Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Характеристика новой техники органотипической культуры сетчатки человека

Published: June 9, 2021 doi: 10.3791/62046
Automatic Translation
*1, 1, 1, *1
1Buchanan Ocular Therapeutics Unit, Department of Ophthalmology and the New Zealand National Eye Centre, University of Auckland
* These authors contributed equally

Summary

Это исследование направлено на разработку новой модели органотипической культуры сетчатки человека (HORC), которая предотвращает компрометацию целостности сетчатки во время эксплантации. Это достигается путем культивирования сетчатки с шелужащимся стекловидным и нижележащим пигментом сетчатки эпителием-сосудистой оболочкой (RPE-сосудистой оболочкой) и склерами.

Abstract

Предыдущие модели органотипической культуры сетчатки человека (HORC) использовали отслоивающиеся сетчатки; однако без структурной поддержки, приданной пигментным эпителием-сосудистой оболочкой сетчатки (RPE-сосудистой оболочкой) и склерой, целостность хрупкой сетчатки может быть легко нарушена. Целью этого исследования была разработка новой модели HORC, которая содержит сетчатку, RPE-хориозию и склеру для поддержания целостности сетчатки при культивировании эксплантов сетчатки.

После разрезания по окружности вдоль лимбуса для удаления радужной оболочки и хрусталика, были сделаны четыре глубоких разреза, чтобы сплющить глазник. В отличие от предыдущих протоколов HORC, трефин использовался для разрезания не только сетчатки, но и RPE-сосудистой оболочки и склеры. Полученную трехслойную эксплантировали в течение 72 ч. Окрашивание гематоксилином и эозином (H & E) использовалось для оценки анатомических структур, а экспланты сетчатки дополнительно характеризовались иммуногистохимией (IHC) для апоптоза, целостности клеток Мюллера и воспаления сетчатки. Чтобы подтвердить возможность индукции заболевания, экспланты подвергались воздействию высокого уровня глюкозы (HG) и провоспалительных цитокинов (Cyt), чтобы имитировать диабетическую ретинопатию (DR). Анализ магнитной бусины Luminex использовался для измерения связанных с DR цитокинов, высвобождаемых в культуральная среда.

Окрашивание H & E выявило отчетливые ламели сетчатки и компактные ядра в эксплантатах сетчатки с нижележащей RPE-сосудистой оболочкой и склерой, в то время как сетчатка без нижележащих структур продемонстрировала уменьшенную толщину и сильную потерю ядер. Результаты IHC показали отсутствие апоптоза и воспаления сетчатки, а также сохранение целостности клеток Мюллера. Анализы Luminex показали значительно повышенную секрецию DR-ассоциированных провоспалительных цитокинов в эксплантатах сетчатки, подвергшихся воздействию HG + Cyt, по сравнению с исходными уровнями через 24 ч.

Мы успешно разработали и охарактеризовали новый протокол HORC, в котором целостность сетчатки сохранялась без апоптоза или воспаления сетчатки. Более того, индуцированная секреция DR-ассоциированных провоспалительных биомаркеров при воздействии эксплантов сетчатки на HG + Cyt предполагает, что эта модель может быть использована для клинически транслируемых исследований заболеваний сетчатки.

Introduction

Сетчатка является узкоспециализированной глазной структурой, ответственной за преобразование входящей световой энергии в электрические сигналы, которые затем обрабатываются мозгом для визуального восприятия. Сетчатка человека содержит динамический диапазон типов клеток, высокоорганизованных в уникальную ламеллярную структуру, состоящую из двух синаптических и трех ядер слоя1 (рисунок 1). Гомеостаз сетчатки поддерживается сложными связями между нейроретинальными клетками, кровеносными сосудами, нервами, соединительными тканями и RPE1. Из-за сложной анатомии и физиологии сетчатки механизмы многих заболеваний сетчатки до сих пор остаются плохо изученными2,3,4,5. Для лучшего изучения заболеваний сетчатки были разработаны модели HORC6,7,8,9. По сравнению с исследованиями на животных и культурами in vitro, модели HORC являются преимуществами, поскольку они сохраняют динамическую клеточную среду и сложные нейрососудистые взаимодействия in situ, обеспечивая хорошую модель для клинической трансляции.

