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Medicine

एक उपन्यास मानव ऑर्गेनोटिपिक रेटिना संस्कृति तकनीक का लक्षण वर्णन

Published: June 9, 2021 doi: 10.3791/62046
Automatic Translation
*1, 1, 1, *1
1Buchanan Ocular Therapeutics Unit, Department of Ophthalmology and the New Zealand National Eye Centre, University of Auckland
* These authors contributed equally

Summary

इस अध्ययन का उद्देश्य एक उपन्यास मानव ऑर्गेनोटिपिक रेटिना कल्चर (HORC) मॉडल विकसित करना है जो एक्सप्लांट हैंडलिंग के दौरान रेटिना अखंडता से समझौता करने से रोकता है। यह रेटिना को अंतर्निहित विट्रियस और अंतर्निहित रेटिना वर्णक एपिथेलियम-कोरॉयड (आरपीई-कोरॉयड) और स्क्लेरा के साथ प्राप्त किया जाता है।

Abstract

पिछले मानव ऑर्गेनोटिपिक रेटिना कल्चर (हॉआरसी) मॉडल ने अलग रेटिना का उपयोग किया है; हालांकि, रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम-कोरॉयड (आरपीई-कोरॉयड) और स्क्लेरा द्वारा प्रदत्त संरचनात्मक समर्थन के बिना, नाजुक रेटिना की अखंडता से आसानी से समझौता किया जा सकता है। इस अध्ययन का उद्देश्य एक उपन्यास HORC मॉडल विकसित करना था जिसमें रेटिना, आरपीई-कोरॉयड और स्क्लेरा शामिल है ताकि रेटिना के विस्तार को बनाए रखा जा सके।

आईरिस और लेंस को हटाने के लिए अंगों के साथ परिधि काटने के बाद, आंखों को समतल करने के लिए चार गहरे चीरे बनाए गए थे। पिछले हॉआरसी प्रोटोकॉल के विपरीत, न केवल रेटिना बल्कि आरपीई-कोरॉइड और स्क्लेरा के माध्यम से कटौती करने के लिए एक ट्रेफिन का उपयोग किया गया था। परिणामी ट्रिपल-स्तरित एक्सप्लांट्स को 72 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया गया था। शारीरिक संरचनाओं का आकलन करने के लिए हेमेटॉक्सीलिन और इओसिन स्टेनिंग (एचएंडई) का उपयोग किया गया था और रेटिना एक्सप्लांट का उपयोग एपोप्टोसिस, मुलर सेल अखंडता और रेटिना सूजन के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) द्वारा आगे की विशेषता थी। रोग प्रेरण की संभावना की पुष्टि करने के लिए, मधुमेह रेटिनोपैथी (डीआर) की नकल करने के लिए उच्च ग्लूकोज (एचजी) और समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स (साइटोकिन्स(साइट) के संपर्क में थे। ल्यूमिनेक्स चुंबकीय मनका परख का उपयोग संस्कृति माध्यम में जारी डीआर-संबंधित साइटोकिन्स को मापने के लिए किया गया था।

एचएंडई धुंधला अंतर्निहित आरपीई-कोरॉयड और स्क्लेरा के साथ रेटिना एक्सप्लांट में अलग रेटिना लैमेले और कॉम्पैक्ट नाभिक का पता चला, जबकि अंतर्निहित संरचनाओं के बिना रेटिना कम मोटाई और गंभीर नाभिक हानि का प्रदर्शन किया । आईएचसी के परिणामों ने एपोप्टोसिस और रेटिना सूजन के साथ-साथ संरक्षित मुलर सेल अखंडता की अनुपस्थिति का संकेत दिया। ल्यूमिनेक्स के नेक कहते हैं कि 24 एच पर बेसलाइन स्तर के सापेक्ष एचजी + साइट के संपर्क में रेटिना एक्सप्लांट में डीआर-संबद्ध समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स का स्राव काफी बढ़ गया है।

हमने सफलतापूर्वक विकसित किया और एक उपन्यास होआरसी प्रोटोकॉल की विशेषता बनाई जिसमें रेटिना अखंडता को एपोप्टोसिस या रेटिना सूजन के बिना संरक्षित किया गया था। इसके अलावा, एचजी + साइट के रेटिना एक्सप्लांट को उजागर करते समय डीआर-संबद्ध समर्थक भड़काऊ बायोमार्कर के प्रेरित स्राव से पता चलता है कि इस मॉडल का उपयोग चिकित्सकीय रूप से अनुवादयोग्य रेटिना रोग अध्ययन के लिए किया जा सकता है।

