Summary
このプロトコルは、 インビトロ 成熟時の単一卵母細胞におけるmRNA翻訳の調節を研究するためのレポーターアッセイを記述する。
Abstract
卵母細胞核成熟に関連する事象がよく記載されている。しかし、トティポテンシーの受精と獲得に備えて細胞質に起こる分子経路やプロセスについては、あまり知られていない。卵母細胞成熟の間、遺伝子発現の変化は、転写ではなく母体メッセンジャーRNA(mRNA)の翻訳と分解のみに依存する。従って、翻訳プログラムの実行は、胚の発達を維持するための卵母細胞の発達能力を確立する上で重要な役割を果たす。この論文は、meiotic成熟時および卵母細胞間遷移時に行われる母体母体翻訳のプログラムの定義に焦点を当てる。本方法論文では、 インビトロ 卵母細胞成熟中の標的mRNAの翻訳の調節を研究する戦略を提示する。ここでは、Ypetレポーターが目的の遺伝子の3'未翻訳領域(UTR)に融合し、注入された体積を制御するためにmCherryのためにポリアデニル化mRNAコードと共に卵母細胞にマイクロインジェクターを注入する。タイムラプス顕微鏡を使用してレポーターの蓄積を測定することにより、卵母細胞系精密成熟中の異なる遷移で翻訳速度が計算されます。ここでは、卵母細胞の単離および注入、タイムラプス記録、およびデータ分析のためのプロトコルについて、Ypet/interleukin-7(IL-7)-3'UTRレポーターを例として用いて説明した。
Introduction
完全に成長した哺乳類の卵母細胞は、受精およびトティポテンシーの獲得に備えて急速な変化を起す。これらの変化は、受精後の胚発生を維持するために不可欠である。核成熟に関連する事象は比較的よく記述されているが、卵母細胞質における分子プロセスおよび経路についてはあまり知られていない。卵母細胞成熟の最終段階では、卵母細胞は転写的に静かであり、遺伝子発現はmRNA翻訳と分解1,2に完全に依存する。したがって、発達能力に重要なタンパク質の合成は、卵母細胞の成長1,3の間に先に合成された長命mRNAの時限翻訳のプログラムに依存する。このプログラムの定義に焦点を当てたのは、meiotic成熟中および卵母細胞間遷移中に実行される母体母体翻訳のこのプログラムの定義に焦点を当て、この論文は、インビトロのmeiotic成熟の間に単一の卵母細胞における標的母性母体の翻訳の活性化と抑制を研究する戦略を提示する。
この方法では、YPetオープンリーディングフレームは、対象のトランスクリプトの3'UTRの上流にクローン化される。次に、このレポーターをコードするmRNAは、注入された体積を制御するためにmCherryをコードするポリアデニル化mRNAと共に卵母細胞にマイクロインジェクションされる。レポーター蓄積は、タイムラプス顕微鏡を用いた インビトロ 卵母細胞の精密成熟の間に測定される。黄色蛍光タンパク質(YFP)とmCherryの蓄積は、個々の卵母細胞に記録され、YFP信号は、共注入されたmCherryの高原レベルによって補正されます。データ取得後、カーブフィッティングにより得られた曲線の傾きを計算することにより、 インビトロ 卵母細胞の滑間成熟時に異なる時間間隔で翻訳速度を計算します。
このアプローチは、選択された内因性mRNAの翻訳の変化を実験的に確認するためのツールを提供します。また、この方法は、3'UTRの標的mRNA4,5,6のシス調節要素を操作することにより、卵母細胞の微細成熟時に翻訳を制御する調節要素の特性評価を容易にする。ポリ(A)尾長の操作はまた卵母細胞のアデニラーゼ/デアデニラーゼ活性への洞察を可能にする 5.シス作用要素またはRNA免疫沈降の変異生成は、同結合RNA結合タンパク質6,7との相互作用を研究するために使用することができる。さらに、この方法は、oocyteの品質が低下したモデルでターゲット3'UTR翻訳を測定することによって、卵子発達能力に不可欠な翻訳プログラムの必須成分を同定するために使用することができる8、9、10。この方法論文は、21日齢のC57/BL6マウスの裸卵母細胞がIL-7の3'UTRに融合したイペット記者とマイクロ注入された代表的な実験を提示する。卵母細胞注入、タイムラプス記録、およびデータ分析のためのセットアップおよびプロトコルについて説明した。
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Protocol
動物を含む実験的手順は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の施設動物管理および使用委員会(プロトコルAN182026)によって承認されました。
1. メディアの準備
- 表1に記載されているとおり、すべての成分を追加して、基本的な卵母細胞収集媒体および卵母細胞成熟培地を作る。基本的な収集媒体の場合は、pHを 7.4 に設定します。回収および成熟培地の場合、使用日に3mg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)と1 μMのクロスタミドを加えます。
2. Ypet-3' UTR および mCherry 用 mRNA エンコーディングの調製
- 目的のmRNAの3′UTR配列を取得します。
注:この研究では、配列は以前マウス卵母細胞cDNAから得られました。 - Ypetコード配列、V5-エピトープタグ、およびT7プロモーターを含む、卵子cDNAおよびpcDNA3.1ベクターの一部から標的3'ユートルを増幅するプライマーを設計する。
- 高忠実度のDNAポリメラーゼキットを使用して増幅します。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)製品をゲル上で実行し、フラグメントのサイズが正しいかどうかを確認し、バンドを切り取り、メーカーの指示に従ってゲル抽出キットを使用してゲルからDNAを抽出します。