Figure 1
Рисунок 1:Задние глазные структуры человеческого глаза. Спереди к задней части слои сетчатки: слой нервных волокон (NFL), слой ганглиозных клеток (GCL), внутренний плексиформный слой (IPL), внутренний ядерный слой (INL), внешний плексиформный слой (OPL), внешний ядерный слой (ONL), внутренний сегмент фоторецептора (IS) и внешний слой фоторецептора (OS). Клетки внутри сетчатки включают ганглионные клетки (синий), амакриновые клетки (желтые), биполярные клетки (красные), горизонтальные клетки (фиолетовые), палочковые фоторецепторы (розовый) и колбочка фоторецепторов (зеленый). Стекловидное стекло расположено перед сетчаткой. RPE, мембрана Бруха, хориоида и склера расположены с задней частью сетчатки. Обратите внимание, что показанное изображение является только схематическим представлением сетчатки, и соотношение клеток / связности сетчатки в каждом слое может не указывать на настройку in vivo. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Ранее охарактеризованные протоколы HORC6,7,8,9 включали отделение сетчатки от лежащей в основе RPE-сосудистой оболочки и склеры с использованием хирургического трефина. Однако без поддержки, обеспечиваемой этими нижележащие структурами, полупрозрачная сетчатка становится хлипкой, трудной в обращении, а такие инструменты, как щипцы, могут легко нарушить ее целостность. Кроме того, было показано, что изоляция сетчатки в культуре без RPE вызывает апоптоз ганглиозных клеток и дегенерацию фоторецепторов10,11,12. Таким образом, альтернативный протокол HORC, который минимизирует потерю целостности сетчатки и лучше имитирует среду in vivo, был бы полезен. Это особенно важно при изучении механизмов заболевания сетчатки, так как физическая травма во время эксплантирования может привести к артефактам. Поэтому целью этого исследования была разработка новой модели HORC, которая включает в себя RPE-хориозию и склеру для защиты целостности сетчатки во время эксплантной обработки и культуры.

Для достижения этой цели экстрагировали экспланты сетчатки, «зажатые» между остаточным стекловидным стекловидным и лежащим в основе RPE-сосудистой оболочкой и склерой. В сэндвич-эксплантах стекловидное стекло утяжелит сетчатку, чтобы предотвратить отслоение и складчатку сетчатки, тогда как жесткая, волокнистая склера действует как каркас для структурной поддержки и точка контакта для щипцов. Более того, животные модели показали, что сохранение RPE в культуре может предотвратить дегенерацию сетчатки и глиальную пролиферацию, реакцию клеток Мюллера на сигналы опасности, такие как гипоксия и воспаление10,11,12.

Чтобы охарактеризовать модель, экспланты сэндвич-сетчатки окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) для оценки анатомических структур и проводили иммуногистохимию (IHC), маркируя экспланты терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой dUTP nick end labeling (TUNEL, апоптотический клеточный маркер), глиальным фибриллярным кислым белком (GFAP, воспаление сетчатки и маркер активации клеток Мюллера) и виментином, маркером целостности клеток Мюллера. Чтобы определить, может ли эта модель быть индуцирована на развитие молекулярных признаков заболевания, экспланты подвергались воздействию высокого уровня глюкозы (HG) с провоспалительными цитокинами (Cyt), интерлейкином-1β (IL-1β) и фактором некроза опухоли α (TNF-α), культивируемой средой, которая, как было показано, имитирует диабетическую ретинопатию (DR) как в моделях клеточных, так и в животных моделях заболеваний13,14,15. Анализы Luminex использовались в модели DR для измерения цитокинов, высвобождаемых в культурную среду.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Глазные чашки доноров были получены из Национального банка глаз Новой Зеландии после иссечения роговицы для трансплантации и одобрены Комитетом по этике здравоохранения и инвалидности Северного В (NTX/06/19/CPD/AM07).

ПРИМЕЧАНИЕ: Культуру следует проводить в шкафу биобезопасности класса II для обеспечения стерильных условий культивированием тканей. Ткани должны быть культивированы в течение 24 ч после вскрытия, чтобы избежать значительной потери целостности сетчатки.

