Summary
本研究は、外植物の取り扱い中にレチナル完全性を損なうことを防ぐ新しいヒトの妄想性レチナルカルチャー(HORC)モデルの開発を目的としている。これは、上層の色素および下層の網膜色素上皮-脈絡膜(RPE-脈絡膜)および皮膜で網膜を培養することによって達成される。
Abstract
以前のヒトの組織性網膜培養(HORC)モデルは、剥離網膜を利用してきました。しかし、網膜色素上皮脈絡(RPE-脈絡膜)および強膜によって与えられる構造的支持能がなければ、脆弱な網膜の完全性が容易に損なわれる可能性がある。本研究の目的は、レチナの外植体を培養する際に、レチナ、RPE-脈絡膜および皮膜を含む新しいHORCモデルを開発することであった。
虹彩とレンズを取り除くために四肢に沿って周方向に切断した後、4つの深い切開部がアイカップを平らにするために作られた。以前のHORCプロトコルとは対照的に、トレフィンは、レチナだけでなく、RPE-脈絡膜およびスクレラを切断するために使用されました。得られた三重層化外植物を72時間培養した。ヘマトキシリンおよびエオシン染色(H&E)は解剖学的構造を評価するために使用され、さらにアポトーシス、ミュラー細胞の完全性および経常性炎症のための免疫組織化学(IHC)によって特徴づけられた。病気の誘発の可能性を確認するために、外植体を高グルコース(HG)および炎症性サイトカイン(Cyt)に曝露し、糖尿病性網膜症(DR)を模倣した。このルミネックス磁気ビーズアッセイは、培養培地中に放出されたDR関連サイトカインを測定するために使用された。
H&E染色は、基礎となるRPE-脈絡膜および強膜を有するレチナル外植体における明確なレチナルラメラおよびコンパクト核を明らかにしたが、基礎構造を有しないレチナは厚さの減少と重度の核喪失を示した。IHCの結果は、アポトーシスおよび再発性炎症の欠如ならびに保存されたミュラー細胞の完全性を示した。Luminexアッセイは、HG+Cytに曝露されたレチナル外植体におけるDR関連の炎症促進サイトカインの分泌が24時間のベースラインレベルに対して有意に増加することを示した。
我々は、アポトーシスやレチナル炎症を伴わずにレチナル完全性を維持する新しいHORCプロトコルの開発と特徴付けに成功した。さらに、HG+Cytにレチナル外植物質を曝露する際のDR関連プロ炎症バイオマーカーの誘導分泌は、このモデルが臨床的に翻訳可能な疾患研究に使用できることを示唆している。
Introduction
レチナは、入ってくる光エネルギーを電気信号に変換する高度に特殊化された眼構造であり、その後、視覚のために脳によって処理されます。ヒトのレティナは、細胞型のダイナミックレンジを含んでおり、シナプス2層と3つの核層1からなる独特な層構造で高度に組織化されている(図1)。レチナル恒常性は、神経レチナル細胞、血管、神経、結合組織およびRPE1との間の複雑な接続によって支えられています。高度な腎解剖学と生理学のために、多くの疾患のメカニズムはまだ十分に理解されていない2,3,4,5.より良い疾患を研究するために、HORCモデルは6、7、8、9を開発しました。動物実験やインビトロ培養と比較して、HORCモデルは、動的な細胞環境と複雑な神経血管相互作用をその場で保持し、臨床翻訳のための良いモデルを提供するため有利です。
図1:人間の眼の後眼構造後部に対する前部、眼窩層は、神経線維層(NFL)、神経節細胞層(GCL)、内神経叢層(IPL)、内核層(INL)、外プレキシフォーム層(OPL)、外核層(ONL)、感光体内層(IS)、および感光体外層(OS)である。この細胞内の細胞には、神経節細胞(青)、アマクライン細胞(黄)、双極細胞(赤)、水平細胞(紫)、ロッド感光体(ピンク)および円錐感光体(緑色)が含まれる。このビトレウスは、レチナの前に位置しています。RPE、ブルッフの膜、脈絡膜および強膜は、後部に位置する。なお、画像は、retinaの概略表現であり、各層内の細胞/レチナル接続性の比率は、in vivo設定を示すものではないかもしれない。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
