Summary
Este protocolo descreve um ensaio repórter para estudar a regulação da tradução de mRNA em oócitos únicos durante a maturação in vitro.
Abstract
Eventos associados à maturação nuclear oócito foram bem descritos. No entanto, muito menos se sabe sobre as vias moleculares e processos que ocorrem no citoplasma em preparação para fertilização e aquisição de totipotency. Durante a maturação do oócito, as mudanças na expressão genética dependem exclusivamente da tradução e degradação das RNAs (mRNAs) do mensageiro materno, em vez da transcrição. A execução do programa translacional, portanto, desempenha um papel fundamental no estabelecimento da competência de desenvolvimento oócito para sustentar o desenvolvimento de embriões. Este artigo faz parte de um foco na definição do programa de tradução materna de mRNA que ocorre durante a maturação meiotica e na transição oócito-zigoto. Neste artigo de método, é apresentada uma estratégia para estudar a regulação da tradução de mRNAs-alvo durante a maturação in vitro oócito. Aqui, um repórter Ypet é fundido à região não traduzida (UTR) de 3' do gene de interesse e, em seguida, micro-injetado em oócitos juntamente com codificação mRNA poliadenilada para mCherry para controlar o volume injetado. Usando microscopia de lapso de tempo para medir o acúmulo de repórteres, as taxas de tradução são calculadas em diferentes transições durante o maturação meiotic oócito. Aqui, os protocolos de isolamento e injeção de oócitos, gravação de lapso de tempo e análise de dados foram descritos, usando o repórter Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3' UTR como exemplo.
Introduction
Um oócito mamífero totalmente cultivado sofre mudanças rápidas na preparação para fertilização e aquisição de totipotency. Essas mudanças são essenciais para sustentar o desenvolvimento embrionário após a fertilização. Embora os eventos associados à maturação nuclear sejam relativamente bem descritos, muito menos se sabe sobre os processos moleculares e caminhos no citoplasma oócito. Durante os estágios finais da maturação do oócito, os oócitos são transcricionalmente silenciosos, e a expressão genética é inteiramente dependente da tradução e degradação do mRNA1,2. A síntese de proteínas críticas para a competência do desenvolvimento, portanto, conta com um programa de tradução cronometrada de mRNAs de longa duração que foram sintetizadas anteriormente durante o crescimento do oócito1,3. Como parte de um foco na definição deste programa de tradução materna mRNA executado durante a maturação meiotic e na transição oólito-zigoto, este artigo apresenta uma estratégia para estudar a ativação e repressão da tradução de mRNAs maternas-alvo em oócitos únicos durante a maturação in vitro.
Neste método, o quadro de leitura aberto YPet é clonado a montante da UTR de 3' da transcrição de interesse. Em seguida, mRNAs codificando este repórter são micro-injetados em oócitos juntamente com mRNAs poliadenilated codificando mCherry para controlar o volume injetado. O acúmulo de repórteres é medido durante a maturação meiotic in vitro oocíte usando microscopia de lapso de tempo. O acúmulo de proteína fluorescente amarela (YFP) e mCherry é registrado em oócitos individuais, e os sinais de YFP são corrigidos pelo nível nivelado do mCherry co-injetado. Após a aquisição dos dados, as taxas de tradução são calculadas para diferentes intervalos de tempo durante a maturação meiotic in vitro oocito calculando a inclinação da curva obtida pelo encaixe da curva.
Esta abordagem fornece uma ferramenta para confirmar experimentalmente mudanças na tradução de mRNAs endógenos selecionados. Além disso, este método facilita a caracterização de elementos regulatórios que controlam a tradução durante o amadurecimento meiotico oocíte, manipulando elementos cis-regulatórios da UTR de 3' dasmRNAs-alvo 4,5,6. A manipulação do comprimento da cauda poli(A) também permite a percepção da atividade adenylase/deadenylase em oócitos5. Mutagênese de elementos cis-ação ou imunoprecipitação de RNA pode ser usado para estudar interações com proteínas de ligação RNA cogina6,7. Além disso, este método pode ser usado para identificar componentes essenciais do programa de tradução que são críticos para a competência de desenvolvimento oócito, medindo a tradução UTR alvo 3' em modelos associados à diminuição da qualidade do oócito 8,9,10. Este artigo de método apresenta um experimento representativo onde oócitos desnudados de camundongos C57/BL6 de 21 dias de idade foram micro-injetados com um repórter Ypet fundido ao UTR de 3' de IL-7. A configuração e o protocolo para injeção de oócito, gravação de lapso de tempo e análise de dados foram descritos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Os procedimentos experimentais envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Califórnia em São Francisco (protocolo AN182026).
1. Preparação de mídia
- Adicione todos os componentes, conforme descrito na Tabela 1,para tornar a média de maturação básica da coleta de oócitos e oócitos. Para o meio de coleta básica, defina o pH para 7,4. Para o meio de coleta e maturação, adicione 3 mg/mL de albumina de soro bovino (BSA) e 1 μM cilostamida no dia do uso.
2. Preparação de codificação mRNA para UTR Ypet-3' e mCherry
- Obtenha as sequências UTR de 3′ dos mRNAs de interesse.
