Summary
Ce protocole décrit une analyse de journaliste pour étudier le règlement de la traduction d’ADN messagère dans les ovocytes simples pendant la maturation in vitro.
Abstract
Des événements liés à la maturation nucléaire d’oocyte ont été bien décrits. Cependant, on en sait beaucoup moins sur les voies moléculaires et les processus qui ont lieu dans le cytoplasme en préparation de la fécondation et de l’acquisition de la totipotence. Au cours de la maturation des ovocytes, les changements dans l’expression des gènes dépendent exclusivement de la traduction et de la dégradation des ARN messagers maternels (ARNm) plutôt que de la transcription. L’exécution du programme translationnel joue donc un rôle clé dans l’établissement de la compétence développementale des ovocytes pour soutenir le développement de l’embryon. Cet article fait partie d’un accent sur la définition du programme de traduction maternelle de l’ARNm qui a lieu pendant la maturation méiotique et à la transition ovocyte-zygote. Dans cet article de méthode, une stratégie est présentée pour étudier la régulation de la traduction des ARNm cibles au cours de la maturation in vitro des ovocytes. Ici, un rapporteur Ypet est fusionné à la région non traduite 3' (UTR) du gène d’intérêt, puis micro-injecté dans les ovocytes avec l’ARNm polyadénylé codant pour mCherry pour contrôler le volume injecté. En utilisant la microscopie time-lapse pour mesurer l’accumulation de rapporteur, les taux de traduction sont calculés à différentes transitions au cours de la maturation méiotique des ovocytes. Ici, les protocoles pour l’isolement et l’injection d’ovocyte, l’enregistrement de time-lapse, et l’analyse de données ont été décrits, utilisant le Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3' UTR reporter comme exemple.
Introduction
Un ovocyte de mammifère adulte subit des changements rapides dans la préparation à la fécondation et à l’acquisition de la totipotence. Ces changements sont essentiels pour soutenir le développement embryonnaire après la fécondation. Bien que les événements associés à la maturation nucléaire soient relativement bien décrits, on en sait beaucoup moins sur les processus moléculaires et les voies dans le cytoplasme des ovocytes. Au cours des dernières étapes de la maturation des ovocytes, les ovocytes sont transcriptionnellement silencieux, et l’expression des gènes dépend entièrement de la traduction et de la dégradation de l’ARNm1,2. La synthèse des protéines critiques pour la compétence développementale s’appuie donc sur un programme de traduction chronométré d’ARNm à longue durée de vie qui ont été synthétisés plus tôt au cours de la croissancedes ovocytes 1,3. Dans le cadre d’un accent sur la définition de ce programme de traduction maternelle de l’ARNm exécuté pendant la maturation méiotique et à la transition ovocyte-zygote, cet article présente une stratégie pour étudier l’activation et la répression de la traduction des ARNm maternels cibles dans des ovocytes simples au cours de la maturation méiotique in vitro.
Dans cette méthode, le cadre de lecture ouvert YPet est cloné en amont de l’UTR 3' de la transcription d’intérêt. Ensuite, les ARNm codant pour ce rapporteur sont micro-injectés dans les ovocytes avec des ARNm polyadenylé codant pour contrôler le volume injecté. L’accumulation de reporter est mesurée pendant la maturation méiotique in vitro d’ovocyte utilisant la microscopie de time-lapse. L’accumulation de protéines fluorescentes jaunes (YFP) et de mCherry est enregistrée dans les ovocytes individuels, et les signaux YFP sont corrigés par le niveau stabilisé du mCherry co-injecté. Après l’acquisition des données, les taux de translation sont calculés pour différents intervalles de temps au cours de la maturation méiotique ovocytaire in vitro en calculant la pente de la courbe obtenue par ajustement de courbe.
Cette approche fournit un outil pour confirmer expérimentalement les changements dans la traduction des ARNm endogènes sélectionnés. De plus, cette méthode facilite la caractérisation des éléments régulateurs qui contrôlent la traduction lors de la maturation méiotique des ovocytes en manipulant les éléments cis-régulateurs du 3' UTR des ARNm cibles4,5,6. La manipulation de la longueur de la queue poly(A) permet également de mieux comprendre l’activité de l’adénylase/deadenylase dans les ovocytes5. La mutagenèse d’éléments cis-agissants ou d’immunoprécipitation de l’ARN peut être utilisée pour étudier les interactions avec les protéines de liaison à l’ARN apparenté6,7. De plus, cette méthode peut être utilisée pour identifier les composants essentiels du programme de traduction qui sont essentiels pour la compétence développementale des ovocytes en mesurant la traduction de l’UTR cible 3' dans des modèles associés à une diminution de la qualité des ovocytes 8,9,10. Ce document de méthode présente une expérience représentative où des ovocytes dénudés de souris C57/BL6 âgées de 21 jours ont été micro-injectés avec un journaliste de Ypet fusionné au 3' UTR d’IL-7. L’installation et le protocole pour l’injection d’ovocyte, l’enregistrement de time-lapse, et l’analyse de données ont été décrits.
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Protocol
Les procédures expérimentales impliquant des animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee de l’Université de Californie à San Francisco (protocole AN182026).
1. Préparation des médias
- Ajouter tous les composants, comme décrit dans le tableau 1, pour faire le milieu de collecte des ovocytes de base et le milieu de maturation des ovocytes. Pour le support de collecte de base, réglez le pH sur 7,4. Pour le milieu de collecte et de maturation, ajouter 3 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) et 1 μM de cilostamide le jour de l’utilisation.