Introduction

रेटिना एक अत्यधिक विशेष नेत्र संरचना है जो आने वाली प्रकाश ऊर्जा को इलेक्ट्रिक संकेतों में बदलने के लिए जिम्मेदार है, जिसे तब दृश्य धारणा के लिए मस्तिष्क द्वारा संसाधित किया जाता है। मानव रेटिना में सेल प्रकारों की एक गतिशील श्रृंखला होती है, जो एक अद्वितीय लैमेलर संरचना में अत्यधिक संगठित होती है जिसमें दो सिनैप्टिक और तीन नाभिक परतें1 (चित्रा 1) शामिल होती हैं। रेटिना होमोस्टेसिस न्यूरोरेटिनल कोशिकाओं, रक्त वाहिकाओं, नसों, संयोजी ऊतकों और आरपीई1के बीच जटिल कनेक्शन द्वारा निरंतर है। परिष्कृत रेटिना शरीर रचना और शरीर विज्ञान के कारण, कई रेटिना रोगों के तंत्र अभी भी खराब समझ में रहते हैं2,3,4,5. रेटिना रोगों का बेहतर अध्ययनकरने के लिए, हॉआरसी मॉडल6,7,8,9विकसित किए गए हैं। पशु अध्ययन और इन विट्रो संस्कृतियों की तुलना में, HORC मॉडल लाभप्रद हैं क्योंकि वे सीटू में गतिशील सेलुलर पर्यावरण और जटिल न्यूरोवैस्कुलर इंटरैक्शन को बनाए रखते हैं, जो नैदानिक अनुवाद के लिए एक अच्छा मॉडल प्रदान करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1:मानव आंखों की पीछे की नेत्र संरचनाएं। पीछे के पूर्वकाल में, रेटिना परतें हैं: तंत्रिका फाइबर परत (एनएफएल), गैंगलियन सेल लेयर (जीसीएल), इनर प्लेक्सिफॉर्म लेयर (आईपीएल), इनर न्यूक्लियर लेयर (आईएनएल), बाहरी प्लेक्सीफॉर्म लेयर (ओपीएल), बाहरी परमाणु परत (ओएनएल), फोटोरिसेप्टर इनर सेगमेंट (आईएस), और फोटोरिसेप्टर बाहरी परत (ओएस)। रेटिना के भीतर कोशिकाओं में गैंगलियन कोशिकाएं (नीली), अमैक्रिन कोशिकाएं (पीली), द्विध्रुवी कोशिकाएं (लाल), क्षैतिज कोशिकाएं (बैंगनी), रॉड फोटोरिसेप्टर (गुलाबी) और शंकु फोटोरिसेप्टर (हरा) शामिल हैं। विट्रेस रेटिना के पूर्वकाल में स्थित है। आरपीई, ब्रुच की झिल्ली, कोरॉइड और स्क्लेरा रेटिना के पीछे स्थित हैं। ध्यान दें कि दिखाया गया चित्र केवल रेटिना का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व है और प्रत्येक परत के भीतर कोशिकाओं/रेटिना कनेक्टिविटी का अनुपात वीवो सेटिंग में का संकेत नहीं हो सकता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पहले विशेषता HORC प्रोटोकॉल6,7,8,9 एक सर्जिकल ट्रेफिन का उपयोग कर अंतर्निहित RPE-choroid और स्क््लीरा से रेटिना को अलग करने में शामिल है । हालांकि, इन अंतर्निहित संरचनाओं द्वारा प्रदान किए गए समर्थन के बिना, पारदर्शी रेटिना तार हो जाता है, संभालना मुश्किल हो जाता है और संदंश जैसे उपकरण आसानी से इसकी अखंडता को बाधित कर सकते हैं। इसके अलावा , आरपीई के बिना संस्कृति में रेटिना को अलग करने से गंगलियन सेल एपोप्टोसिस और फोटोरिसेप्टर डिजनरेशन10 , 11,12का कारण दिखाया गया है । इस प्रकार, एक वैकल्पिक HORC प्रोटोकॉल जो रेटिना अखंडता के नुकसान को कम करता है और वीवो वातावरण में बेहतर नकल करता है, उपयोगी होगा। रेटिना रोग तंत्र का अध्ययन करते समय यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि एक्सप्लांट हैंडलिंग के दौरान शारीरिक चोट कलाकृतियों को पेश कर सकती है। इसलिए, इस अध्ययन का उद्देश्य एक उपन्यास हॉर्क मॉडल विकसित करना था जिसमें एक्सप्लांट हैंडलिंग और संस्कृति के दौरान रेटिना अखंडता की रक्षा के लिए आरपीई-कोरॉइड और स्क््लीरा शामिल है।

इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, अवशिष्ट विट्रियस और अंतर्निहित आरपीई-कोरॉयड और स्क्लेरा के बीच रेटिना एक्सप्लांट "सैंडविच" निकाले गए थे। सैंडविच एक्सप्लांट्स में, रेटिना टुकड़ी और तह को रोकने के लिए रेटिना का वजन होता है, जबकि कठिन, रेशेदार स्क्लेरा संरचनात्मक समर्थन के लिए पाड़ और फोर्स्प के लिए एक संपर्क बिंदु दोनों के रूप में कार्य करता है। इसके अलावा, पशु मॉडलों ने दिखाया है कि संस्कृति में आरपीई को बनाए रखने से रेटिना अध: पतन और ग्लियल प्रसार को रोका जा सकता है, हाइपोक्सिया और सूजन10, 11, 12जैसे खतरे के संकेतों के लिए मुलर कोशिकाओं की प्रतिक्रिया।

मॉडल की विशेषता के लिए, सैंडविच रेटिना एक्सप्लांट्स को शारीरिक संरचनाओं और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) का आकलन करने के लिए हेमटॉक्सीलिन और ईओसिन (एचएंडई) के साथ दाग दिया गया था, टर्मिनल डीऑक्सीन्यूक्लियोक्लियोइटोटिडिल ट्रांसफरेस डयूटीप निक एंड लेबलिंग (ट्यूनल, एक एपोप्टिक सेल मार्कर), ग्लियल फिब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी, रेटिना सूजन और म्यूलर सेल एक्टिवेशन मार्कर) के साथ लेबलिंग एक्सप्लांट्स, और विमेंटिन, म्यूलर सेल इंटीग्रिटी का एक मार्कर। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या इस मॉडल को आणविक रोग के संकेत विकसित करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है, एक्सप्लांट्स को उच्च ग्लूकोज (एचजी) के साथ प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स (साइटोकिन्स(साइट), इंटरल्यूकिन-11 (आईएल-1) और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-α (टीएनएफ-α) के साथ उजागर किया गया था,जो एक खेती वातावरण है जिसे कोशिका और पशु रोग मॉडल13, 14,15दोनों में मधुमेह रेटिनोपैथी (डीआर) की नकल करने के लिए दिखाया गया है। संस्कृति माध्यम में जारी साइटोकिन्स को मापने के लिए डीआर मॉडल में ल्यूमिनेक्स परख का उपयोग किया गया था।

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Protocol

मानव दाता नेत्र कप न्यूजीलैंड नेशनल आई बैंक से प्रत्यारोपण के लिए कॉर्नियल उत्तेजना के बाद प्राप्त किए गए थे और जैसा कि उत्तरी बी स्वास्थ्य और विकलांगता नैतिकता समिति (NTX/06/19/CPD/AM07) द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

नोट: संस्कृति एक वर्ग द्वितीय जैवसेफ्टी कैबिनेट में किया जाना चाहिए बाँझ ऊतक संस्कृति की स्थिति सुनिश्चित करने के लिए । ऊतकों को महत्वपूर्ण रेटिना अखंडता हानि से बचने के लिए 24 घंटे के भीतर सुसंस्कृत किया जाना चाहिए।