NOTA: Para este estudo, as sequências foram obtidas anteriormente a partir de cDNA oocito de rato. - Projete primers para amplificar os UTRs de 3' alvo do oócito cDNA e partes do vetor pcDNA 3.1 contendo uma sequência de codificação Ypet, tag V5-epitope e um promotor T7.
- Amplifique usando um kit de polimerase de DNA de alta fidelidade. Execute os produtos de reação em cadeia de polimerase (PCR) em um gel para verificar se os fragmentos têm o tamanho correto, cortar as bandas e extrair o DNA do gel usando um kit de extração de gel de acordo com as instruções do fabricante.
- Fundir os fragmentos do PCR em um vetor usando um kit de clonagem PCR.
NOTA: Fragmentos de PCR foram incubados no gelo por 4h para facilitar um processo de recombinação mais eficiente. Isso é contrário às instruções do fabricante, que recomendam um tempo de incubação de apenas 45 min. - Fragmentos transfect PCR em bactérias competentes de 5 α Escherichia coli.
- Adicione a mistura e plasmid às bactérias, e incubar no gelo por 30 minutos.
- Aqueça a mistura e o plasmídeo colocando a mistura em um banho de água a 42 °C por 45 s, e esfrie imediatamente no gelo por 3 minutos.
- Adicione 500 μL de caldo Super Ótimo com médio de repressão catabólica (SOC) e incubar por 1h a 37 °C.
- Gire a 7000 × g por 2 min, e remova a maior parte do supernante. Resuspend e placa em uma placa de ágar Luria Broth (LB) com o antibiótico de seleção apropriado.
NOTA: A carbenicilina foi utilizada neste estudo. - Incubar durante a noite a 37 °C. Isole as colônias pressionando levemente uma ponta de pipeta em uma das colônias e colocando-a em 3 mL de meio LB com 100 μg/mL de carbenicilina. Incubar por 12-24 h a 37 °C.
- Extrair o DNA dos plasmídeos usando o kit de isolamento de DNA plasmídeo de acordo com as instruções do fabricante e confirmar as sequências através de sequenciamento de DNA.
- Para Ypet/3' UTR:
- Produzir um modelo PCR linear para transcrição in vitro. Use uma primer para a frente a montante da sequência Ypet e um primer reverso com 20 resíduos adicionais de timina. Consulte a Tabela 2 para a sequência de Ypet/IL-7 3' UTR e as sequências dos primers dianteiros e invertidos.
NOTA: Esses resíduos adicionais de timina adicionarão oligo(A) ao mRNA linear após transcrição in vitro . - In vitro transcreva o produto PCR usando um kit de transcrição T7 de acordo com as instruções do fabricante.
- Purifique o RNA complementar resultante (cRNA) usando um kit de limpeza de transcrição de acordo com as instruções do fabricante.
- Elute o cRNA purificado na água livre de RNAse, mede a concentração e avalia a integridade por eletroforese agarose. Armazenar a −80 °C.
- Produzir um modelo PCR linear para transcrição in vitro. Use uma primer para a frente a montante da sequência Ypet e um primer reverso com 20 resíduos adicionais de timina. Consulte a Tabela 2 para a sequência de Ypet/IL-7 3' UTR e as sequências dos primers dianteiros e invertidos.
- Para mCherry:
- Produzir um modelo PCR linear para transcrição in vitro usando uma enzima de restrição de alta fidelidade; use a enzima de restrição mfEI-HF se replicar este exemplo. Digerir em um tampão de digestão durante a noite a 37 °C.
- Execute um gel para purificar a amostra e extraia o DNA linear usando um kit de extração de gel de acordo com as instruções do fabricante.
- In vitro transcreva o produto PCR usando um kit de transcrição T7 de acordo com as instruções do fabricante.
- Poliadenilate o cRNA (150-200 nucleotídeos) utilizando um kit de rejeito poli(A) de acordo com as instruções do fabricante.
- Purifique o cRNA resultante usando um kit de limpeza de transcrição de acordo com as instruções do fabricante.
- Elute o cRNA purificado em água livre de RNAse, mede as concentrações de mRNA e avalia a integridade da mensagem por eletroforese de gel. Armazenar a −80 °C.
3. Procedimento experimental
NOTA: Uma visão geral esquemática da microinjeção de oócito e da microscopia de lapso de tempo subsequente é dada na Figura 1.
- Dia 1º
- Injetar intraperitoneally camundongos de 21 dias de idade com 5 UI de gonadotropina soro da égua grávida para promover o crescimento do folículo para o estágio antral11.
- Dia 3.
- Coleção Oocyte
- Sacrifique ratos 44-48 h depois de preparar para coletar os ovários, e colocá-los em uma placa de Petri de plástico com meio básico de coleta de oócito.
- Abra cuidadosamente os folículos antrais fazendo um pequeno corte na parede do folículo com uma agulha de 26 G. Isole os oócitos intactos cumulus-enclosed (COCs) com várias camadas de células cumulus usando uma pipeta de vidro operada pela boca.
- Use uma pipeta menor (ligeiramente maior que o diâmetro do oócito), e desnuda mecanicamente os COCs por tubulação repetida.