2. Préparation du codage de l’ARNm pour Ypet-3' UTR et mCherry
- Obtenir les séquences 3′ UTR des ARNm d’intérêt.
REMARQUE: Pour cette étude, des séquences ont été précédemment obtenues à partir de l’ADNc d’ovocyte de souris. - Concevoir des amorces pour amplifier les IDU 3' cibles à partir de l’ADNc ovocytaire et de parties du vecteur pcDNA 3.1 contenant une séquence codante Ypet, une étiquette d’épitope V5 et un promoteur T7.
- Amplifier à l’aide d’un kit d’ADN polymérase haute fidélité. Exécutez les produits de réaction en chaîne de la polymérase (PCR) sur un gel pour vérifier si les fragments ont la bonne taille, découpez les bandes et extrayez l’ADN du gel à l’aide d’un kit d’extraction de gel conformément aux instructions du fabricant.
- Fusionnez les fragments pcr en vecteur à l’aide d’un kit de clonage PCR.
REMARQUE: Des fragments de PCR ont été incubés sur la glace pendant 4 h pour faciliter un processus de recombinaison plus efficace. Ceci est contraire aux instructions du fabricant, qui recommandent un temps d’incubation de seulement 45 min. - Transfecter des fragments de PCR en bactéries Escherichia coli 5-α compétentes.
- Ajouter le mélange et le plasmide aux bactéries et incuber sur de la glace pendant 30 min.
- Choc thermique du mélange et du plasmide en plaçant le mélange dans un bain-marie à 42 °C pendant 45 s, et refroidir immédiatement sur de la glace pendant 3 min.
- Ajouter 500 μL de bouillon Super Optimal avec un milieu de répression catabolite (SOC) et incuber pendant 1 h à 37 °C.
- Tournez vers le bas à 7000 × g pendant 2 min, et retirez la plupart du surnageant. Remise en suspension et plaque sur une plaque de gélose Luria Broth (LB) avec l’antibiotique de sélection approprié.
REMARQUE : La carbénénicilline a été utilisée dans cette étude. - Incuber pendant la nuit à 37 °C. Isolez les colonies en appuyant légèrement sur l’extrémité d’une pipette sur l’une des colonies et en la plaçant dans 3 mL de milieu LB avec 100 μg/mL de carbbénicilline. Incuber pendant 12-24 h à 37 °C.
- Extraire l’ADN des plasmides à l’aide du kit d’isolement de l’ADN plasmidique conformément aux instructions du fabricant et confirmer les séquences via le séquençage de l’ADN.
- Pour Ypet/3' UTR :
- Produire un modèle de PCR linéaire pour la transcription in vitro. Utilisez un apprêt avant en amont de la séquence Ypet et un apprêt inverse avec 20 résidus de thymine supplémentaires. Voir le tableau 2 pour la séquence de Ypet/IL-7 3' UTR et les séquences des amorces avant et arrière.
REMARQUE: Ces résidus de thymine supplémentaires ajouteront oligo(A) à l’ARNm linéaire après transcription in vitro. - Transcrivez in vitro le produit PCR à l’aide d’une trousse de transcription T7 conformément aux instructions du fabricant.
- Purifier l’ARN complémentaire (ARNc) résultant à l’aide d’un kit de nettoyage de transcription conformément aux instructions du fabricant.
- Éluer l’ARNc purifié dans de l’eau sans RNAse, mesurer la concentration et évaluer l’intégrité par électrophorèse de l’agarose. Conserver à −80 °C.
- Produire un modèle de PCR linéaire pour la transcription in vitro. Utilisez un apprêt avant en amont de la séquence Ypet et un apprêt inverse avec 20 résidus de thymine supplémentaires. Voir le tableau 2 pour la séquence de Ypet/IL-7 3' UTR et les séquences des amorces avant et arrière.
- Pour mCherry:
- Produire un modèle de PCR linéaire pour la transcription in vitro en utilisant une enzyme de restriction haute fidélité; utiliser l’enzyme de restriction mfEI-HF si vous répliquez cet exemple. Digérer dans un tampon de digestion pendant la nuit à 37 °C.
- Exécutez un gel pour purifier l’échantillon et extrayez l’ADN linéaire à l’aide d’un kit d’extraction de gel conformément aux instructions du fabricant.
- Transcrivez in vitro le produit PCR à l’aide d’une trousse de transcription T7 conformément aux instructions du fabricant.
- Polyadénylate de l’ARNc (150-200 nucléotides) à l’aide d’un kit de résidus en poly(A) selon les instructions du fabricant.
- Purifier l’ARNc résultant à l’aide d’une trousse de nettoyage de transcription selon les instructions du fabricant.
- Éluer l’ARNc purifié dans de l’eau sans ARNAse, mesurer les concentrations d’ARNm et évaluer l’intégrité du message par électrophorèse sur gel. Conserver à −80 °C.
3. Procédure expérimentale
REMARQUE : Un aperçu schématique de la micro-injection d’ovocytes et de la microscopie time-lapse subséquente est donné à la figure 1.
- Jour 1
- Injecter par voie intrapéritonéale des souris de 21 jours avec 5 UI de gonadotrophine sérique de jument gravide pour favoriser la croissance du follicule au stade antral11.
- Jour 3
- Prélèvement d’ovocytes
- Sacrifier des souris 44-48 h après l’amorçage pour recueillir les ovaires, et les placer dans une boîte de Petri en plastique avec un milieu de collecte d’ovocytes de base.
- Ouvrez soigneusement les follicules antraux en faisant une petite coupe dans la paroi du follicule avec une aiguille de 26 G. Isolez les ovocytes intacts cumulus-enfermés (COC) avec plusieurs couches de cellules de cumulus utilisant une pipette en verre à bouche-actionnée.
