Summary
Fenótipos de crescimento de leveduras são precisamente medidos através de imagens de lapso de tempo altamente paralelas de células imobilizadas crescendo em microcolônias. Simultaneamente, a tolerância ao estresse, a expressão proteica e a localização da proteína podem ser monitoradas, gerando conjuntos de dados integrados para estudar como as diferenças ambientais e genéticas, bem como a heterogeneidade de expressão genética entre as células isogênicas, modulam o crescimento.
Abstract
Medições precisas da heterogeneidade entre e dentro da tensão nas taxas de crescimento microbiano são essenciais para a compreensão de insumos genéticos e ambientais na tolerância ao estresse, patogenicidade e outros componentes-chave da aptidão. Este manuscrito descreve um ensaio baseado em microscópio que rastreia aproximadamente 105 microcolônias de Saccharomyces por experimento. Após a imagem automatizada de lapso de tempo de levedura imobilizada em uma placa multiwell, as taxas de crescimento de microcolonia são facilmente analisadas com software personalizado de análise de imagem. Para cada microcolonia, a expressão e a localização de proteínas fluorescentes e a sobrevivência do estresse agudo também podem ser monitoradas. Este ensaio permite uma estimativa precisa das taxas médias de crescimento das cepas, bem como uma medição abrangente da heterogeneidade no crescimento, expressão genética e tolerância ao estresse dentro das populações clonais.
Introduction
Fenótipos de crescimento contribuem criticamente para o condicionamento físico da levedura. A seleção natural pode distinguir eficientemente entre linhagens com taxas de crescimento diferidas pelo inverso do tamanho populacional efetivo, que pode exceder 108 indivíduos1. Além disso, a variabilidade das taxas de crescimento entre indivíduos dentro de uma população é um parâmetro evolutivamente relevante, pois pode servir de base para estratégias de sobrevivência como cobertura de apostas2,3,4,5,6. Portanto, ensaios que permitem medições altamente precisas de fenótipos de crescimento e suas distribuições são fundamentais para o estudo de microrganismos. O ensaio de crescimento da microcolônia descrito aqui pode gerar medições individuais de taxa de crescimento para ~105 microcolônias por experimento. Este ensaio fornece, portanto, um protocolo poderoso para estudar a genética evolutiva da levedura e a genômica. Ele se presta particularmente bem a testar como a variabilidade dentro de populações de células únicas geneticamente idênticas é gerada, mantida e contribui para a aptidão populacional7,8,9,10.
O método descrito aqui (Figura 1) usa imagens de campo brilhante de baixa ampliação capturadas periodicamente de células crescendo em mídia líquida em uma placa de fundo de vidro de 96 ou 384 poços para rastrear o crescimento em microcolônias. As células aderem à lectina concanavalina A, que reveste a parte inferior da placa de microscópio, e formam colônias bidimensionais. Como as microcolônias crescem em uma monocamada, a área de microcolonia é altamente correlacionada com o celular número7. Portanto, estimativas precisas da taxa de crescimento da microcolonia e do tempo de defasagem podem ser geradas com software personalizado de análise de imagem que rastreia a taxa de mudança da área de cada microcolonia. Além disso, a configuração experimental pode monitorar as abundâncias e até mesmo as localizações subcelulares de proteínas fluorescentes rotuladas expressas nessas microcolônias. O processamento a jusante de dados deste ensaio de crescimento de microcolonia pode ser alcançado por meio de análise personalizada ou por softwares de análise de imagem existentes, como Processing Images Easily (PIE)11, um algoritmo para reconhecimento robusto da área de colônia e análise de crescimento de alto rendimento a partir de imagens de baixa ampliação e brightfield, que está disponível via GitHub12.
Como as estimativas de taxa de crescimento derivadas do ensaio de crescimento da microcolonia são geradas a partir de um grande número de medições de uma única colônia, elas são extremamente precisas, com erros padrão várias ordens de magnitude menores do que as próprias estimativas para um experimento de tamanho razoável. Portanto, o poder do ensaio para detectar diferenças de taxa de crescimento entre diferentes genótipos, tratamentos ou condições ambientais é alto. O formato multiwell-plate permite que inúmeras combinações diferentes de ambiente e genótipo sejam comparadas em um único experimento. Se as cepas expressam com constitutivamente diferentes marcadores fluorescentes, elas podem ser misturadas no mesmo poço e distinguidas pela análise de imagem subsequente, o que poderia aumentar ainda mais a energia, permitindo a normalização dos dados bem-por-bem.
Figura 1: Representação esquemática do protocolo. Este protocolo segue dois passos principais, que são a preparação da placa experimental e a preparação das células para a imagem. A randomização das placas e o crescimento das células devem ser realizados antes e levando ao dia do experimento. A mistura repetida de células em cada etapa durante a diluição é imperativa nas etapas até o revestimento e, portanto, a preparação da placa experimental primeiro é recomendada para que ela esteja pronta para chapeamento imediatamente após a conclusão da diluição celular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocol
1. Preparação de placas aleatórias (antes do Dia do Experimento)
- Planeje as cepas e condições a serem testadas com o ensaio de crescimento. Neste ponto, atribuem aleatoriamente cepas e condições a qualquer poço.