NOTA: Alternativamente, realize a micro-injeção em COCs intactos. - Utilizando uma pipeta maior, aspire os oócitos desnudados e coloque-os em uma placa de Petri com meio de maturação suplementado com 1 μM do inibidor de fosfodiesterase, cilostamida, para evitar a retomada da maturação meiotic12. Coloque o prato na incubadora por 2h para que os oócitos se recuperem do estresse induzido pelo isolamento dos oócitos dos folículos.
- Micro-injeção de oócito
- Prepare as agulhas de injeção colocando um tubo capilar de vidro borossilicato de 10 cm de comprimento em um puxador mecânico. Para uma injeção ideal, dobre a ponta da agulha em um ângulo de 45° usando um filamento aquecido.
- Prepare pratos de poliestireno com gotículas de 20 μL de meio básico de coleta de oócitos e cubra as gotículas com óleo mineral leve.
- Prepare uma mistura de repórter adicionando 12,5 μg/μL Ypet-3' UTR e 12,5 μg/μL mCherry. Prepare um volume maior e faça alíquotas para experimentos futuros para garantir concentrações semelhantes de repórteres. Armazene essas alíquotas a -80 °C. Após o descongelamento, primeiro centrifugar a alíquota por 2 min a 20.000 x g, e transferir para um novo tubo de microcentrifuge.
NOTA: Esta centrifugação evitará que a agulha de injeção fique entupida por potenciais agregados na mistura de repórteres. - Carregue a agulha de injeção por capilaridade com aproximadamente 0,5 μL de mistura de repórter.
- Coloque a pipeta de retenção e a agulha de injeção carregada nos suportes, e posicione-se na gota do meio de coleta de oócito. Aspire um pouco do meio na pipeta de retenção.
- Abra a agulha de injeção batendo suavemente contra a pipeta de retenção.
- Coloque oócitos em uma gota de meio básico de coleta, e injete 5-10 pL da mistura de repórteres.
- Incubar os oócitos no meio de maturação com cilostamida de 1 μM por 16 h para permitir que o sinal mCherry planar.
- Prepare uma placa de Petri que será usada para microscopia de lapso de tempo com pelo menos duas gotículas de 20 μL de meio de maturação para cada repórter injetado: uma gota com cilostamida de 1 μM para oócitos de prophase de controle I-arrested e uma gotícula sem cilostamida para oócitos maduros. Cubra as gotículas com óleo mineral leve e coloque na incubadora.
- Microscopia de lapso de tempo
- Após a pré-incubação, remova os oócitos injetados da incubadora e lave-os quatro vezes em meio de maturação sem cilostamida. Mantenha alguns oócitos em meio de maturação com cilostamida de 1 μM como um grupo de controle de oócitos preso por prophase.
- Transfira os oócitos injetados para suas respectivas gotículas no prato de microscópio de lapso de tempo previamente preparado. Aglomerado os oócitos usando uma pipeta de vidro fechada (uma pipeta fechada pode ser preparada segurando a ponta em chamas por alguns segundos).
NOTA: O agrupamento dos oócitos ajuda a evitar seu movimento durante a gravação. - Coloque o prato sob o microscópio equipado com um sistema de iluminação de diodo emissor de luz e um estágio motorizado equipado com uma câmara ambiental mantida a 37 °C e 5% de CO2. Para replicar este estudo, utilize os seguintes parâmetros: conjunto de filtro: espelho dicrómico YFP/CFP/mCherry 69008BS; Canal YFP (Excitação (Ex): S500/20 × 49057; Emissão (EM): D535/30 m 47281), canal mCherry (Ex: 580/25 × 49829; Em: 632/60 m).
- Digite as configurações apropriadas para o experimento time-lapse (ver Tabela de Materiais para o software utilizado neste estudo): Clique em Aplicativos | Aquisição Multidimensional. Selecione a primeira guia Principal e selecione timelapse, várias posições de palcoe vários comprimentos de onda.
- Selecione a guia Salvar para inserir o local onde o experimento deve ser salvo.
- Selecione a guia Timelapse para inserir o número de pontos de tempo, duração e intervalo de tempo.
NOTA: A duração do experimento de lapso de tempo depende das espécies animais estudadas, pois o tempo de maturação meiotic oócito difere entre as espécies. Neste experimento com oócitos de camundongos, os oócitos foram registrados a cada 15 minutos por 16 h. - Selecione a guia Estágio. Ligue o campo brilhante e localize a posição dos oócitos abrindo uma nova janela selecionando a Acquire | Adquirir | Show Ao Vivo. Uma vez localizados os oócitos, volte para a janela Aquisição Multidimensional e pressione + para definir a localização dos oócitos.
- Selecione a guia Comprimentos de ondae defina 3 comprimentos de onda diferentes para brightfield (exposição de 15 ms), YFP (exposição de 150 ms para UTR Ypet/IL7 3') e mCherry (exposição de 75 ms para Ypet/IL7 3' UTR).
NOTA: Ajuste a exposição para cada repórter Ypet/3' UTR com base no nível de acúmulo de repórteres e no volume injetado. Certifique-se de que o sinal YFP caia no centro da faixa de detecção no início do experimento para evitar subestimação ou saturação em caso de ativação da tradução. Para mCherry, ajuste a exposição para cada lote de mCherry, pois o sinal depende do número de nucleotídeos de adenina que foram adicionados durante o procedimento de poliadenylation. Devido à variação da eficiência da poliadenilação, use o mesmo lote de mCherry em diferentes experimentos para uma melhor comparação entre experimentos. - Inicie o experimento de lapso de tempo clicando em Acquire. Consulte a Figura 2 e o Arquivo Suplementar para obter um exemplo de uma gravação de lapso de tempo em um único oócito.