- Utilisez une pipette plus petite (légèrement plus grande que le diamètre de l’ovocyte) et désamorcer mécaniquement les COC par pipetage répété.
REMARQUE: Vous pouvez également effectuer une micro-injection sur des COC intacts. - À l’aide d’une pipette plus grande, aspirer les ovocytes dénudés et les placer dans une boîte de Petri avec un milieu de maturation complété par 1 μM de l’inhibiteur de la phosphodiestérase, le cilostamide, pour empêcher la reprise de la maturation méiotique12. Placez le plat dans l’incubateur pendant 2 h pour laisser les ovocytes récupérer du stress induit par l’isolement des ovocytes des follicules.
- Micro-injection d’ovocytes
- Préparez les aiguilles d’injection en plaçant un tube capillaire en verre borosilicate de 10 cm de long dans un tiroir mécanique. Pour une injection optimale, pliez la pointe de l’aiguille dans un angle de 45 ° à l’aide d’un filament chauffé.
- Préparez des plats en polystyrène avec des gouttelettes de 20 μL de milieu de collecte d’ovocytes de base et couvrez les gouttelettes d’huile minérale légère.
- Préparer un mélange rapporteur en ajoutant 12,5 μg/μL d’UTR Ypet-3' et 12,5 μg/μL mCherry. Préparer un plus grand volume et faire des aliquotes pour les expériences futures afin d’assurer des concentrations similaires de déclarants. Conservez ces aliquotes à -80 °C. Lors de la décongélation, centrifugez d’abord la partie aliquote pendant 2 min à 20 000 x g,puis transférez-la dans un nouveau tube de microcentrifugation.
REMARQUE: Cette centrifugation empêchera l’aiguille d’injection d’être obstruée par des agrégats potentiels dans le mélange de rapporteur. - Chargez l’aiguille d’injection par capillarité avec environ 0,5 μL de mélange rapporteur.
- Placez la pipette de maintien et l’aiguille d’injection chargée dans les supports et placez-la dans la gouttelette du milieu de collecte des ovocytes. Aspirez une partie du milieu dans la pipette de maintien.
- Ouvrez l’aiguille d’injection en la tapotant doucement contre la pipette de maintien.
- Placez les ovocytes dans une gouttelette de milieu de collecte de base et injectez 5 à 10 pL du mélange rapporteur.
- Incuber les ovocytes dans le milieu de maturation avec 1 μM de cilostamide pendant 16 h pour permettre au signal mCherry de se stabiliser.
- Préparer une boîte de Petri qui sera utilisée pour la microscopie en accéléré avec au moins deux gouttelettes de 20 μL de milieu de maturation pour chaque rapporteur injecté : une gouttelette avec 1 μM de cilostamide pour contrôler les ovocytes arrêtés par la prophase I et une gouttelette sans cilostamide pour la maturation des ovocytes. Couvrir les gouttelettes avec de l’huile minérale légère et placer dans l’incubateur.
- Microscopie time-lapse
- Après la pré-incubation, retirez les ovocytes injectés de l’incubateur et lavez-les quatre fois dans un milieu de maturation sans cilostamide. Conserver certains ovocytes dans un milieu de maturation avec du cilostamide de 1 μM comme groupe témoin d’ovocytes arrêté par la prophase I.
- Transférer les ovocytes injectés dans leurs gouttelettes respectives sur la parabole du microscope time-lapse préalablement préparée. Regroupez les ovocytes à l’aide d’une pipette en verre fermée (une pipette fermée peut être préparée en maintenant la pointe dans une flamme pendant quelques secondes).
REMARQUE: Le regroupement des ovocytes aide à empêcher leur mouvement pendant l’enregistrement. - Placer l’enceinte sous le microscope équipée d’un système d’éclairage à diodes électroluminescentes et d’un étage motorisé équipé d’une chambre environnementale maintenue à 37 °C et 5 % deCO2. Pour reproduire cette étude, utilisez les paramètres suivants : ensemble de filtres : miroir dichroïque YFP/CFP/mCherry 69008BS; Canal YFP (Excitation (Ex): S500/20 × 49057; Émission (EM): D535/30 m 47281), canal mCherry (Ex: 580/25 × 49829; Em : 632/60 m).
- Entrez les paramètres appropriés pour l’expérience time-lapse (voir la table des matériaux pour le logiciel utilisé dans cette étude) : Cliquez sur Applications | Acquisition multidimensionnelle. Sélectionnez le premier onglet Main et sélectionnez timelapse, plusieurs positions de scèneet plusieurs longueurs d’onde.
- Sélectionnez l’onglet Enregistrement pour entrer l’emplacement où l’expérience doit être enregistrée.
- Sélectionnez l’onglet Timelapse pour entrer le nombre de points de temps, la durée et l’intervalle de temps.
REMARQUE: La durée de l’expérience time-lapse dépend de l’espèce animale étudiée, car le moment de la maturation méiotique des ovocytes diffère d’une espèce à l’autre. Dans cette expérience avec des ovocytes de souris, des ovocytes ont été enregistrés toutes les 15 minutes pendant 16 h. - Sélectionnez l’onglet Scène. Allumez brightfield et localisez la position des ovocytes en ouvrant une nouvelle fenêtre en sélectionnant Acquérir | Acquérir | Afficher en direct. Une fois les ovocytes localisés, revenez à la fenêtre Acquisition multidimensionnelle et appuyez sur + pour définir l’emplacement des ovocytes.