NOTA: Ao considerar a configuração da placa, é aconselhável incluir mais de uma réplica por tensão e condição de crescimento em uma única placa para explicar o ruído bem relacionado nas medições. Consulte Discussão para obter mais detalhes. - Computacionalmente randomizar a localização de cada cepa e condição ambiental para réplicas de placas que serão executadas em dias diferentes.
- Cultivar todas as células que serão usadas no experimento para saturação em extrato de levedura-peptone-dextrose (YEPD; 2% glicose) médio em um agitador a 30 °C (ou qualquer outra temperatura apropriada).
- Crie as placas de estoque aleatórias manualmente ou com um robô de manuseio de líquidos. Adicione 10 μL das células saturadas designadas a cada poço de uma placa de cultura de tecido estéril do fundo U. Se várias cepas serão testadas em um único poço, não as combine neste momento; esta combinação será feita pouco antes das diluições celulares no dia do experimento para garantir que todas as cepas estejam nas concentrações corretas quando banhadas como células fundadoras da microcolonia.
- Adicione 10 μL de 30% de glicerol a cada poço de cada placa. Pipet para cima e para baixo para que as células e o glicerol se tornem bem misturados.
- Sele cada placa com uma tampa de papel alumínio e congele imediatamente a -70 °C até estar pronto para usar.
NOTA: É importante criar todas as placas aleatórias no mesmo dia, e congelá-las, para que as condições de pré-crescimento das células em cada placa tenham sido idênticas e não gerem variação técnica no ensaio de taxa de crescimento.
2. Pré-Crescimento da Levedura
NOTA: Normalmente, isso começa antes do dia do experimento e é altamente dependente da questão experimental. Consulte Discussão para obter detalhes.
- Retire uma placa de caldo (levedura de 10 μL, 10 μL glicerol por poço) do congelador -70 °C e adicione 180 μL da mídia a ser usada para o experimento. Se o experimento for realizado usando meios limitantes de nutrientes, não pré-cresça levedura para saturação na mídia limitante de nutrientes, pois a esporulação da levedura pode ocorrer. Em vez disso, pré-crescer em mídia não limitante.
- Cresça levedura enquanto treme a 30 °C. Considere se executar o ensaio começando com células em fase de registro ou em fase estacionária para determinar se a diluição das células várias vezes antes do experimento será necessária. Se as cepas ou condições de levedura no ensaio tiverem taxas de crescimento significativamente diferentes, então um período pré-crescimento de dois dias será necessário para que todas as condições diferentes cheguem à fase estacionária.
3. Configuração do microscópio
- Preparação da placa de microscópio
- Certifique-se de que a incubadora de microscópio está ligado e aquecendo a câmara de microscópio à temperatura de crescimento desejada para as condições experimentais. Para experimentos padrão usando células de saccharomyces cerevisiae, a incubadora deve aquecer a câmara de microscópio a 30 °C para garantir que as condições de crescimento das células estejam corretas durante o ensaio da taxa de crescimento.
- Higienize a bancada, pipetas e outras ferramentas com 70% de etanol. Recupere uma placa de microscópio e coloque-a no banco em cima de uma limpeza sem fiapos e estáticas.
NOTA: Nunca toque na parte inferior da placa do microscópio, mesmo com luvas, e sempre coloque a placa de microscópio em cima de uma limpeza sem fiapos e estáticas sempre que tocar em qualquer superfície. Isso evita que manchas ou arranhões impeçam as medições da taxa de crescimento uma vez que o experimento esteja sendo imagedo. - Descongele 5 mL de concanavalina 5x Uma solução, diluir para 1x com água e filtrar esterilizar através de uma seringa equipada com um filtro de 0,2-μm.
- O filtro esteriliza todos os outros líquidos que serão usados no ensaio com um filtro de 0,2 μm, incluindo mídia experimental, para remover quaisquer cristais ou detritos que possam ter se materializado nas soluções. A presença de cristais reduziria a qualidade das imagens de microscopia.
- Pipet 200 μL de concanavalina Uma solução em cada poço da placa de microscópio.
- Centrifugar a placa por 2 min a 411 x gravidade(g) com um lenço de fiapo e estático sob a placa, para garantir que a solução concanavalina Uma solução cobre uniformemente o fundo de cada poço e que não há bolhas de ar.
- Cubra a placa com a tampa e deixe-a sentada por 1-2 h. O tempo exato em que a placa é flexível, mas é importante ser consistente entre diferentes corridas do experimento.