- Análise da tradução UTR Ypet-3'
- Para esta análise (ver Tabela de Materiais para o software utilizado neste estudo), realize duas medidas de região para cada oócito: o próprio oócito clique na região de elipse e cerque a região oócito-e uma pequena região próxima ao oócito a ser usada para subtração de fundo-clique na região retangular.
NOTA: Certifique-se de que os oócitos não saiam da região selecionada durante a gravação do lapso de tempo. Preste especial atenção à colocação da medição da região em torno da extrusão do corpo polar, pois isso causa movimento no oócito e pode distorcer a gravação. - Exporte os dados de medição da região para uma planilha clicando primeiro no Open Log e depois no Log Data para exportar o software de análise de dados.
- Para cada oócito individual e para todos os pontos de tempo medidos, subtraia a medição da região de fundo da medição da região do oócito. Faça isso para comprimentos de onda YFP e mCherry separadamente.
- Regisso tempo de quebra de vesícula germinal (GVBD) e extrusão do corpo polar (PBE) para referência posterior.
NOTA: Exclua oócitos do mouse amadurecido quando o GVBD exceder 2 h. - Plot YFP e mCherry expressão ao longo do tempo para cada oócito para verificar outliers.
NOTA: Esta deve ser uma curva suave, se não for isso pode indicar que o oócito se moveu durante a gravação. - Para cada oócito individual, calcule a expressão mCherry média para os últimos dez pontos de tempo da gravação. Para cada ponto de tempo, divida a expressão YFP pela expressão mCherry média para corrigir o volume injetado para obter uma razão YFP/mCherry em cada ponto de tempo para cada oócito individual.
- Calcule as taxas de tradução para um intervalo de tempo específico, encaixando a inclinação da curva por regressão linear. Avalie as diferenças nas taxas de tradução usando inferência estatística.
- Para esta análise (ver Tabela de Materiais para o software utilizado neste estudo), realize duas medidas de região para cada oócito: o próprio oócito clique na região de elipse e cerque a região oócito-e uma pequena região próxima ao oócito a ser usada para subtração de fundo-clique na região retangular.
- Coleção Oocyte
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Os oócitos desnudados prophase I-arrested de ratos C57/BL6 de 21 dias de idade foram injetados com uma mistura de repórter contendo mRNA codificando o repórter Ypet fundido ao UTR de 3' de IL-7 e mRNA codificação mCherry. YFP e mCherry expressão foi registrado em 39 oócitos, dos quais 30 foram amadurecidos, e 9 foram presos em prophase I como um controle negativo. Três oócitos maduros foram excluídos para análise por terem um GVBD atrasado (N=2) ou movidos no prato durante a gravação (N=1). A Figura 3 mostra a expressão mCherry e YFP em prophase I e oócitos maduros. A Figura 4 mostra a expressão YFP de oócitos de maturação corrigidos para a expressão mCherry nivelada (expressão mCherry média nos últimos 10 pontos de tempo) para corrigir para o volume injetado. As taxas de tradução do repórter foram medidas pelo ajuste de curva (regressão linear) os valores YFP/mCherry em prophase I e em oócitos maduros durante os primeiros 0-2 h ou 8-10 h após a liberação da cilostamida(Figura 5A). O acúmulo do repórter não segue um padrão linear, como indicado por uma diferença significativa nas taxas de tradução entre 0-2 h e 8-10 h após a liberação da cilostamida (p<0.0001; Figura 5B). Portanto, esses resultados indicam ativação da tradução IL-7 durante a maturação meiotic oócito.