以前に特徴付けられるHORCプロトコル6、7、8、9は、外科トレフィンを使用して、基礎となるRPE-脈絡膜および鎖膜からレチナを分離することに関与していた。しかし、これらの基礎構造によって提供されるサポートがなければ、半透明のretinaは薄っぺらになり、取り扱いにくく、鉗子などのツールは容易にその完全性を破壊し得る。さらに、RPEを含まない培養での分離性レチナは、神経節細胞アポトーシスおよび感光体変性10、11、12を引き起こすことが示されている。したがって、retinal完全性の損失を最小限に抑え、in vivo環境をよりよく模倣する代替HORCプロトコルが有用であろう。これは、外植の取り扱い中の身体的傷害が人工物を導入する可能性があるため、疾患のメカニズムを研究する際に特に重要です。そこで本研究の目的は、外植の取り扱いと培養の際のレチナル完全性を保護するために、RPE-脈絡膜と皮膜を含む新しいHORCモデルを開発することであった。
この目的を達成するために、残留性の植物と下層のRPE-脈絡膜と皮膜の間に「挟まれた」植物の再チナリを抽出した。サンドイッチの外植では、網膜剥離と折りたたみを防ぐために網膜の重さを量るのに対し、硬い線維性強膜は構造的支持のための足場と鉗子の接触点の両方として機能する。また、動物モデルは、培養中にRPEを保持することで、残存性の変性やグリア増殖を防ぐことができる、低酸素および炎症10、11、12などの危険信号に対するミュラー細胞の応答を示している。
モデルを特徴付けるために、サンドイッチの残膜外植体をヘマトキシリンとエオシン(H&E)で染色し、解剖学的構造を評価し、免疫組織化学(IHC)を実施し、 末端デオキシヌクレオチジルトランスファーーゼdUTPニックエンドラベリング(TUNEL、アポトーシス細胞マーカー)、グリア性フィブリリン酸タンパク質(GFAP、眼炎およびミュラー細胞活性化マーカー)、およびミュラー細胞完全性のマーカーであるビメンチンを用いた外植体を標識する。このモデルが分子疾患の徴候を発症するように誘導できるかどうかを判断するために、外植体は、炎症促進性サイトカイン(Cyt)、インターロイキン-1β(IL-1β)および腫瘍壊死因子α(TNF-α)を有する高グルコース(HG)に曝露された。ルミネックスアッセイは、培養培地中に放出されたサイトカインを測定するためにDRモデルで使用された。
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Protocol
ヒトドナーアイカップは、移植のための角膜切除後、および北B健康障害倫理委員会(NTX/06/19/CPD/AM07)によって承認された後、ニュージーランド国立眼銀行から入手されました。
注:培養は、滅菌組織培養条件を確保するためにクラスIIバイオセーフティキャビネットで行う必要があります。組織は、有意なレチング完全性の損失を避けるために、死後24時間以内に培養されなければならない。
図2:サンドイッチの残りの外植体を収集する手順を示す画像。外植の準備のために、切開中の組織の損傷を減らすために、1つの鋭い先端と1つの鈍い端を持つ解剖用はさみを使用し、鈍い端が地球の内側に向けて使用します。また、取り扱い中に眼内組織を傷つけないように、鈍い端を持つ鉗子を使用してください。外科的なはさみを使用して、鈍い端が内側を向いて、虹彩とレンズ(A-C)を取り除くために手足に沿って切る。ONHは、開いた眼球(D)をまっすぐに見ると見つけることができます。鈍い先端を持つ鉗子を使用して、強い強い球を保持して地球を安定させる(E)。ONHに向かって2つの深い切開を行うことによって、地球を垂直に2つの半分に分割しますが、ONHを切断しないでください。水平子午線(G)に沿ってこれを繰り返します。強い強い場所に鈍い鉗子を適用し、クローバーの形に穏やかに地球を開く(H-K)。鉗子を使用して、折り畳まれたレティナを滑らかにするために慎重に石膜を操作します, 女性の手引きとして, しかし、直接、retinaに触れないでください(I).網膜剥離や折りたたみを引き起こしている場合は、その除去します(透明な渦が写真にうまく写っていないため、図2には示されていません)。レティナが平坦な領域を見つけ、外科トレフィン(L)を使用してレチンの外植を抽出する。強膜に鉗子を適用し、プリ調製された培養培地(M,N)に慎重にレチナル外植を移す。サンドイッチの外植全体は、その重量のために井戸の底に沈む必要がありますので、各外植は培地(O)に沈む。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
1. 接合部からのサンドイッチの伸び物の抽出
- 虹彩とレンズを取り外します。
- アイリスとレンズを上向きにし、視神経ヘッド(ONH)がペトリ皿に接触して、ペトリ皿の中にアイカップを置きます(図2A)。
