Summary
يصف هذا البروتوكول مقاهات المراسل لدراسة تنظيم ترجمة الحمض النووي الريبي في البويضات المفردة أثناء النضج في المختبر.
Abstract
وقد وصفت جيدا الأحداث المرتبطة النضج النووي البويضات. ومع ذلك ، لا يعرف الكثير عن المسارات والعمليات الجزيئية التي تحدث في السيتوبلازم استعدادا للإخصاب واكتساب التوبيتوتين. أثناء نضوج البويضات، تعتمد التغيرات في التعبير الجيني حصريا على ترجمة وتدهور الحمض النووي الريبي الرسولي الأمومي (mRNAs) بدلا من النسخ. وبالتالي، يلعب تنفيذ البرنامج الترجمي دورا رئيسيا في تأسيس كفاءة نمو البويضات للحفاظ على نمو الجنين. هذه الورقة هي جزء من التركيز على تحديد برنامج ترجمة الحمض النووي الريبي الأمومي الذي يحدث أثناء النضج المتوسط وفي الانتقال من البويضات إلى الزيجوتي. في ورقة الأسلوب هذه، يتم تقديم استراتيجية لدراسة تنظيم ترجمة الحمض النووي الريبي المستهدف أثناء نضوج البويضات في المختبر. هنا، يتم دمج مراسل Ypet إلى المنطقة 3 'غير المترجمة (UTR) من جين الفائدة ومن ثم حقنها في البويضات جنبا إلى جنب مع ترميز ميرنا متعددة الأضلاع ل mCherry للسيطرة على حجم حقن. باستخدام المجهر الفاصل زمنيا لقياس تراكم المراسل، يتم حساب معدلات الترجمة في انتقالات مختلفة أثناء النضج الدموي البويضات. هنا، تم وصف بروتوكولات عزل البويضات وحقنها، وتسجيل الفاصل الزمني، وتحليل البيانات، وذلك باستخدام مراسل Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3'UTR كمثال.
Introduction
تخضع البويضات الثديية الكاملة النمو لتغيرات سريعة استعدادا للإخصاب واكتساب التريبوتين. وهذه التغيرات ضرورية للحفاظ على النمو الجنيني بعد الإخصاب. على الرغم من أن الأحداث المرتبطة بالنضج النووي موصوفة بشكل جيد نسبيا ، إلا أنه لا يعرف الكثير عن العمليات والمسارات الجزيئية في السيتوبلازم البويضات. خلال المراحل النهائية من نضوج البويضات ، تكون البويضات صامتة نسخيا ، ويعتمد التعبير الجيني اعتمادا كليا على ترجمة ميرناوتدهورها 1،2. تركيب البروتينات الحاسمة للكفاءة التنموية، لذلك، يعتمد على برنامج الترجمة في الوقت المناسب من الحمض النووي الريبي طويلة الأجل التي تم توليفها في وقت سابق خلال نمو البويضات1،3. كجزء من التركيز على تعريف هذا البرنامج من ترجمة مرنا الأم المنفذة خلال النضج المطيسي وفي الانتقال البويضات إلى الزيجوتي، تقدم هذه الورقة استراتيجية لدراسة تفعيل وقمع ترجمة الحمض النووي الريبي الأم المستهدفة في البويضات واحدة أثناء النضج المتوسطي في المختبر.
في هذه الطريقة، يتم استنساخ إطار القراءة المفتوحة YPet المنبع من UTR 3 'من نص الاهتمام. بعد ذلك، يتم حقن mRNAs ترميز هذا المراسل في البويضات جنبا إلى جنب مع mRNAs متعددة الأضلاع ترميز mCherry للسيطرة على حجم حقن. يتم قياس تراكم المراسل أثناء النضج الدموي في المختبر باستخدام المجهر الفاصل الزمني. يتم تسجيل تراكم البروتين الفلوري الأصفر (YFP) و mCherry في البويضات الفردية ، ويتم تصحيح إشارات YFP من خلال المستوى الهضب للمشيري المحقون. بعد الحصول على البيانات، يتم حساب معدلات الترجمة لفواصل زمنية مختلفة أثناء النضج الدموي في المختبر عن طريق حساب منحدر المنحنى الذي تم الحصول عليه عن طريق تركيب المنحنى.
ويوفر هذا النهج أداة للتأكد تجريبيا من التغيرات في ترجمة الرنانات الذاتية المختارة. وبالإضافة إلى ذلك، يسهل هذا الأسلوب توصيف العناصر التنظيمية التي تتحكم في الترجمة أثناء النضج البويضي من خلال التلاعب بالعناصر التنظيمية لرابطة الدول المستقلة من 3' UTR من mRNAs الهدف4،5،6. التلاعب في طول ذيل بولي (A) يسمح أيضا نظرة ثاقبة النشاط adenylase / deadenylase في البويضات5. يمكن استخدام موتاجينيسيس من عناصر رابطة الدول المستقلة بالنيابة أو RNA المناعي لدراسة التفاعلات مع cognate الحمض النووي الريبي ملزمة البروتينات6،7. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد المكونات الأساسية لبرنامج الترجمة التي تعتبر حاسمة لكفاءة نمو البويضات من خلال قياس الهدف 3' ترجمة UTR في النماذج المرتبطة بانخفاض جودة البويضات 8و9و10. تقدم ورقة الأسلوب هذه تجربة تمثيلية حيث تم حقن البويضات الناضحة لفئران C57/BL6 البالغة من العمر 21 يوما بالحقن الدقيق مع مراسل Ypet المنصهر في UTR 3 من IL-7. وقد وصفت الإعداد والبروتوكول لحقن البويضات، وتسجيل الفاصل الزمني، وتحليل البيانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية التي تشمل الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو (البروتوكول AN182026).
1. إعداد وسائل الإعلام
- إضافة جميع المكونات، كما هو موضح في الجدول 1،لجعل مجموعة البويضات الأساسية المتوسطة والمتوسطة نضوج البويضات. بالنسبة إلى وسيطة التجميع الأساسية، قم بتعيين درجة الحموضة إلى 7.4. لكل من جمع ونضوج المتوسطة, إضافة 3 ملغم / مل من الألبومين مصل البقري (جيش العمل الأميركي) و 1 ميكرومتر cilostamide في يوم الاستخدام.