Figure 2
Рисунок 2:Изображения, показывающие процедуру сбора сэндвича эксплантов сетчатки. Для приготовления эксплантата используйте рассекающие ножницы с одним острым кончиком и одним тупым концом, с тупым концом, обращенным к внутренней части земного шара, чтобы уменьшить повреждение тканей во время разреза. Также используйте щипцы с тупыми концами, чтобы избежать расчесывания внутриглазных тканей во время обработки. С помощью хирургических ножниц, тупым концом, обращенным внутрь, разрезают вдоль лимбуса, чтобы удалить радужную оболочку и хрусталик(A-C). ONH может быть расположен, если смотреть прямо в открытый наглазник(D). Используя щипцы с тупыми кончиками, удерживайте склеру для стабилизации земного шара(E). Разделите глобус вертикально на две половины, сделав два глубоких разреза в сторону ONH, но не прорезайте ONH. Повторите это вдоль горизонтального меридиана(G). Нанесите тупые щипцы на склеру и осторожно откройте глобус до клеверной формы(H-K). Используйте щипцы, чтобы осторожно манипулировать стекловидным стеклом, чтобы сгладить сложенную сетчатку, так как стекловидное стекло тянет за сетчатку, но не прикасайтесь к сетчатке напрямую(I). Удалите стекловидное стекло, если оно вызывает отслоение сетчатки или сворачивание (не показано на рисунке 2, так как прозрачное стекловидное стекло плохо запечатлено на фотографиях). Найдите области, где сетчатка плоская, и извлеките экспланты сетчатки с помощью хирургического трефина(L). Прикладывая щипцы к склере, осторожно переносят экспланты сетчатки в заранее подготовленную культуральную среду(М,Н). Весь сэндвич эксплант должен опускаться на дно скважины из-за его веса, поэтому каждый эксплант погружается в среду(О). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

1. Извлечение сэндвича из сетчатки из наглазницы

  1. Снимите радужную оболочку и линзу.
    1. Поместите глазную чашку внутрь чашки Петри, с радужной оболочкой и линзой, обращенной вверх, и головкой зрительного нерва (ONH), контактирующей с чашкой Петри(рисунок 2A).
    2. Держите глазную чашку устойчиво на лимбе с помощью щипцов(рисунок 2B).
    3. Отсоединять радужную оболочку и линзу, сделав небольшие разрезы по окружности вдоль внешнего края лимбуса(рисунок 2А).
    4. Осторожно снимите радужную оболочку и линзу. Избегайте нарушения сетчатки во время манипуляций(рисунок 2C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хрусталик не попадет в глазную чашку, так как он прикреплен через зонульные волокна к цилиарному телу.
  2. Расплющить глазную чашку.
    1. Когда глазная чашка все еще сидит вертикально, определите ONH. Это проще с ярким источником белого света(рисунок 2D).
    2. Наклониться в четырех квадрантах в сторону ONH(рисунок 2E). Чашку Петри можно вращать для упрощения обработки. НЕ вырезайте ONH.
    3. Аккуратно распределите и расплющите глазную чашку(рисунок 2E).
    4. Нанесите щипцы на склеру вместо сетчатки, чтобы избежать нарушения целостности сетчатки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Периферическая отслойка и сворачивание сетчатки неизбежны, так как вес переполненного стекловидного тела будет тянуть за сетчатку. В этих областях удалите стекловидное стекло, чтобы предотвратить дальнейшее сворачивание сетчатки. Не забудьте оставить остаточное стекловидное стекло, чтобы стабилизировать сетчатку поверх RPE-сосудистой оболочки и склеры.
  3. Соберите бутербродные экспланты сетчатки.
    1. Поместите хирургический трефин на сетчатку в область без складок сетчатки(рисунок 2F).
    2. Надавливание сильно проникает в склеру, которая должна генерировать трескучий звук.
    3. Скручите трефин на 180°, чтобы убедиться, что склера была полностью проникла таким образом, что эксплант сетчатки теперь отделен от оставшейся ткани.
    4. Нанесите щипцы на склеру и перенесите сэндвич-эксплант сетчатки в культуральнуюсреду (рисунок 2G-I).
    5. Получить 2-3 сэндвич-эксплантата сетчатки из периферической сетчатки каждого квадранта.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сэндвич-эксплант сетчатки иногда может быть захвачен в отверстии трефина. Используя щипцы, аккуратно выдразнить небольшой участок основания склеры. Это происходит чаще, когда лезвие тупое и может вызвать потерю сетчатки(рисунок 3A-C).
    6. Используйте новый трефин после вырезания 1-2 эксплантов сетчатки, так как лезвие легко тупое(рисунок 3CFigure 3
      Рисунок 3:Устранение неполадок. Во время процесса экстракции эксплант сетчатки может быть захвачен при вскрытии хирургического трефина(А). Осторожно выдозните ткань от основания склеры, не касаясь сетчатки(B). Это может происходить чаще, если хирургический трефин используется для извлечения более двух эксплантов сетчатки, так как лезвие может легко стать тупым(C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
  4. Культивирует экспланты сетчатки.
    1. Подготовьте культурную среду, содержащую питательную смесь F-12 (DMEM-F12) от Dulbecco's Modified Eagle Medium и 1-кратную смесь антибиотиков и антимикотиков (AA, 100x бульон).
    2. Перед эксплантной добычей поместите 500 мкл среды в скважины 24-скважинной плиты и уравновесьте в инкубаторе. Это важно, так как добавление среды после этого может вытесдить сетчатку.
    3. Культивируйте сэндвич-эксплантатор сетчатки при 37 °C в течение 72 ч в увлажненный 5% CO2 инкубатор в среде, приготовленной на этапе 1.4.2.
    4. Для индуцирования DR-подобных изменений культивируют экспланты сетчатки в среде, содержащей DMEM-F12, с комбинацией 32,5 мМ HG с Cyt, TNF-α (10 нг/мл) и IL-1β (10 нг/мл).