Figura 1: Visão geral esquemática do procedimento experimental. Oligoadenylated Ypet/3' UTR e mRNA codificado poliadenylated mCherry são micro-injetados em oócitos desnudos de ratos C57/BL6 de 21 dias de idade. Os oócitos são pré-incubados por 16 h em cilostamida contendo meio de maturação para permitir que o sinal mCherry chegue a um platô. Após a pré-incubação, uma gravação de lapso de tempo é iniciada onde os oócitos são mantidos em meio com cilostamida para criar um grupo de controle prophase I-arrested ou liberados em meio livre de cilostamida para amadurecer. Abreviaturas: UTR = região não traduzida; YFP = proteína fluorescente amarela; primer fw = primer para a frente; primer de rotação = primer reverso; Ampr = resistência à ampicilina; poliA = poliadenyl; oligoA = oligoadenyl; GV = vesícula germinal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Exemplo de uma única gravação de lapso de tempo oócito. Gravações de Brightfield, YFP e mCherry de um único oólito injetado com mRNAs codificando Ypet/Interleukin-7 3' UTR e mCherry poliadenylated em prophase I, MI (6 h após liberação de cilostamida) e MII (15 h após a liberação de cilostamida). Barra de escala = 25 μm. Abreviaturas: YFP = proteína fluorescente amarela; GV = vesícula germinal; MI = metafase I; MII = metafase II. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Sinais YFP e mCherry registrados por microscopia de lapso de tempo. Sinais YFP e mCherry de oócitos injetados com oligoadenylated Ypet/IL7 3' UTR e mRNA codificado poliadenylated mCherry. Os oócitos foram mantidos em meio com cilostamida para gerar um grupo de controle prophase I-arrested (N=9) ou liberados em meio livre de cilostamida para permitir a maturação (N=30). Os dados são medidas individuais de oócito. Abreviaturas: IL-7 = interleucina-7; YFP = proteína fluorescente amarela. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Sinal YFP corrigido para o nível mCherry co-injetado. Os sinais YFP de prophase I-arrested e oócitos maduros foram corrigidos para o volume injetado dividindo o sinal YFP pelo sinal mCherry médio dos últimos 10 pontos de tempo. As razões individuais de YFP/mCherry para (A) prophase I-arrested oócitos e (B) oócitos maduros e ± erro padrão médio das razões médias YFP/mCherry de (C) prophase I-arrested e (D) oócitos maduros. Abreviaturas: YFP = proteína fluorescente amarela; GVBD = quebra de vesícula germinal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Taxas de tradução calculadas em 0-2 h e 8-10 h de maturação. (A) Sinais de proteína fluorescente amarela (YFP) de oócitos únicos corrigidos para mCherry (YFP/mCherry) a 0-2 h ou 8-8-810 h após a liberação de cilostamida e (B) taxas de tradução (erro padrão ± médio da média) calculadas por encaixe de curva (regressão linear) os valores YFP/mCherry em 0-2 h e 8-10 h após a liberação de cilostamida. Os dados foram analisados utilizando-se o teste t de duas caudas não verificado. *p < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Exemplo de repressão da tradução: Oosp2. Reanulados dados de um experimento onde os oócitos foram injetados com Ypet-Oosp2 3′ UTR e mRNA codificação poliadenylated mCherry. Os sinais YFP de prophase I-arrested (N=63) e oócitos maduros (N=72) foram corrigidos para o volume injetado dividindo o sinal YFP pelo sinal mCherry médio dos últimos 10 pontos de tempo. Os dados de expressão YFP e mCherry foram obtidos usando uma lâmpada Xenon Arc, ao contrário do experimento IL-7, onde uma fonte de luz LED foi usada. Os dados representam a média ± erro padrão da média de medições individuais de oócitos e foram publicados anteriormente em Luong et al. 5. Abreviaturas: YFP = proteína fluorescente amarela; Oosp2 = proteína secretada oóteis 2; UTR = região não traduzida; IL-7 = interleucina-7; LED= diodo emissor de luz; GVBD = quebra de vesícula germinal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Efeito da exposição à microjeção e fluorescência no tempo de GVBD e PBE. Tempo de GVBD e PBE de oócitos que foram micro-injetados e expostos à fluorescência (injetado), ou não injetados e não expostos à fluorescência (não injetado). Os dados são medidas individuais de oócito. Os dados foram analisados utilizando-se o teste tde duas caudas não verificado. *p<0.001. Abreviaturas: GVBD = quebra de vesícula germinal; PBE= extrusão do corpo polar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Meio básico de coleta de oócito | ||
| componente | Por 500 mL | |
| Hepes modificado Mínimo Essencial Águia Média | 7,1 g | |
| bicarbonato de sódio | 252 mgs | |
| Piruvato de sódio | 1,15 mL | |
| Penicilina/Streptomicina 100x | 5 mL | |
| Água destilada ultrapura (Invitrogen, 10977-015) | Até 500 mL | |
| Meio de maturação | ||
| componente | Por 500 mL | |
| MEM alfa 1x | Até 500 mL | |
| Piruvato de sódio | 1,15 mL | |
| Penicilina/Streptomicina 100x | 5 mL | |
Tabela 1: Preparação de mídia. Lista de componentes que precisam ser adicionados para preparar meio básico de coleta de oócito e meio de maturação oócida.
| seqüenciar | |||||
| Ypet/Interleukin-7 3' UTR | GAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTG GCTAGTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACCGGTCCCCACCATGGTGAAAGAGGCGA AGAGCTGTTCACCGGCGTGGTGCCCATCCTGGGGAGCTGGCGACGTGAACGGCC ACAAGTTCAGCGTGAGGCGAGGGUGUGUGACGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTG AAGCTGCTGTGCACCACCGGCAAGCTGCCCCCCCCTGGCCCACCCTGGTGACCACCCTG GGCTACGGCGTGCAGTGCCGCCCCCCCCCCCGACCACATGAAGAGACACACACTTCTTCA AGAGCGCCATGCCCGAGGGUGUGUGGGGGAGAGUCATCTTCCAAGGACGACGGCAA CTACAAGACCCGGGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGAGACCCTGGTGAACCGGATCGAGCTGA AGGGCATCGACTTCAAGGAGGACCAACATCCTGGCCACAAGCTGGAGAGAGTACAACTACAAC AGCCACAACGTGTACATCACCCCGACAAGGAGAGAACGGCAAGGCCAACTTCAAGAT CCGGCACAACATCGAGGCGGCGGCGTGAGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCC CATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCTACCAGAGCGCCCTG TTCAAGGACCCCAACGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGACATGGTGCTGGGCTGGGCCCTGACCCCGCCGCCGCCCC GGCATCACCGAGGGGAGAGAGAGCTATAAGAGATCTTTCGAGAAGGTAAGCCTATCCCTAAA CCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACGCGTACCGGTCATCACCATCACCATTGAACAGGAC ATGTAGTAACAACCTCCAAGAATCTACTGGTTCATATACTTGGGAGAAACCCTTCCAG AAGTTCCTGGATGCCTCCTGCTCAAAGAGAGAGGAGAGAAATACAGTGAGGTATG AGATGATGGCAGAAATGCAGCTGACTGCTGCCGTCAGCATATACATATAAAGATATATCAA CTATACAGATTTTTGTAATGCAATCATCAACTGCAATGCTTTTAAAAACCGTTCCAAATGTTTC TAACACTACAAAGTCTACAAAAAAGCAAGGCTGAGATTCAGAGTCACCACTTTTCTTAGC AAAATGATGGTATGGTTAAACATTCATTGGTGAACCACTGGGAGTGGAACTGTCCTGTTTTAG ACTGGAGATACTGGGGGGCTCACGGTGATGGATAATGCTCGAAAACAAACAGTCTATCTTAAAGC AGCAGCAAAAAAAAAGAGAGAGAGAGACTTAAGGCATCAAATTATATATGAATGTATAACA CATAACTTCAGTAAAGAGCATAGCAGATATTTTTAAAAAAGTATTTTTAAGATAGAAATGCACTTAT TCCAAAGATACTGAACCTTAGTATTCAGTCTTGACACTTGTGTATAAAAGCTTATAACTGAA TTTTCAATTTGAAAAGTATATTTTTAAAAAAAATATATGCTAGACTTTTAATGTATATGTTTAATTT TGGCATTCTGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTATCTATATCTATATTATATATATATA ATTTTCATATACTACCAATTGCGTACTTTGGATAGTGTCTCTTTTTAACCTAATGACCTTTATTAACAC TGTCAGGTTCCCTTACTCGAGAGTTCATTGCTGCACTCATTTGATCCCAGTTTTATTGAACAC ATATCCTTTAACACACTCACGTCCAGATTTAGCAGGAGACTAGGACCCTATAACTTTGTTAAGAGAGAA AACACTAATTTCTTTTTTATAGTAGGGTCTTATTCGTATCTAGGCAGGGGCTAGGATTGCAGACATGAGC CAATATGCTTAGAAACATTCTTTTTATTTAAACTCATGTCTTTTACAAGATGCCTACATATATCCTAT GTATATGCCTGTTTAAATCCTTTTTTTTGTAAGGTCTGTCTTCCTTCGTAATGGAAAAGAAACACTA TGTTGTAGAGGCCAAATTTCTGAAAGTGATAAGGGTTTTTGTGAATTCTCTCTCCCTCTCTCTCTCTCTTTGCTTT TTCCAGCCACGTGAGCATCTACTATATATATGCTGGATATTTGACCGCTGCTCCCTCTCTGGCAC ATTGCATGTGTGTGGTAGCCATTCTTTTCTCTCCTTTTCCCCCCCCCCCTATCTCTACTCAGTCAGTGG TACAGATAGCTGGGATTATCACAATTGAGAGAGAAACACAATTGTTTAAAGTTTTTTCATAATCACCATTT GCCCAGAAAACAGTTCTCAACTTGTTTGCAACATGTAATTTAAGAAACTCAATTTTGTTAATGGACTT TCGATAACTTCCTTAGATATCCCACATCCTACGTCAGTCCTGAGAGGAACTGGTAAAAATGGGTA AGCCCTTAGCTAGCGAACTGAAGGCATCATGTAAGATAATCTATACCCTCAAGGCTGGCTGGAT GGCTCCCTACCAATATTGAACAATATTCTGATTGGCAAAAAGGATAATATTTT |
||||
| Primer para a frente | GAGAACCCACTGCTTAC | ||||
| Primer reverso | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAATATTACTTTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATACTTTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATACTTTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT CCAAAATC |
||||
Tabela 2: Exemplo de sequências de repórter e primer Sequência de repórter YFP/IL7 3'UTR e sequências de primers dianteiros e invertidos que foram usados para produzir um modelo PCR linear para transcrição in vitro.
Arquivo suplementar: Proteína fluorescente amarela(YFP) e registro de lapso de tempo mCherry. Gravações de lapso de tempo YFP e mCherry de um único oócito injetados com mRNAs codificando Ypet/Interleukin-7 3' UTR e poliadenylated mCherry. Canal YFP (Ex: S500/20 × 49057; Em: D535/30 m 47281), canal mCherry (Ex: 580/25 × 49829; Em: 632/60 m). Os oócitos foram registrados a cada 15 min por 16 h (7 quadros/segundo). Clique aqui para baixar este arquivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O método apresentado descreve uma estratégia para estudar a ativação e a repressão da tradução do mRNA alvo em diferentes transições durante a maturação meiotic in vitro oocito. IL-7, uma citocina liberada pelo oócito que pode estar envolvida na comunicação celular oócito-cumulus8,13, foi escolhida com o propósito de descrever este método. O IL-7 é conhecido por ser cada vez mais traduzido durante a maturação do oócito8 e permite uma boa visualização da ativação translacional usando este método. Se, no entanto, a tradução ocorrer em uma taxa constante ao longo do experimento, o acúmulo de um repórter seguirá um padrão linear, e as taxas de tradução no início e no final do experimento serão semelhantes. Esta conclusão pode ser verificada pela bondade do ajuste (R) de uma regressão linear durante todo o intervalo de gravação. Uma repressão na tradução de repórteres se apresentará como o planar do sinal YFP.