2. إعداد ترميز مرنا لYpet-3 'UTR و mCherry
- الحصول على تسلسل UTR 3 من mRNAs من الفائدة.
ملاحظة: لهذه الدراسة، تم الحصول على تسلسل سابقا من الماوس البويضات cDNA. - تصميم التمهيديات لتضخيم الهدف 3 'UTRs من cDNA البويضات وأجزاء من ناقلات PCDNA 3.1 التي تحتوي على تسلسل الترميز Ypet، V5-epitope العلامة، والمروج T7.
- تضخيم باستخدام مجموعة بوليمرات الحمض النووي عالية الدقة. تشغيل البوليميراز سلسلة من ردود الفعل (PCR) المنتجات على هلام للتحقق مما إذا كانت شظايا لها الحجم الصحيح، وقطع العصابات، واستخراج الحمض النووي من هلام باستخدام عدة استخراج هلام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- دمج شظايا PCR إلى متجه باستخدام عدة استنساخ PCR.
ملاحظة: تم احتضان شظايا PCR على الجليد لمدة 4 ساعة لتسهيل عملية إعادة التركيب الأكثر كفاءة. وهذا يتعارض مع تعليمات الشركة المصنعة، التي توصي بفترة حضانة 45 دقيقة فقط. - شظايا PCR ترانسفيكت إلى المختصة 5-α Escherichia القولونية البكتيريا.
- يضاف المزيج والبلازميد إلى البكتيريا، ويحتضن على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- الحرارة صدمة المزيج وplasmid عن طريق وضع الخليط في حمام مائي في 42 درجة مئوية لمدة 45 ق، وتبرد على الفور على الجليد لمدة 3 دقائق.
- إضافة 500 ميكرولتر من مرق سوبر الأمثل مع قمع تقويض (SOC) المتوسطة واحتضان لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية.
- تدور أسفل في 7000 × غرام لمدة 2 دقيقة، وإزالة معظم supernatant. ريسوسبند ولوحة على لوحة لوريا مرق (LB) أجار مع المضادات الحيوية الاختيار المناسب.
ملاحظة: تم استخدام كاربينسيلين في هذه الدراسة. - حضانة بين عشية وضحاها في 37 °C. عزل المستعمرات عن طريق الضغط بخفة على طرف ماصة على واحدة من المستعمرات ووضعه في 3 مل من LB المتوسطة مع 100 ميكروغرام / مل من كاربينسيلين. حضانة لمدة 12-24 ساعة في 37 درجة مئوية.
- استخراج الحمض النووي للplasmids باستخدام عدة عزل الحمض النووي البلازميد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وتأكيد تسلسل عن طريق تسلسل الحمض النووي.
- لYpet / 3 ' UTR:
- إنتاج قالب PCR خطي للنسخ في المختبر. استخدام التمهيدي إلى الأمام المنبع من تسلسل Ypet والتمهيدي العكسي مع 20 بقايا الثيمين إضافية. انظر الجدول 2 لتسلسل Ypet/IL-7 3'UTR وتسلسلات التهيئة الأمامية والعكسية.
ملاحظة: هذه بقايا الثيمين إضافية سوف تضيف oligo(A) إلى مرنا الخطية بعد النسخ في المختبر . - في المختبر نسخ المنتج PCR باستخدام مجموعة نسخ T7 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- تنقية الحمض النووي الريبي التكميلي الناتج (cRNA) باستخدام عدة تنظيف النسخ وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- Elute cRNA المنقى في المياه الخالية من RNAse، وقياس التركيز وتقييم السلامة عن طريق إلكتروفورسيس agarose. يخزن عند -80 درجة مئوية.
- إنتاج قالب PCR خطي للنسخ في المختبر. استخدام التمهيدي إلى الأمام المنبع من تسلسل Ypet والتمهيدي العكسي مع 20 بقايا الثيمين إضافية. انظر الجدول 2 لتسلسل Ypet/IL-7 3'UTR وتسلسلات التهيئة الأمامية والعكسية.
- ل mCherry:
- إنتاج قالب PCR خطي للنسخ في المختبر باستخدام إنزيم تقييد عالي الدقة؛ استخدام تقييد إنزيم mfEI-HF إذا تكرار هذا المثال. هضم في عازل الهضم بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- تشغيل هلام لتنقية العينة، واستخراج الحمض النووي الخطي باستخدام عدة استخراج هلام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- في المختبر نسخ المنتج PCR باستخدام مجموعة نسخ T7 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- Polyadenylate الرنا (150-200 النيوكليوتيدات) باستخدام عدة المخلفات بولي (A) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- تنقية cRNA الناتجة باستخدام عدة تنظيف النسخ وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- Elute cRNA المنقى في المياه الخالية من RNAse، وقياس تركيزات مرنا، وتقييم سلامة الرسالة عن طريق الكهربائي هلام. يخزن عند -80 درجة مئوية.
3. إجراء تجريبي
ملاحظة: يتم إعطاء نظرة عامة تخطيطية للحقن المجهري البويضات والمجهر الفاصل الزمني اللاحق في الشكل 1.
- اليوم الأول
- حقن Intraperitoneally الفئران 21 يوما من العمر مع 5 وحدة IU من gonadotropin مصل فرس الحوامل لتعزيز نمو الجريبات إلى المرحلة الأنترال11.
- اليوم الثالث
- جمع البويضات
- الفئران التضحية 44-48 ح بعد فتيلة لجمع المبيضين، ووضعها في طبق بيتري البلاستيك مع المتوسطة جمع البويضات الأساسية.
- افتح بصيلات الأنترال بعناية عن طريق إجراء قطع صغير في جدار الجريب بإبرة 26 G. عزل البويضات المغلقة الركلس سليمة (COCs) مع عدة طبقات من خلايا الركامي باستخدام ماصة زجاجية تعمل بالفم.
- استخدام ماصة أصغر (أكبر قليلا من قطر البويضات)، وdenude ميكانيكيا COCs عن طريق الأنابيب المتكررة.