- PCR クローニング キットを使用して PCR フラグメントをベクターに融合します。
注: PCR フラグメントを氷上で 4 時間インキュベートし、より効率的な組み換えプロセスを促進します。これは、わずか45分のインキュベーション時間を推奨するメーカーの指示に反しています。 - PCR断片を有能な 5 α大腸菌 にトランスフェクトする。
- ミックスとプラスミドを細菌に加え、氷の上で30分間インキュベートします。
- 45sの水浴に混合物を置くことによって混合物とプラスミドを熱ショックし、すぐに3分間氷の上で冷却します。
- カタボライト抑制(SOC)培地で500μLの超最適ブロスを加え、37°Cで1時間インキュベートします。
- 7000×gで2分間スピンダウンし、上清のほとんどを取り除く。適切な選択抗生物質とルリアブロス(LB)寒天プレートに再中断し、プレート。
注:カルベニシリンは、この研究で使用されました。 - 37°Cで一晩インキュベートする。 コロニーの1つにピペットチップを軽く押し、100μg/mLのカルベニシリンでLB培地の3mLに入れることでコロニーを分離します。37°Cで12〜24時間インキュベートする。
- メーカーの指示に従ってプラスミドDNA分離キットを使用してプラスミドのDNAを抽出し、DNAシーケンシングを介して配列を確認します。
- イペット/3' UTRの場合:
- インビトロ転写のための線形PCRテンプレートを作成します。Ypet配列の前方プライマー上流と20個の追加チミン残基を含むリバースプライマーを使用してください。Ypet/IL-7 3' UTR の配列およびフォワードおよびリバースプライマーのシーケンスについては、表 2を参照してください。
注:これらの追加のチミン残基は、 インビトロ転写後にリニアmRNAにオリゴ(A)を追加します。 - In vitro は、メーカーの指示に従って T7 転写キットを使用して PCR 製品を転写します。
- 製造者の指示に従って転写クリーンアップキットを使用して、得られた相補RNA(cRNA)を精製します。
- 精製したcRNAをRNAAseフリー水に溶け込み、濃度を測定し、アガロース電気泳動による完全性を評価します。-80°Cで保管する。
- インビトロ転写のための線形PCRテンプレートを作成します。Ypet配列の前方プライマー上流と20個の追加チミン残基を含むリバースプライマーを使用してください。Ypet/IL-7 3' UTR の配列およびフォワードおよびリバースプライマーのシーケンスについては、表 2を参照してください。
- mCherryの場合:
- 高忠実度制限酵素を使用して 、インビトロ 転写用のリニア PCR テンプレートを作成します。この例を複製する場合は、制限酵素 mfEI-HF を使用してください。消化バッファーで一晩 37 °Cで消化します。
- ゲルを実行してサンプルを精製し、メーカーの指示に従ってゲル抽出キットを使用してリニアDNAを抽出します。
- In vitro は、メーカーの指示に従って T7 転写キットを使用して PCR 製品を転写します。
- 製造者の指示に従って、ポリ(A)テーリングキットを使用してcRNA(150-200ヌクレオチド)をポリアデニル化します。
- 製造者の指示に従って、転写クリーンアップキットを使用して得られたcRNAを精製します。
- 精製したcRNAをRNAAseフリー水に溶け込み、mRNA濃度を測定し、ゲル電気泳動によりメッセージの完全性を評価します。-80°Cで保管する。
3. 実験手順
注: 卵母細胞マイクロインジェクションとその後のタイムラプス顕微鏡の概略図を 図 1に示します。
- 1日目
- 腹腔内に21日齢マウスを妊娠した雌の血清性ゴナドトロピンの5 IUを注入し、卵胞成長を促進する。
- 3日目
- 卵母細胞コレクション
- マウスを44〜48時間後に屠殺して卵巣を採取し、基本的な卵母細胞採取培地を備えたプラスチックペトリ皿に入れる。
- 26G針で卵胞壁に小さな切り傷を入れ、角包を慎重に開けます。口操作ガラスピペットを使用して、cumulus細胞のいくつかの層で無傷の積雲閉卵母細胞(COC)を分離します。
- 小さなピペット(卵母細胞の直径よりわずかに大きい)を使用し、繰り返しピペット処理を行うことによってCOCを機械的に脱裸にする。
注: または、無傷の COC にマイクロインジェクションを実行します。 - より大きなピペットを使用して、裸卵母細胞を吸引し、1μMのホスホジエステラーゼ阻害剤、シロスタミドを添加した成熟培地を含むペトリ皿に入れ、meiotic成熟12の再開を防止する。卵母細胞が卵胞から卵母細胞を単離して引き起こしたストレスから回復できるように、皿を2時間インキュベーターに入れます。
- 卵母細胞マイクロインジェクション
- 長さ10cmのホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブをメカニカルプーラーに入れ、注射針を準備します。最適な注入のために、加熱されたフィラメントを使用して針先を45°の角度で曲げ。
- 基本的な卵母細胞の収集媒体の20 μLの液滴でポリスチレン皿を準備し、軽いミネラルオイルで液滴をカバーする。
- 12.5 μg/μL Ypet-3' UTR と 12.5 μg/μL mCherry を追加して、レポーターミックスを準備します。より大きなボリュームを準備し、同様のレポーター濃度を確保するために、将来の実験のためのアリコートを作ります。これらのアリコートは-80°Cで保管してください。 解凍すると、最初に20,000 x gで2分間アリコートを遠心し、新しいマイクロ遠心チューブに移します。