Um exemplo de repressão da tradução UTR de 3'' pode ser encontrado no estudo de Luong et al. 5, onde os autores relatam repressão da Proteína Secretada Oócito 2 (Oosp2) durante a maturação oótica. Esses dados foram re-analisados e apresentados na Figura 6. Os oócitos amadurecidos mostram o planagem do sinal YFP, o que indica repressão da tradução, enquanto o grupo de controle prophase I-arrested segue um padrão linear de acumulação de repórteres, o que indica taxas de tradução semelhantes no início e no final do experimento. Ao estudar a repressão da tradução, é especialmente importante incluir um grupo de controle prophase I-arrested para garantir que o planar do sinal YPF não seja explicado por uma diminuição na qualidade do oócito devido às más condições de cultura, confirmando assim a viabilidade dos oócitos. O acúmulo do repórter pode ser validado por PCR de transcrição reversa quantitativa usando primers para YFP ou por mancha ocidental aproveitando a tag V5-epitope incluída no repórter neste protocolo.
O planalto do sinal YFP pode não ser apenas devido à repressão ativamente regulamentada da tradução, mas também pode ser explicado pela degradação do repórter durante a progressão oócica. Isso pode espelhar a desestabilização do mRNA endógeno, essencial para a transição para a expressão do genoma embrionário14,15,16. Essa possibilidade pode ser verificada medindo os níveis de transcrição genética-alvo no estágio prophase I vs. metafase II para confirmar a estabilidade dos mRNAs. Ao preparar cDNA oócito, é preferível usar hexamer aleatório priming sobre oligo-dT priming. Este último método apresenta diferenças aparentes nos níveis de transcrição genética que podem refletir diferenças no comprimento poli(A) dessas transcrições em vez de diferenças reais nosníveis detranscrição 7 .
Existem vários métodos para estudar a tradução de mRNA endógena em todo o genoma em oócitos de rato. Estes métodos incluem o perfil polisome7,17,18 e RiboTag/RNA-Seq5,19,20. O perfil ribossomo é outro método para estudar a tradução em todo o genoma que tem sido usada na levedura, que é outro organismo modelo que é usado para estudar a meiose21,22. No entanto, essas análises em todo o genoma para estudar a tradução de mRNA no camundongo exigem o uso de 150-200 oócitos por amostra, enquanto o número de oócitos disponíveis para análise é geralmente limitado. O ensaio monoócito aqui descrito para avaliar a tradução de 3' UTR de mRNAs-alvo complementa análises de tradução em todo o genoma, pois permite a caracterização de elementos do UTR de 3' que regulam o programa de tradução durante o oócito meiotic maturation4,5,6. No passado, ensaios baseados em luciferase eram utilizados para avaliar a tradução do UTR de 3' de mRNAs-alvo10,20,23, pois é um método muito sensível que requer apenas alguns oócitos por amostra; no entanto, os oócitos precisam ser líscidos para detectar a quantidade de luciferase em uma amostra.
Outros usaram um repórter de proteína fluorescente verde de 3' UTR /green (GFP) para avaliar o acúmulo de GFP em oócitos de camundongos vivos4. No entanto, nesses experimentos, foram utilizados apenas dois pontos de tempo: o início da incubação (prophase I) e o fim da incubação (metafase II). Isso diminui muito o poder das medições e aumenta a possibilidade de erros. Os dados cinéticos fornecem medições precisas com base em taxas (vários pontos) e definem com precisão o tempo em que a ativação ou repressão translacional ocorre. Além disso, a repressão da tradução não pode ser avaliada nestes pontos de tempo únicos, o que pode levar a uma conclusão imprecisa. Portanto, este método foi ajustado aplicando microscopia de lapso de tempo para avaliar o acúmulo de repórteres UTR Ypet/3' ao longo da maturação in vitro dos oócitos do rato5,6,9. Utilizando essa estratégia, é possível estudar a tradução em diferentes transições durante a maturação do oócito.
Há vários aspectos importantes a considerar sobre este método. Primeiro, os repórteres usados incluem uma cauda de oligo(A) cuja omissão reduz consideravelmente o acúmulo de repórteres. Isso pode ser devido tanto à diminuição da tradução quanto à desestabilização do repórter mRNA24,25. Durante a pré-incubação em prophase I, a tradução de uma sonda oligoadenylated ajusta-se para refletir a taxa de tradução do mRNA endógeno5. Em segundo lugar, é importante perceber que um aumento no número de gravações ou duração da exposição à fluorescência pode potencialmente induzir a fototoxicidade e, assim, prejudicar a qualidade do oócito. Embora o experimento atual tenha adotado intervalos de 15 minutos, a taxa de amostragem pode ser diminuída quando uma alta exposição à fluorescência deve ser usada em caso de baixa expressão do repórter.