Figure 2
चित्रा 2:सैंडविच रेटिना एक्सप्लांट इकट्ठा करने की प्रक्रिया दिखाने वाली छवियां। एक्सप्लांट तैयारी के लिए, चीरा के दौरान ऊतक क्षति को कम करने के लिए दुनिया के अंदर का सामना करना पड़ कुंद अंत के साथ, एक तेज टिप और एक कुंद अंत के साथ विच्छेदन कैंची का उपयोग करें। हैंडलिंग के दौरान इंट्राओक्यूलर ऊतकों को खरोंचने से बचने के लिए कुंद सिरों के साथ संदंश का उपयोग करें। सर्जिकल कैंची का उपयोग करना, कुंद अंत के साथ अंदर का सामना करना पड़ रहा है, आईरिस और लेंस(ए-सी)को हटाने के लिए लिम्बस के साथ काटा । ओनएच स्थित हो सकता है यदि सीधे खोले गए आईकप(डी)में देख रहे हैं। कुंद सुझावों के साथ संदंश का उपयोग करना, दुनिया को स्थिर करने के लिए स्क्लेरा पकड़(ई)। ओनएच की ओर दो गहरे चीरे बनाकर ग्लोब को दो हिस्सों में खड़ी बांटें लेकिन ओनएच के माध्यम से कटौती न करें। इसे क्षैतिज मेरिडियन(जी)के साथ दोहराएं। स्क्लीरा पर कुंद संदंश लागू करें और धीरे से एक क्लोवर आकार(एच-कश्मीर)के लिए ग्लोब खोलें । जोड़ रेटिना को चिकना करने के लिए विट्रेस को सावधानीपूर्वक हेरफेर करने के लिए संदंश का उपयोग करें, रेटिना पर विट्रेस टग के रूप में, लेकिन रेटिना को सीधे(I)न छुएं। यदि यह रेटिना टुकड़ी या तह पैदा कर रहा है तो विट्रियस को हटा दें (चित्रा 2 में नहीं दिखाया गया है क्योंकि पारदर्शी विट्रियस तस्वीरों पर अच्छी तरह से कैप्चर नहीं किया गया है)। उन क्षेत्रों का पता लगाएं जहां रेटिना सपाट है और सर्जिकल ट्रेफिन(एल)का उपयोग करके रेटिना एक्सप्लांट निकालता है। स्क्लीरा में संदंश लागू करना, रेटिना एक्सप्लांट को पहले से तैयार संस्कृति माध्यम(एम, एन)में सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें। पूरे सैंडविच एक्सप्लांट को अपने वजन के कारण कुएं के नीचे तक डूबना चाहिए, इसलिए प्रत्येक एक्सप्लांट को माध्यम(ओ)में पनडुब्बी किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

1. आईकप से सैंडविच रेटिना एक्सप्लांट्स का निष्कर्षण

  1. आईरिस और लेंस को हटा दें।
    1. एक पेट्री डिश के अंदर आंखों के कप रखें, आईरिस और लेंस के साथ ऊपर की ओर और ऑप्टिक तंत्रिका सिर (ओनएच) पेट्री डिश(चित्रा 2A)से संपर्क करते हैं।
    2. संदंश(चित्रा 2B)का उपयोग करके लिम्बस पर आंखों के कप को स्थिर रखें।
    3. लिम्बस(चित्रा 2 ए)के बाहरी किनारे के साथ परिधीय रूप से छोटे कटौती करके आईरिस और लेंस को अलग कर दें।
    4. आईरिस और लेंस को ध्यान से निकालें। हेरफेर(चित्रा 2C)के दौरान रेटिना परेशान करने से बचें ।
      नोट: लेंस आंख के कप में नहीं गिरेगा क्योंकि यह ज़ोन्यूल फाइबर के माध्यम से, सिलियरी शरीर में जुड़ा हुआ है।
  2. आंखों के कप को समतल करें।
    1. आंख कप के साथ अभी भी सीधे बैठे, ONH की पहचान । यह एक उज्ज्वल सफेद प्रकाश स्रोत(चित्रा 2D) केसाथ आसान है।
    2. ओनएच(चित्रा 2E)की ओर चार क्वाड्रंट्स पर चीरा। पेट्री डिश को आसान हैंडलिंग के लिए घुमाया जा सकता है। ओनएच न काटें।
    3. आंखों के कप को सावधानी से फैलाएं और समतलकरें (चित्रा 2E)।
    4. रेटिना अखंडता को बाधित करने से बचने के लिए रेटिना के बजाय स्क्लेरा पर संदंश लागू करें।
      नोट: परिधीय रेटिना टुकड़ी और तह अपरिहार्य है, के रूप में बह ता हुआ vitreous का वजन रेटिना पर खींच जाएगा । इन क्षेत्रों में, आगे रेटिना तह को रोकने के लिए विट्रियस को हटा दें। आरपीई-कोरॉयड और स्क्लेरा के शीर्ष पर रेटिना को स्थिर करने के लिए अवशिष्ट विट्रियस छोड़ना याद रखें।
  3. सैंडविच रेटिना एक्सप्लांट ्स लीजिए।
    1. रेटिना सिलवटों(चित्रा 2F)के बिना एक क्षेत्र में रेटिना पर एक सर्जिकल ट्रेफिन रखें।
    2. स्क्लीरा को भेदने के लिए कड़ी मेहनत करें, जिससे क्रैकिंग ध्वनि उत्पन्न होनी चाहिए।
    3. यह सुनिश्चित करने के लिए ट्रेफिन को 180 डिग्री से मोड़ें कि स्क्लेरा पूरी तरह से प्रवेश कर गया है ताकि रेटिना एक्सप्लांट अब शेष ऊतकों से अलग हो जाए।
    4. स्क्लीरा पर संदंश लागू करें और सैंडविच रेटिना एक्सप्लांट को कल्चर मीडियम(चित्रा 2G-I)में ट्रांसफरकरें।
    5. प्रत्येक चतुर्भुज के परिधीय रेटिना से 2-3 सैंडविच रेटिना एक्सप्लांट प्राप्त करें।
      नोट: सैंडविच रेटिना एक्सप्लांट कभी-कभी ट्रेफिन के उद्घाटन में फंस सकता है। संदंश का उपयोग करके, स्क्लेरा के आधार के एक छोटे से हिस्से को धीरे-धीरे चिढ़ाएं। यह अधिक बार होता है जब ब्लेड कुंद होता है और रेटिना(चित्रा 3A-C)का नुकसान हो सकताहै।
    6. ब्लेड आसानी से कुंद हो जाता है के रूप में 1-2 रेटिना explants काटने के बाद एक नया ट्रेफिन का प्रयोग करें(चित्रा 3CFigure 3
      चित्र 3:समस्या निवारण। निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान, रेटिना एक्सप्लांट सर्जिकल ट्रेफिन (ए) के उद्घाटन पर फंससकता है। रेटिना(बी)को छूने के बिना स्क्लेरा के आधार से धीरे-धीरे ऊतक को चिढ़ाएं। यह अधिक बार हो सकता है यदि सर्जिकल ट्रेफिन का उपयोग दो से अधिक रेटिना एक्सप्लांट निकालने के लिए किया जाता है, क्योंकि ब्लेड आसानी से कुंद(सी)बन सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
  4. संस्कृति रेटिना एक्सप्लांट्स।
    1. दुलबेक्को के संशोधित ईगल मध्यम पोषक तत्व मिश्रण एफ-12 (DMEM-F12) और एक 1x एंटीबायोटिक दवाओं और एंटीमाइकोटिक्स मिश्रण (ए. ए., 100x स्टॉक) युक्त संस्कृति माध्यम तैयार करें।
    2. निष्कर्षण निकालने से पहले, 24-अच्छी प्लेट के कुओं में मध्यम के 500 माइक्रोन रखें और इनक्यूबेटर में संतुलन रखें। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि बाद में माध्यम जोड़ने से रेटिना को उखाड़ फेंकना हो सकता है।
    3. संस्कृति 1.4.2 चरण में तैयार मध्यम में एक आर्द्रीकृत 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 72 घंटे तक के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सैंडविच रेटिना एक्सप्लांट करता है।
    4. डीआर-जैसे परिवर्तनों को प्रेरित करने के लिए, सीम-एफ 12 के संयोजन के साथ डीएमईएम-एफ 12 युक्त मध्यम में संस्कृति रेटिना एक्सप्लांट्स, टीएनएफ-α (10 एनजी/एमएल) और आईएल-1