- 鉗子を使って、眼球をしっかりと持ち続けます(図2B)。
- 手足の外縁に沿って周方向に小さな切り傷を作って虹彩とレンズを外します(図2A)。
- 虹彩とレンズを注意深く取り外します。操作中にレティナを邪魔しないようにします(図2C)。
注:レンズは、ゾヌル繊維を介して毛様体に取り付けられているので、アイカップに落ちることはありません。
- アイカップを平らにします。
- アイカップを直立したまま、ONHを特定します。これは、明るい白色の光源(図2D)で簡単です。
- ONH に向かって 4 つの象限を切り込む (図 2E)。ペトリ皿は容易な処理のために回すことができる。ONHをカット しないでください 。
- アイカップを慎重に広げて平らにする(図2E)。
- レチナの代わりに強膜に鉗子を適用して、レチナルの完全性を乱さないようにします。
注:周辺網膜剥離と折りたたみは、あふれる渦の重量が網膜を引っ張るように避けられません。これらの領域では、さらにレチンの折り畳みを防ぐために、ビトレウスを除去します。残存の亜塩素を残して、RPE-脈絡膜および皮膜の上にレチナを安定化させる。
- サンドイッチの植物を収集します。
- レチンの折り目のない領域のレティナに外科的トレフィンを置く(図2F)。
- 強く押して強い強音を貫通し、クラッキング音を発生させる必要があります。
- トレフィンを180°ずつねじって、強膜が完全に貫通し、残りの組織から外植が分離されるようにします。
- 強膜で鉗子を塗布し、サンドイッチの残りの外植物を培養培地に移す(図2G-I)。
- 各象限の末梢性レチナから2-3サンドイッチの残りの外植を得る。
注:サンドイッチのレチン外植は時々トレフィンの開口部に閉じ込められることがあります。鉗子を使用して、強気部の基部の小さな部分をそっといじめます。これは、ブレードが鈍く、失いが生じる場合に発生することがよくあります(図3A-C)。 - ブレードが鈍くなるので、1-2のレチナル外植を切り取った後に新しいトレフィンを使用します(図3C
図3: トラブルシューティング抽出プロセス中に、レチン外植は、外科的トレフィンの開口部に閉じ込められる可能性があります(A)。レチナ(B)に触れることなく、スクレラの基部から組織を優しくいじめる。これは、外科トレフィンが2つ以上のレチナル外植植物を抽出するために使用される場合、より頻繁に起こり得る。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- 植物の植物を培養する。
- Dulbeccoの修飾イーグル培地栄養混合物F-12(DMEM-F12)と1x抗生物質と抗ミコティック混合物(AA、100x株)を含む培地を調製します。
- 外植抽出の前に、培地500μLを24ウェルプレートのウェルに入れ、インキュベーターで平衡化します。これは、後で培地を添加すると、レティナを取り除くことができるので重要です。
- サンドイッチのレチナル外植を37°Cで最大72時間、ステップ1.4.2で調製した培地で加湿した5%CO2インキュベーターで培養する。
- DR様変化を誘発するために、シト、TNF-α(10 ng/mL)およびIL-1β(10ng/mL)と32.5mM HGを組み合わせたDMEM-F12を含む培地中の培養レチン性外植体。
2. サンドイッチの残りの外植物のパラフィン埋め込み
- サンドイッチの残りの外植を修正します。
- サンドイッチのレチンの外植を10%ホルマリンに少なくとも24時間浸漬する。
- ホルマリン溶液を取り出し、サンドイッチの脱トナーを組織パッドとカセットにそっと移します。
- サンドイッチの残りの外植を70%エタノールに少なくとも24時間浸します。
- パラフィン埋め込みレチンの外植物をブロックにする。
- ミクロトームを使用して、パラフィン埋め込まれたレチナル組織を5μmの厚いセクションに切り、ガラススライドに取り付けます。イメージングまで室温で保管します。
- セクションを分離します。
- 70%キシレンに5分間浸します。
- セクションを100%キシレンに5分間浸します。
- 70%エタノールで5分間水分補給を行います。
- 5分間、100%エタノールで切片を水分補給します。
- 水道水の下のセクションを10分間洗います。
H&E、IHC、磁気ルミネックスアッセイを用いた特性評価
- H&E染色プロトコル
- ステップ 2.2 を使用してセクションを分離します。
- 水道水で5分間水を入れます。