- Sélectionnez l’onglet Longueurs d’ondeet définissez 3 longueurs d’onde différentes pour brightfield (exposition 15 ms), YFP (exposition 150 ms pour Ypet / IL7 3' UTR) et mCherry (exposition 75 ms pour Ypet / IL7 3' UTR).
REMARQUE : Ajustez l’exposition pour chaque déclarant UTR Ypet/3' en fonction du niveau d’accumulation du déclarant et du volume injecté. S’assurer que le signal YFP tombe au centre de la plage de détection au début de l’expérience pour éviter la sous-estimation ou la saturation en cas d’activation de la traduction. Pour mCherry, ajustez l’exposition pour chaque lot de mCherry car le signal dépend du nombre de nucléotides d’adénine qui ont été ajoutés pendant la procédure de polyadenylation. En raison de la variation de l’efficacité de la polyadenylation, utilisez le même lot de mCherry dans différentes expériences pour une meilleure comparaison entre les expériences. - Démarrez l’expérience time lapse en cliquant sur Acquérir. Voir la figure 2 et le fichier supplémentaire pour obtenir un exemple d’enregistrement en accéléré dans un seul ovocyte.
- Analyse de la traduction de l’UTR Ypet-3'
- Pour cette analyse (voir la table des matériaux pour le logiciel utilisé dans cette étude), effectuez deux mesures de région pour chaque ovocyte: l’ovocyte lui-même - cliquez sur la région de l’ellipse et entourez l’ovocyte - et une petite région proche de l’ovocyte à utiliser pour la soustraction de fond - cliquez sur la région rectangulaire.
Remarque : Assurez-vous que les ovocytes ne se déplacent pas hors de la région sélectionnée pendant l’enregistrement time-lapse. Portez une attention particulière au placement de la mesure de la région autour de l’extrusion du corps polaire, car cela provoque un mouvement dans l’ovocyte et peut fausser l’enregistrement. - Exportez les données de mesure de région vers une feuille de calcul en cliquant d’abord sur Ouvrir le journal, puis sur Données du journal pour exporter le logiciel d’analyse des données.
- Pour chaque ovocyte individuel et pour tous les points temporels mesurés, soustrayez la mesure de la région d’arrière-plan de la mesure de la région ovocytaire. Effectuez cette option séparément pour les longueurs d’onde YFP et mCherry.
- Consigner le moment de la dégradation des vésicules germinales (GVBD) et de l’extrusion du corps polaire (PBE) pour référence ultérieure.
REMARQUE: Exclure les ovocytes de souris en cours de maturation lorsque le GVBD dépasse 2 h. - Tracez l’expression YFP et mCherry au fil du temps pour chaque ovocyte afin de vérifier les valeurs aberrantes.
REMARQUE: Il doit s’agir d’une courbe lisse, si ce n’est pas le cas, cela peut indiquer que l’ovocyte s’est déplacé pendant l’enregistrement. - Pour chaque ovocyte individuel, calculer l’expression moyenne de mCherry pour les dix derniers points temporels de l’enregistrement. Pour chaque point de temps, divisez l’expression YFP par l’expression mCherry moyenncée pour corriger le volume injecté afin d’obtenir un rapport YFP/mCherry à chaque point temporel pour chaque ovocyte individuel.
- Calculez les taux de translation pour un intervalle de temps spécifique en ajustant la pente de la courbe par régression linéaire. Évaluer les différences dans les taux de traduction à l’aide de l’inférence statistique.
- Pour cette analyse (voir la table des matériaux pour le logiciel utilisé dans cette étude), effectuez deux mesures de région pour chaque ovocyte: l’ovocyte lui-même - cliquez sur la région de l’ellipse et entourez l’ovocyte - et une petite région proche de l’ovocyte à utiliser pour la soustraction de fond - cliquez sur la région rectangulaire.
- Prélèvement d’ovocytes
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Representative Results
Des ovocytes I-arrêtés de prophase dénudés des souris C57/BL6 de 21 jours ont été injectés avec un mélange de journaliste contenant l’ADN messagère codant le journaliste de Ypet fusionné au 3' UTR d’IL-7 et adn messagère codant mCherry. L’expression de YFP et de mCherry a été enregistrée dans 39 oocytes, dont 30 ont été mûris, et 9 ont été arrêtés dans la prophase I comme commande négative. Trois ovocytes en maturation ont été exclus pour l’analyse parce qu’ils avaient un GVBD retardé (N = 2) ou déplacés dans la parabole pendant l’enregistrement (N = 1). La figure 3 montre l’expression de mCherry et de YFP dans la prophase I et les ovocytes en cours de maturation. La figure 4 montre l’expression YFP des ovocytes en cours de maturation corrigée pour l’expression mCherry stabilisée (expression mCherry moyenne dans les 10 derniers points de temps) pour corriger le volume injecté. Les taux de traduction du déclarant ont été mesurés par ajustement de courbe (régression linéaire) des valeurs YFP/mCherry dans la prophase I et dans les ovocytes en maturation au cours des 0-2 h ou 8-10 h premiers après la libération de cilostamide(figure 5A). L’accumulation du rapporteur ne suit pas un modèle linéaire, comme l’indique une différence significative dans les taux de traduction entre 0-2 h et 8-10 h après libération de cilostamide (p<0,0001; Figure 5B). Par conséquent, ces résultats indiquent l’activation de la traduction IL-7 pendant la maturation meiotic d’oocyte.