2. सैंडविच रेटिना एक्सप्लांट्स का पैराफिन-एम्बेडिंग

  1. सैंडविच रेटिना एक्सप्लांट्स को ठीक करें।
    1. कम से कम 24 घंटे के लिए 10% फॉर्मेलिन में सैंडविच रेटिना एक्सप्लांट विसर्जित करें।
    2. फॉर्मेलिन समाधान निकालें और सैंडविच रेटिना एक्सप्लांट्स को धीरे-धीरे ऊतक पैड और कैसेट में स्थानांतरित करें।
    3. सैंडविच रेटिना एक्सप्लांट को कम से कम 24 घंटे के लिए 70% इथेनॉल में भिगो दें।
    4. ब्लॉक में पैराफिन-एम्बेड रेटिना एक्सप्लांट।
    5. माइक्रोटॉम का उपयोग करके पैराफिन-एम्बेडेड रेटिना ऊतकों को 5 माइक्रोम मोटी अनुभागों में काटें और ग्लास स्लाइड पर माउंट करें। इमेजिंग तक कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  2. वर्गों को डिपैराफिनाइज करें।
    1. 5 मिनट के लिए 70% जाइलीन में वर्गों को विसर्जित करें।
    2. 5 मिनट के लिए 100% जाइलीन में वर्गों को विसर्जित करें।
    3. 5 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में वर्गों को फिर से हाइड्रेट करें।
    4. 5 मिनट के लिए 100% इथेनॉल में वर्गों को फिर से हाइड्रेट करें।
    5. 10 मिनट के लिए नल के पानी के तहत धाराओं को धोएं।

3. एचएंडई, आईएचसी और एक चुंबकीय ल्यूमिनेक्स परख का उपयोग करके लक्षण वर्णन

  1. एचएंडई धुंधला प्रोटोकॉल
    1. चरण 2.2 का उपयोग करके अनुभागों को डिपैराफिन करें।
    2. 5 मिनट के लिए नल के पानी में वर्गों को हाइड्रेट करें।
    3. 5 मिनट के लिए गिल के 2 हेमटॉक्सीलिन समाधान में वर्गों दाग ।
    4. अतिरिक्त दाग को दूर करने के लिए नल के पानी के नीचे धाराओं को अच्छी तरह से धोएं।
    5. 1% एसिड अल्कोहल में दो बार वर्गों को डुबोकर अंतर करें।
    6. नल के पानी के नीचे धाराओं को जल्दी से धोएं।
    7. 1% लिथियम कार्बोनेट (10 मिलीग्राम/एमएल) में छह बार सूई से वर्गों नीले दाग ।
    8. अतिरिक्त नीले दाग को दूर करने के लिए 5 मिनट के लिए नल के पानी को चलाने के तहत वर्गों को अच्छी तरह से धोएं।
    9. 1% eosin में वर्गों डुबकी 10 बार।
    10. अतिरिक्त दाग को दूर करने के लिए नल के पानी के नीचे अनुभागों को जल्दी से धोएं।
    11. 100% इथेनॉल में 10 बार सूई लगाकर वर्गों को निर्जलित करें। ऐसा दो बार करें।
    12. 70% जाइलीन में वर्गों को 10 बार डुबोएं।
    13. 100% जाइलीन में वर्गों को 10 बार डुबोएं।
    14. डाइब्यूटिल्फ्थैलेट पॉलीस्टीरिन जाइलीन (डीपीएक्स) बढ़ते माध्यम का उपयोग करके एक कवरस्लिप के साथ माउंट करें।
    15. हल्के माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवियां लें।
  2. आईएचसी लेबलिंग प्रोटोकॉल'
    1. चरण 2.2 का उपयोग करके अनुभागों को डिपैराफिन करें।
    2. स्लाइड्स में पीएच 6.0 पर 0.05% ट्वीन 20 के साथ 10 एमएम सोडियम साइट्रेट बफर वाले घोल में रखें और 2 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर ऑटोमेटेड प्रेशर कुकर में एंटीजन रिट्रीवल चलाएं।
    3. 5 मिनट के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में वर्गों को धोएं। ऐसा 3 बार करें।
    4. पीबीएस वाले वर्गों को 0.1% ट्राइटन एक्स-100 और 10% सामान्य बकरी सीरम के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ब्लॉक करें।
    5. प्राथमिक एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका) के लिए संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट अनुभाग।
    6. पीबीएस में 5 मिनट के लिए वर्गों को धोएं। ऐसा 3 बार करें।
    7. दाग नाभिक 2 मिनट के लिए 4′, 6-diamidino-2-फेनीलिंडोल (DAPI) का उपयोग कर ।
    8. एक विरोधी फीका अभिकर्ती का उपयोग कर वर्गों को धोएं और माउंट करें।
    9. नेल पॉलिश के साथ सील कवर्लिप्स।
    10. एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवियों को ले लो।
  3. चुंबकीय ल्यूमिनेक्स परख
    1. 24 और 72 घंटे में 96-अच्छी तरह से यू-बॉटम प्लेट में प्रत्येक कुएं से मीडिया के 75 माइक्रोन स्थानांतरित करें।
    2. ल्यूमिनेक्स साइटोकिन परख का उपयोग करके 24 और 72 घंटे के बाद आईएल-18, आईएल-6, आईएल-8 और वैस्कुलर एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीजीएफ) के लिए सेल सुपरनैंट का विश्लेषण करें। परख16का संचालन करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें ।