- ギルの2ヘマトキシリン溶液のセクションを5分間染色します。
- 余分な汚れを取り除くために水道水を流す下でセクションを十分に洗ってください。
- 1%の酸アルコールに2回浸漬して差別化する。
- 水道水の下で素早くセクションを洗います。
- 1%炭酸リチウム(10mg/mL)に6回浸漬して、切片を青色に染色する。
- 余分な青い汚れを取り除くために5分間水道水を流してセクションを十分に洗います。
- セクションを1%のエオシンに10回浸します。
- 水道水の下で切片を素早く洗い、余分な汚れを取り除きます。
- 100%エタノールに10回浸漬して、切片を脱水する。これを2回行います。
- 70%キシレン10回に浸します。
- 100%キシレン10回にセクションを浸します。
- ジブチルフタレートポリスチレン(DPX)実装媒体を使用したカバースリップ付きマウント。
- 軽顕微鏡を使用して画像を撮ります。
- IHC ラベリング プロトコル'
- ステップ 2.2 を使用してセクションを分離します。
- スライドを、pH 6.0で0.05%Tween 20の10 mMクエン酸ナトリウムバッファーを含む溶液に入れ、121°Cで自動化された圧力鍋で2分間抗原検索を実行します。
- リン酸緩衝生理食塩分(PBS)で5分間洗浄します。これを3回行います。
- 0.1%トリトンX-100と10%の通常のヤギの血清を室温で1時間含有するPBSでセクションをブロックします。
- 一次抗体を二次抗体に結合させた一次抗体を用いて、4°Cで一晩の切片をインキュベートする(材料表)。
- PBSで5分間セクションを洗います。これを3回行います。
- 4′,6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)を2分間使用した染色核。
- アンチフェード試薬を使用してセクションを洗浄し、マウントします。
- マニキュア付きシールカバーリップ。
- 共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して画像を撮ります。
- 磁気ルミネックスアッセイ
- 各ウェルから75 μLのメディアを24時間と72時間で96 μ-底プレートに移します。
- ルミネックスサイトカインアッセイを用いて、24時間および72時間後にIL-18、IL-6、IL-8および血管内皮成長因子(VEGF)の細胞上清を分析する。アッセイ16を実行するには、メーカーの指示に従ってください。
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Representative Results
このHORCモデルでは、レチナル完全性が維持されました。レティナルインテグリティは、培養サンドイッチの残膜外植で保存されたが、隣接する構造なしで培養されたレティナで失われた。H&Eは、培養中の72時間後に切除サンドイッチの残りの外植物の構造的完全性を調べるために行われました。サンドイッチの残りの外植は、INLとONLのコンパクトな核を持つGCLからONLまでの保存された完全性と明確なラメラ構造を示した(図4A)。しかし、網膜の完全性が乱れたのは、網膜が基礎となるRPE-脈絡膜および鎖骨から剥離し、網膜の厚さおよびINLの減少および核の断絶を示す同じサンプルの端で発見された(図4B)。
図4:72時間培地で培養したレチン性外植体のH&E画像A)基礎となるRPE-脈絡膜および皮膜に付着した領域において維持される構造的完全性は、各レチナル層をGCLからONLおよびINLおよびONLのコンパクト核に明確に分離することによって描かれる。B)RPE-脈絡膜および強膜から剥離した領域における網膜完全性の深刻な損失は、INLおよびONLにおける全体的な網膜の厚さの減少および減少した核数によって示される。スケールバー= 50 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
IHCを用いた植物のレチナル外植の特徴は、培養中の72時間後でも十分に保存されたレチナル完全性を示した。アポトーシスを示すTUNEL陽性細胞核は、基底条件で培養されたレチナル外植体に見つからず、72時間後でも持続細胞生存率を示した(図5A-C)。GFAP発現は、正常なレチナル組織17,18に見られるように、GCLおよびIPLに局在した状態のままであった。グリア線維症はなかったが、筋炎症に応答したミュラー細胞の活性化および増殖の徴候であり、それ以外の場合はONL10、11、12に及ぶアップレギュレートGFAP発現として同定されるだろう(図5D-F)。ビメンチン標識(赤)は、GCLからONLまで高く発現し、正常な残線組織に見られるように、保存されたミュラー細胞の完全性を示した(図5G-I)。