- Remova toda a solução concanavalina Uma da placa por sucção ou descarregando-a à força na pia ou em um recipiente. Tenha cuidado para não tocar na parte de vidro da placa. É aceitável que algumas gotas de concanavalina uma solução permaneçam nos poços.
- Lave os poços da placa de microscópio adicionando 400 μL de água estéril. Remova a água como feito com a concanavalina A na etapa anterior. Não deixe a placa secar.
- Adicione imediatamente 185 μL de mídia de crescimento experimental na placa. 15 μL de células corretamente diluídas serão adicionadas a esta placa.
- Diluição celular de levedura
NOTA: As etapas abaixo descrevem uma diluição da levedura de uma cultura saturada (aproximadamente 108 células/mL) 400 vezes para alcançar uma concentração de 250.000 células/mL, 15 μL dos quais serão diluídos em 400 μL na placa de fundo de vidro, dando um número final de aproximadamente 4000 células por poço em uma placa de 96 poços. Se usar uma placa de 384 poços, o número final de células por poço deve ser de aproximadamente 700 e as diluições devem ser ajustadas em conformidade. Essa razão deve ser ajustada para células coletadas em fase de registro, crescendo em meios pré-crescimento mais ricos ou mais pobres, ou de diferentes cepas. A densidade final das células por poço deve ser reduzida ao executar o ensaio da taxa de crescimento por períodos de tempo superiores a 10 h.- Configure duas placas de cultura de 96 poços para diluições seriais: rotule como placa 1 e 2, e adicione 90 μL de mídia de crescimento experimental (ou seja, a mídia em que a levedura crescerá no microscópio) a cada placa de diluição serial.
NOTA: Independentemente da diluição final, pelo menos duas diluições seriais de células são recomendadas, em cada uma das quais um pequeno volume de levedura é pipetado em um volume maior de mídia experimental e, em seguida, um grande volume de mídia experimental é misturado vigorosamente com uma tubulação (como nas etapas 3.2.5 e 3.2.6 abaixo). - Recupere a placa de células do pré-crescimento e centrifugar a placa por 2 min a 411 x g.
NOTA: É muito importante não contaminar diferentes poços na placa. O objetivo desta centrifugação antes de remover a folha que cobre as placas é garantir que as gotículas cheias de leveduras de um poço não voem da folha e acabem em outros poços. Tenha cuidado para nunca inclinar ou agitar as placas para evitar que o fermento entre em contato com a folha cobrindo após a centrifugação. - Retire cuidadosamente a folha e resuspend as células, encanar vigorosamente as células com uma tubulação definida para aproximadamente metade do volume total da placa enquanto move a tubulação ao redor do poço para misturar. Verifique se todas as células foram resuspendidas do fundo dos poços.
- Se múltiplas cepas dentro de poços individuais forem usadas, as cepas devem ser misturadas neste momento na razão necessária para o experimento. Se uma cepa de referência for usada para gerar medições de taxa de crescimento, a razão de referência à cepa de teste deve ser de 1:1.
- Pipet 10 μL de levedura da mídia de crescimento para a placa de diluição 1. Adicione 100 μL de mídia de crescimento experimental a cada poço a um volume final de 200 μL por poço. Pipet para cima e para baixo vigorosamente.
- Pipet 10 μL de levedura da placa 1 para a placa 2. Adicione 100 μL de mídia de crescimento experimental a cada poço, e pipeta para cima e para baixo vigorosamente para misturar.
NOTA: Essas etapas de diluição são fundamentais para ajudar a separar os aglomerados de levedura que estão presos juntos no final do estágio pré-crescimento e garantir que aproximadamente o número igual de células de levedura acabe em cada poço. Ter um número consistente de levedura em cada poço ajuda a remover ruídos experimentais e vieses em medições de taxa de crescimento (ver Resultados Representativos).
- Configure duas placas de cultura de 96 poços para diluições seriais: rotule como placa 1 e 2, e adicione 90 μL de mídia de crescimento experimental (ou seja, a mídia em que a levedura crescerá no microscópio) a cada placa de diluição serial.
- Sonication
NOTA: A sônicação é opcional, e só precisa ser realizada para cepas de leveduras que tenham alta propensão a aderir umas às outras (por exemplo, algumas cepas selvagens). Para cepas de laboratório, a sônica geralmente não é necessária e pode ser ignorada procedendo à etapa 3.4.- Higienize uma cabeça sônica de 96 pinos com 70% de etanol colocando-a em uma placa de 96 poços cheia de 70% de etanol e seca com um lenço de fiapo e estático.
- Estabeleça um programa de sônica que seja suficientemente forte para quebrar células de levedura floculadas, mas não mate células ou cause respostas elevadas de estresse. Alguns testes podem ser necessários para identificar o melhor programa de sônica para um determinado experimento. O programa de sônica utilizado neste experimento é: amplitude = 10, tempo de processo = 10 s, pulse-on = 1 s, pulse-off = 1 s. Este programa exato provavelmente não é aplicável a todos os sonicadores, por isso os testes são sugeridos antes do dia do experimento.