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Representative Results

रेटिना अखंडता इस HORC मॉडल में संरक्षित किया गया था । रेटिना अखंडता को सुसंस्कृत सैंडविच रेटिना एक्सप्लांट में संरक्षित किया गया था लेकिन आसन्न संरचनाओं के बिना सुसंस्कृत रेटिना में खो गया था। एचएंडई संस्कृति में ७२ घंटे के बाद खंडित सैंडविच रेटिना एक्सप्लांट की संरचनात्मक अखंडता की जांच करने के लिए आयोजित किया गया था । सैंडविच रेटिना एक्सप्लांट्स ने आईएनएल और ओएनएल(चित्रा 4A)में कॉम्पैक्ट नाभिक के साथ जीसीएल से ओएनएल तक संरक्षित अखंडता और एक अलग लैमेल संरचना दिखाई। हालांकि, बाधित रेटिना अखंडता एक ही नमूने के किनारों पर पाया गया था, जहां रेटिना अंतर्निहित RPE-choroid और स्क्लेरा से अलग किया था, कम रेटिना मोटाई दिखा रहा है और INL और ONL(चित्रा 4B)में नाभिक के नुकसान तोड़ ।

Figure 4
चित्रा 4:रेटिना एक्सप्लांट की एचएंडई छवियां 72 घंटे के लिए मध्यम रूप से सुसंस्कृत होती हैं। A)अंतर्निहित आरपीई-कोरॉयड और स्क््लीरा से जुड़े क्षेत्रों में संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखा गया है, जिसे जीसीएल से ओएनएल और आईएनएल और ओएनएल में कॉम्पैक्ट नाभिक में प्रत्येक रेटिना परत के अलग-अलग पृथक्करण द्वारा दर्शाया गया है । B)आरपीई-कोरॉयड और स्क््लीरा से अलग क्षेत्रों में रेटिना अखंडता में गंभीर नुकसान, समग्र रेटिना मोटाई में कमी और आईएनएल और ओएनएल में नाभिक की संख्या में कमी से दिखाया गया है । स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आईएचसी का उपयोग करके रेटिना एक्सप्लांट के लक्षण वर्णन ने संस्कृति में 72 घंटे के बाद भी अच्छी तरह से संरक्षित रेटिना अखंडता का प्रदर्शन किया। कोई ट्यूनल-पॉजिटिव सेल न्यूक्लियी, जो एपोप्टोसिस को चिह्नित करता है, बेसल स्थितियों में सुसंस्कृत रेटिना एक्सप्लांट में पाया गया, 72 घंटे(चित्रा 5A-C)के बाद भी निरंतर कोशिका व्यवहार्यता का प्रदर्शन करता है। जीएफएपी अभिव्यक्ति जीसीएल और आईपीएल में स्थानीयकृत रही, जैसा कि सामान्य रेटिना ऊतकों मेंदेखा गया 17,18। रेटिना सूजन के जवाब में मुलर सेल सक्रियण और प्रसार का संकेत कोई ग्लियल फाइब्रोसिस नहीं था, जिसे अन्यथा उपनियमित जीएफएपी अभिव्यक्ति के रूप में पहचाना जाएगा जो ओएनएल10,11,12(चित्रा 5D-F)में फैली हुई है। Vimentin लेबलिंग (लाल) अत्यधिक जीसीएल से ओएनएल के लिए व्यक्त किया गया था, संरक्षित Müller सेल अखंडता दिखा, के रूप में सामांय रेटिना ऊतकों मेंदेखा (चित्रा 5G-I)।

Figure 5
चित्रा 5:72 घंटे के लिए बेसल मीडिया में खेती के बाद रेटिना एक्सप्लांट की आईएचसी छवियां। ट्यूनल-पॉजिटिव स्टेनिंग (ग्रीन) की कमी से पता चलता है कि जीसीएल से ओएनएल(ए-सी)तक रेटिना परतों में कोई सेलुलर एपोप्टोसिस नहीं हुआ है। जीएफएपी लेबलिंग (लाल) को ग्लियल फाइब्रोसिस के बिना जीसीएल और आईपीएल तक सीमित कर दिया गया था, जिसे ओएनएल(डी-एफ)में जीएफएपी की विस्तारित अभिव्यक्ति के रूप में पहचाना जाएगा । Vimentin (लाल) अत्यधिक जीसीएल से ओएनएल के लिए व्यक्त किया गया था, Müller कोशिकाओं का पता लगाने कि इन रेटिना परतों(जी-1)के माध्यम से अवधि । सेल नाभिक DAPI (नीला) के साथ दाग थे। स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एचजी और साइट में सैंडविच रेटिना एक्सप्लांट को बनाकर एक डीआर मॉडल विकसित किया गया था। एचजी और साइट, आईएल-1ए और टीएनएफ-α ने बेसलाइन स्तर के सापेक्ष आईएल-18, वीजीएफ, आईएल-6 और आईएल-8 का स्राव बढ़ाया। एचजी + साइट कंडीशन(चित्रा6) के तहत 24 और 72 घंटे के लिए खेती के बाद रेटिना एक्सप्लांट द्वारा स्रावित साइटोकिन्स आईएल-18, वीजीएफ, आईएल-6 और आईएल-8 को मापने के लिए एक ल्यूमिनेक्स परख का उपयोग किया गया था। अंतर-दाता मतभेदों को कम करने के लिए, स्रावित साइटोकिन के स्तर की तुलना बेसलाइन (बिंदीदार लाल रेखा द्वारा इंगित) से की गई थी, जो एक ही दाता से सैंडविच एक्सप्लांट द्वारा स्रावित साइटोकिन स्तरों द्वारा दर्शाया गया था लेकिन बेसल माध्यम में सुसंस्कृत (चरण 1.4.1 में तैयार)। 24 घंटे के बाद, स्रावित आईएल-18, वीजीएफ, आईएल-6 और आईएल-8 का स्तर बेसलाइन के सापेक्ष काफी बढ़ गया। 72 घंटे के बाद, केवल आईएल-18 और वीजीएफ का स्तर काफी ऊंचा रहा, जबकि बेसलाइन की तुलना में आईएल-6 और आईएल-8 स्तरों में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया।