ملاحظة: بدلا من ذلك، قم بإجراء الحقن الدقيق على COCs سليمة. - باستخدام ماصة أكبر، يستنشق البويضات النضح ووضعها في طبق بيتري مع متوسط النضج تستكمل مع 1 ميكرومتر من مثبط فوسفوديستيراز، cilostamide، لمنع استئناف النضج الميوتي12. ضع الطبق في الحاضنة لمدة 2 ساعة للسماح للبويضات بالشفاء من الإجهاد الناجم عن عزل البويضات عن الجريبات.
- Oocyte حقن الصغرى
- إعداد الإبر الحقن عن طريق وضع 10 سم طويلة البوروسيليكات الزجاج أنبوب الشعرية في سحب الميكانيكية. للحقن الأمثل، ثني طرف الإبرة في زاوية 45 درجة باستخدام خيوط ساخنة.
- إعداد أطباق البوليسترين مع قطرات 20 ميكرولتر من المتوسطة جمع البويضات الأساسية، وتغطية قطرات مع الزيت المعدني الخفيف.
- إعداد مزيج مراسل بإضافة 12.5 ميكروغرام / μL Ypet - 3 'UTR و 12.5 ميكروغرام / μL mCherry. إعداد حجم أكبر وجعل aliquots للتجارب المستقبلية لضمان تركيزات مراسل مماثلة. تخزين هذه aliquots في -80 درجة مئوية. عند ذوبان الجليد، أول جهاز طرد مركزي وaliquot لمدة 2 دقيقة في 20،000 x ز،ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الجديد.
ملاحظة: سيمنع هذا الطرد المركزي إبرة الحقن من انسدادها بواسطة المجاميع المحتملة في مزيج المراسل. - تحميل إبرة الحقن عن طريق الشعيرات الدموية مع ما يقرب من 0.5 ميكرولتر من مزيج المراسل.
- وضع ماصة عقد وإبرة حقن محملة في أصحاب، والموقف في قطرة من البويضات جمع المتوسطة. يستنشق بعض من المتوسطة في ماصة عقد.
- فتح إبرة الحقن عن طريق التنصت بلطف ضد ماصة عقد.
- ضع البويضات في قطرة من وسيط التجميع الأساسي ، وحقن 5-10 pL من مزيج المراسل.
- احتضان البويضات في المتوسط النضج مع 1 ميكرومتر cilostamide لمدة 16 ساعة للسماح للإشارة mCherry إلى الهضبة.
- إعداد طبق بيتري التي سيتم استخدامها للمجهر الفاصل الزمني مع ما لا يقل عن اثنين من قطرات 20 ميكرولتر من متوسط النضج لكل مراسل حقن: قطرة واحدة مع 1 ميكرومتر cilostamide للسيطرة على البويضات البروبهاز الأول اعتقل وقطرات واحدة دون cilostamide للبويضات النضج. تغطية قطرات مع الزيت المعدني الخفيف ومكان في حاضنة.
- المجهر الفاصل الزمني
- بعد مرحلة ما قبل الحضانة، قم بإزالة البويضات المحقونة من الحاضنة، وغسلها أربع مرات في وسط النضج دون السيلوستاميد. الحفاظ على بعض البويضات في المتوسط النضج مع 1 ميكرومتر cilostamide كمجموعة مراقبة البويضات بروبهاز I-القبض.
- نقل البويضات المحقونة إلى قطرات كل منها على طبق المجهر الفاصل الزمني المعد مسبقا. الكتلة البويضات باستخدام ماصة زجاجية مغلقة (يمكن إعداد ماصة مغلقة عن طريق عقد غيض في لهب لبضع ثوان).
ملاحظة: تجميع البويضات يساعد على منع حركتهم أثناء التسجيل. - ضع الطبق تحت المجهر المجهز بنظام إضاءة الصمام الثنائي الباعث للضوء ومرحلة مزودة بمحرك مجهز بغرفة بيئية يتم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية و5٪ CO2. لتكرار هذه الدراسة، استخدم المعلمات التالية: مجموعة عوامل التصفية: مرآة ديكهروبيك YFP/CFP/mCherry 69008BS; قناة YFP (الإثارة (على هيئة): S500/20 × 49057؛ الانبعاثات (EM): D535/30 m 47281)، قناة mCherry (على: 580/25 × 49829؛ م: 632/60 م).
- أدخل الإعدادات المناسبة لتجربة الفاصل الزمني (راجع جدول المواد للبرنامج المستخدم في هذه الدراسة): انقر على التطبيقات | اكتساب متعدد الأبعاد. حدد علامة التبويب الرئيسية الأولى وحدد الفاصل الزمني، ومواضع المراحل المتعددة، والأطوال الموجية المتعددة.
- حدد علامة التبويب حفظ لإدخال الموقع الذي يجب حفظ التجربة فيه.
- حدد علامة التبويب Timelapse لإدخال عدد النقاط الزمنية والمدة والفاصل الزمني.
ملاحظة: تعتمد مدة تجربة الفاصل الزمني على الأنواع الحيوانية التي تمت دراستها ، حيث يختلف توقيت النضج الدموي بين الأنواع. في هذه التجربة مع البويضات الماوس، تم تسجيل البويضات كل 15 دقيقة لمدة 16 ساعة. - حدد مرحلةعلامة التبويب . قم بتشغيل brightfield وحدد موضع البويضات عن طريق فتح نافذة جديدة عن طريق تحديد الحصول على | الحصول على | عرض مباشر. مرة واحدة يتم تحديد موقع البويضات، والتحول مرة أخرى إلى نافذة اكتساب الأبعاد المتعددة، واضغط + لتعيين موقع البويضات.
- حدد علامات التبويب الأطوال الموجية، وتعيين 3 أطوال موجية مختلفة ل brightfield (التعرض 15 مللي ثانية) ، YFP (التعرض 150 مللي ثانية لYpet / IL7 3 'UTR) ، وmCherry (التعرض 75 مللي ثانية لYpet / IL7 3 ' UTR).