- Misture o fermento na placa de diluição serial 2 mais uma vez, pipetando para cima e para baixo vigorosamente cinco vezes.
- Coloque a placa de diluição 2 na plataforma e fixe-a com os pinos do sonicator na suspensão da célula, mas não toque na parte inferior da placa. Execute o programa de sônica usando proteção auditiva apropriada.
- Após a ção do programa, limpe a cabeça do sonicator com 70% de etanol e depois com água, e depois prossiga imediatamente para a preparação da placa de microscópio para que as células não se desembrareça novamente.
- Prepare a placa para microscópio:
- Pipet 15 μL de levedura da placa de diluição serial 2 na placa de microscópio a um volume de 200 μL. Adicione 200 μL de mídia de crescimento experimental a cada poço a um volume final de 400 μL por poço, e pipet para cima e para baixo vigorosamente para misturar.
- Cubra a placa com uma membrana respirável. É importante selar bem a placa com esta membrana, por exemplo, usando um rolo de borracha.
- Para aderir as células de levedura à concanavalina A na superfície do vidro, centrifugar a placa com um lenço de fiapos e estáticos abaixo dele por 2 min a 411 x g.
- No microscópio, limpe a parte superior e inferior da placa com uma limpeza sem fiapos e estáticas, e sopre ar comprimido na placa para se livrar dos detritos.
- Coloque a placa sobre o microscópio, certificando-se de que está nivelado e que o poço A1 está no canto superior esquerdo.
4. Medições de taxa de crescimento da microscopia de lapso de tempo
NOTA: Durante a microscopia de lapso de tempo, as seguintes características são controladas por computador: x, y e z, persianas e filtros de fluorescência. Um sistema de foco automático baseado em hardware é ideal para evitar a deriva do avião focal durante a imagem de lapso de tempo. Alternativamente, um loop de foco automático baseado em software pode ser usado. Para manter a umidade na câmara de microscópio, é aconselhável manter um béquer com água purificada na câmara durante toda a duração do experimento.
- Crie uma lista de posições (x,y) para imagem, de modo que cada poço de placa de microscópio seja totalmente imagem. Evite imagens sobrepostas para que nenhuma célula seja analisada várias vezes.
- Imagem em brightfield com iluminação diascópica (DIA) em uma ampliação de 15x. Definir exposição a ~5 ms.
- Amplie a imagem digitalmente para que as células sejam claramente visíveis. Use os botões de foco para identificar o foco ideal para o experimento nos quatro poços no canto da placa e em um bem no centro da placa. Concentre-se de forma a obter o máximo contraste das células.
- Defina a posição z (ou posição de foco automático) para que o experimento seja uma média das posições de foco automático z identificadas para cada um desses poços. Se a placa do microscópio for bem feita e a parte inferior do vidro não tiver defeitos, as posições de foco ideais devem ser semelhantes para cada poço.
NOTA: Ao analisar imagens com o pipeline de análise de imagens Facilmente (PIE) do Pipeline de Análise de Imagens de Processamento11,12, é útil que as células fiquem ligeiramente fora de foco no microscópio para que haja uma borda escura fora da célula e um interior de cor clara, o que auxilia no reconhecimento preciso das colônias e estimativas de tamanho. - Se usar cepas fluorescentes, identifique os canais e as exposições com as quais a imagem, garantindo que nenhum pixel seja superexposto. Ao definir o tempo de exposição para canais fluorescentes, desligue o modo de "captura ao vivo" no microscópio para evitar expor as células à excitação da fluorescência por longos períodos de tempo, pois isso pode tanto fotoblear as células quanto causar estresse.
- Configure a aquisição de sequência de tempo para capturar imagens no intervalo de tempo desejado pelo tempo desejado.
- Executar o experimento.
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Representative Results
A novidade deste protocolo é que a taxa de crescimento pode ser calculada para células individuais dentro de uma população, rastreando seu crescimento em microcolônias através de imagens de lapso de tempo(Figura 2A). Como as microcolônias crescem por muitas horas de forma planar devido à presença de concanavalina A, suas áreas podem ser rastreadas ao longo do experimento, e um ajuste linear à mudança no tronco natural da área ao longo do tempo pode ser usado para calcular a taxa de crescimento de cada colônia individual observada 7,9,10,13. Diferenças na taxa de crescimento da microcolonia para células isogênicas individuais no mesmo ambiente são claramente registradas (Figuras 2A, 2B). O software de análise de imagem deve ser usado para rastrear automaticamente alterações no tamanho e fluorescência da microcolonia(Figura 2C); o rastreamento da colônia mostrado na Figura 2A foi feito usando PIE11,12.