Figure 6
चित्रा 6:24 और 72 घंटे के बाद एचजी और साइट, आईएल-1, टीएनएफ-α में सुसंस्कृत सैंडविच रेटिना एक्सप्लांट्स द्वारा साइटोकिन्स रिलीज। स्रावित आईएल-18, वीजीएफ, आईएल-6 और आईएल-8 का स्तर 24 घंटे (पी < 0.05) के बाद बेसलाइन से काफी ऊपर बढ़ गया। 72 घंटे के बाद, आईएल-18 और वीजीएफ का स्तर काफी बढ़ा (पी < 0.05) रहा, लेकिन बेसलाइन की तुलना में आईएल-6 और आईएल-8 स्तरों में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया। बिंदीदार लाल रेखा बेसलाइन स्तर को इंगित करती है, जो एक ही दाता से एक्सप्लांट द्वारा स्रावित साइटोकिन स्तर का प्रतिनिधित्व करती है लेकिन सामान्य माध्यम में सुसंस्कृत होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

हॉआरसी वर्तमान में प्रीक्लिनिकल रेटिना अनुसंधान में सबसे चिकित्सकीय अनुवाद योग्य मॉडल है। इन विट्रो सेल कल्चर मॉडल की तुलना में, हॉआरसी गतिशील रेटिना सेल प्रकारों और न्यूरॉन्स, वैक्यूलेचर और बाह्य पर्यावरण19के साथ उनके कनेक्शन को बनाए रखने के माध्यम से, सीटू में मानव रेटिना की शारीरिक रचना का बेहतर प्रतिनिधित्व कर सकता है। पशु मॉडलों की तुलना में, HORC अंतर-प्रजातियों के बदलावों के कारण मानव रेटिना रोगों के लिए रोगविज्ञान और डिजाइन दवा उपचार का अध्ययन करने में अधिक लाभप्रद हैं, जैसे कि विभिन्न रेटिना सेल प्रकार के साथ-साथ अलग-अलग फोटोरिसेप्टर घनत्व और अनुपात, जो पशु मॉडल19में सकारात्मक परिणामों के बावजूद असफल नैदानिक परीक्षणों में योगदान दे सकते हैं। हालांकि, पिछले HORC प्रोटोकॉल में, रेटिना जानबूझकर RPE-choroid और स्क्लीरा से अलग किया गया था । कठिन स्क्लेरा के बिना, तार रेटिना को संभालना मुश्किल है और रेटिना अखंडता से समझौता किया जा सकता है यदिसीधे6,7,8,9 द्वारा संभालाजाताहै। यह इस तथ्य से सबूत है कि अलग रेटिना का उपयोग करके पिछले अध्ययनों ने संस्कृति के 72 घंटे तक मुलर सेल सक्रियण और ट्यूनल-सकारात्मक नाभिक में वृद्धि की सूचना दी है। यह हमारे निष्कर्षों के विपरीत है, सुझाव है कि सैंडविच विधि बेहतर रेटिना अखंडता को बरकरार रखता है । दूसरे, आरपीई10, 11, 12के साथ सुसंस्कृत रेटिना की तुलना में, आरपीई के बिना सुसंस्कृत रेटिना में पशु ओआरसी मॉडल में वृद्धि हुई न्यूरोनल अध: पतन और ग्लियल प्रसार पाया गया।

रेटिना अखंडता से समझौता करने की संभावना को कम करने के लिए, इस उपन्यास HORC प्रोटोकॉल में सैंडविच रेटिना एक्सप्लांट का उपयोग किया गया था। पिछले हॉर्क प्रोटोकॉल के विपरीत, ट्रेफिन ने न केवल रेटिना के माध्यम से कटौती की, बल्कि आरपीई-विट्रियस और स्क््लीरा भी काटा, जैसे कि परिणामी एक्सप्लांट "सैंडविच" है और अवशिष्ट विट्रेस और अंतर्निहित संरचनाओं के बीच स्थिर है। अवशिष्ट वित्रीय अंतर्निहित संरचनाओं से तह और टुकड़ी को रोकने के लिए रेटिना का वजन करता है जबकि स्क्लेरा रेटिना वास्तुकला को संदंश-प्रेरित चोट से बचाने के लिए रेटिना वास्तुकला का समर्थन करने के लिए एक पाड़ के रूप में कार्य करता है। इसके अलावा , आरपीई के साथ रेटिना की खेती करने से रेटिना के पतन और संस्कृति में10 , 11,12में चमकता प्रसार को रोका जासकताहै ।

सैंडविच रेटिना एक्सप्लांट निकालते समय निम्नलिखित बिंदुओं को याद रखें। जब लिम्बस के साथ काटने, लेंस नीचे आईरिस वजन होगा, लेकिन आंख कप के अंदर गिर के रूप में यह जुड़ा हुआ है नहीं होगा, zonule फाइबर के माध्यम से, सिलियरी शरीर के लिए । स्क्लेरा पर संदंश लागू करें और रेटिना अखंडता को बाधित करने से रोकने के लिए रेटिना को छूने से बचें। कुओं के अंदर रेटिना एक्सप्लांट रखने से पहले खेती के कुओं को माध्यम से भरें। कुओं के अंदर रेटिना एक्सप्लांट रखने के बाद माध्यम को जोड़ने से आरपीई-कोरॉयड और स्क्लीरा से रेटिना को उखाड़ फेंकने या पूरे एक्सप्लांट को उल्टा फ्लिप करने का खतरा बढ़ जाता है। चार चतुर्भुज में गहरे चीरे बनाते समय, ध्यान रखें कि परिधीय रेटिना आंख के कप से बाहर निकलने वाले विट्रेस के कारण अलग हो सकता है। रेटिना की टुकड़ी या तह को रोकने के लिए, रेटिना पर खींच रहे क्षेत्र में विट्रियस को हटा दें। यद्यपि पिछला बिंदु रेटिना पर विट्रियस पुलिंग को हटाने की सलाह देता है, लेकिन सैंडविच रेटिना एक्सप्लांट की स्थिरता बढ़ाने के लिए आरपीई-कोरॉयड और स्क्लेरा के शीर्ष पर रेटिना को तौलने के लिए पर्याप्त अवशिष्ट विट्रियस छोड़ दें। कठिन, रेशेदार स्क््लीरा के माध्यम से काटने पर, ट्रेफिन आसानी से कुंद हो सकता है। नतीजतन, अत्यधिक बल की आवश्यकता हो सकती है या स्क्लेरा पूरी तरह से प्रवेश नहीं कर सकता है। स्क्लेरा के माध्यम से अधूरी पैठ से बचने के लिए हर 1-2 निकाले गए रेटिना एक्सप्लांट के लिए एक नए ट्रेफिन का उपयोग करें। रेटिना की रक्षा के लिए सावधानीपूर्वक हैंडलिंग में अनुभव महत्वपूर्ण है; इसलिए, पोर्सिन आंखों के साथ प्रशिक्षण, जो मानव आंखों के आकार और संरचना में समान हैं, सीमित दाता स्क्लेरल आईकप का उपयोग करने से पहले सलाह दी जाती है।