注:この遠心分離は、注射針がレポーターミックスの潜在的な凝集体によって詰まるのを防ぎます。 - 約0.5μLのレポーターミックスで毛細血管で注射針をロードします。
- 保持ピペットと装填された注射針をホルダーに入れ、卵母細胞採取培地の液滴に位置します。培地の一部を保持ピペットに吸引する。
- 注入針を、保持ピペットにそっと叩いて開きます。
- 卵母細胞を基本採取培地の液滴に入れ、レポーターミックスの5〜10pLを注入する。
- 1μMシロサミドを16時間分の成熟培地にインキュベートし、mCherry信号を高原にします。
- 注入されたレポーターごとに少なくとも2つの20 μL滴の成熟培地でタイムラプス顕微鏡に使用されるペトリ皿を準備します:1 μMシロスターミドを持つ1滴の切り出しは、I逮捕卵細胞を制御し、1滴は卵細胞を成熟させるクロスタミドなしで準備します。軽いミネラルオイルで液滴を覆い、インキュベーターに入れます。
- タイムラプス顕微鏡
- インキュベーション後、注入した卵母細胞をインキュベーターから取り出し、シロスターミドを使わずに成熟培地で4回洗浄します。1 μMシロスターミドを含む成熟培地の中に、I逮捕卵母細胞対照群としていくつかの卵母細胞を保管します。
- 注入された卵母細胞を、以前に調製したタイムラプス顕微鏡皿のそれぞれの液滴に移す。閉じたガラスピペットを使用して卵母細胞をクラスター化します(閉じたピペットは、数秒間炎の中で先端を保持することによって準備することができます)。
注: 卵母細胞をクラスタリングすると、記録中の移動を防ぐことができます。 - 37°Cと5%CO2で維持された環境室を備えた発光ダイオード照明システムとモーター式ステージを備えた顕微鏡の下に皿を置きます。この調査を複製するには、次のパラメータを使用します: フィルタセット: 二色ミラー YFP/CFP/mCherry 69008BS;YFPチャネル(励起(Ex):S500/20 ×49057;エミッション(EM):D535/30 m 47281)、mCherryチャンネル(Ex:580/25 ×49829;エム:632/60メートル)。
- タイムラプス実験に適した設定を入力します(この調査で使用するソフトウェアの資料表を参照してください):[アプリ]をクリック| 多次元取得.最初のタブを選択して、タイムラプス、複数のステージ位置、および複数の波長を選択します。
- [ 保存] タブを選択して、実験を保存する場所を入力します。
- タブ Timelapse を選択して、時間ポイント数、期間、および時間間隔を入力します。
注:タイムラプス実験の期間は、卵母細胞の微細成熟のタイミングが種によって異なるように、研究された動物種に依存します。マウス卵母細胞を用いたこの実験では、卵母細胞を16時間毎に15分毎に記録した。 - タブの [ステージ] を選択します。ブライトフィールドをオンにし、[取得] を選択して新しいウィンドウを開いて、卵母細胞の位置を見 つけます||を取得するライブを表示します。卵母細胞が見つかったら、[ 多次元取得 ]ウィンドウに戻り、+を押して卵母細胞の位置を設定します。
- [ 波長]タブを選択し、明視野(露出15ミリ秒)、YFP(Ypet/ IL7 3' UTRの露出150 ms)、およびmCherry(Ypet / IL7 3'UTRの露出75 ms)に3つの異なる波長を設定します。
注:レポーターの蓄積のレベルと注入されたボリュームに基づいて、Ypet/3' UTRレポータごとに露出を調整します。YFP信号が実験開始時に検出範囲の中心に収まるようにして、翻訳の活性化の場合の過小評価や飽和を防ぎます。mCherryの場合、シグナルがポリアデニル化手順中に追加されたアデニンヌクレオチドの数に依存するので、mCherryの各バッチの暴露を調整します。ポリアデニル化効率のばらつきのため、実験間の比較を改善するために、異なる実験で同じバッチのmCherryを使用します。 - [取得] をクリックして、タイムラプス実験を開始します。単一の卵母細胞でのタイムラプス記録の例については、図2と補足ファイルを参照してください。
- Ypet-3' UTR翻訳の分析
- この分析(本研究で使用するソフトウェア の材料表 を参照)では、卵母細胞自体が 楕円領域 をクリックして、卵母細胞を囲み、卵母細胞に近い小さな領域を囲み、 矩形領域のバックグラウンド減算クリックに使用する2つの領域測定を行います。
注: タイムラプス記録中に、選択した領域から卵母細胞が移動しないようにします。これは卵母細胞の動きを引き起こし、記録を歪める可能性があるため、極体押出の周りの領域測定の配置に特別な注意を払ってください。 - 最初に [ログを開く ] をクリックし、[ ログ データ ] をクリックしてデータ分析ソフトウェアをエクスポートして、地域の測定データをスプレッドシートにエクスポートします。
- 個々の卵母細胞と測定された時間ポイントごとに、卵母細胞領域の測定値から背景領域の測定値を差し引きます。YFP と mCherry の波長に対しては、これを別々に行います。
- 後で参照するために、胚状の小胞破壊(GVBD)と極体押出(PBE)のタイミングを記録します。
注: GVBD が 2 時間を超えた場合は、マウスの卵母細胞を除外します。 - 各卵母細胞が外れ値をチェックするために YFP と mCherry の表現を時間をかけてプロットします。
注: 滑らかなカーブでない場合は、録音中に卵母細胞が移動したことを示している可能性があります。 - 個々の卵母細胞について、記録の最後の10のタイムポイントの平均mCherry表現を計算します。各タイムポイントについて、YFP 式を平均 mCherry 式で割って、注入されたボリュームを補正し、個々の卵母細胞の各時間ポイントで YFP/mCherry 比を得る。