Figure 1: Aperçu schématique de la procédure expérimentale. L’UTR Ypet/3' oligoadénylé et l’ARNm polyadénylé codant pour mCherry sont micro-injectés dans des ovocytes dénudés de souris C57/BL6 âgées de 21 jours. Les ovocytes sont pré-incubés pendant 16 h dans un milieu de maturation contenant du cilostamide pour permettre au signal mCherry d’atteindre un plateau. Après la pré-incubation, un enregistrement en accéléré est commencé où les ovocytes sont soit conservés en milieu avec du cilostamide pour créer un groupe témoin arrêté par la prophase I, soit libérés dans un milieu sans cilostamide pour mûrir. Abréviations : UTR = région non traduite; YFP = protéine fluorescente jaune; fw primer = amorce avant; amorce rev = amorce inverse; Ampr = résistance à l’ampicilline; polyA = polyadenyl; oligoA = oligoadenyl; GV = vésicule germinale. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Exemple d’un enregistrement time-lapse d’un seul ovocyte. Brightfield, YFP et mCherry enregistrements d’un seul ovocyte injecté avec des ARNm codant pour Ypet/Interleukin-7 3' UTR et mCherry polyadenylated à la prophase I, MI (6 h après la libération de cilostamide) et MII (15 h après la libération de cilostamide). Barre d’échelle = 25 μm. Abréviations : YFP = protéine fluorescente jaune; GV = vésicule germinale; MI = métaphase I; MII = métaphase II. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Signaux YFP et mCherry enregistrés par microscopie time-lapse. Signaux YFP et mCherry d’ovocytes injectés avec Ypet/IL7 oligoadénylé 3' UTR et ARNm polyadénylé codant pour mCherry. Les ovocytes ont été conservés en milieu avec du cilostamide pour générer un groupe témoin arrêté par la prophase I (N = 9) ou libérés dans un milieu sans cilostamide pour permettre la maturation (N = 30). Les données sont des mesures individuelles des ovocytes. Abréviations : IL-7 = interleukine-7; YFP = protéine fluorescente jaune. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Signal YFP corrigé pour le niveau de mCherry co-injecté. Des signaux de YFP des ovocytes I-arrêtés de prophase et de maturation ont été corrigés pour le volume injecté en divisant le signal de YFP par le signal moyen de mCherry des 10 derniers points de temps. Rapports YFP/mCherry individuels pour(A)les ovocytes à la prophase I-arrêtés et(B)les ovocytes en maturation et ± moyenne erreur type des rapports YFP/mCherry moyens des ovocytes(C)prophase I-arrêtés et(D)maturants. Abréviations : YFP = protéine fluorescente jaune; GVBD = dégradation des vésicules germinales. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Taux de translation calculés à 0-2 h et 8-10 h de maturation. (A) Signaux de protéines fluorescentes jaunes (YFP) d’ovocytes simples corrigés pour mCherry (YFP/mCherry) à 0-2 h ou 8-10 h après libération de cilostamide et(B)taux de translation (moyenne ± erreur type de la moyenne) calculés par ajustement de courbe (régression linéaire) les valeurs YFP/mCherry à 0-2 h et 8-10 h après libération de cilostamide. Les données ont été analysées à l’aide du test t à deux queues non apparié. *p < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: Exemple de répression de la traduction : Oosp2. Ré-analysé les données d’une expérience où des ovocytes ont été injectés avec Ypet-Oosp2 3′ UTR et ADN messagère polyadénylé codant mCherry. Des signaux de YFP de la prophase I-arrêté (N=63) et des oocytes de maturation (N=72) ont été corrigés pour le volume injecté en divisant le signal de YFP par le signal moyen de mCherry des 10 derniers points de temps. Les données d’expression YFP et mCherry ont été obtenues à l’aide d’une lampe à arc au xénon, contrairement à l’expérience IL-7 où une source lumineuse LED a été utilisée. Les données représentent la moyenne ±'erreur type de la moyenne des mesures individuelles des ovocytes et ont été précédemment publiées dans Luong etal. 5.Abréviations : YFP = protéine fluorescente jaune; Oosp2 = protéine sécrétée d’ovocytes 2; UTR = région non traduite; IL-7 = interleukine-7; LED= diode électroluminescente; GVBD = dégradation des vésicules germinales. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7: Effet de l’exposition par micro-injection et par fluorescence sur le moment de la GVBD et du PBE. Synchronisation du GVBD et du PBE des ovocytes qui ont été soit micro-injectés et exposés à la fluorescence (injectés), soit non injectés et non exposés à la fluorescence (non injectés). Les données sont des mesures individuelles des ovocytes. Les données ont été analysées à l’aide du test tbi-caudale non apparié. *p<0.001. Abréviations : GVBD = dégradation des vésicules germinales; PBE= extrusion du corps polaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Milieu de collecte d’ovocytes de base | ||
| composant | Pour 500 mL | |
| HEPES modifié Minimum Essential Medium Eagle | 7,1 g | |
| Bicarbonate de sodium | 252 mg | |
| Pyruvate de sodium | 1,15 mL | |
| Pénicilline/streptomycine 100x | 5 mL | |
| Eau distillée ultrapure (Invitrogen, 10977-015) | Jusqu’à 500 mL | |
| Milieu de maturation | ||
| composant | Pour 500 mL | |
| MEM alpha 1x | Jusqu’à 500 mL | |
| Pyruvate de sodium | 1,15 mL | |
| Pénicilline/streptomycine 100x | 5 mL | |
Tableau 1 : Préparation des supports. Liste des composants qui doivent être ajoutés pour préparer le milieu de collecte des ovocytes de base et le milieu de maturation des ovocytes.
