figure 1
Figura 1: Foto del sistema acoustofluidic. El sistema de flujo acoustofluidic contiene una cámara de flujo basada en PDMS con un transductor PZT integrado impulsado por un microcontrolador. Una caja impresa en 3D con un indicador LED y un botón de encendido / apagado son características adicionales opcionales. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 2
Figura 2:El tratamiento acoustofluidic mejora laentrega deluoresceína f a las células T humanas. (A)La intensidad de fluorescencia en las células T primarias aumentó después del tratamiento acoustofluidic con la fluoresceína comparada al grupo de control no tratado (ningún acoustofluidics y ningunas microburbujas)(p<0,05, n=3/group). (B)La viabilidad celular disminuyó ligeramente después del tratamiento acoustofluidic pero se mantuvo por encima del 80% medido por citometría de flujo(p<0,05, n=3/group). (C)Histograma representativo de citometría de flujo que indica una mayor fluorescencia en el grupo de tratamiento acoustofluidic. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 3
Figura 3: El tratamiento acostofluídico mejora laadministración de trehalosa a las células cancerosas de pulmón humano. (A)La absorción de trehalosa aumentó de las células de carcinoma pulmonar A549 en comparación con el flujo solamente (sin ultrasonido y sin microburbujas) y el grupo control no tratado (ANOVA p<0,05, n = 3 / grupo). (B)La viabilidad celular se mantuvo por encima del 90% después del tratamiento acoustofluidic medido por el ensayo trypan blue (n=3-7/group). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

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Discussion

Este protocolo describe el montaje y el funcionamiento de un sistema acoustofluidic de bajo costo que mejora la entrega intracelular de biomoléculas para aplicaciones de investigación. Hay varios factores importantes a tener en cuenta al ensamblar y operar este sistema. El dispositivo acoustofluidic se fabrica en PDMS, que es un material biocompatible que se puede moldear fácilmente con dimensiones de canalconsistentes 27. Los canales del dispositivo se pueden enjuagar con 15 mL de solución de etanol al 70% antes del procesamiento acoustofluidic para aumentar la esterilidad cuando se trabaja con células cultivadas. Después de la limpieza del etanol, se pueden usar 15 mL de agua desionizada para enjuagar el dispositivo para eliminar el etanol residual de los canales antes de agregar soluciones celulares. Los pequeños canales acoustofluidic pueden quedar fácilmente bloqueados por escombros o agregados celulares, lo que hace que esto sea una limitación para el uso frecuente del dispositivo. Enjuagar a fondo los canales entre cada muestra ayudará a prevenir problemas con el bloqueo del canal. Además, se pueden fabricar varios dispositivos PDMS en cada lote para que los dispositivos se puedan reemplazar rápidamente si es necesario. Para aplicaciones basadas en ultrasonidos, es importante producir dispositivos PDMS con un espesor consistente, ya que las diferencias en el espesor pdms pueden afectar las presiones de ultrasonido dentro de los canales fluídicos. Las ondas de ultrasonido se propagan continuamente a través del dispositivo y las ondas transmitidas interactúan con las ondas reflejadas para formar patrones de ondas acústicas estacionarias que son muy sensibles a las diferencias en el espesor del PDMS17. El espesor del PDMS está determinado principalmente por la cantidad de PDMS añadido al molde (paso 1.7) y este protocolo produce un espesor de PDMS de 3,5 mm.

La frecuencia de salida máxima del microcontrolador (8 MHz) se seleccionó para producir la longitud de onda acústica más pequeña dentro del canal fluídico. La salida del microcontrolador es típicamente una onda cuadrada, pero las mediciones del osciloscopio revelaron que la salida a 8 MHz se vuelve más similar a una forma de onda sinusoide debido a las limitaciones de velocidad de giro. Una limitación de este sistema es que la salida de voltaje máximo del microcontrolador es de 5V y se requiere un amplificador de RF externo si se desean salidas de voltaje más altas. La salida de presión de campo libre del transductor en este sistema fue de 18 kPa a 1 cm medida con un hidrófono de aguja (Precision Acoustics, Dorchester, Reino Unido). Aunque esta presión es relativamente baja, las ondas estacionarias dentro de los canales pueden aumentar las presiones acústicas a las que las muestras están expuestas a medida que pasan a través del haz de ultrasonido.

Los agentes de contraste por ultrasonido se utilizan para nuclear la cavitación acústica dentro de los canales acoustofluídicos, lo que mejora la entrega de biomoléculas a través de las membranas celulares28,29. Este protocolo describe la síntesis de microburbujas llenas de gas perfluorocarbono encapsuladas por una membrana catiónica de fosfolípidos. Como se describió anteriormente, esta formulación consiste en microburbujas principalmente entre 1-3 μm de diámetro30. La superficie cargada positivamente de las microburbujas los atrae hacia las membranas celulares cargadas negativamente, lo que aumenta la entrega molecular mediada por sonoporación cuando las microburbujas y las células están muy cerca. La concentración de microburbujas en la solución celular es un factor crítico que puede influir en la eficiencia de la entrega molecular y la viabilidad celular después del tratamiento acoustofluidic, y la concentración óptima de microburbujas puede ser específica para cada célula tipo 19. La concentración de microburbujas llenas de gas con una cáscara de lípidos puede disminuir con el tiempo después de la síntesis, por lo que se deben usar agentes de contraste de ultrasonido dentro de unas pocas horas después de la síntesis.

