Summary
Этот протокол описывает репортерный анализ для изучения регуляции трансляции мРНК в отдельных ооцитах во время созревания in vitro.
Abstract
События, связанные с созреванием ядер ооцитов, хорошо описаны. Однако гораздо меньше известно о молекулярных путях и процессах, которые происходят в цитоплазме при подготовке к оплодотворению и приобретению тотипотентности. Во время созревания ооцитов изменения в экспрессии генов зависят исключительно от трансляции и деградации материнских матричных РНК (мРНК), а не от транскрипции. Таким образом, выполнение трансляционной программы играет ключевую роль в установлении компетентности развития ооцитов для поддержания развития эмбриона. Данная работа является частью фокуса на определении программы трансляции материнской мРНК, которая происходит во время мейотического созревания и при переходе ооцитов в зиготу. В данной методе представлена стратегия исследования регуляции трансляции целевых мРНК при созревании ооцитов in vitro. Здесь репортер Ypet сливается с 3'-й нетранслируемой областью (UTR) интересуемого гена, а затем микроинъецируется в ооциты вместе с полиаденилированной мРНК, кодирующей для mCherry для контроля введенного объема. Используя покадровую микроскопию для измерения репортерного накопления, скорость трансляции рассчитывается при различных переходах во время мейотического созревания ооцитов. Здесь описаны протоколы выделения и инъекции ооцитов, покадровой записи и анализа данных с использованием репортера Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3' UTR в качестве примера.
Introduction
Полностью выращенный ооцит млекопитающего претерпевает быстрые изменения при подготовке к оплодотворению и приобретении котипотентности. Эти изменения необходимы для поддержания эмбрионального развития после оплодотворения. Хотя события, связанные с ядерным созреванием, относительно хорошо описаны, гораздо меньше известно о молекулярных процессах и путях в цитоплазме ооцитов. На заключительных стадиях созревания ооцитов ооциты транскрипционно молчат, а экспрессия генов полностью зависит от трансляции и деградации мРНК1,2. Синтез белков, критически важных для развития компетентности, поэтому опирается на программу временной трансляции долгоживущих мРНК, которые были синтезированы ранее во время роста ооцитов1,3. В рамках акцента на определении этой программы трансляции материнской мРНК, выполняемой во время мейотического созревания и при переходе ооцитов в зиготу, в статье представлена стратегия изучения активации и подавления трансляции целевых материнских мРНК в одиночных ооцитах при мейотическом созревании in vitro.
В этом методе открытая рамка чтения YPet клонируется выше 3' UTR интересуемой транскрипты. Затем мРНК, кодирующие этот репортер, микроинъецируются в ооциты вместе с полиаденилированными мРНК, кодируемыми mCherry, для контроля инъецируемого объема. Накопление репортера измеряется во время мейотического созревания ооцитов in vitro с помощью покадровой микроскопии. Накопление желтого флуоресцентного белка (YFP) и mCherry регистрируется в отдельных ооцитах, а сигналы YFP корректируются плато-уровнем совместно вводимого mCherry. После сбора данных рассчитываются скорости трансляции для различных временных интервалов во время мейотического созревания мейотических яйцеклеток in vitro путем вычисления наклона кривой, полученной путем подгонки кривой.
Этот подход предоставляет инструмент для экспериментального подтверждения изменений в трансляции выбранных эндогенных мРНК. Кроме того, этот метод облегчает характеристику регуляторных элементов, контролирующих трансляцию во время мейотического созревания ооцитов путем манипулирования цис-регуляторными элементами 3' UTR целевых мРНК4,5,6. Манипуляции с длиной поли(А) хвоста также позволяют понять активность аденилазы/моденилазы в ооцитах5. Мутагенез цис-действующих элементов или иммунопреципитация РНК может быть использован для изучения взаимодействий с родственными РНК-связывающими белками6,7. Кроме того, этот метод может быть использован для идентификации основных компонентов программы трансляции, которые имеют решающее значение для компетентности развития ооцитов, путем измерения целевой трансляции 3' UTR в моделях, связанных со снижением качества ооцитов 8,9,10. В этой методной работе представлен репрезентативный эксперимент, в котором оголенные ооциты 21-дневных мышей C57 / BL6 были микроинъецированы с репортером Ypet, слитым с 3'UTR IL-7. Описаны установка и протокол для инъекции ооцитов, покадровой записи и анализа данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Экспериментальные процедуры с участием животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Калифорнийского университета в Сан-Франциско (протокол AN182026).
1. Подготовка СМИ
- Добавьте все компоненты, как описано в таблице 1,чтобы получить основную среду сбора ооцитов и среду созревания ооцитов. Для базового носителя сбора установите pH на 7,4. Как для сбора, так и для созревания добавляйте 3 мг/мл бытового сывороточного альбумина (BSA) и 1 мкМ цилостамида в день использования.
2. Подготовка кодирования мРНК для Ypet-3' UTR и mCherry
- Получение 3′ UTR-последовательностей интересующих мРНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого исследования последовательности были ранее получены из кДНК ооцитов мыши. - Разработать праймеры для усиления целевых 3' UUTR из кДНК ооцитов и частей вектора pcDNA 3.1, содержащих кодирующую последовательность Ypet, метку V5-эпитопа и промотор T7.