ملاحظة: ضبط التعرض لكل مراسل UTR Ypet/3 'استنادا إلى مستوى تراكم المراسل وحجم حقن. تأكد من أن إشارة YFP تقع في وسط نطاق الكشف في بداية التجربة لمنع التقليل من شأن أو التشبع في حالة تنشيط الترجمة. بالنسبة إلى mCherry، قم بضبط التعرض لكل دفعة من mCherry حيث تعتمد الإشارة على عدد النيوكليوتيدات الأدينينية التي تمت إضافتها أثناء إجراء تعدد الغدد. بسبب الاختلاف في كفاءة تعدد ال ملادين، استخدم نفس الدفعة من mCherry في تجارب مختلفة لإجراء مقارنة أفضل بين التجارب. - ابدأ تجربة الفاصل الزمني بالنقر على اكتساب. انظر الشكل 2 والملف التكميلي للحصول على مثال لتسجيل الفاصل الزمني في بويضة واحدة.
- تحليل ترجمة Ypet-3 'UTR
- لهذا التحليل (انظر جدول المواد للبرنامج المستخدم في هذه الدراسة) ، قم بإجراء قياسين للمنطقة لكل بويضة: البويضات نفسها انقر فوق منطقة القطع الناقص وتحيط بالبويضات - ومنطقة صغيرة قريبة من البويضات لاستخدامها في النقر على خلفية الطرح على منطقة مستطيلة.
ملاحظة: تأكد من عدم تحرك البويضات خارج المنطقة المحددة أثناء التسجيل الفاصل الزمني. إيلاء اهتمام خاص لوضع قياس المنطقة حول قذف الجسم القطبي، لأن هذا يسبب الحركة في البويضات، ويمكن أن تشوه التسجيل. - تصدير بيانات قياس المنطقة إلى جدول بيانات بالنقر أولا على فتح سجل ثم على تسجيل البيانات لتصدير برنامج تحليل البيانات.
- لكل بويضة فردية ولجميع النقاط الزمنية المقاسة، قم بطرح قياس منطقة الخلفية من قياس منطقة البويضات. القيام بذلك لأطوال موجية YFP و mCherry بشكل منفصل.
- تسجيل توقيت انهيار الحويكل الجرثومي (GVBD) وبث الجسم القطبي (PBE) للرجوع إليها في وقت لاحق.
ملاحظة: استبعاد البويضات الماوس maturing عندما يتجاوز GVBD 2 ساعة. - رسم YFP والتعبير mCherry مع مرور الوقت لكل البويضات للتحقق من القيم المتطرفة.
ملاحظة: يجب أن يكون هذا منحنى سلس، إذا لم يكن هذا قد يشير إلى أن البويضات انتقلت أثناء التسجيل. - لكل البويضات الفردية، حساب متوسط التعبير mCherry لآخر عشر نقاط زمنية من التسجيل. لكل نقطة زمنية، قم بتقسيم تعبير YFP على متوسط التعبير mCherry لتصحيح الحجم المحقون للحصول على نسبة YFP/mCherry في كل نقطة زمنية لكل بويضة فردية.
- حساب معدلات الترجمة لفترة زمنية محددة عن طريق تركيب المنحدر من منحنى الانحدار الخطي. تقييم الفروق في معدلات الترجمة باستخدام الاستدلال الإحصائي.
- لهذا التحليل (انظر جدول المواد للبرنامج المستخدم في هذه الدراسة) ، قم بإجراء قياسين للمنطقة لكل بويضة: البويضات نفسها انقر فوق منطقة القطع الناقص وتحيط بالبويضات - ومنطقة صغيرة قريبة من البويضات لاستخدامها في النقر على خلفية الطرح على منطقة مستطيلة.
- جمع البويضات
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم حقن البويضات التي تم القبض عليها من قبل Denuded prophase I لفئران C57/BL6 البالغة من العمر 21 يوما بمزيج مراسل يحتوي على ترميز الحمض النووي الريبي لمراسل Ypet المنصهر في UTR 3 من IL-7 و mRNA ترميز mCherry. تم تسجيل تعبير YFP و mCherry في 39 بويضة ، منها 30 نضجت ، وألقي القبض على 9 في prophase I كتحكم سلبي. تم استبعاد ثلاث بويضات ناضجة للتحليل لأنها إما تأخرت GVBD (N = 2) أو انتقلت في الطبق أثناء التسجيل (N = 1). الشكل 3 يظهر mCherry وتعبير YFP في prophase I والبويضات الناضجة. يظهر الشكل 4 تعبير YFP عن البويضات الناضجة التي تم تصحيحها لتعبير mCherry الهضب (متوسط تعبير mCherry في آخر 10 نقاط زمنية) لتصحيح الحجم المحقون. تم قياس معدلات الترجمة للمراسل من خلال منحنى المناسب (الانحدار الخطي) قيم YFP / mCherry في prophase I وفي البويضات النضج خلال أول 0-2 ساعة أو 8-10 ساعة بعد الافراج عن cilostamide (الشكل 5A). ولا يتبع تراكم المراسل نمطا خطيا، كما هو مبين في الفرق الكبير في معدلات الترجمة بين 0-2 ساعة و8-10 ساعة بعد إطلاق السيلوستاميد (p<0.0001؛ الشكل 5ب). لذلك، تشير هذه النتائج إلى تنشيط ترجمة IL-7 أثناء النضج الدموي البويضات.