Demostramos la entrega de un compuesto fluorescente (fluoresceína) a las células de T humanas no activadas primarias usando el sistema acoustofluidic en este protocolo. Es importante tener en cuenta que el estado de activación de las células T humanas primarias puede afectar la eficiencia de la entrega molecular intracelular. Las propiedades de fluorescencia de la fluoresceína permiten la detección intracelular sensible con citometría de flujo, pero otros compuestos solubles también se pueden entregar en las células utilizando este sistema acoustofluidic. Por ejemplo, demostramos la entrega acoustofluidic de trehalosa en las células cancerosas humanas del pulmón. La administración acustofluídica de trehalosa en las células puede permitir una mayor recuperación después de un almacenamiento congelado y seco, lo que podría tener impactos significativos en una serie de aplicaciones biomédicas y de investigación 19.

La administración acostofluídica de otras biomoléculas, como proteínas o plásmidos de ADN, también es posible, aunque una limitación de este sistema es que la eficiencia de la entrega molecular puede ser menor para compuestos más grandes18,31. La optimización del caudal acoustofluidic, de las concentraciones de agentes del contraste del ultrasonido, de las concentraciones de la célula, y de los medios puede ser necesaria para la entrega de otras biomoléculas. Además, los parámetros óptimos pueden variar entre los diversos tipos de la célula debido a factores tales como diámetro de la célula, morfología, propiedades de la membrana, y fenotipo.

El sistema acoustofluidic descrito en este protocolo se puede ensamblar y funcionar fácilmente a un costo relativamente bajo. Adicionalmente, este sistema se puede personalizar para otras aplicaciones conectando otras fuentes de señal o transductores de ultrasonido para generar presiones de salida y frecuencias específicas32,33,34. Además, el sistema de bomba de jeringa descrito en este protocolo puede ser reemplazado por bombas peristálticas si se desea. A una velocidad de flujo de 50 mL/h, el tiempo de residencia de las células dentro del haz de ultrasonido a medida que pasan a través del canal acoustofluidic es de aproximadamente 1 s, pero este tiempo de residencia se puede modificar según sea necesario para aplicaciones específicas ajustando la tasa de flujo de fluido.

A diferencia de otras técnicas comunes de transfección, las biomoléculas se pueden entregar en las células en cuestión de minutos en lugar de horas y este sistema no requiere equipos especializados y costosos. Además, este sistema es compatible con una amplia gama de medios de cultivo celular de uso común u otros búferes. En resumen, este sistema acoustofluidic permite la entrega rápida de biomoléculas a las células, que pueden ser útiles para una amplia gama de aplicaciones de investigación.

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Disclosures

Los coautores MAM y JAK poseen la propiedad de DesiCorp, que puede beneficiarse financieramente de los productos relacionados con esta investigación.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado en parte por fondos de la National Science Foundation (#1827521, #1827521, #1450370) y los Institutos Nacionales de Salud (U01HL127518). Los servicios de fotolitografía fueron proporcionados por el Centro de Tecnología Micro/Nano de la Universidad de Louisville.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fabrication of Acoustofluidic Device
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT Ellsworth Adhesives 4019862 (SKU) https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/
Harris Uni-Core (2.5 mm) Electron Microscopy Sciences 69039-25
Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube - S (2/4 port) Darwin Microfluidics LVF-KPT-S-2 (SKU) https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port
Microscope Slide VWR 16004-430 https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium
trichlorosilane Gelest 105732-02-3 (Cas. No.) Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage. 
Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD) McMaster-Carr 5233K51 (Part #) https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/
Assembly of Acoustofluidic System
Arduino Uno Arduino 7630049200050 (Barcode) https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3
Preparation of Ultrasound Contrast Agents
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) Avanti Lipids 890703P-25mg (SKU) https://avantilipids.com/product/890703
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) Avanti Lipids 850365P-25mg (SKU) https://avantilipids.com/product/850365
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) Avanti Lipids 840465P-25mg (SKU) https://avantilipids.com/product/840465
APF-140HP (decafluorobutate gas) FlouroMed 355-25-9 (Cas No.) http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/
DB-338 Amalgamators  COXO https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/
polyoxyethylene 40 stearate  Sigma-Aldrich P3440-250G (SKU) https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en&region=US&gclid=
Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj
Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS
vID64X-1KbO3LUKGjVUwb
PDAaAqvOEALw_wcB
Q125 Sonicator Qsonica Q125-110 (Ref.) https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r
Preparation of Primarty T Cells
autoMACs running buffer Miltenyi Biotec 130-091-221 (Order No.) https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref
Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail)  Miltenyi Biotec 130-096-535 (Order No.) https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535
magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator) Miltenyi Biotec 130-092-545 (Order No.) https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545
Preparation of A549 Lung Cancer Cells
Trehalose Assay Kit  Megazyme K-TREH (Cat. No.) https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit
Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile) VWR 97063-702 (Cat. No.) https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile

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Montaje Y Operación De Un Dispositivo Acoustofluidic Para La Entrega Mejorada De Compuestos Moleculares A Las Células
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Centner, C. S., Murphy, E. M., Stamp, B. F., Priddy, M. C., Moore, J. T., Bates, P. J., Menze, M. A., Yaddanapudi, K., Kopechek, J. A. Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells. J. Vis. Exp. (167), e62035, doi:10.3791/62035 (2021).

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