रेटिना अखंडता अवशिष्ट विट्रियस और अंतर्निहित आरपीई-कोरॉयड और स्क्लीरा के बीच सैंडविच किए गए एक्सप्लांट्स में संरक्षित किया गया था। एचएंडई धुंधला बेहतर संरचनात्मक अखंडता दिखाया जब सुसंस्कृत रेटिना एक्सप्लांट RPE-choroid और स्क्लेरा से जुड़ा हुआ था, अकेले रेटिना की खेती की तुलना में । इस खोज का समर्थन करते हुए, ट्यूनल-पॉजिटिव सेल नाभिक की कमी ने सभी रेटिना परतों के भीतर एपोप्टोसिस की अनुपस्थिति का सुझाव दिया, 72 घंटे के बाद भी संरक्षित सेलुलर व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, विमेंटिन लेबलिंग ने Müller सेल अखंडता और जीसीएल और आईएनएल में प्रतिबंधित GFAP अभिव्यक्ति की पुष्टि की, जो सामान्य रेटिना में पाया जाता है, फिर से रेटिना में भड़काऊ या तनाव संकेतों की कमी को सत्यापित करता है।

इस अध्ययन में विशेषता वाले हॉर्क मॉडल के परिणामस्वरूप रेटिना सूजन और सेलुलर एपोप्टोसिस को रोकने के दौरान रेटिना संरचना और मुलर सेल अखंडता संरक्षित हुई। इसके अलावा, इसका उपयोग रेटिना रोगों को मॉडल करने के लिए किया जा सकता है, जो रोग मार्गों और दवा तंत्र की पहचान करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। पिछले पशु और इन विट्रो अध्ययनों से पता चला है कि जब पशु रेटिना या कोशिकाएं एचजी और साइट 13 , 14,15के संपर्क में आती हैं तो डीआर सूजन को प्रेरित किया जा सकता है । इस HORC अध्ययन में, संस्कृति में 24 घंटे के लिए सैंडविच explants के लिए एचजी और Cyt लागू करने से, आईएल-18, VEGF, आईएल-6 और आईएल-8 के स्राव काफी बेसलाइन से ऊपर ऊंचा था । ये साइटोकिन्स गैर-मधुमेह नियंत्रणों की तुलना में डीआर के साथ रोगियों के विट्रियस और सीरम में वृद्धि करने के लिए अच्छी तरह से जाने जाते हैं, यह मान्य करते हैं कि यह डीआर मॉडल चिकित्सकीय रूप से अनुवादयोग्य20,21,22,23, 24,25है। यद्यपि इस अध्ययन में केवल चुंबकीय ल्यूमिनेक्स परख का उपयोग करके डीआर की विशेषता है, पश्चिमी ब्लॉटिंग, आईएचसी और पॉलीमराइज्ड चेन रिएक्शन (पीसीआर) जैसी अन्य तकनीकों को भी26किया जा सकता है।

ऊपर उल्लिखित स्पष्ट फायदों के बावजूद, इस उपन्यास एचआरसी मॉडल की कुछ सीमाएं भी हैं। इस प्रोटोकॉल की एक प्रमुख सीमा ऊतक की कम आपूर्ति है। दाता नेत्र कप, जो सभी नेत्र संरचनाओं है, लेकिन कॉर्निया आम तौर पर प्रत्यारोपण के लिए हटा दिया, इस तरह के मोतियाबिंद shunts, कक्षीय प्रत्यारोपण, रेटिना टुकड़ी में नुकसान की मरंमत और उजागर टांके के कवरेज के रूप में शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं में स्क्लीरा के लिए बड़ी मांग के कारण अनुसंधान के लिए शायद ही कभी उपलब्ध हैं । इस सीमा को कम करने के लिए, हमारा सुझाव है कि सभी प्रायोगिक समूह एक ही दाता से एकत्र किए जाते हैं। यह अंतर-दाता-वेरिबिलिटीज के लिए खाते की आवश्यकता को हटा देता है, जैसे उम्र, बीमारी की अवधि, बेसलाइन साइटोकिन का स्तर, और अन्य कारक जो विभिन्न रोगियों के बीच तुलना करने पर भ्रमित चर में योगदान दे सकते हैं। इसके अलावा, सबसे दाता ऊतकों बुजुर्ग लोगों से कर रहे है के रूप में यह कठिन है युवा आयु समूहों से नमूने प्राप्त करने के लिए, और यहां तक कि जब उपलब्ध है, युवा दाताओं की मौत का कारण अक्सर प्रकृति में दर्दनाक है कि संस्कृति के लिए अनुपयुक्त है क्षतिग्रस्त ऊतकों के लिए अग्रणी । फिर भी, यह देखते हुए कि अधिकांश पुरानी रेटिना बीमारियां वृद्ध रोगियों में होती हैं, यह मॉडल अभी भी उम्र से संबंधित पुरानी रेटिना बीमारियों जैसे डॉ और उम्र से संबंधित मैकुलर अध: पतन का अध्ययन करने में उपयोगिता को बरकरार रखता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक आंखों के ऊतकों के उदार दानदाताओं और न्यूजीलैंड नेशनल आई बैंक की टीम को उनके समर्थन के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं । इस काम को मौरिस और फिलिस पेकेल ट्रस्ट और ऑकलैंड मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन (1117015) से परियोजना अनुदान द्वारा आर्थिक रूप से समर्थन दिया गया था। आईडीआर की डायरेक्टरशिप बुकानन चैरिटेबल फाउंडेशन द्वारा समर्थित है । सीके की स्कॉलरशिप न्यूजीलैंड एसोसिएशन ऑफ ऑप्टोमेट्रिस्ट्स एजुकेशन एंड रिसर्च फंड (CC36812) द्वारा प्रदान की जाती है और एचएचएल की छात्रवृत्ति बुकानन चैरिटेबल फाउंडेशन द्वारा प्रदान की जाती है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposable Biopsy Punches (5 mm) Integra York PA Inc., USA 21909-142 Referred as surgical trephines
in this article
Human Recombinant IL-1β Peprotech, USA 200-01B Working concentration: 10 ng/mL
Human Recombinant  TNF-a Peprotech, USA 300-01A Working concentration: 10 ng/mL
DAPI (1 µg/mL) Sigma Aldrich, Germany #D9542 Nuclear stain. Working dilution 1:1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA 10565018 Dulbecco’s Modified Eagle Medium nutrient mixture F-12 containing a 1× antibiotics and antimycotics mixture (AA, 100× stock)
Fine Scissors - Sharp-Blunt Fine Science Tools (F.S.T) 14028-10 Tips: Sharp-Blunt, Cutting Edge: 27mm, Length: 10cm, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight
Graefe Forceps Fine Science Tools (F.S.T) 11050-10 Length:10cm, Tip shape: Straight, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8mm, Tip Dimensions:0.8 x 0.7mm, Alloy/Materials: Stainless Steel
Mouse monoclonal GFAP-Cy3 Sigma Aldrich, Germany #C9205 Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:1000.
Mouse monoclonal Vimentin-Cy3 Sigma Aldrich, Germany #C9080 Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:50.
Rabbit polyclonal TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein) Sigma Aldrich, Germany #11684795910 Primary antibody conjugated to Fluorescein-dUTP. Working dilution 1:10 with enzyme-buffer solution.