- 線形回帰によって曲線の傾きを合わせて、特定の時間間隔の翻訳速度を計算します。統計的推論を使用して、翻訳率の差を評価します。
- この分析(本研究で使用するソフトウェア の材料表 を参照)では、卵母細胞自体が 楕円領域 をクリックして、卵母細胞を囲み、卵母細胞に近い小さな領域を囲み、 矩形領域のバックグラウンド減算クリックに使用する2つの領域測定を行います。
- 卵母細胞コレクション
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Representative Results
21日齢のC57/BL6マウスのI逮捕卵母細胞を否定したプロフェイズI逮捕卵母細胞は、Il-7の3'UTRとmRNAコードmCherryの3'UTRに融合したイペットレポーターをコードするmRNAを含むレポーターミックスを注射した。YFPとmCherryの発現は39個の卵母細胞に記録され、そのうち30個が成熟し、9人が陰性対照として相Iで逮捕された。3つの成熟卵母細胞は、GVBDが遅れたか(N =2)か、録音中に皿内を移動したため(N=1)ため、分析のために除外された。 図3 は、フェーズIおよび成熟卵子におけるmCherryおよびYFP発現を示す。 図4 は、注入された体積を補正するためにプラトー式mCherry発現(最後の10時点で平均mCherry発現)を補正した成熟卵母細胞のYFP発現を示す。レポーターの翻訳速度は、カーブフィッティング(線形回帰)のYFP/mCherry値をプロフェーズIで、そしてシロスアミド放出後の最初の0〜2時間または8〜10時間の間に卵母細胞を成熟させて測定した(図5A)。レポーターの蓄積は、シロスターミド放出後の0-2時間と8-10時間の間の翻訳速度の有意な差によって示されるように線形パターンに従わない(p<0.0001; 図5B)。したがって、これらの結果は、卵母細胞の病気の成熟の間にIL-7翻訳の活性化を示す。
図1: 実験手順の概略図 オリゴアデニル化 Ypet/3' UTR およびポリアデニル化 mRNA コード mCherry は、21日齢の C57/BL6 マウスのヌード卵母細胞にマイクロインジェクションされます。卵母細胞は、成熟培地を含むシロアミド中で16時間前培養され、mCherry信号が高原に到達することを可能にする。インキュベーション前に、卵母細胞がシロスターミドと培地に保管され、プロフェーズI逮捕対照群を作成するか、またはシロスアミドフリー培地で成熟する状態で放出されるタイムラプス記録が開始される。略語: UTR = 未翻訳領域;YFP = 黄色の蛍光タンパク質;fw プライマー = フォワードプライマー;回転プライマー = リバースプライマー;アンプラ=アンピシリン耐性;ポリA = ポリアデニル;オリゴア = オリゴアデニル;GV = 胚芽小胞。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:単一の卵母細胞タイムラプス記録の例 ブライトフィールド、YFP、およびmCherryの単一の卵母細胞の録音は、プロフェイズI、MI(シロスターミド放出後6時間)、MII(シロスターミド放出後15時間)でYpet/Interleukin-7 3'UTRおよびポリアデニル化mCherryをコードするmRNAを注入した。スケールバー= 25 μm。略語: YFP = 黄色の蛍光タンパク質;GV = 生殖小胞;MI = メタフェーズ I;MII = メタフェーズ II. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:タイムラプス顕微鏡で記録されたYFPおよびmCherry信号 オリゴアデニル化 Ypet/IL7 3' UTR および mCherry をコードするポリアデニル化 mRNA を注入した卵母細胞の YFP および mCherry シグナル。卵母細胞は、シロスターミドと共に培地に保管され、I逮捕対照群(N=9)の相を生成するか、成熟を可能にするためにクロスアミドフリー培地で放出された(N=30)。データは個々の卵母細胞の測定である。略語: IL-7 = インターロイキン-7;YFP = 黄色の蛍光タンパク質。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:YFP信号を共注入したmCherryレベルに補正した。 I逮捕および成熟卵母細胞のYFP信号は、YFP信号を最後の10のタイムポイントの平均mCherry信号で割ることによって、注入された体積に対して修正された。(A)プロフェイズI逮捕卵母細胞および(B)成熟卵母細胞に対する個々のYFP/mCherry比は、(C)プロフェイズI逮捕および(D)交配卵子の平均YFP/mCherry比の±標準誤差を意味する。略語: YFP = 黄色の蛍光タンパク質;GVBD = 胚芽小胞の破壊。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:0-2時間および8-10時間の成熟度で計算された翻訳速度。 (A)シロスターミド放出後0-2時間または8-10時間でmCherry(YFP/mCherry)を補正した単一卵母細胞の黄色蛍光タンパク質(YFP)シグナルおよび(B)はカーブフィッティング(線形回帰)で計算した翻訳速度(平均±平均の標準誤差)で計算したシロセステ放出後のYFP/mCherry値を0-2hおよび8-10hで算出した。データは、ペアになっていない両側t検定を用いて分析した。 *p < 0.0001. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6: 翻訳抑制の例: Oosp2. 