- Амплификация с использованием высокоточного набора ДНК-полимеразы. Запустите продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР) на геле, чтобы проверить, имеют ли фрагменты правильный размер, вырежьте полосы и извлеките ДНК из геля с помощью набора для экстракции геля в соответствии с инструкциями производителя.
- Слить фрагменты ПЦР с вектором с помощью комплекта для клонирования ПЦР.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фрагменты ПЦР инкубировали на льду в течение 4 ч для облегчения более эффективного процесса рекомбинации. Это противоречит инструкциям производителя, которые рекомендуют инкубационное время всего 45 мин. - Трансфектировать фрагменты ПЦР в компетентные 5-α бактерии Escherichia coli.
- Добавьте смесь и плазмиду к бактериям и высиживайте на льду в течение 30 минут.
- Тепловой удар смеси и плазмиды путем помещения смеси на водяную баню при 42 °C в течение 45 с, и немедленно охлаждают на льду в течение 3 мин.
- Добавьте 500 мкл супероптимального бульона со средой репрессирования катаболита (SOC) и инкубируют в течение 1 ч при 37 °C.
- Открутите вниз при 7000 × g в течение 2 мин и удалите большую часть супернатанта. Повторное суспенд и пластина на агаровой пластине Luria Broth (LB) с соответствующим антибиотиком подбора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Карбенициллин был использован в этом исследовании. - Инкубировать в течение ночи при 37 °C. Изолируйте колонии, слегка надавливая кончиком пипетки на одну из колоний и помещая ее в 3 мл среды LB со 100 мкг/мл карбенициллина. Инкубировать в течение 12-24 ч при 37 °С.
- Извлеките ДНК плазмид с помощью набора для изоляции плазмидной ДНК в соответствии с инструкциями производителя и подтвердите последовательности с помощью секвенирования ДНК.
- Для Ypet/3' UTR:
- Создайте линейный шаблон ПЦР для транскрипции in vitro. Используйте прямую грунтовку перед последовательностью Ypet и обратную праймер с 20 дополнительными остатками тимина. В таблице 2 приведена последовательность Ypet/IL-7 3' UTR и последовательности прямого и обратного праймеров.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти дополнительные остатки тимина добавят олиго(А) к линейной мРНК после транскрипции in vitro. - In vitro транскрибируйте продукт ПЦР с использованием набора транскрипции T7 в соответствии с инструкциями производителя.
- Очистите полученную комплементарную РНК (цРНК) с помощью набора для очистки транскрипции в соответствии с инструкциями производителя.
- Элюдирование очищенной цРНК в воде, не содержит РНК, измерение концентрации и оценка целостности с помощью агарозного электрофореза. Хранить при температуре −80 °C.
- Создайте линейный шаблон ПЦР для транскрипции in vitro. Используйте прямую грунтовку перед последовательностью Ypet и обратную праймер с 20 дополнительными остатками тимина. В таблице 2 приведена последовательность Ypet/IL-7 3' UTR и последовательности прямого и обратного праймеров.
- Для мВечерри:
- Создание линейного шаблона ПЦР для транскрипции in vitro с помощью высокоточного фермента рестрикции; используйте фермент рестрикции mfEI-HF при репликации этого примера. Переваривает в буфере пищеварения в течение ночи при 37 °C.
- Запустите гель для очистки образца и извлеките линейную ДНК с помощью набора для экстракции геля в соответствии с инструкциями производителя.
- In vitro транскрибируйте продукт ПЦР с использованием набора транскрипции T7 в соответствии с инструкциями производителя.
- Полиаденилировать цРНК (150-200 нуклеотидов) с помощью поли(А) хвостохранилища согласно инструкции производителя.
- Очистите полученную кРНК с помощью комплекта для очистки транскрипции в соответствии с инструкциями производителя.
- Элюдирование очищенной цРНК в воде, свободной от РНК, измерение концентраций мРНК и оценка целостности сообщения с помощью гелевого электрофореза. Хранить при температуре −80 °C.
3. Экспериментальная процедура
ПРИМЕЧАНИЕ: Схематический обзор микроанализии ооцитов и последующей покадровой микроскопии приведен на рисунке 1.
- День 1
- Внутрибрюшинно вводят 21-дневным мышам 5 МЕ сывороточного гонадотропина беременной кобылы, чтобы способствовать росту фолликула до антральной стадии11.
- День 3
- Коллекция ооцитов
- Жертвоприношение мышей через 44-48 ч после прайминга для сбора яичников и помещает их в пластиковую чашку Петри с основной средой сбора ооцитов.
- Осторожно откройте антральные фолликулы, сделав небольшой разрез в стенке фолликула иглой 26 г. Изолируйте интактные кучевые ооциты (КОК) с несколькими слоями кучевых клеток с помощью стеклянной пипетки, управляемой ртом.
- Используйте меньшую пипетку (немного больше диаметра яйцеклетки) и механически обнажают КОК путем повторного пипетирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, выполните микро-инъекцию неповрежденных КОК. - Используя большую пипетку, аспирировать оголенные ооциты и поместить их в чашку Петри со средой созревания, дополненной 1 мкМ ингибитора фосфодиэстеразы, цилостамидом, чтобы предотвратить возобновление мейотического созревания12. Поместите чашку в инкубатор на 2 ч, чтобы яйцеклетки оправились от стресса, вызванного выделением ооцитов из фолликулов.