Figura 2: Quantificação da taxa de crescimento e fluorescência em microcolônias de leveduras. (A) Uma porção de um único campo de imagem mostrando microcolônias crescendo no início do experimento, após 3h, e depois de 6h, mostrando o rastreamento de colônias usando o software de rastreamento da colônia PIE. Colônias estão visivelmente crescendo em uma monocamadas durante o experimento. (B) Alterar na ln(área) ao longo do tempo para as colônias rastreadas no painel A. Se existirem dados de ponto de tempo suficientes para uma colônia, sua taxa de crescimento e tempo de atraso pré-crescimento podem ser calculados. (C) Imagem mostrando intensidade de fluorescência GFP para as colônias no painel A, tirada após a parte de crescimento do experimento ser completa, com os contornos da colônia do ponto de tempo de 6h sobreposto. Aqui, Scw11P::GFP marca uma cepa de referência incluída em todos os poços experimentais. Calcular o nível de fluorescência GFP de cada colônia permite determinar quais colônias se originam da cepa de referência, e qual das cepas não-referenciais em cada poço. Cada barra de escala é de 50 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Normalmente, ~105 taxas de crescimento de microcolonia por experimento podem ser coletadas usando este ensaio. Esses dados podem ser usados para observar tanto as diferenças entre as cepas/condições de crescimento, quanto a variação entre microcolônias geneticamente idênticas cultivadas em uma condição compartilhada. Por exemplo, a Figura 3A mostra as distribuições de taxas de crescimento para ~12.000 colônias de uma linha de acumulação de mutação (MAH.44)14 e cepa de referência marcada por GFP cultivadas nos mesmos poços, com ambas as diferenças entre as cepas e a variabilidade interna de alta tensão visíveis. Na Figura 3B,são mostradas taxas de crescimento individual e estatísticas sumárias para 10 cepas de acumulação de mutação, emparelhadas com seus controles marcados por GFP in-well; os dados coletados permitem um cálculo preciso das pequenas diferenças médias de taxa de crescimento.
Figura 3. Grandes tamanhos amostrais de taxas de crescimento de microcolonia individuais permitem quantificação precisa da variação de crescimento entre tensão e entre tensões. (A) As distribuições de taxas de crescimento de ~12.000 colônias de duas cepas. Observe diferenças entre os modos das distribuições, bem como a longa cauda de colônias de crescimento lento presentes em cada uma delas; Este último só é detectável devido a medições individuais de microcolonia. (B) Distribuições de taxas de crescimento de microcolonia individual (pontos pretos) e estatísticas sumárias (boxplots mostrando mediana, bem como mais baixos e superiores 25% quantiles) para ~120.000 colônias de 11 cepas. Como em (A), cada cepa foi cultivada em um poço individual com uma cepa de referência marcada por GFP; os dados aqui mostrados representam 14 poços experimentais por par de cepas de referência MAH. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O ensaio de crescimento da microcolonia também pode ser usado para medir simultaneamente o crescimento e a expressão genética por meio de imagens tanto de canais de campo brilhante quanto de fluorescência. No experimento mostrado na Figura 2,a imagem fluorescente da expressão GFP após a conclusão da fase de crescimento do experimento permitiu a identificação de colônias pertencentes a uma cepa de referência marcada por GFP com fraca expressão de GFP(Figura 2C); no entanto, a medição das diferenças intercolonias nos níveis de expressão genética entre os pontos de tempo também é possível (ver Discussão).
Uma série de armadilhas comuns podem impedir a coleta de dados precisos da taxa de crescimento ou a análise correta desses dados. Um ponto-chave é que as medidas de taxa de crescimento dependem da formação de microcolônias imóveis e bidimensionais de células de leveduras fundadoras. Concanavalina A interage não covalentemente com polissacarídeos nas superfícies das células de levedura para imobilizar microcolônias. O vínculo entre células de concanavalina A e levedura pode ser revertido pela concorrência com açúcares ou por baixo pH15. Portanto, a mídia ou mídia fortemente ácida que contenham componentes de ligação de lectina, como extrato de levedura (LEVEM) ou ftalato (Edimburgo Minimal Media), não podem ser usados para este ensaio sem modificações na técnica de imobilização(Figura 4A).
Se o ensaio de crescimento estiver sendo conduzido com cepas de leveduras que floculam, a etapa opcional de sônicação deve ser usada para quebrar células agregadas para que células únicas sejam imobilizadas na placa de microscópio no início do experimento (ver Figura 4B para um exemplo de células floculante pós-plating se a etapa de sonicação for omitida). Quaisquer microcolônias fundadas por um conjunto de múltiplas células devem ser excluídas na análise a jusante, uma vez que as medidas de taxa de crescimento não são mais derivadas de uma única célula fundadora, e as células podem não estar crescendo em duas dimensões. Microcolônias que são fundadas por uma célula brotante são admissíveis. A formação de microcolônias bidimensionais é impedida por leveduras que floculam muito fortemente, mesmo que as colônias sejam fundadas por uma única célula, e, portanto, a capacidade de uma cepa de levedura crescer em uma única camada sobre concanavalina A deve ser testada antes de realizar um ensaio de crescimento.