卵母細胞にYpet-Oosp2 3′ UTRおよびmCherryをコードするポリアデニル化mRNAを注入した実験のデータを再分析した。I逮捕されたフェーズ(N=63)と成熟卵母細胞(N=72)のYFP信号を、YFP信号を最後の10タイムポイントの平均mCherry信号で割って注入された体積を補正した。YFPとmCherryの発現データは、LED光源を使用したIL-7実験とは異なり、キセノンアークランプを使用して取得した。データは、個々の卵母細胞測定の平均の平均±標準誤差を表し、以前にLuongらで公表された。5.略語: YFP = 黄色の蛍光タンパク質;Oosp2 = 卵母細胞分泌タンパク質 2;UTR = 未翻訳領域;IL-7 = インターロイキン-7;LED=発光ダイオード;GVBD = 胚芽小胞の破壊。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7: GVBDおよびPBEのタイミングに及ぼすマイクロインジェクションおよび蛍光曝露の影響 GVBDおよび卵母細胞のPBEのタイミングは、マイクロ注入され、蛍光にさらされる(注入)、または未注入で蛍光にさらされなかった(注射されていない)。データは個々の卵母細胞の測定である。データは、ペアになっていない両側 t-testを用いて分析した。 *p<0.001.略語: GVBD = 胚芽小胞の破壊;PBE= 極体押し出し。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 基本的な卵母細胞コレクション媒体 | ||
| コンポーネント | 500 mLの場合 | |
| HEPESは、最小必須培地イーグルを変更しました | 7.1 g | |
| 炭酸水素ナトリウム | 252 mg | |
| ピルビン酸ナトリウム | 1.15 mL | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン 100x | 5 mL | |
| 超純蒸留水(インビトロジェン、10977-015) | 500 mLまで | |
| 成熟培地 | ||
| コンポーネント | 500 mLの場合 | |
| MEMアルファ1x | 500 mLまで | |
| ピルビン酸ナトリウム | 1.15 mL | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン 100x | 5 mL | |
表1:メディアの準備 基本的な卵母細胞収集培地および卵母細胞成熟培地を調製するために追加する必要があるコンポーネントのリスト。
| 順序 | |||||
| イペット/インターロイキン-7 3' UTR | ガガハッカクトクトクCGAattaataCGACTCACTATAGGガガガガガッカガッカクカグカグク GCTAGTTAGGCTGGGGCTGGATACCACCACCACCACCACCACCACCGGACCGGGGGGGGGGGGGGCGA アガクトクトカックチャクグクトクチャクチクトクトガグクチャクガック アカーアクトカグチャグクトガググラムCGGCGGCGAGGGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCACCACCTACGGCTGACCCTG アアグクトクトロッカックグカッグクトググラムグッヒクト・アッケグ・アックトクト グッタックグクトクトガクトクトゥクマクグ・グルチックガカガガGCGCガッカガカッテクトクトッカ アガグコッカグアッガグガグガッググクタッグクトGCAGGAggaggaggggaccatctTCTTCAAGGAGGCGアッカッカ チャカーガガックグクグガグクトガークトグッガグコッガグGCGCGACCCTGGGGGGGGGCGCガクガ アグGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCGGGCカカアグクトクトガカアクサカアク アクトカアクグタカカッカッカガグカガアガックッカッカガッカガクトカクトアクトカーガガト CCGGCACAACATCGAGGAGGGGCGGCGCGCGGGGGGGGGCGGGCGGGGGCGCGGGCGGGCGCGGGCGCGCGGGCGCGCGCGGGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCACCACCACCAGGCACCCC カッCGGCGCGCGCTGCCCCGACAACCACCクトガクトッカッカガッカガッカガグCGCCCTG TTCAAGGACCCCCCAAAGAGGGGACCACCACCCATGGTGCTGCTGGGGGgGgTgtTGGGgTgttcctaccggGGCGCC グッカタッカーッカグガッガグカガグククトクトタータガガトクトCGAAGGTAGCCTATCCCAA CCCTCTCCTCGCTCGATTCGCGTACCGGGGTCATカカカカトガアッガサック アグタガアカアッカッカガガテクトクトガガガグットガクトクトッカグ AAGTTGGGGATGCクトクトクトクトチャガッカアタカガグガグタット アガガッガガカガトGCGCCTGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCTGCTGCTGCTGCGCGCGCTGCGCGCGCGCGCGCATATATATAA クカタガッタクトガテクトカッテクトチャクトGCTTTTTAATGTTTTTTTTTTTTTTTTTC ターアカッチャアクトタカアアアグカアグクトガーガガタットカガグチャクトッタクトクタグ AAAAATATATATGGATATATATACATTTGGTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGTGTクトッタッグ アクグガタクガッグガッグガッチャッグガッチャタテクトガーアアアアカガクトタッタガー アグガグカーアガーガグッタガッチャグカシア・カア・タグッタットガートガートガタカ カタクトカグターガガッカガガタットッタアアアクトGTタットッタアアクトタットッタガガターテGCACTTAT TCCAAAAACTGCTTAGTタット・カクトタアターガアガテ TTTTCATTTTGAAAAAGTATTttttaaaaatgcactttttaaTTAATGTTTTAATTTTTTTT TGGCATTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTATCTCTCTATCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT アット・カタクトアクトカクトットッタクト・タッチャクト・アック・タッチャッタカッカ TGTCGTCCCTACTCTGCGCGTクトガタカガッタハッカッタカッテ アタクトッタッカクトカッカクトカッガッタタグカガガガクトクトッタクトッタガガーガー アカタットクトッタタグタグクトターグカグチャグチャガッグタッタタッガトチャガカガグ カアタッテグッタタガタカタットクトッタクトッタット GTATGCCTGTッタクトクトットTTTTTTTTTCAGTTGTGTTAATGGAAAAAACACTA TGTTGTAGAGGCAAtTCTGAAGTGTTTTGTACTGAATTCTCTTTTTTTTTTTTTT TTCCAGCCTGAGGAGCATCCTCTCTTTGACCATGCGCGCGCGGGGCAC アトGCGTGTGTGTGGタグクト タカガタグクトガッガッタッタクトガアアカッチャアットクトッタッタgtTTTtカタトカッカキャット GcCCCAAAacaGTTCTCTCTCAACTTTTTTTTTACATGTAATATTAAAAACTCAATTTTTTTAATGGACTT TCGATAACTTCCTタガタカタタカタマカタマチックカトクトクトクト アグハックッタグタグCGAACTGAAGGCATCATGTGTGTAAGATCTCTATATACCTGCAAGGCTCTGGGGAT GGCTCCCCAATTGAAATTCtTTTggaaaaggatatttt |
||||
| フォワードプライマー | ガガアハマクアクティクト | ||||
| リバースプライマー | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAATATATCCTTTTTTTTTTTTTTG CCAAAATC |
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表2:YFP/IL7 3'UTRレポーターのレポーターとプライマー配列のシーケンスと、インビトロ転写用のリニアPCRテンプレートを生成するために使用されたフォワードおよびリバースプライマーのシーケンスの例。
補足ファイル:黄色蛍光タンパク質(YFP)および mCherry タイムラプス記録。 Ypet/Interleukin-7 3' UTRおよびポリアデニル化mCherryをコードするmRNAを注入した単一の卵母細胞のYFPおよびmCherryタイムラプス記録。YFP チャンネル (S500/20 × 49057;Em: D535/30 m 47281), mCherryチャンネル (Ex: 580/25 × 49829;エム:632/60メートル)。卵母細胞は16時間(7フレーム/秒)15分ごとに記録された。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
提示された方法は、インビトロ卵母細胞のmeiotic成熟中に異なる遷移における標的mRNAの翻訳の活性化および抑制を研究する戦略を記述する。IL-7は、卵母細胞-cumulus細胞通信8,13に関与し得る卵母細胞によって放出されるサイトカインを、この方法を記述する目的で選択した。IL-7は卵母細胞成熟8中にますます翻訳されることが知られており、この方法を用いた翻訳活性化の良好な可視化を可能にする。しかし、実験全体を通して一定の速度で翻訳が行われると、レポーターの蓄積は線形パターンに従い、実験の開始と終了の翻訳速度は類似します。この結論は、全体の記録間隔を通して線形回帰の適合度(R)によって検証することができる。記者の翻訳における抑圧は、YFP信号の高原として自分自身を提示します。
3'UTR翻訳の抑圧の一例は、Luongらの研究で見つけることができます。5、著者らは、卵母細胞の大腸成熟中に卵母細胞分泌タンパク質2(Oosp2)の抑制を報告する。これらのデータは再分析されており、 図 6に示します。成熟卵母細胞は、翻訳の抑制を示すYFP信号の高原を示し、フェーズI逮捕対照群は、実験の開始時と終了時に同様の翻訳速度を示すレポーター蓄積の線形パターンに従う。翻訳の抑制を研究する際には、YPFシグナルの高原が貧しい培養条件による卵母細胞の質の低下によって説明されないようにするために、I逮捕された対照群を含めることが特に重要であり、したがって卵母細胞の生存可能性を確認する。レポーターの蓄積は、YFP用プライマーを用いた定量的な逆転写PCR、またはこのプロトコルに含まれるV5-エピトープタグを利用してウェスタンブロットすることにより検証することができる。
YFP信号の高原は、翻訳の積極的に調節された抑圧によるものではないが、卵母細胞の大動脈進行中のレポーターの劣化によっても説明され得る。これは、胚性ゲノム発現14、15、16への移行に不可欠である内因性mRNAの不安定化を反映し得る。この可能性は、mRNAの安定性を確認するために、フェーズIステージとメタフェーズII段階での標的遺伝子転写レベルを測定することによって検証することができる。卵母細胞cDNAを調製する場合、オリゴdTプライミング上にランダムな六方体プライミングを使用することが好ましい。後者の方法は、これらの転写物の多重(A)長さの違いを反映する可能性のある遺伝子転写レベルの明らかな違いを示すが、転写レベル7の実際の違いではなく。