- Микро-инъекция ооцитов
- Подготовьте инъекционные иглы, поместив боросиликатную стеклянную капиллярную трубку длиной 10 см в механический съемник. Для оптимального впрыска согните наконечник иглы под углом 45° с помощью нагретой нити накала.
- Готовят блюда из полистирола с 20 мкл капель основной среды для сбора ооцитов и покрывают капли легким минеральным маслом.
- Приготовьте репортерную смесь, добавив 12,5 мкг/мкл Ypet-3' UTR и 12,5 мкг/мкл вишни. Подготовьте больший объем и сделайте аликвоты для будущих экспериментов, чтобы обеспечить аналогичные концентрации репортеров. Храните эти аликвоты при -80 °C. После оттаивания сначала центрифугируют аликвот в течение 2 мин при 20 000 х ги переносят на новую микроцентрифужную трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта центрифугирование предотвратит засорение инъекционной иглы потенциальными агрегатами в репортерной смеси. - Загрузите инъекционную иглу капиллярностью примерно 0,5 мкл репортерной смеси.
- Поместите удерживающая пипетку и загруженную инъекционную иглу в держатели и поместите в каплю среды сбора ооцитов. Аспирировать часть среды в удерживающая пипетку.
- Откройте инъекционную иглу, осторожно постукивая ею по удерживающей пипетке.
- Поместите ооциты в каплю основной среды сбора и вводят 5-10 пл репортерной смеси.
- Инкубируют ооциты в среде созревания с 1 мкМ цилостамида в течение 16 ч, чтобы сигнал mCherry вышел на плато.
- Приготовьте чашку Петри, которая будет использоваться для покадровой микроскопии с по меньшей мере двумя каплями среды созревания по 20 мкл на каждого введенного репортера: одной каплей с цилостамидом 1 мкМ для контрольной профазы I-арестованных ооцитов и одной каплей без цилостамида для созревания ооцитов. Накройте капли легким минеральным маслом и поместите в инкубатор.
- Покадровая микроскопия
- После предварительной инкубации извлекают введенные ооциты из инкубатора и промывают их четыре раза в среде созревания без цилостамида. Держите некоторые ооциты в среде созревания с 1 мкМ цилостамида в качестве профазы I-арестованной контрольной группы ооцитов.
- Перенесите введенные ооциты в соответствующие капли на предварительно подготовленной тарелке для покадрового микроскопа. Сгруппировать ооциты с помощью закрытой стеклянной пипетки (закрытую пипетку можно приготовить, удерживая наконечник в огне в течение нескольких секунд).
ПРИМЕЧАНИЕ: Кластеризация ооцитов помогает предотвратить их движение во время записи. - Поместите тарелку под микроскоп, оснащенный светодиодной системой освещения и моторизованной сценой, оборудованной камерой окружающей среды, поддерживаемой при 37 °C и 5% CO2. Для воспроизведения этого исследования используйте следующие параметры: набор фильтров: дихроичное зеркало YFP/CFP/mCherry 69008BS; Канал YFP (возбуждение (Ex): S500/20 × 49057; Эмиссия (EM): D535/30 m 47281), мВечерный канал (Ex: 580/25 × 49829; Эм: 632/60 м).
- Введите соответствующие настройки для покадрового эксперимента (см. Таблицу материалов для программного обеспечения, используемого в этом исследовании): Нажмите на Приложения | Многомерное приобретение. Выберите первую вкладку Главная и выберите таймлапс, несколько позиций ступении несколько длин волн.
- Выберите вкладку Сохранение, чтобы ввести место, где должен быть сохранен эксперимент.
- Выберите вкладку Timelapse, чтобы ввести количество точек времени, продолжительность и интервал времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность покадрового эксперимента зависит от изучаемых видов животных, так как сроки мейотического созревания ооцитов различаются между видами. В этом эксперименте с мышиными ооцитами ооциты регистрировали каждые 15 мин в течение 16 ч. - Выберите вкладку Рабочая область. Включите brightfield и найдите положение ооцитов, открыв новое окно, выбрав Получить | Приобрести | Шоу в прямом эфире. Как только ооциты будут обнаружены, вернитесь в окно Многомерного Сбора и нажмите +, чтобы установить местоположение ооцитов.
- Выберите вкладку Длины волни установите 3 различные длины волн для яркого поля (экспозиция 15 мс), YFP (экспозиция 150 мс для Ypet/IL7 3' UTR) и mCherry (экспозиция 75 мс для Ypet/IL7 3' UTR).
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте экспозицию для каждого репортера Ypet/3' UTR в зависимости от уровня накопления репортера и впрыскиваемого объема. Убедитесь, что сигнал YFP попадает в центр диапазона обнаружения в начале эксперимента, чтобы предотвратить недооценку или насыщение в случае активации трансляции. Для mCherry отрегулируйте экспозицию для каждой партии mCherry, так как сигнал зависит от количества адениннуклеотидов, которые были добавлены во время процедуры полиаденилирования. Из-за различий в эффективности полиаденилирования используйте одну и ту же партию mCherry в разных экспериментах для лучшего сравнения между экспериментами. - Начните эксперимент с временными промежутками, щелкнув Получить. См. рисунок 2 и дополнительный файл для примера покадровой записи в одной яйцеклетки.