Outro importante conjunto de considerações vem durante as etapas de planejamento e análise do experimento, ao determinar quantos pontos de tempo incluir na análise. Em primeiro lugar, é importante incluir dados para pontos de tempo suficientes em um período suficiente de tempo para acompanhar com precisão o crescimento: recomenda-se que os ensaios sejam executados de tal forma que a levedura tenha tempo para passar por ~5 duplicações, com pelo menos 10 pontos de tempo coletados durante esse período. No entanto, simplesmente incluir cada ponto de tempo coletado no cálculo da taxa de crescimento resultará em um viés que reduz artificialmente a taxa de crescimento para muitas colônias. Esse viés pode ocorrer quando as células passam por uma fase de defasagem antes de iniciar o crescimento(Figura 4C). A defasagem pré-crescimento das microcolônias é comum e varia entre condições experimentais e cepas9,13. Os métodos de análise experimental devem ser capazes de diferenciar os pontos de tempo no período de "crescimento ativo" da defasagem pré-crescimento; uma abordagem é usar um número pré-definido de pontos de tempo em uma janela e encontrar a janela que corresponde à maior taxa de crescimento(Figura 4C, linha sólida)11,13.
Finalmente, um dos passos mais críticos do ensaio de crescimento da microcolonia é a etapa de diluição de células de levedura. A concentração de células e a razão de diferentes genótipos dentro de poços de placas de microscópio devem ser cuidadosamente controladas. Para análise estatística é importante que os experimentos sejam equilibrados de forma que aproximadamente o número igual de células para cada genótipo e condição sejam testados e comparados16. Além disso, as taxas de crescimento úteis normalmente não podem ser medidas após a fusão das colônias vizinhas porque as taxas de crescimento das colônias individuais não podem mais ser discernidas; portanto, células mais densamente banhadas produzirão dados de crescimento de menos pontos de tempo(Figura 4D). É importante ressaltar que, se a densidade celular for alta ou desigual no início de um experimento, filtrar microcolônias fundidas excluirá desproporcionalmente microcolônias de crescimento mais rápido de análises a jusante, porque os produtores rápidos se fundirão com mais frequência do que os produtores lentos. Portanto, as medidas finais de crescimento serão tendenciosas para subsu populações de crescimento mais lento. Além disso, diferentes números de colônias podem ser filtradas para diferentes tratamentos, impedindo um experimento equilibrado. Recomenda-se aplacar cerca de 4000 células por poço em uma placa de 96 poços (ou 700 células por poço em uma placa de 384 poços). A mistura completa de tubulação ao longo da porção de diluição de leveduras do protocolo é imprescindível para garantir que o número correto de células esteja presente em cada poço, e que as células sejam uniformemente dispersas por todo o poço. Também é aconselhável remover quaisquer microcolônias da análise cujos centros estão dentro de ~25 diâmetros celulares uns dos outros.
Figura 4. Armadilhas experimentais. (A) Colônias crescendo em mídia YEPD, o que impede a vinculação eficiente das células à concanavalina A. O aparecimento de novas células longe de qualquer colônia (pontas de flecha), bem como o aparecimento de muitas células fora de foco na borda da colônia, são o resultado de células que não conseguem aderir à superfície do vidro e se afastam da colônia durante o crescimento. (B) Células de uma cepa floculante logo após o revestimento sem sônica; observe a presença de um grande número de aglomerados de múltiplas células (pontas de flecha), e células dentro dos aglomerados em diferentes planos focais. (C) Mudança na ln(área) ao longo do tempo para uma colônia com uma longa fase de defasagem. Observe que se todos os pontos de tempo forem usados para a estimativa da taxa de crescimento, a taxa de crescimento estimada está significativamente deprimida; uma medição precisa é produzida somente quando o subconjunto de pontos de tempo n (aqui n=6) que resulta na maior estimativa de taxa de crescimento é usado. (D) Células que foram banhadas muito densamente mostradas no início do experimento e após 7h de crescimento. As cores rastreiam colônias individuais até se fundirem com os vizinhos; aqui, pela marca de 7h, a maioria das colônias se fundiram, restando apenas um pequeno número de colônias individuais de crescimento lento. (O rastreamento de um pequeno subconjunto das colônias aqui mostrados é perdido por razões não relacionadas à fusão de colônias.) Cada barra de escala é de 50 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo descrito aqui é um ensaio versátil que permite que o crescimento celular e a expressão genética sejam monitorados simultaneamente ao nível de microcolônias individuais. A combinação dessas duas modalidades produz insights biológicos únicos. Por exemplo, trabalhos anteriores usaram este ensaio para mostrar uma correlação negativa entre a expressão do gene TSL1 e a taxa de crescimento da microcolonia em células selvagens isogênicas medindo simultaneamente7,10. Também é possível monitorar a relação entre a taxa de crescimento e a dinâmica de localização subcelular de proteínas fluorescentes marcadas com o ensaio descrito. Por exemplo, uma relação negativa entre a taxa de crescimento e a ocupação nuclear do fator de transcrição marcado por RFP Msn2 foi identificada por fluorescência de imagem nas células a cada minuto por 30 minutos antes de inicializar o ensaio de crescimento10. Por fim, este protocolo permite o monitoramento das respostas celulares a estresses ambientais e perturbações. Tratamentos como choque térmico podem ser administrados parcialmente através do ensaio de crescimento. Tais estudos revelaram, por exemplo, que células de crescimento lento expressando altos níveis de Tsl1 são mais tolerantes ao choque térmico 7,10.