الشكل 1:نظرة عامة تخطيطية للإجراء التجريبي. Oligoadenylated Ypet/3'UTR وrRNA متعددة الأضلاع ترميز mCherry يتم حقنها بشكل صغير في البويضات الناضحة من الفئران C57/BL6 البالغ من العمر 21 يوما. يتم احتضان البويضات مسبقا لمدة 16 ساعة في السيلوستاميد الذي يحتوي على وسيط النضج للسماح للإشارة mCherry بالوصول إلى الهضبة. بعد مرحلة ما قبل الحضانة ، يتم بدء تسجيل الفاصل الزمني حيث يتم الاحتفاظ بالبويضات إما في المتوسط مع cilostamide لإنشاء مجموعة تحكم تم القبض عليها من قبل prophase I أو يتم إطلاقها في وسط خال من السيلوستاميد حتى ينضج. المختصرات: UTR = منطقة غير مترجمة؛ YFP = بروتين الفلورسنت الأصفر. fw التمهيدي = التمهيدي الأمامي؛ rev التمهيدي = التمهيدي العكسي; أمبير = مقاومة أمبيسلين; polyA = بوليدينيل; أوليغوا = أوليغوادنيل; GV = الحويول الجرثومي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مثال على تسجيل واحد البويضات الفاصل الزمني. برايتفيلد، YFP، وتسجيلات mCherry من البويضات واحدة حقن مع mRNAs ترميز Ypet/Interleukin-7 3 'UTR وmCherry polyadenylated في prophase I، MI (6 ساعة بعد الافراج عن cilostamide)، وMII (15 ساعة بعد الافراج عن cilostamide). شريط المقياس = 25 ميكرومتر. المختصرات: YFP = بروتين فلوري أصفر. GV = الحويول الجرثومي؛ MI = ميتافيزي I; MII = ميتافيزي الثاني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: إشارات YFP و mCherry المسجلة بواسطة المجهر الفاصل الزمني. YFP وإشارات mCherry من البويضات حقن مع oligoadenylated Ypet/IL7 3 'UTR وrRNA متعددة الأضلاع ترميز mCherry. تم الاحتفاظ البويضات إما في المتوسط مع cilostamide لتوليد مجموعة مراقبة بروبهاز I-القبض (N = 9) أو أفرج عنه في وسط خال من السيلوستاميد للسماح للنضوج (N = 30). البيانات هي قياسات البويضات الفردية. الاختصارات: IL-7 = إنترلوكين-7; YFP = بروتين الفلورسنت الأصفر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: إشارة YFP تصحيحها لمستوى mCherry حقن المشترك. تم تصحيح إشارات YFP من البويضات التي تم القبض عليها ونضجها من أجل الحجم المحقون عن طريق تقسيم إشارة YFP على متوسط إشارة mCherry لآخر 10 نقاط زمنية. الفردية YFP /mCherry نسب ل (أ) prophase I-القبض على البويضات و (ب) البويضات النضج ويعني ± خطأ قياسي من متوسط نسب YFP / mCherry من (C) prophase I-arrested و (D) تنضج البويضات. المختصرات: YFP = بروتين فلوري أصفر. GVBD = انهيار الحويكل الجرثومي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: معدلات الترجمة المحسوبة في 0-2 ساعة و 8-10 ساعة من النضج. (أ) إشارات البروتين الفلوري الأصفر (YFP) من البويضات الفردية تصحيحها ل mCherry (YFP / mCherry) في 0-2 ساعة أو 8-0 10 ح بعد إطلاق cilostamide و (ب) معدلات الترجمة (متوسط ± خطأ قياسي من المتوسط) حسب منحنى المناسب (الانحدار الخطي) قيم YFP / mCherry في 0-2 ساعة و 8-10 ساعة بعد الافراج cilostamide. تم تحليل البيانات باستخدام اختبار t ذو الذيلين غير المدفوع. *ص < 0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6:مثال على قمع الترجمة: Oosp2. إعادة تحليل البيانات من تجربة حيث تم حقن البويضات مع Ypet-Oosp2 3′ UTR وتعدد الأضلاع مرنا ترميز mCherry. تم تصحيح إشارات YFP من البروبهاز I-القبض (N = 63) والبويضات الناضجة (N = 72) لحجم حقن بقسمة إشارة YFP على متوسط إشارة mCherry من آخر 10 نقاط زمنية. تم الحصول على بيانات التعبير YFP و mCherry باستخدام مصباح Xenon Arc ، على عكس تجربة IL-7 حيث تم استخدام مصدر ضوء LED. تمثل البيانات متوسط الخطأ المعياري ± لمؤشر قياسات البويضات الفردية وقد نشرت سابقا في Luong et al. 5.الاختصارات: YFP = بروتين الفلورسنت الأصفر. Oosp2 = البويضات تفرز البروتين 2; UTR = المنطقة غير المترجمة؛ IL-7 = إنترلوكين-7; LED = الصمام الثنائي الباعث للضوء؛ GVBD = انهيار الحويكل الجرثومي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: تأثير الحقن الدقيق والتعرض للفلور على توقيت GVBD و PBE. توقيت GVBD و PBE من البويضات التي تم حقنها بشكل دقيق وتعرضت للفلورسينس (حقن)، أو غير حقنها وعدم التعرض للفلورسينس (غير المحقون). البيانات هي قياسات البويضات الفردية. تم تحليل البيانات باستخدام غير مدفوعة اثنين الذيل تياختبار. *ع <0.001. المختصرات: GVBD = انهيار الحوي فيسينال الجرثومية; PBE = قذف الجسم القطبي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| وسيط جمع البويضات الأساسي | ||
| مكون | ل500 مل | |
| HEPES تعديل الحد الأدنى من النسر المتوسط الأساسية | 7.1 غرام | |
| بيكربونات الصوديوم | 252 ملغ | |
| بيروفات الصوديوم | 1.15 مل | |
| البنسلين/ستريبتومايسين 100x | 5 مل | |
| المياه المقطرة فائقة البور (Invitrogen، 10977-015) | حتى 500 مل | |
| متوسطة النضج | ||
| مكون | ل500 مل | |
| MEM ألفا 1x | حتى 500 مل | |
| بيروفات الصوديوم | 1.15 مل | |
| البنسلين/ستريبتومايسين 100x | 5 مل | |
الجدول 1: إعداد وسائط الإعلام. قائمة المكونات التي تحتاج إلى إضافة لإعداد مجموعة البويضات الأساسية المتوسطة والمتوسطة نضوج البويضات.