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References

  1. Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. Facts and Figures Concerning the Human Retina. Webvision-The Organization of the Retina and Visual System. , Internet (2005).
  2. Gemenetzi, M., De Salvo, G., Lotery, A. Central serous chorioretinopathy: an update on pathogenesis and treatment. Eye. 24 (12), 1743-1756 (2010).
  3. Buschini, E., Piras, A., Nuzzi, R., Vercelli, A. Age related macular degeneration and drusen: neuroinflammation in the retina. Progress in Neurobiology. 95 (1), 14-25 (2011).
  4. Chen, S. -Y., et al. Current concepts regarding developmental mechanisms in diabetic retinopathy in Taiwan. Biomedicine. 6 (2), (2016).
  5. Kaaja, R., Loukovaara, S. Progression of retinopathy in type 1 diabetic women during pregnancy. Current Diabetes Reviews. 3 (2), 85-93 (2007).
  6. Azizzadeh Pormehr, L., et al. Human organotypic retinal flat-mount culture (HORFC) as a model for retinitis pigmentosa11. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (8), 6775-6783 (2018).
  7. Fernandez-Bueno, I., et al. Time course modifications in organotypic culture of human neuroretina. Experimental Eye Research. 104, 26-38 (2012).
  8. Niyadurupola, N., Sidaway, P., Osborne, A., Broadway, D. C., Sanderson, J. The development of human organotypic retinal cultures (HORCs) to study retinal neurodegeneration. British Journal of Ophthalmology. 95 (5), 720-726 (2011).
  9. Osborne, A., Hopes, M., Wright, P., Broadway, D. C., Sanderson, J. Human organotypic retinal cultures (HORCs) as a chronic experimental model for investigation of retinal ganglion cell degeneration. Experimental Eye Research. 143, 28-38 (2016).
  10. Caffe, A., Visser, H., Jansen, H., Sanyal, S. Histotypic differentiation of neonatal mouse retina in organ culture. Current Eye Research. 8 (10), 1083-1092 (1989).
  11. Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. K., Thumann, G. Novel organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with retinal pigment epithelium. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 47-58 (2008).
  12. Liu, L., Cheng, S. -H., Jiang, L. -Z., Hansmann, G., Layer, P. G. The pigmented epithelium sustains cell growth and tissue differentiation of chicken retinal explants in vitro. Experimental Eye Research. 46 (5), 801-812 (1988).
  13. Kuo, C., Green, C. R., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. Connexin43 hemichannel block protects against retinal pigment epithelial cell barrier breakdown. Acta Diabetologica. 57 (1), 13-22 (2020).
  14. Mugisho, O. O., et al. The inflammasome pathway is amplified and perpetuated in an autocrine manner through connexin43 hemichannel mediated ATP release. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1862 (3), 385-393 (2018).
  15. Mugisho, O. O., et al. Intravitreal pro-inflammatory cytokines in non-obese diabetic mice: Modelling signs of diabetic retinopathy. PLoS ONE. 13 (8), 0202156 (2018).
  16. R&D Systems, I. , Available from: https://www.rndsystems.com/protocol-types/luminex (2020).
  17. Nakazawa, T., et al. Attenuated glial reactions and photoreceptor degeneration after retinal detachment in mice deficient in glial fibrillary acidic protein and vimentin. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (6), 2760-2768 (2007).
  18. Okada, M., Matsumura, M., Ogino, N., Honda, Y. Müller cells in detached human retina express glial fibrillary acidic protein and vimentin. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 228 (5), 467-474 (1990).
  19. Murali, A., Ramlogan-Steel, C. A., Andrzejewski, S., Steel, J. C., Layton, C. J. Retinal explant culture: A platform to investigate human neuro-retina. Clinical & Experimental Ophthalmology. 47 (2), 274-285 (2019).
  20. Koleva-Georgieva, D. N., Sivkova, N. P., Terzieva, D. Serum inflammatory cytokines IL-1beta, IL-6, TNF-alpha and VEGF have influence on the development of diabetic retinopathy. Folia Medica (Plovdiv). 53 (2), 44-50 (2011).
  21. Lee, J. -H., et al. Cytokine profile of peripheral blood in type 2 diabetes mellitus patients with diabetic retinopathy. Annals of Clinical & Laboratory Science. 38 (4), 361-367 (2008).
  22. Chorostowska-Wynimko, J., et al. In vitro angiomodulatory activity of sera from type 2 diabetic patients with background retinopathy. Journal of Physiology and Pharmacology: An Official Journal of the Polish Physiological Society. 56, 65-70 (2005).
  23. Khalifa, R. A., Khalef, N., Moemen, L. A., Labib, H. M. The role interleukin 12 (IL-12), interferon-inducible protein 10 (IP-10) and Interleukin 18 (IL-18) in the angiogenic activity of diabetic retinopathy. Research Journal of Medicine and Medical Sciences. 4, 510-514 (2009).
  24. Zhou, J., Wang, S., Xia, X. Role of intravitreal inflammatory cytokines and angiogenic factors in proliferative diabetic retinopathy. Current Eye Research. 37 (5), 416-420 (2012).
  25. Song, Z., et al. Increased intravitreous interleukin-18 correlated to vascular endothelial growth factor in patients with active proliferative diabetic retinopathy. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 252 (8), 1229-1234 (2014).
  26. Louie, H. H., Shome, A., Kuo, C. Y. J., Rupenthal, I. D., Green, C. R., Mugisho, O. O. Connexin43 hemichannel block inhibits NLRP3 inflammasome activation in a human retinal explant model of diabetic retinopathy. Experimental Eye Research. , (2020).

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एक उपन्यास मानव ऑर्गेनोटिपिक रेटिना संस्कृति तकनीक का लक्षण वर्णन
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Kuo, C. Y. J., Louie, H. H., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique. J. Vis. Exp. (172), e62046, doi:10.3791/62046 (2021).

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