Além das armadilhas comuns descritas na seção Resultados Representativos (Fig 4), vários fatores-chave devem ser considerados ao projetar um experimento de ensaio de crescimento. A variação fenotípica medida com o ensaio é afetada por múltiplos fatores, alguns dos quais são repetitivos e de interesse inerente, como genótipo ou ambiente, enquanto outros são resultado da variação técnica13. Portanto, a primeira consideração importante ao projetar um ensaio de microcolonia é realizar o experimento de forma a facilitar a separação dos efeitos de interesse dos efeitos decorrentes da variação técnica; chave para essa separação são randomizar tratamentos ou cepas em placas experimentais, e incluir controles em todos os experimentos. Métodos estatísticos adequados, como modelagem mista linear (LMM), devem ser aplicados aos dados após a coleta, para responder por diferentes fontes de variação na análise a jusante17,18.
Para empregar métodos estatísticos para separar a variação dos fenótipos de crescimento devido a variáveis experimentais de interesse da variação devido a fatores aleatórios, como efeitos em lote, é necessário executar múltiplos experimentos em dias diferentes e com locais de poços randomizados de genótipo e condições de crescimento. Além disso, para aumentar o poder do experimento para detectar diferenças de crescimento entre cepas ou condições de tratamento, também é importante incluir múltiplas réplicas de cada genótipo ou condição de crescimento testado, em uma única placa experimental, sempre que possível.
Uma das principais vantagens do ensaio de crescimento da microcolonia está na quantidade de dados que pode coletar: uma única placa experimental normalmente gera dados para ~105 microcolônias individuais, que são várias ordens de magnitude maior do que experimentos típicos usando dispositivos microfluidos em vez de placas multiwell. Software que rastreia automaticamente colônias e calcula dados relevantes (por exemplo, tempos de atraso, taxas de crescimento e intensidades fluorescentes médias) é fundamental para aproveitar ao máximo este ensaio. Este software deve não apenas identificar robustamente os limites das colônias e rastrear colônias através do tempo, mas também medir corretamente o crescimento em colônias com uma fase de defasagem13. Uma opção desenvolvida para este fim é o PIE, software de código aberto que rastreia colônias ao longo do tempo (incluindo a contabilização de turnos na posição de colônia), calcula as taxas de crescimento e permite a integração de dados de imagem fluorescente em medições experimentais11,12.
O ensaio de crescimento da microcolonia pode ser usado para obter insights sobre questões fundamentais relacionadas ao condicionamento e evolução da levedura, incluindo variabilidade de fenótipo de crescimento, mudanças em diferentes ambientes ou em resposta ao estresse, e a relação entre crescimento e expressão proteica ou localização subcelular. O ensaio tem sido amplamente utilizado em estudos de cepas laboratoriais e selvagens de S. cerevisiae7,9,10,13.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Naomi Ziv, Sasha Levy e Shuang Li por suas contribuições para o desenvolvimento deste protocolo, David Gresham por equipamentos compartilhados, e Marissa Knoll por ajuda na produção de vídeo. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde do Instituto R35GM118170.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Materials | |||
| 500 mL Bottletop Filter .22 µm PES Sterilizing, Low Protein Binding, w/45mm Neck | Fisher | CLS431154 | used to filter the media |
| BD Falcon*Tissue Culture Plates, microtest u-bottom | Fisher | 08-772-54 | 96-well culture tubes used to freeze cells, pre-grow cells, and dilutions |
| BD Syringes without Needle, 50 mL | Fisher | 13-689-8 | Used to filter the Concanavalin A |
| Costar Sterile Disposable Reagent Reservoirs | Fisher | 07-200-127 | reagent reservoirs used to pipette solutions with multichannel pipette |
| Costar Thermowell Aluminum Sealing Tape | Fisher | 07-200-684 | 96-well plate seal for pre-growth and freezing |
| lint and static free Kimwipes | Fisher | 06-666A | lint and static free wipes to keep microscope plate bottom free of debris and scratches |
| Nalgene Syringe Filters | ThermoFisher Scientific | 199-2020 | 0.2 μm pore size, 25 mm diameter; used to filter concanavalin A solution |
| Media Components | |||
| Minimal chemically defined media (MD; 2% glucose) | alternative microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy | ||