- Анализ перевода УТР Ypet-3'
- Для этого анализа (см. Таблицу материалов для программного обеспечения, используемого в этом исследовании) выполните два измерения области для каждой яйцеклетки: сама яйцеклетка - щелчок по области эллипса и окружение ооцита - и небольшая область, близкая к ооциту, которая будет использоваться для фонового вычитания - щелчок по прямоугольной области.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ооциты не выходят из выбранной области во время покадровой записи. Обратите особое внимание на размещение измерения области вокруг экструзии полярного тела, так как это вызывает движение в ооците и может исказить запись. - Экспортируйте данные измерения региона в электронную таблицу, щелкнув сначала Открыть журнал, а затем Данные журнала, чтобы экспортировать программное обеспечение для анализа данных.
- Для каждого отдельного ооцита и для всех измеренных временных точек вычтите измерение фоновой области из измерения области ооцитов. Сделайте это для длин волн YFP и mCherry отдельно.
- Запишите время разрушения зародышевого везикулы (GVBD) и экструзии полярного тела (PBE) для последующего использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Исключить созревание мышиных ооцитов, когда GVBD превышает 2 ч. - График экспрессии YFP и mCherry с течением времени для каждого ооцита, чтобы проверить выбросы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это должна быть гладкая кривая, если это не так, это может указывать на то, что яйцеклетка двигалась во время записи. - Для каждого отдельного ооцита рассчитайте среднюю экспрессию mCherry за последние десять временных точек записи. Для каждой временной точки разделите экспрессию YFP на усредненную экспрессию mCherry, чтобы скорректировать для введенного объема, чтобы получить соотношение YFP/mCherry в каждой точке времени для каждого отдельного ооцита.
- Рассчитайте скорости трансляции для определенного временного интервала, подгоняя наклон кривой линейной регрессией. Оцените различия в скорости перевода с помощью статистического вывода.
- Для этого анализа (см. Таблицу материалов для программного обеспечения, используемого в этом исследовании) выполните два измерения области для каждой яйцеклетки: сама яйцеклетка - щелчок по области эллипса и окружение ооцита - и небольшая область, близкая к ооциту, которая будет использоваться для фонового вычитания - щелчок по прямоугольной области.
- Коллекция ооцитов
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Оголенные профазные I-арестованные ооциты 21-дневных мышей C57/BL6 вводили репортерную смесь, содержащую мРНК, кодирующую репортера Ypet, слитую с 3'UTR IL-7 и мРНК, кодирующих mCherry. Экспрессия YFP и mCherry была зарегистрирована в 39 ооцитах, из которых 30 были зрелыми, а 9 были арестованы в профазе I в качестве отрицательного контроля. Три созревающих ооцита были исключены для анализа, потому что они либо имели задержку GVBD (N = 2), либо перемещались в чашке во время записи (N = 1). На рисунке 3 показана экспрессия mCherry и YFP в профазе I и созревающих ооцитах. На рисунке 4 показана экспрессия YFP созревающих ооцитов, скорректированная на плато экспрессию mCherry (усредненная экспрессия mCherry за последние 10 временных точек) для корректировки на введенный объем. Скорость трансляции репортера измеряли кривой подгонкой (линейной регрессией) значений YFP/mCherry в профазе I и в созревающих ооцитах в течение первых 0-2 ч или 8-10 ч после высвобождения цилостамида(рис. 5А). Накопление репортера не следует линейной схеме, о чем свидетельствует значительная разница в скорости трансляции между 0-2 ч и 8-10 ч после высвобождения цилостамида (p<0,0001; Рисунок 5B). Поэтому эти результаты указывают на активацию трансляции IL-7 во время мейотического созревания ооцитов.
Рисунок 1:Схематический обзор экспериментальной процедуры. Олигоаденилированный Ypet/3' UTR и полиаденилированная мРНК, кодируя mCherry, микро-вводятся в оголенные ооциты 21-дневных мышей C57/BL6. Ооциты предварительно инкубируют в течение 16 ч в цилостамидной среде созревания, чтобы сигнал mCherry достиг плато. После предварительной инкубации начинается покадровая запись, где ооциты либо удерживаются в среде с цилостамидом для создания профазной I-арестованной контрольной группы, либо высвобождаются в среде, свободной от цилостамида, для созревания. Сокращения: UTR = непереведенный регион; YFP = желтый флуоресцентный белок; fw primer = форвардный грунтовка; rev primer = обратная грунтовка; Ampr = сопротивление ампициллина; polyA = полиаденил; oligoA = олигоаденил; GV = зародышевый жизикул. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Пример покадровой записи одного ооцита. Записи Brightfield, YFP и mCherry одного ооцита, вводимого с мРНК, кодирующих Ypet/Interleukin-7 3' UTR и полиаденилированной mCherry при профазе I, MI (6 ч после высвобождения цилостамида) и MII (15 ч после высвобождения цилостамида). Шкала бара = 25 мкм. Сокращения: YFP = желтый флуоресцентный белок; GV = зародышевый жизикул; MI = метафаза I; MII = метафаза II. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Сигналы YFP и mCherry, записанные с помощью покадровой микроскопии. YFP и mCherry сигналы ооцитов, вводимых с олигоаденилированной Ypet/IL7 3' UTR и полиаденилированной мРНК, кодирующей mCherry. Ооциты либо содержали в среде с цилостамидом для получения профазной I-арестованной контрольной группы (N=9), либо высвобождали в среде, свободной от цилостамида, чтобы обеспечить созревание (N=30). Данные представляют собой индивидуальные измерения ооцитов. Сокращения: Ил-7 = интерлейкин-7; YFP = желтый флуоресцентный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Сигнал YFP скорректирован для совместного введения уровня mCherry. Сигналы YFP профазных I-арестованных и созревающих ооцитов корректировали на вводимый объем путем деления сигнала YFP на средний сигнал mCherry последних 10 временных точек. Индивидуальные соотношения YFP/mCherry для(A)профазных I-арестованных ооцитов и(B)созревающих ооцитов и средняя ±стандартной погрешности среднего соотношения YFP/mCherry профазных I-арестованных и(D)созревающих ооцитов. Сокращения: YFP = желтый флуоресцентный белок; GVBD = распад зародышевого езикулы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Расчетные скорости трансляции при 0-2 ч и 8-10 ч созревания. (A) Желтые флуоресцентные белковые (YFP) сигналы одиночных ооцитов, скорректированные для mCherry (YFP / mCherry) через 0-2 ч или 8-10 ч после высвобождения цилостамида и(B)скорость трансляции (средняя ± стандартной погрешности среднего), рассчитанная путем подгонки кривой (линейной регрессии) значений YFP/mCherry через 0-2 ч и 8-10 ч после высвобождения цилостамида. Данные анализировались с помощью непарного двуххвостого т-теста. *p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6:Пример подавления перевода: Oosp2. Повторно проанализированы данные эксперимента, в котором оооцитам вводили Ypet-Oosp2 3′ UTR и полиаденилированную мРНК, кодируемую mCherry. Сигналы YFP профазных I-арестованных (N=63) и созревающих ооцитов (N=72) корректировали на инъекционный объем путем деления сигнала YFP на средний сигнал mCherry последних 10 временных точек. Данные экспрессии YFP и mCherry были получены с использованием ксеноневой дуговой лампы, в отличие от эксперимента IL-7, где использовался светодиодный источник света. Данные представляют собой среднюю ± стандартной погрешности среднего значения отдельных измерений ооцитов и были ранее опубликованы в Luong etal. 5. Сокращения: YFP = желтый флуоресцентный белок; Oosp2 = секретируемый ооцитами белок 2; UTR = непереведенный регион; Ил-7 = интерлейкин-7; LED = светодиод; GVBD = распад зародышевого езикулы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7:Влияние микровпрыскного и флуоресцентного воздействия на сроки ГВБД и ПБЭ. Сроки применения GVBD и PBE ооцитов, которые были либо микроинъецированы и подвергнуты флуоресценции (введены), либо не введены и не подвергались флуоресценции (не вводились). Данные представляют собой индивидуальные измерения ооцитов. Данные анализировались с помощью непарного двуххвостого t-теста. *с<0.001. Сокращения: GVBD = распад зародышевого езикулы; PBE = экструзия полярного тела. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Основная среда сбора ооцитов | ||
| компонент | Для 500 мл | |
| HEPES модифицированный минимальный существенный средний eagle | 7.1 г | |
| Бикарбонат натрия | 252 мг | |
| Пируват натрия | 1.15 мл | |
| Пенициллин/Стрептомицин 100x | 5 мл | |
| Сверхчистая дистиллированная вода (Invitrogen, 10977-015) | До 500 мл | |
| Среда созревания | ||
| компонент | Для 500 мл | |
| MEM альфа 1x | До 500 мл | |
| Пируват натрия | 1.15 мл | |
| Пенициллин/Стрептомицин 100x | 5 мл | |
Таблица 1: Подготовка носителей. Перечень компонентов, которые необходимо добавить для приготовления основной среды сбора ооцитов и среды созревания ооцитов.
| последовательность | |||||