| séquence | |||||
| Ypet/Interleukin-7 3' UTR | GAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTG GCTAGTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAAGGCGA AGAGCTGTTCACCGGCGTGGTGCCCATCCTGGTGGAGCTGGACGGCGACGTGAACGGCC ACAAGTTCAGCGTGAGCGGCGAGGGCGAGGGCGACGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTG AAGCTGCTGTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCCCTGGCCCACCCTGGTGACCACCCTG GGCTACGGCGTGCAGTGCTTCGCCCGGTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCA AGAGCGCCATGCCCGAGGGCTACGTGCAGGAGCGGACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAA CTACAAGACCCGGGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGGATCGAGCTGA AGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGCCACAAGCTGGAGTACAACTACAAC AGCCACAACGTGTACATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGAT CCGGCACAACATCGAGGACGGCGGCGTGCAGCTGGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCC CATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCTACCAGAGCGCCCTG TTCAAGGACCCCAACGAGAAGCGGGACCACATGGTGCTGCTGGAGTTCCTGACCGCCGCC GGCATCACCGAGGGCATGAACGAGCTCTATAAGAGATCTTTCGAAGGTAAGCCTATCCCTAA CCCTCTCCTCGGTCGATTCTACGCGTACCGGTCATCATCACCATCACCATTGAACAGGAC ATGTAGTAACAACCTCCAAGAATCTACTGGTTCATATACTTGGAGAGGTTGAAACCCTTCCAG AAGTTCCTGGATGCCTCCTGCTCAAATAAGCCAAGCAGCTGAGAAATCTACAGTGAGGTATG AGATGATGGACACAGAAATGCAGCTGACTGCTGCCGTCAGCATATACATATAAAGATATATCAA CTATACAGATTTTTGTAATGCAATCATGTCAACTGCAATGCTTTTAAAACCGTTCCAAATGTTTC TAACACTACAAAGTCTACAAAAAGCAAGGCTATGAAGATTCAGAGTCACCACTGTTTTCTTAGC AAAATGATGGTATGGTTAAACATTCATTGGTGAACCACTGGGGGAGTGGAACTGTCCTGTTTTAG ACTGGAGATACTGGAGGGCTCACGGTGATGGATAATGCTCTTGAAAACAAGAGTCTATCTTAAAGC AGCAGCAAAAAGAAGCTTAAGGCACTTAAGGCATCAACAAATGTAGTTAAATATGAATGTATAACA CATAACTTCAGTAAAGAGCATAGCAGATATTTTTAAATAAAAGTATTTTTAAAGATAGAAATGCACTTAT TCCAAAGATACTGAACCTTAGTATTCAGTCGCTTTTGACACTTGTGTATAATAAAGCTTATATAACTGAA TTTTCAATTTGAAAAGTATATTTTTAAAAGAATAATATATGCTAGACTTTTAATTAATGTATATGTTTAATTT TGGCATTCTGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT ATTTTCATATACTACCAATTGCGTACTTTGGATAGTCTCTTTTTAACCTAAATGACCTTTATTAACAC TGTCAGGTTCCCTTACTCTCGAGAGTGTTCATTGCTGCACTGTCATTTGATCCCAGTTTTATTGAACAC ATATCCTTTAACACACTCACGTCCAGATTTAGCAGGAGACTAGGACCCTATAACTTTGTTAAGAGAGAA AACACTAATTTCTTTTTTATAGGGTCTTATTCGTATCTAAGGCAGGCTAGGATTGCAGACATGAGC CAATATGCTTAATTAGAAACATTCTTTTTATGTTAAACTCATGTCTTTTACAAGATGCCTACATATATCCTAT GTATATGCCTGTTTAAATCCTTTTTTTTGTAAGGTCTGCTGTCTTCCTTCAGTTGTAATGGAAAGAAACACTA TGTTGTAGAGGCCAAATTTCTGAAAGTGATAAGGGTTTGCTTGTACTGAATTCTCATTCTCCTTGCTTT TTCCAGCCACGTGAGCATCTAGCTATCTATACGCTGGATGTATTTGACCGATGCCTGCTCCACTGGCAC ATTGCATGTGTGGTAGCCATGCCTTCTTGCTTCTCCTTTTCCCCAACCCCTATAATGCTCTACTCAGTGG TACAGATAGCTGGGATTATCAATTTTGAGAGAAACACCAATTGTTTAAAGTTTGTTTCATAATCACCATTT GCCCAGAAAACAGTTCTCTCAACTTGTTTGCAACATGTAATAATTTAAGAAACTCAATTTTTTTTAATGGACTT TCGATAACTTCCTTAGATATCCCACATCTCCTACGTCAGTCCTTTGTCCTGAGGAACTGGTAAAATGGGTA AGCCCTTAGCTAGCGAACTGAAGGCATTCGCATGTGTAAGATAATCTCTATACCTGCAAGGCTGTCTGGAT GGCTCCCTACCAATATTGAACAATATTCTGATTTTGGCAAAATAAAGGATAATATTTT |
||||
| Amorce avant | GAGAACCCACTGCTTAC | ||||
| Amorce inverse | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT CCAAAATC |
||||
Tableau 2: Exemple de séquences de rapporteur et d’amorce Séquence de reporter YFP/IL7 3'UTR et séquences d’amorces avant et arrière qui ont été utilisées pour produire un modèle de PCR linéaire pour la transcription in vitro.