| Synthetic Complete Media (SC; 2% glucose) | microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy | ||
| Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium | cell growth prior to freezing down randomized plates | ||
| Microscopy Materials | |||
| Breathe-Easy sealing membrane | Millipore Sigma | Z380059-1PAK | breathable membranes used to seal plate during microscopy experiment. At this stage breathable membranes are recommended because they prevent condensation in the wells and allow for better microscopy images |
| Brooks 96-well flat clear glass bottom microscope plate | Dot Scientific | MGB096-1-2-LG-L | microscope plate |
| Concanavalin A from canavalia ensiformis (Jack Bean), lyophilized powder | Millipore Sigma | 45-C2010-1G | Make 5x concanavalin A solution and freeze 5ml of 5x concanavalin A in 50 mL conical tubes at -80 °C |
| Strains Used | |||
| MAH.5, MAH.96, MAH.52, MAH.66, MAH.11, MAH.58, MAH.135, MAH.15, MAH.44, MAH.132 | Haploid mutation accumulation strains in a laboratory background, described in Hall and Joseph 2010 | ||
| EP026.2A-2C | Progeny of the ancestral Hall and Joseph 2010 mutation accumulation strain, transformed with YFR054cΔ::Scw11P::GFP | ||
| Equipment | |||
| Misonix Sonicator S-4000 with 96-pin attachment | Sonicator https://www.labx.com/item/misonix-inc-s-4000-sonicator/4771281 | ||
| Nikon Eclipse Ti-E with Perfect Focus System | Inverted microscope with automated stage and autofocus system |
References
- Geiler-Samerotte, K. A., Hashimoto, T., Dion, M. F., Budnik, B. A., Airoldi, E. M., Drummond, D. A. Quantifying condition-dependent intracellular protein levels enables high-precision fitness estimates. PloS one. 8 (9), 75320 (2013).
- Kussell, E., Leibler, S. Phenotypic diversity, population growth, and information in fluctuating environments. Science. 309 (5743), 2075-2078 (2005).
- Thattai, M., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression in fluctuating environments. Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).
- King, O. D., Masel, J. The evolution of bet-hedging adaptations to rare scenarios. Theoretical population biology. 72 (4), 560-575 (2007).
- Acar, M., Mettetal, J. T., van Oudenaarden, A. Stochastic switching as a survival strategy in fluctuating environments. Nature genetics. 40 (4), 471-475 (2008).
- Avery, S. V. Microbial cell individuality and the underlying sources of heterogeneity. Nature reviews. Microbiology. 4 (8), 577-587 (2006).
- Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant. PLoS biology. 10 (5), 1001325 (2012).
- van Dijk, D., et al. Slow-growing cells within isogenic populations have increased RNA polymerase error rates and DNA damage. Nature communications. 6, 7972 (2015).
- Ziv, N., Shuster, B. M., Siegal, M. L., Gresham, D. Resolving the Complex Genetic Basis of Phenotypic Variation and Variability of Cellular Growth. Genetics. 206 (3), 1645-1657 (2017).
- Li, S., Giardina, D. M., Siegal, M. L. Control of nongenetic heterogeneity in growth rate and stress tolerance of Saccharomyces cerevisiae by cyclic AMP-regulated transcription factors. PLoS genetics. 14 (11), 1007744 (2018).
- Plavskin, Y., Li, S., Ziv, N., Levy, S. F., Siegal, M. L. Robust colony recognition for high-throughput growth analysis from suboptimal low-magnification brightfield micrographs. bioRxiv. , (2018).
- Siegallab. , Available from: http://github.com/Siegallab/PIE (2020).
- Ziv, N., Siegal, M. L., Gresham, D. Genetic and nongenetic determinants of cell growth variation assessed by high-throughput microscopy. Molecular biology and evolution. 30 (12), 2568-2578 (2013).
- Hall, D. W., Joseph, S. B. A high frequency of beneficial mutations across multiple fitness components in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 185 (4), 1397-1409 (2010).
- Saleemuddin, M., Husain, Q. Concanavalin A: a useful ligand for glycoenzyme immobilization--a review. Enzyme and microbial technology. 13 (4), 290-295 (1991).
- Geiler-Samerotte, K. A., Bauer, C. R., Li, S., Ziv, N., Gresham, D., Siegal, M. L. The details in the distributions: why and how to study phenotypic variability. Current opinion in biotechnology. 24 (4), 752-759 (2013).
- Nakagawa, S., Schielzeth, H. Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: a practical guide for biologists. Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 85 (4), 935-956 (2010).
- Bolker, J. A. Exemplary and surrogate models: two modes of representation in biology. Perspectives in biology and medicine. 52 (4), 485-499 (2009).