図5: 72時間の基底培地で培養した後の植物のIHC画像TUNEL陽性染色(緑色)の欠如は、GCLからONL(A-C)までのレチナル層に細胞アポトーシスが起こっていないことを示唆している。GFAP標識(赤色)は、グリア線維症を伴わないGCLおよびIPLに限定され、これはONL(D-F)へのGFAPの発現の延長として同定されるであろう。Vimentin(赤)はGCLからONLまで高く発現し、これらのレチナル層(G-I)を介して広がるミュラー細胞を見つけました。細胞核をDAPI(青色)で染色した。スケールバー= 50 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
HGとCytでサンドイッチの植物の培養によりDRモデルを開発しました。 HGおよびCyt、IL-1βおよびTNF-αは、ベースラインレベルに対するIL-18、VEGF、IL-6およびIL-8の分泌を増加した。ルミネックスアッセイは、HG+Cyt条件下で24、72時間培養した後に、レチナル外植によって分泌されるサイトカインIL-18、VEGF、IL-6およびIL-8を測定するために使用された(図6)。ドナー間の違いを最小限に抑えるために、分泌されたサイトカインレベルをベースライン(赤色線で示す)と比較し、同じドナーからサンドイッチ外植によって分泌されるサイトカインレベルで表されるが、基底培地で培養された(ステップ1.4.1で調製)。24時間後、分泌されたIL-18、VEGF、IL-6およびIL-8レベルはベースラインに対して有意に増加した。72時間後、IL-18およびVEGFレベルのみが有意に上昇したままであったのに対し、ベースラインと比較してIL-6およびIL-8レベルでは有意な差は見つからなかった。
図6:24及び72時間後にHG及びCyt、IL-1β及びTNF-αで培養したサンドイッチの残膜外植によってサイトカイン放出を行う。分泌されたIL-18,VEGF,IL-6およびIL-8レベルは24時間後にベースラインを大幅に上回る(p<0.05)。72時間後、IL-18およびVEGFレベルは有意に増加したままでした(p < 0.05)が、ベースラインと比較してIL-6およびIL-8レベルでは有意な差は見つからなかった。点線の赤線はベースラインレベルを示し、これは同じドナーから外植によって分泌されるサイトカインレベルを表すが、通常の培地で培養される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
HORCは現在、前臨床の臨床前の研究で最も臨床的に翻訳可能なモデルです。in vitro細胞培養モデルと比較して、HORCは、動的なレチナル細胞タイプおよびニューロンとのそれらの接続を保持することによって、ヒトのレチナの解剖学的構造をより良く表すことができる、 血管系および細胞外環境19。動物モデルと比較してHORCは、動物モデル19の陽性結果にもかかわらず、異なる網膜細胞型、異なる感光体密度および割合などの種間変動によるヒト網膜疾患の病態生理学を研究し、設計する上でより有利である。しかし、以前のHORCプロトコルでは、網膜は意図的にRPE-脈絡膜およびスクレラから切り離された。タフな強膜がなければ、薄っぺらなretinaは扱いにくく、鉗子6、7、8、9によって直接処理されれば、レチナの完全性が損なわれる可能性がある。これは、単離されたレチナを用いた以前の研究では、培養の72時間によってミュラー細胞活性化およびTUNEL陽性核の増加を報告しているという事実によって証明される。これは我々の知見とは対照的であり、サンドイッチ法はレチンタル完全性をよりよく保存することを示唆している。第二に、RPEを使用せずに培養したレチナでの動物ORCモデルにおいて増加した神経変性およびグリア増殖が、RPE10、11、12で培養されたレチナと比較して見られた。
この新しいHORCプロトコルでは、不整合性を損なう可能性を最小限に抑えるため、サンドイッチの残りの外植物を利用しました。以前のHORCプロトコルとは対照的に、トレフィンはレチナだけでなく、RPE-ビトリウスとスクレラを切断し、結果として生じる外植物が「挟み込まれる」と、残留性の膜子と下層構造の間で安定化される。残留性のバイトリウスは網膜を重くして下層構造からの折り畳みや剥離を防ぎ、強膜は網膜を鉗子誘発傷害から保護するための足場として機能する。さらに、RPEを用いたレチナの培養は、培養10、11、12におけるレチナル変性およびグリア増殖を防ぐことができる。