| تسلسل | |||||
| Ypet / إنترلوكين -7 3 'UTR | غاغاكاتكاتكاتغكاتكاتكتاكتاغاتاكاتاتاكاتاكتاكاغ غاتاغتاجكت غاتاكاغاتغاتكاغاتكاغاتغا أغاككتجتتكاكغتكاتكاتكغغكاتغكغغاكغاغاكغتك أكاغتكاغغغاغاغكغغغغاكاتكاكات أجكتغكتغجتغاكاتاكاغكاتغكغكاتغغج جاكاتغ جي جي سيتاكغكغكتكتكتكغتكاغاكاكاكاغاكاغاكتكتكا أغاغاككاتكاتكاغاغغاغغاغاغاغاغاكاتكاغاغاكاكا CTACAAGACCCGCCGAGGAGAGTGATGAGGGCGACTCTCTCTCTCTCTCT أغكاتكاتجيكتكاغاغاغاكاكاكاتكغغكاغغاكاكتاكاكاكاك أكاكاجاكجتاكاتاكاغسكاغاكاتاكاجاكاكتاكاكتاكاغاغات كجاكااكاتاكاغاغاكغكغكغكتاجكاتغكاتاكاكاغاغاكاكاتشيك كاتكغكغاكغكاتغكتغكاتغكوجاكاكاتكاتكاتغاكاتاكاغاغكوغككتغ TTCAAGGACCACACGاغاغغاكاكاتغكتغاتغاتGACCGCCCC GGCATCACCGAGGGCATGAGCTATAغاغاكتاتCTGAGTAGCCCTCTAA CCCTCTCCTCGGTCTغاتكاتاكغتكجاتكات كاتكاتاكاتاكاتاكاتاغاك أتاجتاكاكاكاتاكاغاكتاتكات كاتاتاتكتغاغاكتكاتكاج أجاتشتغغاتغاتكاتككتغاتاكاتاكاجاجكاغاغاغاكتاكاغتاجتاتغاتغ أغاتغاغاغاغاغااتغاغاغاغككتغككتغك تغتكاتاكاكاتاكاتاغاتاتاكاتاكا كاتاكاتاكاتشتغاتااتغاتكاتكاتكاتكاكتغاكتاتغاتاكاتغات تاكواكاغاغاتاكاتاكاغاغاتغاتاغاتاغاتكاكتشتكتاتكاتكاتك أاتغاغاتجاتجاتاكاتغاتغاتغاكاتغاكاتغ أكتغاغاتاكتغغكاتكاتغاتغاغاتااتكاتغاغاتكتاغا أغاكاغااغاغاكتاكاكاكاتاغاتاتاكاتاكاتاتاغاغاتاتاكا كاتاكتاكاتاغاغاتاوتاغاكتات تاكاغاغاكتاغاتاكتاتا تيتكاتغاتاغاتاتاغاتاغاتاغاكتاتاكتات TGGCATTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT أتكتاتاكاتاكتاتغاكتغاتاغتغتكتكتاتوتاتااتغاكتاتاك تغتكاغتكتاكتاكتاغاغتاتكاتغكتغكاتكاتاتغاك أتاتكتاكاساكاككاكجتاتاغاتاغاغاغاغاكاتاكتاغاغاغا أكاكتاتكاتشتغتاغتاغكاتاغاغا كاتاتاغاتاكاتاكاتاكتاتشتاتاغاكتاتاغاكتاتاكاكتاتاكاتاكتاتشاكتاتاكتات GTATATGCCTCTCTATATATTTTTGTAGCTCTCTCTCCCC تاتغاغااغاساكاتا تغتاغاغاتاكتغاتاغجتجتغاكتاتغاكتكتكت ستات تيكاجكاتجاجغاغاتكاتكتاكتاتكغجتاتغكتككاتكاك أتغكتاتجتغتاجتاجكاتككتاتشاتاكاكتاتاتCTACTCAGTGG تاكاغاتاغغاتاتاكاتاكاتاغاغااكاتاوتاغتغتات كاتكاتاتاكات سكيفاكاغااكاكتكتاكاكتكتجتغاكاتاتاكاتاغاكاتكاتغاكتاتغاتاكتاتغاتاكتغكت تكغاتاكتكتاغاتاتاكاتكاتيكتاكتاكتجاجتجاجتشتشتاكتغاغاكتاجاتاغاتاغغستا أغكشيتاغتاجاغاكتغاغاكاتكاتكاتغاكتاتغاتاوتاكتاتاكتاغاتغات غجكتاتاكاتااتغاتاكاتاتغاتغاتغاتاغاغاتااتاتاتات |
||||
| التمهيدي الأمامي | غاغاكاككتاك | ||||
| التمهيدي العكسي | تيتتTTTTTTTTTTTTTTAATATاتكتاتغ CCAAAATC |
||||
الجدول 2: مثال على تسلسل المراسل والتسلسل التمهيدي لمراسل YFP/IL7 3'UTR وتسلسل التهيئة الأمامية والعكسية التي تم استخدامها لإنتاج قالب PCR خطي للنسخ في المختبر.
ملف تكميلي: بروتين الفلورسنت الأصفر(YFP) وتسجيل الفاصل الزمني mCherry. YFP و mCherry تسجيلات الفاصل الزمني للبويضة واحدة حقن مع mRNAs ترميز Ypet / Interleukin-7 3 'UTR و mCherry polyadenylated. قناة YFP (على: S500/20 × 49057; إم: D535/30 م 47281), قناة mCherry (على السف: 580/25 × 49829; م: 632/60 م). تم تسجيل البويضات كل 15 دقيقة لمدة 16 ساعة (7 إطارات / ثانية). الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تصف الطريقة المقدمة استراتيجية لدراسة تنشيط وقمع ترجمة الحمض النووي الريبي المستهدف في التحولات المختلفة أثناء النضج الدموي في المختبر. IL-7، تم اختيار السيتوكين الصادر عن البويضات التي قد تشارك في الاتصالات الخلية البويضات-الركامية8،13،لغرض وصف هذه الطريقة. ومن المعروف IL-7 أن تترجم على نحو متزايد خلال نضوج البويضات8 ويسمح لتصور جيد للتنشيط الترجمة باستخدام هذه الطريقة. ومع ذلك، إذا حدثت الترجمة بمعدل ثابت طوال التجربة، فإن تراكم المراسل سيتبع نمطا خطيا، وستكون معدلات الترجمة في بداية التجربة ونهايتيها متشابهة. يمكن التحقق من هذا الاستنتاج عن طريق الخير من صالح (R) من الانحدار الخطي من خلال الفاصل الزمني تسجيل كامل. القمع في ترجمة المراسلين سيقدم نفسه على أنه ثبات لإشارة YFP.