| Ипет/Интерлейкин-7 3' УТР | ГАГААККККТКТКТКТГКТКТКТКТКТГАААТТААТТАКТКТАТАГГГАГАККАААКТКТГККАААКТГКТГ GCTAGTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAAGGCGA AGAGCTGTTCACCGGCGTGGTGCCCATCCTGGGGAGCTGGGGGGCGACGTGAACGGCC ACAAGTTCAGCGTGAGCGGCGAGGGCGAGGGACGCGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGCTGCTG AAGCTGCTGTGCACCACCGGCAAGCTGCCCCCCCTGGCCCCCCCCCTGGTGACCCCCCCCCCTCCTCCTG GGCTACGGCGTGCAGTGCTTCGCCCGCGCCCCCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCA AGAGCGCCATGCCCGAGGTACGTGCAGGAGCGGACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAA CTACAAGACCCGGGGGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGCGACACCCTGGTGAACCGGATCGAGCTGAAGCTGA AGGGCATCGACTTCAAGGAGGGGCAACATCCTGGGCCACAAGCTGGAGTACAACTACAAC AGCCACAACGTGTACATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGAT CCGGCACAACATCGAGGGGGGCGGCGTGCAGCTGGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCC CATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCCCGACAACCACTACTACTACTACTACTACTACTTACCAGAGCGCCCTG TTCAAGGACCCCAACGAGAAGCGGGACCACATGGTGCTGCTGGAGTTCCTGACCGCCGCCCC GGCATCACCGAGGGCATGAACGAGCTCTATAAGAGATCTTTCGAAGGTAAGCCTATCCCTAA CCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACGCGTACCGGTCATCATCACCATCACCATTGAACAGGAC ATGTAGTAACAACCTCCAAGAATCTACTGGTTCATATACTTGGGGGAAACCCTTCCAG AAGTTCCTGGATGCCTCCTGCTCAAATAAGCCAAGCAGCTGAGAAATCTACAGTGAGGTATG AGATGATGGACACAGAAATGCAGCTGACTGCTGCTGCCGTCAGCATATACATATAATAAAGATATATCAA CTATACAGATTTTTGTAATGCAATCATGTCAACTGCAATGCTTTTAAAACCGTTCCAAATGTTTCTC TAACACTACAAAGTCTACAAAAAGCAAGGCTATGAAGATTCAGTCACCACTGTTTTCTTAGCGC AAAATGATGGTATGGTTAAACATTCATTGGTGAACCACTGGGGGAGTGGAACTGTCCTGTTTTAGTAG ACTGGAGATACTGGAGGGCTCACGGTGATGGATAATGCTCTTGAAAACAAGAGTCTATCTTAAAGC AGCAGCAAAAAAAGAAGCTTAAGGCACTTAAGGCATCAACAAATGTAGTTAAATATGAATGTATAACAACA CATAACTTCAGTAAAGAGCATAGCAGATATTTTTAAATAAAAGTATTTTTAAAGATAGAAATGCACTTATTAT TCCAAAGATACTGAACCTTAGTATTCAGTCGCTTTTGACACTTGTATAATAAAGCTTATATAACTGAA TTTTCAATTTGAAAAGTATATTTTTAAAAGAATATATGCTAGACTTTTAATTAATGTATATGTTTAATTTTTATTT TGGCATTCTGTCTCTCTCTTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTACCTATCTATCTATATATTATTATATATATATTATTATTATATATATATATACTTATATATATACTTATATATACTTATATATATCTCTCTC АТТТТАТАТАКТАКТАКТАКТААТТГКТГГАТТАГТТАКТТТАКТТТАКТТААКТТААКТТААККТТААККТТААККТТАКТТАКТТАКТТАКТКТКТАТТАТТАКТКТАТТАКТТАКТТАКТТАКТТАКТТАКТТАКТТАКТТАКТТААКТТААККТТААККТТААК TGTCAGGTTCCCTTACTCTCGAGAGTGTTCATTGCTGCACTGTCATTTGATCCCAGTTTTATTGAACAC ATATCCTTTAACACACTCACGTCCAGATTTAGTAGCAGGAGACTAGGACCCTATAACTTTGTTAAGAGAGAGAAA AACACTAATTTCTTGTTTTATAGTAGTAGGGTCTTATTCGTATCTAAGGCAGGCTAGGATTGCAGACATGAGCGC CAATATGCTTAATTAGAAACATTCTTTTTTTTTTGTTAAACTCATGTCTTTTACAAGATGCCTACATATATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTAT GTATATGCCTGTTTAAATCCTTTTTTGTAAGGTCTGCTCTTCAGTTGTAATGGAAAGAAACACTA TGTTGTAGAGGCCAAATTTCTGAAAGTGATAAGGGTTTGCTTGTACTGAATTCTCATTCCTTGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTCCAGCCACGTGAGCATCTAGCTATCTATACGCTGGATGTATTTGACCGATGCCTGCTCCACTGGCAC ATTGCATGTGTGTGGTAGCCATGCCTTCTTTCTTCTCCCCCCCCCAACCCCTATAATGCTCTACTCAGTGG TACAGATAGCTGGGATTATCACAATTTTGAGAGAAACCAATTGTTTAAAGTTTTTCATAATCACCATTTTTTTCATTTAATCACCATTT GCCCAGAAAACAGTTCTCTCAACTTGTTTGCAACATGTAATAATTTAAGAAACTCAATTTTGTTAATGGACTT TCGATAACTTCCTTAGATATCCCACATCTCCTGTGTCAGTCCTTTGTCCTGAGGAACTGGTAAAATGGGTA AGCCCTTAGCTAGCGAACTGAAGGCATTCGCATGTGTAAGATAATCTATACCTGCAAGGCTGTCTGGAT GGCTCCCTACCAATATTGAACAATCTGATTTTGGCAAAATAAAGGATAATTTTTTT |
||||
| Грунтовка вперед | ГАГААКККАКТКТТКТК | ||||
| Обратная грунтовка | ТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТАААТАТТАТТТТТТГ ККААААТК |
||||
Таблица 2:Пример репортерных и праймерных последовательностей Последовательности репортеров YFP/IL7 3'UTR и последовательностей прямого и обратного праймеров, которые использовались для получения линейного шаблона ПЦР для транскрипции in vitro.
Дополнительный файл: Желтый флуоресцентный белок(YFP) и запись mCherry time-lapse. YFP и mCherry покадровые записи одного ооцита, вводимого с мРНК, кодирующие Ypet/Interleukin-7 3' UTR и полиаденилированный mCherry. Канал YFP (например, S500/20 × 49057; Em: D535/30 m 47281), mВечерный канал (Ex: 580/25 × 49829; Эм: 632/60 м). Ооциты регистрировали каждые 15 мин в течение 16 ч (7 кадров в секунду). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленный метод описывает стратегию изучения активации и подавления трансляции целевой мРНК при различных переходах при мейотическом созревании мейотического созревания ооцитов in vitro. IL-7, цитокин, высвобождаемый ооцитом, который может быть вовлечен в ооцитар-кучевую клеточную связь8,13,был выбран с целью описания этого способа. Известно, что IL-7 все чаще транслируется во время созревания ооцитов8 и позволяет хорошо визуализировать трансляционную активацию с использованием этого метода. Если, однако, перевод происходит с постоянной скоростью на протяжении всего эксперимента, накопление репортера будет следовать линейной схеме, а скорости перевода в начале и конце эксперимента будут одинаковыми. Этот вывод может быть проверен хорошостью соответствия (R) линейной регрессии через весь интервал записи. Репрессии в репортерском переводе будут выдаваться как плато сигнала YFP.