マウス卵母細胞におけるゲノム全体の内因性mRNA翻訳を研究する方法はいくつかあります。これらの方法には、ポリソームプロファイリング7、17、18、RiboTag/RNA-Seq 5、19、20が含まれます。リボソームプロファイリングは、酵母で使用されているゲノム全体の翻訳を研究するもう一つの方法であり、これは、meiosis21,22を研究するために使用される別のモデル生物である。しかし、マウスでmRNA翻訳を研究するためのこれらのゲノム全体の分析は、サンプル当たり150〜200個の卵母細胞を使用する必要がありますが、分析に利用できる卵母細胞の数は通常限られています。標的mRNAの3'UTRの翻訳を評価するために本明細書に記載されている単卵母細胞アッセイは、卵母細胞系間の翻訳プログラムを調節する3'UTRの要素の特徴付けが可能となるため、翻訳のゲノム全体の分析を補完する。以前は、ルシファーゼベースのアッセイは、サンプルあたり少数の卵母細胞のみを必要とする非常に敏感な方法であるため、標的mRNA10、20、23の3'UTRの翻訳を評価するために使用されました。しかし、卵母細胞はサンプル中のルシファーゼの量を検出するためにlysedする必要があります。
他の人は、3' UTR/緑色蛍光タンパク質 (GFP) レポーターを使用して、生きたマウス卵母細胞4の GFP 蓄積を評価しています。しかし、これらの実験では、インキュベーションの開始(相I)とインキュベーションの終了(メタフェーズII)の2つのタイムポイントのみが使用されました。これは測定の力を非常に減少させ、エラーの可能性を高める。キネティックデータは、レート(複数ポイント)に基づいて正確な測定を提供し、翻訳の活性化または抑圧が行われる時間を正確に定義します。さらに、翻訳の抑圧は、これらの単一のタイムポイントで評価することができず、不正確な結論につながる可能性があります。したがって、この方法は、マウス卵母細胞5、6、9のインビトロ成熟を通してYpet/3'UTRレポーターの蓄積を評価するためにタイムラプス顕微鏡を適用することによって調整した。この戦略を用いることで、卵母細胞成熟時に異なる遷移で翻訳を研究することが可能となる。
この方法には、考慮すべきいくつかの重要な側面があります。まず、使用される記者は、その省略がかなりレポーターの蓄積を減少させるオリゴ(A)尾を含みます。これは、レポーターmRNA不安定化24,25と同様に翻訳の減少の両方に起因する可能性がある。相Iにおける前インキュベーション中に、オリゴアデニル化プローブの翻訳は、内因性mRNA5の翻訳速度を反映するように調整する。第二に、蛍光暴露の記録数または持続時間の増加が光毒性を誘発し、それによって卵母細胞の品質を損なう可能性があることを認識することが重要である。現在の実験では15分間隔を採用していますが、レポーター発現が低い場合には高い蛍光露光を使用する必要がある場合にサンプリングレートを低下させることができます。
光毒性の量を制限するために、冷たいLED光源を使用し、短い励起26を必要とする。卵母細胞における潜在的な光毒性効果を評価するために、GVBDおよびPBEのタイミングを、マイクロインジェクションして蛍光にさらされたか、または注入されず蛍光にさらされていない卵母細胞で比較した。マイクロ注射と蛍光曝露の組み合わせはGVBD(p<0.001)をわずかに遅らせることが分かったが、PBEのタイミングは類似していた(図7)。
この方法は、体外卵母細胞の造成の間に3'UTRの翻訳調節要素を研究するために使用されてきた。同様に、翻訳の調節に不可欠な機能5'UTR要素を研究したり、体外卵母細胞受精中に翻訳を研究するためにも使用することができる。この方法はヒトおよびマウスの卵母細胞に適用されているが、他の動物種にも適用可能である。このレポーターアッセイは単一の卵母細胞で行われるため、分析に利用できる卵母細胞の数が限られている単発性種での使用に特に適している。脱裸卵母細胞を用いるように、この技術のもう一つの応用は、積雲細胞が翻訳プログラム8、10、27の調節において大きな役割を果たすため、積雲で囲まれた卵母細胞へのレポーターの注入である。しかし、CUC拡張中の積雲細胞の動きのために、積雲を含む卵母細胞は、実験中に記録面から離れる可能性が高いことを考慮する必要があります。これにより、分析から除外する必要がある卵母細胞の割合が大きくなる可能性があります。将来的には、液滴中の卵母細胞のx、y、z位置を追跡できるセルトラッキングソフトウェアが使用される可能性があり、この問題を解決する可能性があります。
結論として、記載された単一の卵母細胞レポーターアッセイは、卵母細胞間遷移で実行される翻訳プログラムを調査する戦略を表す。この翻訳プログラムの知識の増加は、卵母細胞の発達能力の分子調節に関する重要な手がかりを提供することができます。
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Disclosures
著者らは利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
この研究は、NIH R01 GM097165、GM116926、ユーニス・ケネディ・シュリバーNICHD国立生殖・不妊研究センターP50 HD055764からマルコ・コンティに支援されました。エンリコ・M・ダルデッロはラロール財団のフェローシップによって支援され、ナタシャ・G・J・コスターマンスはオランダ科学研究機構(NWO)のルビコン・フェローシップによって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Preparation of media | |||
| Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra | Sigma-Aldrich | SIAL-A3311 | |
| Cilostamide | EMD Millipore | 231085 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M2645 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered | Genesee Scientific Corporation (GenClone) | 25-512 | |
| Sodium Bicarbonate | JT-Baker | 3506-1 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry | |||
| Agarose | Apex Biomedical | 20-102QD | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-1G | |
| Choo-Choo Cloning Kit | McLab | CCK-20 | |
| CutSmart Buffer (10x) | New England Biolabs | B7204 | |
| DNA loading dye (6x) | Thermo Scientific | R0611 | |
| dNTP Solution | New England Biolabs | N0447S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Fisher | SM1333 | |
| LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova | Teknova | L1010 | |
| LB Medium (Capsules) | MP Biomedicals | 3002-021 | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Life Technologies | AM1908 | |
| MfeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3589 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1344 | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(A) Tailing kit | Invitrogen | AM1350 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| S.O.C. medium | Thermo Fisher | 15544034 | |
| TAE buffer | Apex Biomedical | 20-193 | |
| Ultrapure Ethidium Bromide Solution | Life Technologies | 15585011 | |
| Oocyte collection | |||
| Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Calibrated micro-pipettes | Drummond Scientific Company | 2-000-025 | |
| PMSG- 5000 | Mybiosource | MBS142665 | |
| PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2 | BD | 305111 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| Oocyte micro-injection | |||
| 35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-0-20-C | For time-lapse microscopy |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Oil for Embryo Culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Petri Dish | Falcon | 351006 | For micro-injection |
| Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | For oocyte incubation |
| VacuTip Holding Capillary | Eppendorf | 5195000036 | |
| Software | |||
| Biorender | BioRender | Preparation of Figure 1S | |
| MetaMorph, version 7.8.13.0 | Molecular Devices | For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation |
References
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