مثال على القمع من ترجمة UTR 3 ، يمكن العثور عليها في دراسة Luongوآخرون. 5, حيث تقرير المؤلفين قمع البروتين Oocyte يفرز 2 (Oosp2) خلال النضج الدموي. وقد أعيد تحليل هذه البيانات وتظهر في الشكل 6. تظهر البويضات الناضجة استقراء إشارة YFP ، مما يشير إلى قمع الترجمة ، في حين تتبع مجموعة التحكم التي اعتقلت prophase I نمطا خطيا من تراكم المراسل ، مما يشير إلى معدلات ترجمة مماثلة في بداية ونهاية التجربة. عند دراسة قمع الترجمة ، من المهم بشكل خاص تضمين مجموعة مراقبة تم القبض عليها من قبل prophase I لضمان عدم تفسير استقرار إشارة YPF بانخفاض جودة البويضات بسبب ظروف الثقافة السيئة ، مما يؤكد صلاحية البويضات. يمكن التحقق من صحة تراكم المراسل عن طريق النسخ العكسي الكمي PCR باستخدام التمهيديات ل YFP أو عن طريق النشاف الغربي من خلال الاستفادة من علامة V5-epitope المدرجة في المراسل في هذا البروتوكول.
قد لا يكون تحديد إشارة YFP راجعا فقط إلى القمع المنظم بنشاط للترجمة ، ولكن يمكن تفسيره أيضا بتدهور المراسل أثناء التقدم الدموي البويضات. وهذا قد يعكس زعزعة استقرار الحمض النووي الريبي الداخلي، وهو أمر ضروري للانتقال إلى التعبير الجينوم الجنيني14،15،16. ويمكن التحقق من هذا الاحتمال عن طريق قياس مستويات النص الجيني المستهدف في مرحلة البروبهاز الأول مقابل مرحلة ميتافاز الثاني لتأكيد استقرار الرناس. عند إعداد البويضات cDNA، فمن الأفضل استخدام عشوائي سداسية فتيلة على أوليغو دي تي فتيلة. الطريقة الأخيرة تقدم اختلافات واضحة في مستويات النص الجيني التي قد تعكس الاختلافات في طول البولي (A) من هذه النصوص بدلا من الاختلافات الفعلية في مستويات النص7.
هناك عدة طرق لدراسة الجينوم على نطاق ترجمة ميرنا الذاتية في البويضات الماوس. وتشمل هذه الأساليب التنميط المتعدد7،17،18 وريبتاغ / RNA - Seq5،19،20. التنميط ريبوسوم هو طريقة أخرى لدراسة ترجمة الجينوم على نطاق واسع التي تم استخدامها في الخميرة، وهو كائن حي نموذج آخر يستخدم لدراسة meiosis21،22. ومع ذلك، تتطلب هذه التحليلات على نطاق الجينوم لدراسة ترجمة الحمض النووي الريبي في الماوس استخدام 150-200 بويضة لكل عينة في حين أن عدد البويضات المتاحة للتحليل عادة ما يكون محدودا. إن المقايسة أحادية البويضات الموصوفة هنا لتقييم ترجمة 3'UTR من الحمض النووي الريبي المستهدف تكمل التحليلات على نطاق الجينوم للترجمة ، لأنها تسمح بتحديد خصائص عناصر UTR 3 التي تنظم برنامج الترجمة أثناءالنضجالدموي الدموي 4و5و6. في الماضي، استخدمت المقايسات المستندة إلى لوسيفيراز لتقييم ترجمة 3'UTR من mRNAs الهدف10،20،23 كما هو أسلوب حساس جدا يتطلب سوى عدد قليل من البويضات لكل عينة. ومع ذلك ، فإن البويضات تحتاج إلى أن يتم lysed للكشف عن كمية لوسيفيراز في عينة.
وقد استخدمت آخرون 3 'UTR / الأخضر البروتين الفلوري (GFP) مراسل لتقييم تراكم GFP في البويضات الماوسالحية 4. ومع ذلك، في هذه التجارب، تم استخدام نقطتين زمنيتين فقط: بداية الحضانة (البروبهاز الأول) ونهاية الحضانة (ميتافاز الثاني). وهذا يقلل إلى حد كبير من قوة القياسات ويزيد من احتمال حدوث أخطاء. توفر البيانات الحركية قياسات دقيقة استنادا إلى المعدلات (نقاط متعددة) وتحدد بدقة الوقت الذي يحدث فيه التنشيط أو القمع الترجمي. وبالإضافة إلى ذلك، لا يمكن تقييم قمع الترجمة في هذه النقاط الزمنية الوحيدة، مما قد يؤدي إلى استنتاج غير دقيق. لذلك، تم تعديل هذه الطريقة عن طريق تطبيق المجهر الفاصل الزمني لتقييم Ypet/3' تراكم مراسل UTR في جميع أنحاء النضج في المختبر من البويضات الماوس5،6،9. باستخدام هذه الاستراتيجية، من الممكن دراسة الترجمة في التحولات المختلفة أثناء نضوج البويضات.
هناك العديد من الجوانب الهامة حول هذا الأسلوب للنظر. أولا، يشمل المراسلون المستخدمون ذيل أوليغو (A) الذي يقلل إغفاله بشكل كبير من تراكم المراسلين. قد يكون هذا بسبب كل من انخفاض الترجمة وكذلك مراسل مزعزعة الاستقرارRNA 24,25. خلال فترة ما قبل الحضانة في prophase الأول ، ترجمة مسبار oligoadenylated يعدل لتعكس معدل ترجمة ميرناالذاتية 5. ثانيا، من المهم أن ندرك أن زيادة في عدد التسجيلات أو مدة التعرض للفلورقد تحفز السمية الضوئية وبالتالي إضعاف جودة البويضات. على الرغم من أن التجربة الحالية اعتمدت فترات زمنية 15 دقيقة، يمكن خفض معدل أخذ العينات عندما يجب استخدام التعرض الفلوري العالي في حالة انخفاض التعبير عن المراسل.