サンドイッチの残りの外植物を抽出する際には、以下の点を覚えておいてください。リンブスに沿って切断するとき、レンズは虹彩を重くしますが、ゾヌル繊維を介して毛様体に取り付けられているので、アイカップの中に落ちることはありません。強膜に鉗子を適用し、残性の完全性を破壊することを防ぐために、レチナに触れないようにします。外側の外植を井戸の中に入れる前に、培養井戸を培地で満たします。ウェル内にレチナル外植を置いた後に培地を追加すると、RPE-コロロイドとスクレラからレチナを外したり、外植全体を逆さまに反転させるリスクが高くなります。4つの象限で深い切開を行う場合、眼球から漏出する炎上のために末梢網膜が剥離する可能性があることを念頭に置いて下さる。網膜の剥離や折りたたみを防ぐには、網膜を引っ張っている領域のビトリアを取り除きます。前の点は、リチナの上に有膜を引っ張る草膜を除去するように助言するが、サンドイッチの残存外植物の安定性を高めるために、RPE-脈絡膜および強膜の上にレチナを計量するのに十分な残留の亜膜を残す。硬い、線維性強い強切を切断するとき、トレフィンは容易に鈍くなる可能性があります。その結果、過剰な力が必要となるか、強切が完全に浸透しない場合があります。1-2抽出されたレチンの外植のたびに新しいトレフィンを使用して、クリンラを通して不完全な浸透を避けます。慎重な取り扱いの経験は、retinaを保護するために重要です。従って、人間の目に似た大きさと構造であるブタの目によるトレーニングは、利用可能な限られたドナーの強膜の眼を使用する前に推奨される。
残存性の植物と、基礎となるRPE-脈絡膜および皮膜の間に挟まれた外植体において、レチナル完全性が維持された。H&E染色は、培養されたレチナル外植体がレチナ単独で培養するのと比較して、RPE-脈絡膜および強膜に付着した場合、より良い構造的完全性を示した。この発見を支持して、TUNEL陽性細胞核の欠如は、すべてのレチナル層内にアポトーシスの欠如を示唆し、72時間後でさえ保存された細胞生存率を示した。さらに、正常なレティナに見られるGCLおよびINLにおけるミュラー細胞の完全性および制限されたGFAP発現を確認したビメンチン標識は、再び、レティナにおける炎症性またはストレスシグナルの欠如を確認した。
本研究で特徴づけられたHORCモデルは、レチナル炎症および細胞アポトーシスを予防しながら、保存されたレチナル構造とミュラー細胞の完全性をもたらした。さらに、疾患経路や医薬メカニズムを同定するのに特に有用である、疾患をモデル化するために使用することができる。以前の動物およびインビトロ研究では、動物のレチナまたは細胞がHGおよびCyt13、14、15に曝露されたときにDR炎症を誘発することができることが示されている。本HORC研究では、培養中の24時間のサンドイッチ外植にHG及びCytを適用することにより、IL-18、VEGF、IL-6およびIL-8の分泌がベースラインを上回って有意に上昇した。これらのサイトカインは、非糖尿病コントロールと比較してDR患者の膜炎および血清中で増加することがよく知られており、このDRモデルが臨床的に翻訳可能であることを検証する20、21、22、23、24、25。本研究は、磁気ルミネックスアッセイを用いたDRのみを特徴付けているが、ウェスタンブロッティング、IHCおよび重合連鎖反応(PCR)などの他の技術も26を行うことができる。
上記の明確な利点にもかかわらず、この新しいHORCモデルにもいくつかの制限があります。このプロトコルの主な制限は、組織の低供給です。すべての眼構造を有するが、一般的に移植のために角膜を取り除いたドナーアイカップは、緑内障シャント、眼窩インプラント、網膜剥離の損傷修復および露出した縫合糸のカバレッジなどの外科的処置における強膜の需要が大きいため、研究に利用されることはめったにありません。この制限を最小限に抑えるために、我々は、すべての実験群が同じドナーから収集されることを示唆する。これにより、年齢、疾患期間、ベースラインサイトカインレベル、および異なる患者間で比較する場合に交絡変数に寄与する可能性のあるその他の要因など、ドナー間変動性を考慮する必要がなくなります。