Dossier supplémentaire : Enregistrement des protéines fluorescentes jaunes(YFP) et des time-lapse mCherry. Enregistrements time-lapse YFP et mCherry d’un seul ovocyte injecté avec des ARNm codant pour Ypet/Interleukin-7 3' UTR et mCherry polyadenylated. Canal YFP (ex: S500/20 × 49057; Em: D535/30 m 47281), canal mCherry (Ex: 580/25 × 49829; Em : 632/60 m). Les oocytes ont été enregistrés toutes les 15 minutes pendant 16 h (7 images/seconde). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
La méthode présentée décrit une stratégie pour étudier l’activation et la répression de la traduction de l’ARNm cible à différentes transitions au cours de la maturation méiotique ovocytaire in vitro. IL-7, une cytokine libérée par l’ovocyte qui peut être impliquée dans la communication cellulaire ovocyte-cumulus 8,13, a été choisie dans le but de décrire ce procédé. IL-7 est connu pour être de plus en plus traduit pendant la maturation d’ovocyte8 et permet une bonne visualisation de l’activation translationnelle utilisant cette méthode. Si, toutefois, la traduction se produit à un rythme constant tout au long de l’expérience, l’accumulation d’un rapporteur suivra un modèle linéaire, et les taux de traduction au début et à la fin de l’expérience seront similaires. Cette conclusion peut être vérifiée par la bonté de l’ajustement (R) d’une régression linéaire à travers tout l’intervalle d’enregistrement. Une répression dans la traduction des journalistes se présentera comme le plateau du signal YFP.
Un exemple de répression de la traduction 3' UTR, peut être trouvé dans l’étude de Luong et al. 5, où les auteurs rapportent la répression de la protéine sécrétée 2 d’oocyte (Oosp2) pendant la maturation méiotique d’oocyte. Ces données ont été ré-analysées et sont illustrées à la figure 6. Les ovocytes en maturation montrent un plateau du signal YFP, ce qui indique une répression de la traduction, tandis que le groupe témoin prophase arrêté par I suit un modèle linéaire d’accumulation de rapporteur, ce qui indique des taux de traduction similaires au début et à la fin de l’expérience. Lors de l’étude de la répression de la traduction, il est particulièrement important d’inclure un groupe témoin prophase arrêté I pour s’assurer que le plateau du signal YPF ne s’explique pas par une diminution de la qualité des ovocytes due à de mauvaises conditions de culture, confirmant ainsi la viabilité des ovocytes. L’accumulation du rapporteur peut être validée par PCR quantitative de reverse-transcription utilisant des amorces pour YFP ou par éponger occidental en profitant de la balise de V5-épitope incluse dans le journaliste dans ce protocole.
Le plateau du signal YFP peut ne pas être uniquement dû à une répression activement régulée de la traduction, mais peut également s’expliquer par la dégradation du rapporteur pendant la progression méiotique des ovocytes. Cela peut refléter la déstabilisation de l’ARNm endogène, qui est essentielle pour la transition vers l’expression du génome embryonnaire14,15,16. Cette possibilité peut être vérifiée en mesurant les niveaux de transcription des gènes cibles au stade de la prophase I par rapport au stade de la métaphase II pour confirmer la stabilité des ARNm. Lors de la préparation de l’ADNc des ovocytes, il est préférable d’utiliser un amorçage aléatoire de l’hexamère plutôt qu’un amorçage oligo-dT. Cette dernière méthode présente des différences apparentes dans les niveaux de transcription de gènes qui peuvent refléter des différences dans la longueur poly(A) de ces transcriptions plutôt que des différences réelles dans les niveaux de transcription7.
Il existe plusieurs méthodes pour étudier la traduction endogène de l’ARNm à l’échelle du génome dans les ovocytes de souris. Ces méthodes comprennent le profilage polysome7,17,18 et RiboTag/RNA-Seq5,19,20. Le profilage des ribosomes est une autre méthode d’étude de la traduction à l’échelle du génome qui a été utilisée chez la levure, qui est un autre organisme modèle utilisé pour étudier la méiose21,22. Cependant, ces analyses à l’échelle du génome pour étudier la traduction de l’ARNm chez la souris nécessitent l’utilisation de 150 à 200 ovocytes par échantillon, tandis que le nombre d’ovocytes disponibles pour l’analyse est généralement limité. Le test à ovocyte unique décrit ici pour évaluer la traduction de 3' UTR des ARNm cibles complète les analyses de la traduction à l’échelle du génome, car il permet la caractérisation des éléments du 3' UTR qui régulent le programme de traduction pendant la maturation méiotique des ovocytes4,5,6. Dans le passé, des tests à base de luciférase ont été utilisés pour évaluer la traduction de l’UTR 3' des ARNm cibles10,20,23 car il s’agit d’une méthode très sensible qui ne nécessite que quelques ovocytes par échantillon; cependant, les ovocytes doivent être lysés pour détecter la quantité de luciférase dans un échantillon.
D’autres ont utilisé un déclarant UTR/protéine fluorescente verte (GFP) de 3' pour évaluer l’accumulation de GFP dans les ovocytes de souris vivants4. Cependant, dans ces expériences, seuls deux points temporels ont été utilisés : le début de l’incubation (prophase I) et la fin de l’incubation (métaphase II). Cela diminue considérablement la puissance des mesures et augmente le risque d’erreurs. Les données cinétiques fournissent des mesures précises basées sur les taux (points multiples) et définissent avec précision le moment où l’activation translationnelle ou la répression a lieu. En outre, la répression de la traduction ne peut être évaluée à ces moments uniques, ce qui peut conduire à une conclusion inexacte. Par conséquent, cette méthode a été ajustée en appliquant une microscopie time-lapse pour évaluer l’accumulation de rapporteur UTR Ypet/3' tout au long de la maturation in vitro des ovocytes de souris5,6,9. En utilisant cette stratégie, il est possible d’étudier la traduction à différentes transitions au cours de la maturation des ovocytes.