للحد من كمية السمية الضوئية ، تم استخدام مصدر ضوء LED بارد ، مما يتطلب إثارة أقصر26. لتقييم الآثار المحتملة للسمية الضوئية في البويضات، تمت مقارنة توقيت GVBD و PBE في البويضات التي كانت إما حقن صغيرة وتعرضت للفلورسينس أو لم يتم حقنها وعدم التعرض للفلورسينس. ووجد أن الجمع بين الحقن الدقيق والتعرض للفلورسين يؤخر قليلا GVBD (p<0.001)، في حين كان توقيت PBE مماثلا(الشكل 7).
وقد استخدمت هذه الطريقة لدراسة العناصر التنظيمية الترجمية من UTR 3 'خلال النضج الدموي في المختبر. وبالمثل، فإنه يمكن أيضا أن تستخدم لدراسة وظيفية 5 'UTR العناصر الأساسية لتنظيم الترجمة أو لدراسة الترجمة أثناء الإخصاب البويضات في المختبر . على الرغم من أن هذه الطريقة قد طبقت على البويضات البشرية والفأرة ، إلا أنها تنطبق أيضا على الأنواع الحيوانية الأخرى. لأن هذا المقايسة المراسل يتم إجراؤها في البويضات واحدة، وهي مناسبة بشكل خاص للاستخدام في الأنواع أحادية الإباضة التي يكون فيها عدد البويضات المتاحة للتحليل محدودة. بدلا من استخدام البويضات الناضحة ، هناك تطبيق آخر لهذه التقنية هو حقن المراسل في البويضات المغلقة بالركاز ، حيث تلعب خلايا الركامية دورا رئيسيا في تنظيم البرنامج الترجمي8و10و27. ومع ذلك ، ينبغي أن يؤخذ في الاعتبار أن البويضات المغلقة الركامية هي أكثر عرضة للابتعاد عن مستوى التسجيل أثناء التجربة بالمقارنة مع البويضات الناضحة بسبب حركة خلايا الركاز أثناء توسع COC. قد يؤدي هذا إلى نسبة أكبر من البويضات التي يجب استبعادها من التحليل. في المستقبل، يمكن استخدام برنامج تتبع الخلايا القادر على تتبع مواقع x و y و z للبويضات في القطيرات، مما قد يحل هذه المشكلة.
في الختام، يمثل اختبار مراسل البويضات الواحد الموصوف استراتيجية للتحقيق في البرنامج الترجمي المنفذ في مرحلة الانتقال من البويضات إلى الزيجوتي. زيادة المعرفة من هذا البرنامج الترجمة يمكن أن توفر أدلة هامة حول التنظيم الجزيئي للكفاءة التنموية البويضات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة R01 GM097165، GM116926 ومراكز يونيس كينيدي شرايفر NICHD الوطنية للبحوث التحويلية في الإنجاب والعقم P50 HD055764 لماركو كونتي. 10- وتحظى إنريكو م. دالديلو بدعم من زمالة من مؤسسة لالور، وتحظى ناتاسيا ج. ج. كوسترمانز بدعم من زمالة روبيكون من المنظمة الهولندية للبحث العلمي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Preparation of media | |||
| Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra | Sigma-Aldrich | SIAL-A3311 | |
| Cilostamide | EMD Millipore | 231085 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M2645 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered | Genesee Scientific Corporation (GenClone) | 25-512 | |
| Sodium Bicarbonate | JT-Baker | 3506-1 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry | |||
| Agarose | Apex Biomedical | 20-102QD | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-1G | |
| Choo-Choo Cloning Kit | McLab | CCK-20 | |
| CutSmart Buffer (10x) | New England Biolabs | B7204 | |
| DNA loading dye (6x) | Thermo Scientific | R0611 | |
| dNTP Solution | New England Biolabs | N0447S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Fisher | SM1333 | |
| LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova | Teknova | L1010 | |
| LB Medium (Capsules) | MP Biomedicals | 3002-021 | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Life Technologies | AM1908 | |
| MfeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3589 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1344 | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(A) Tailing kit | Invitrogen | AM1350 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| S.O.C. medium | Thermo Fisher | 15544034 | |
| TAE buffer | Apex Biomedical | 20-193 | |
| Ultrapure Ethidium Bromide Solution | Life Technologies | 15585011 | |
| Oocyte collection | |||
| Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Calibrated micro-pipettes | Drummond Scientific Company | 2-000-025 | |
| PMSG- 5000 | Mybiosource | MBS142665 | |
| PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2 | BD | 305111 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| Oocyte micro-injection | |||
| 35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-0-20-C | For time-lapse microscopy |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Oil for Embryo Culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Petri Dish | Falcon | 351006 | For micro-injection |
| Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | For oocyte incubation |
| VacuTip Holding Capillary | Eppendorf | 5195000036 | |
| Software | |||
| Biorender | BioRender | Preparation of Figure 1S | |
| MetaMorph, version 7.8.13.0 | Molecular Devices | For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation |
References
- Clarke, H. J. Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis. Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).
- Gosden, R., Lee, B. Portrait of an oocyte: our obscure origin. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).
- Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F. Translational control in the germ line. Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. , Springer, Cham. 129-156 (2015).
- Dai, X. -X., et al. A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte. Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).
- Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption. Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).
- Yang, C. R., et al. The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation. Nature Communications. 11, 1399 (2020).
- Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes & Development. 25 (7), 755-766 (2011).
- Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).
- Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes. Development. 146 (8), (2019).
- Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence. Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).
- Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary. Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).
- Shu, Y., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
- Cheng, Y., et al. Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats. Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).
- Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation. Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).
- Sha, Q. Q., et al. CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte. The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).
- Yartseva, V., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming. Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).
- Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
- Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
- Martins, J. P. S., et al. DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation. Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).
- Yang, Y., et al. Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation. Genes & development. 31, 1302-1307 (2017).
- Cheng, Z., et al. Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis. Cell. 172 (5), 910-923 (2018).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. A combinatorial code for CPE-mediated translational control. Cell. 132 (3), 434-448 (2008).
- Morgan, M., et al. mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome. Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).
- Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation. RNA. 26 (3), 324-344 (2020).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
- Chen, J., et al. Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes. Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).