Пример подавления перевода 3' UTR, можно найти в исследовании Luong etal. 5, где авторы сообщают о репрессии секретируемого белка ооцитов 2 (Oosp2) во время мейотического созревания ооцитов. Эти данные были повторно проанализированы и показаны на рисунке 6. Созревающие ооциты показывают плато сигнала YFP, что указывает на подавление трансляции, в то время как профазная I-арестованная контрольная группа следует линейной схеме репортерного накопления, что указывает на аналогичные скорости трансляции в начале и конце эксперимента. При изучении репрессии трансляции особенно важно включить профазную I-арестованную контрольную группу, чтобы убедиться, что плато сигнала YPF не объясняется снижением качества ооцитов из-за плохих условий культивирования, тем самым подтверждая жизнеспособность ооцитов. Накопление репортера может быть подтверждено количественной ПЦР с обратной транскрипцией с использованием праймеров для YFP или западным блоттингом, используя метку V5-эпитопа, включенную в репортер в этом протоколе.
Плато сигнала YFP может быть обусловлено не только активно регулируемым подавлением трансляции, но также может быть объяснено деградацией репортера во время мейотической прогрессии ооцитов. Это может отражать дестабилизацию эндогенной мРНК, которая необходима для перехода к экспрессии эмбрионального генома14,15,16. Эта возможность может быть проверена путем измерения уровней транскрипта гена-мишени на стадии I профазы и стадии метафазы II для подтверждения стабильности мРНК. При получении ооцитарной кДНК предпочтительно использовать случайную гексамерную праймингу над олиго-dT-праймингом. Последний метод представляет очевидные различия в уровнях транскриптов генов, которые могут отражать различия в поли(А) длине этих транскриптов, а не фактические различия в уровнях транскриптов7.
Существует несколько методов изучения общегенной трансляции мРНК в мышиных ооцитах. Эти методы включают полисомное профилирование7,17,18 и RiboTag/RNA-Seq5,19,20. Профилирование рибосом является еще одним методом изучения общегеномной трансляции, который был использован в дрожжах, которые являются еще одним модельным организмом, который используется для изучения мейоза21,22. Однако эти геномные анализы для изучения трансляции мРНК у мышей требуют использования 150-200 ооцитов на образец, в то время как количество ооцитов, доступных для анализа, обычно ограничено. Анализ одного ооцита, описанный в настоящем описании для оценки трансляции 3' UTR целевых мРНК, дополняет общегеномный анализ трансляции, поскольку позволяет характеризовать элементы 3' UTR, которые регулируют программу трансляции во время мейотического созревания яйцеклеток4,5,6. В прошлом анализы на основе люциферазы использовались для оценки трансляции 3' UTR целевых мРНК10, 20,23, поскольку это очень чувствительный метод, который требует только нескольких ооцитов на образец; однако ооциты должны быть лизированы, чтобы обнаружить количество люциферазы в образце.
Другие использовали 3'UTR/зеленый флуоресцентный белок (GFP) репортер для оценки накопления GFP в живых мышиных ооцитах4. Однако в этих экспериментах использовались только две временные точки: начало инкубации (профаза I) и конец инкубации (метафаза II). Это значительно уменьшает мощность измерений и увеличивает вероятность ошибок. Кинетические данные обеспечивают точные измерения, основанные на скоростях (несколько точек) и точно определяют время, когда происходит трансляционная активация или вытеснение. Кроме того, подавление перевода не может быть оценено в эти единые временные моменты, что может привести к неточному выводу. Поэтому этот метод был скорректирован путем применения покадровой микроскопии для оценки накопления репортера Ypet/3' UTR на протяжении всего созревания ооцитов мыши in vitro 5,6,9. Используя эту стратегию, можно изучать трансляцию при различных переходах во время созревания ооцитов.
Есть несколько важных аспектов этого метода, которые следует учитывать. Во-первых, используемые репортеры включают хвост олиго (А), пропуск которого значительно уменьшает накопление репортеров. Это может быть связано как с уменьшением трансляции, так и с дестабилизацией репортерной мРНК24,25. Во время предварительной инкубации в профазе I трансляция олигоаденилированного зонда корректируется, чтобы отразить скорость трансляции эндогенной мРНК5. Во-вторых, важно понимать, что увеличение числа записей или продолжительности флуоресцентного воздействия может потенциально вызвать фототоксичность и тем самым ухудшить качество ооцитов. Хотя в текущем эксперименте были приняты 15-минутные интервалы, частота дискретизации может быть уменьшена, когда необходимо использовать воздействие высокой флуоресценции в случае низкой экспрессии репортера.