また、ほとんどのドナー組織は若い年齢層からサンプルを得るのが難しいため高齢者からのもので、利用可能な場合でも、若いドナーの死因は本質的に外傷性であり、文化に適さない損傷した組織につながることが多い。それにもかかわらず、ほとんどの慢性疾患が高齢患者に発生することを考えると、このモデルは、DRおよび加齢黄斑変性症などの加齢性慢性性性病変性疾患を研究する上で依然として有用性を保持している。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、眼組織の寛大なドナーとニュージーランド国立眼科銀行のチームの支援に感謝したいと考えています。この研究は、モーリス・アンド・フィリス・ペイケル・トラストとオークランド医学研究財団(1117015)からのプロジェクト助成金によって財政的に支援されました。IDRの取締役はブキャナン慈善財団の支援を受けています。CKの奨学金はニュージーランド検眼医教育研究基金(CC36812)によって提供され、HHLの奨学金はブキャナン慈善財団によって提供されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposable Biopsy Punches (5 mm) | Integra York PA Inc., USA | 21909-142 | Referred as surgical trephines in this article |
| Human Recombinant IL-1β | Peprotech, USA | 200-01B | Working concentration: 10 ng/mL |
| Human Recombinant TNF-a | Peprotech, USA | 300-01A | Working concentration: 10 ng/mL |
| DAPI (1 µg/mL) | Sigma Aldrich, Germany | #D9542 | Nuclear stain. Working dilution 1:1000 |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA | 10565018 | Dulbecco’s Modified Eagle Medium nutrient mixture F-12 containing a 1× antibiotics and antimycotics mixture (AA, 100× stock) |
| Fine Scissors - Sharp-Blunt | Fine Science Tools (F.S.T) | 14028-10 | Tips: Sharp-Blunt, Cutting Edge: 27mm, Length: 10cm, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools (F.S.T) | 11050-10 | Length:10cm, Tip shape: Straight, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8mm, Tip Dimensions:0.8 x 0.7mm, Alloy/Materials: Stainless Steel |
| Mouse monoclonal GFAP-Cy3 | Sigma Aldrich, Germany | #C9205 | Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:1000. |
| Mouse monoclonal Vimentin-Cy3 | Sigma Aldrich, Germany | #C9080 | Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:50. |
| Rabbit polyclonal TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein) | Sigma Aldrich, Germany | #11684795910 | Primary antibody conjugated to Fluorescein-dUTP. Working dilution 1:10 with enzyme-buffer solution. |
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