Il y a plusieurs aspects importants de cette méthode à considérer. Tout d’abord, les déclarants utilisés comprennent une queue oligo(A) dont l’omission réduit considérablement l’accumulation de déclarants. Cela peut être dû à la fois à une diminution de la traduction ainsi qu’à une déstabilisation de l’ARNmrapporteur 24,25. Lors de la pré-incubation en prophase I, la translation d’une sonde oligoadénylée s’ajuste pour refléter le taux de traduction de l’ARNm endogène5. Deuxièmement, il est important de réaliser qu’une augmentation du nombre d’enregistrements ou de la durée de l’exposition à la fluorescence peut potentiellement induire une phototoxicité et ainsi nuire à la qualité des ovocytes. Bien que l’expérience actuelle ait adopté des intervalles de 15 minutes, le taux d’échantillonnage peut être diminué lorsqu’une exposition élevée à la fluorescence doit être utilisée en cas de faible expression du rapporteur.
Pour limiter la quantité de phototoxicité, une source lumineuse LED froide a été utilisée, ce qui nécessite une excitation plus courte26. Pour évaluer les effets potentiels de phototoxicité dans les ovocytes, le moment de la GVBD et de la PBE a été comparé dans les ovocytes qui ont été micro-injectés et exposés à la fluorescence ou qui n’ont pas été injectés et qui n’ont pas été exposés à la fluorescence. La combinaison de l’exposition par micro-injection et par fluorescence s’est avérée légèrement retarder le GVBD (p<0,001), tandis que le moment de l’IBE était similaire (Figure 7).
Cette méthode a été employée pour étudier les éléments translationnels régulateurs du 3' UTR pendant la maturation meiotic in vitro d’ovocyte. De même, il peut également être utilisé pour étudier des éléments fonctionnels 5' UTR essentiels à la régulation de la traduction ou pour étudier la traduction lors de la fécondation in vitro desovocytes. Bien que cette méthode ait été appliquée aux ovocytes humains et de souris, elle est également applicable à d’autres espèces animales. Étant donné que ce test rapporteur est effectué dans des ovocytes simples, il est particulièrement adapté à une utilisation chez les espèces mono-ovulatoires dans lesquelles le nombre d’ovocytes disponibles pour l’analyse est limité. Contrairement à l’utilisation d’ovocytes dénudés, une autre application de cette technique est l’injection du rapporteur dans des ovocytes enfermés dans des cumulus, car les cellules cumulus jouent un rôle majeur dans la régulation du programme translationnel8,10,27. Cependant, il faut tenir compte du fait que les ovocytes enfermés dans le cumulus sont plus susceptibles de s’éloigner du plan d’enregistrement pendant l’expérience que les ovocytes dénudés en raison du mouvement des cellules cumulus pendant l’expansion du COC. Cela peut entraîner une plus grande proportion d’ovocytes qui doivent être exclus de l’analyse. À l’avenir, un logiciel de suivi cellulaire capable de suivre les positions x, y et z des ovocytes dans la gouttelette, ce qui peut résoudre ce problème.
En conclusion, l’essai de rapporteur d’ovocyte simple décrit représente une stratégie pour étudier le programme translationnel exécuté à la transition d’ovocyte-à-zygote. Une meilleure connaissance de ce programme translationnel peut fournir des indices importants sur la régulation moléculaire de la compétence développementale des ovocytes.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par NIH R01 GM097165, GM116926 et Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 à Marco Conti. Enrico M. Daldello a été soutenu par une bourse de la Fondation Lalor et Natasja G. J. Costermans a été soutenu par une bourse Rubicon de l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Preparation of media | |||
| Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra | Sigma-Aldrich | SIAL-A3311 | |
| Cilostamide | EMD Millipore | 231085 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M2645 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered | Genesee Scientific Corporation (GenClone) | 25-512 | |
| Sodium Bicarbonate | JT-Baker | 3506-1 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry | |||
| Agarose | Apex Biomedical | 20-102QD | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-1G | |
| Choo-Choo Cloning Kit | McLab | CCK-20 | |
| CutSmart Buffer (10x) | New England Biolabs | B7204 | |
| DNA loading dye (6x) | Thermo Scientific | R0611 | |
| dNTP Solution | New England Biolabs | N0447S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Fisher | SM1333 | |
| LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova | Teknova | L1010 | |
| LB Medium (Capsules) | MP Biomedicals | 3002-021 | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Life Technologies | AM1908 | |
| MfeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3589 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1344 | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(A) Tailing kit | Invitrogen | AM1350 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| S.O.C. medium | Thermo Fisher | 15544034 | |
| TAE buffer | Apex Biomedical | 20-193 | |
| Ultrapure Ethidium Bromide Solution | Life Technologies | 15585011 | |
| Oocyte collection | |||
| Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Calibrated micro-pipettes | Drummond Scientific Company | 2-000-025 | |
| PMSG- 5000 | Mybiosource | MBS142665 | |
| PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2 | BD | 305111 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| Oocyte micro-injection | |||
| 35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-0-20-C | For time-lapse microscopy |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Oil for Embryo Culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Petri Dish | Falcon | 351006 | For micro-injection |
| Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | For oocyte incubation |
| VacuTip Holding Capillary | Eppendorf | 5195000036 | |
| Software | |||
| Biorender | BioRender | Preparation of Figure 1S | |
| MetaMorph, version 7.8.13.0 | Molecular Devices | For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation |
References
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