Para limitar a quantidade de fototoxicidade, foi utilizada uma fonte de luz LED fria, que requer uma excitação mais curta26. Para avaliar potenciais efeitos fototoxicidade nos oócitos, o tempo de GVBD e PBE foi comparado em oócitos que foram micro-injetados e expostos à fluorescência ou não injetados e não expostos à fluorescência. A combinação de exposição à microjeção e fluorescência foi encontrada para um pouco de atraso GVBD (p<0,001), enquanto o tempo de PBE foi semelhante(Figura 7).
Este método tem sido usado para estudar elementos regulatórios translacionais do UTR de 3' durante a maturação meiotic in vitro oocito. Da mesma forma, também pode ser usado para estudar elementos funcionais utr de 5' essenciais para a regulação da tradução ou para estudar a tradução durante a fertilização in vitro oocyte. Embora este método tenha sido aplicado aos oócitos humanos e camundongos, também é aplicável a outras espécies animais. Como este ensaio repórter é realizado em oócitos únicos, é especialmente adequado para uso em espécies mono-ovulatórias nas quais o número de oócitos disponíveis para análise é limitado. Ao contrário do uso de oócitos desnudados, outra aplicação dessa técnica é a injeção do repórter em oócitos cumulus-fechados, uma vez que as células cumulus desempenham um papel importante na regulação do programa translacional8,10,27. No entanto, deve-se levar em conta que os oócitos envoltos em cumulus são mais propensos a se afastar do plano de gravação durante o experimento em comparação com oócitos desnudos devido ao movimento das células cumulus durante a expansão do COC. Isso pode resultar em uma proporção maior de oócitos que devem ser excluídos da análise. No futuro, pode-se usar um software de rastreamento de células capaz de rastrear as posições x, y e z dos oócitos na gotícula, o que pode resolver esse problema.
Em conclusão, o ensaio de repórter único oócito representa uma estratégia para investigar o programa translacional executado na transição oócito-zigoto. O maior conhecimento deste programa translacional pode fornecer pistas importantes sobre a regulação molecular da competência de desenvolvimento oócito.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo NIH R01 GM097165, GM116926 e Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 para Marco Conti. Enrico M. Daldello foi apoiado por uma bolsa da Fundação Lalor e Natasja G. J. Costermans foi apoiada por uma bolsa Rubicon da Organização Holandesa para Pesquisa Científica (NWO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Preparation of media | |||
| Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra | Sigma-Aldrich | SIAL-A3311 | |
| Cilostamide | EMD Millipore | 231085 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M2645 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered | Genesee Scientific Corporation (GenClone) | 25-512 | |
| Sodium Bicarbonate | JT-Baker | 3506-1 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry | |||
| Agarose | Apex Biomedical | 20-102QD | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-1G | |
| Choo-Choo Cloning Kit | McLab | CCK-20 | |
| CutSmart Buffer (10x) | New England Biolabs | B7204 | |
| DNA loading dye (6x) | Thermo Scientific | R0611 | |
| dNTP Solution | New England Biolabs | N0447S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Fisher | SM1333 | |
| LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova | Teknova | L1010 | |
| LB Medium (Capsules) | MP Biomedicals | 3002-021 | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Life Technologies | AM1908 | |
| MfeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3589 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1344 | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(A) Tailing kit | Invitrogen | AM1350 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| S.O.C. medium | Thermo Fisher | 15544034 | |
| TAE buffer | Apex Biomedical | 20-193 | |
| Ultrapure Ethidium Bromide Solution | Life Technologies | 15585011 | |
| Oocyte collection | |||
| Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Calibrated micro-pipettes | Drummond Scientific Company | 2-000-025 | |
| PMSG- 5000 | Mybiosource | MBS142665 | |
| PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2 | BD | 305111 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| Oocyte micro-injection | |||
| 35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-0-20-C | For time-lapse microscopy |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Oil for Embryo Culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Petri Dish | Falcon | 351006 | For micro-injection |
| Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | For oocyte incubation |
| VacuTip Holding Capillary | Eppendorf | 5195000036 | |
| Software | |||
| Biorender | BioRender | Preparation of Figure 1S | |
| MetaMorph, version 7.8.13.0 | Molecular Devices | For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation |
References
- Clarke, H. J. Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis. Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).
- Gosden, R., Lee, B. Portrait of an oocyte: our obscure origin. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).
- Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F. Translational control in the germ line. Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. , Springer, Cham. 129-156 (2015).
- Dai, X. -X., et al. A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte. Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).
- Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption. Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).
- Yang, C. R., et al. The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation. Nature Communications. 11, 1399 (2020).
- Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes & Development. 25 (7), 755-766 (2011).
- Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).
- Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes. Development. 146 (8), (2019).
- Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence. Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).
- Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary. Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).
- Shu, Y., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
- Cheng, Y., et al. Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats. Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).
- Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation. Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).
- Sha, Q. Q., et al. CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte. The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).
- Yartseva, V., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming. Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).
- Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
- Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
- Martins, J. P. S., et al. DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation. Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).
- Yang, Y., et al. Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation. Genes & development. 31, 1302-1307 (2017).
- Cheng, Z., et al. Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis. Cell. 172 (5), 910-923 (2018).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. A combinatorial code for CPE-mediated translational control. Cell. 132 (3), 434-448 (2008).
- Morgan, M., et al. mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome. Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).
- Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation. RNA. 26 (3), 324-344 (2020).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
- Chen, J., et al. Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes. Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).