Для ограничения величины фототоксичности был использован холодный светодиодный источник света, который требует более короткого возбуждения26. Чтобы оценить потенциальные эффекты фототоксичности в ооцитах, время GVBD и PBE сравнивали в ооцитах, которые были либо микроинъецированы и подвергнуты флуоресценции, либо не введены и не подвергались флуоресценции. Было обнаружено, что комбинация микровпрыскивания и флуоресцентного воздействия немного задерживает GVBD (p<0,001), в то время как сроки PBE были аналогичными(рисунок 7).
Этот метод был использован для изучения трансляционных регуляторных элементов 3' UTR во время мейотического созревания мейотического созревания ооцитов in vitro. Аналогичным образом, он также может быть использован для изучения функциональных 5' элементов UTR, необходимых для регуляции трансляции, или для изучения трансляции во время оплодотворения оплодотворения ооцитов in vitro. Хотя этот метод был применен к ооцитам человека и мыши, он также применим к другим видам животных. Поскольку этот репортерный анализ выполняется в одиночных ооцитах, он особенно подходит для использования в моноовуляторных видах, у которых количество ооцитов, доступных для анализа, ограничено. В отличие от использования оголенных ооцитов, другим применением этого метода является введение репортера в кучевые ооциты, так как кучевые клетки играют важную роль в регуляции трансляционной программы8,10,27. Однако следует учитывать, что кучевые ооциты с большей вероятностью отодвигаются от регистрирующей плоскости во время эксперимента по сравнению с оголенными ооцитами из-за движения кучевых клеток во время расширения КОК. Это может привести к увеличению доли ооцитов, которые должны быть исключены из анализа. В будущем может быть использовано программное обеспечение для отслеживания клеток, которое способно отслеживать x, y и z положения ооцитов в капле, что может решить эту проблему.
В заключение, описанный анализ репортера одного ооцита представляет собой стратегию исследования трансляционной программы, выполняемой при переходе ооцита в зиготу. Расширенные знания об этой трансляционной программе могут дать важные подсказки о молекулярной регуляции компетентности развития ооцитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH R01 GM097165, GM116926 и Юнис Кеннеди Шрайвер NICHD Национальными центрами трансляционных исследований в области репродукции и бесплодия P50 HD055764 Марко Конти. Энрико М. Далделло был поддержан стипендией Фонда Лалора, а Натасья Г. Я. Костерманс была поддержана стипендией Рубикона от Нидерландской организации научных исследований (NWO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Preparation of media | |||
| Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra | Sigma-Aldrich | SIAL-A3311 | |
| Cilostamide | EMD Millipore | 231085 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M2645 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered | Genesee Scientific Corporation (GenClone) | 25-512 | |
| Sodium Bicarbonate | JT-Baker | 3506-1 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry | |||
| Agarose | Apex Biomedical | 20-102QD | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-1G | |
| Choo-Choo Cloning Kit | McLab | CCK-20 | |
| CutSmart Buffer (10x) | New England Biolabs | B7204 | |
| DNA loading dye (6x) | Thermo Scientific | R0611 | |
| dNTP Solution | New England Biolabs | N0447S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Fisher | SM1333 | |
| LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova | Teknova | L1010 | |
| LB Medium (Capsules) | MP Biomedicals | 3002-021 | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Life Technologies | AM1908 | |
| MfeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3589 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1344 | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(A) Tailing kit | Invitrogen | AM1350 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| S.O.C. medium | Thermo Fisher | 15544034 | |
| TAE buffer | Apex Biomedical | 20-193 | |
| Ultrapure Ethidium Bromide Solution | Life Technologies | 15585011 | |
| Oocyte collection | |||
| Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Calibrated micro-pipettes | Drummond Scientific Company | 2-000-025 | |
| PMSG- 5000 | Mybiosource | MBS142665 | |
| PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2 | BD | 305111 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| Oocyte micro-injection | |||
| 35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-0-20-C | For time-lapse microscopy |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Oil for Embryo Culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Petri Dish | Falcon | 351006 | For micro-injection |
| Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | For oocyte incubation |
| VacuTip Holding Capillary | Eppendorf | 5195000036 | |
| Software | |||
| Biorender | BioRender | Preparation of Figure 1S | |
| MetaMorph, version 7.8.13.0 | Molecular Devices | For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation |
References
- Clarke, H. J. Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis. Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).
- Gosden, R., Lee, B. Portrait of an oocyte: our obscure origin. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).
- Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F. Translational control in the germ line. Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. , Springer, Cham. 129-156 (2015).
- Dai, X. -X., et al. A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte. Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).
- Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption. Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).
- Yang, C. R., et al. The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation. Nature Communications. 11, 1399 (2020).
- Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes & Development. 25 (7), 755-766 (2011).
- Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).
- Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes. Development. 146 (8), (2019).
- Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence. Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).
- Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary. Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).
- Shu, Y., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
- Cheng, Y., et al. Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats. Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).
- Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation. Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).
- Sha, Q. Q., et al. CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte. The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).
- Yartseva, V., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming. Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).
- Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
- Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
- Martins, J. P. S., et al. DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation. Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).
- Yang, Y., et al. Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation. Genes & development. 31, 1302-1307 (2017).
- Cheng, Z., et al. Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis. Cell. 172 (5), 910-923 (2018).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. A combinatorial code for CPE-mediated translational control. Cell. 132 (3), 434-448 (2008).
- Morgan, M., et al. mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome. Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).
- Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation. RNA. 26 (3), 324-344 (2020).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
- Chen, J., et al. Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes. Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).