2. Парафин-встраивание сэндвича эксплантов сетчатки

  1. Зафиксируйте бутерброд сетчаткой эксплантов.
    1. Погружайте бутербродные экспланты сетчатки в 10% формалин не менее 24 ч.
    2. Удалите раствор формалина и аккуратно переложите экспланты сетчатки сэндвича в тканевые прокладки и кассеты.
    3. Замочите бутербродные экспланты сетчатки в 70% этаноле в течение не менее 24 ч.
    4. Парафин-встраиваемые экспланты сетчатки в блоки.
    5. Разрежьте парафиновые ткани сетчатки на участки толщиной 5 мкм с помощью микротома и установите на стеклянные слайды. Хранить при комнатной температуре до тех пор, пока не будет установлено изображение.
  2. Депарафинизация разделов.
    1. Погружайте срезы в 70% ксилол на 5 мин.
    2. Погружайте срезы в 100% ксилол на 5 мин.
    3. Регидратировать срезы в 70% этаноле в течение 5 мин.
    4. Регидратировать срезы в 100% этаноле в течение 5 мин.
    5. Промыть секции под проточной водопроводной водой в течение 10 мин.

3. Характеристика с использованием H&E, IHC и магнитного анализа Luminex

  1. Протокол окрашивания H&E
    1. Депарафинизируйте разделы, используя шаг 2.2.
    2. Увлажняйте срезы в водопроводной воде в течение 5 мин.
    3. Окрашивают срезы в 2 гематоксилина Гилла в течение 5 мин.
    4. Тщательно вымойте секции под проточной водопроводной водой, чтобы удалить лишние пятна.
    5. Дифференцировать, обмакивая секции дважды в 1% кислый спирт.
    6. Быстро вымойте секции под проточной водопроводной водой.
    7. Окрашивают участки в синий цвет, окунув шесть раз в 1% карбонат лития (10 мг/мл).
    8. Тщательно вымойте участки под проточной водопроводной водой в течение 5 мин, чтобы удалить излишки синего пятна.
    9. Окуните срезы в 1% эозина 10 раз.
    10. Быстро вымойте участки под водопроводной водой, чтобы удалить лишние пятна.
    11. Обезвоживать срезы, окунув их 10 раз в 100% этанол. Сделайте это дважды.
    12. Окуните срезы в 70% ксилол 10 раз.
    13. Окуните срезы в 100% ксилол 10 раз.
    14. Монтаж с помощью обтекательного вала с использованием монтажной среды из дибутилфталата полистирола ксилола (DPX).
    15. Сделайте снимки с помощью светового микроскопа.
  2. Протокол маркировки IHC'
    1. Депарафинизируйте разделы, используя шаг 2.2.
    2. Поместите слайды в раствор, содержащий 10 мМ буфера цитрата натрия с 0,05% Tween 20 при рН 6,0 и запустите извлечение антигена в скороварке, автоматизированной при 121 °C в течение 2 мин.
    3. Промывайте участки фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) в течение 5 мин. Сделайте это 3 раза.
    4. Блокируют участки с PBS, содержащими 0,1% Triton X-100 и 10% нормальной козьей сыворотки, в течение 1 ч при комнатной температуре.
    5. Инкубировать участки в течение ночи при 4 °C с первичными антителами, конъюгированными со вторичными антителами (Таблица материалов).
    6. Промывайте секции в PBS в течение 5 мин. Сделайте это 3 раза.
    7. Окрашивают ядра с помощью 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в течение 2 мин.
    8. Мойте и монтируйте секции с помощью антивядающего реагента.
    9. Запечатайте чехлы лаком для ногтей.
    10. Снимайте снимки с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа.
  3. Магнитный анализ Luminex
    1. Перенос 75 мкл среды из каждой скважины в 96-скважинную u-дно плиту через 24 и 72 ч.
    2. Анализ клеточного супернатанта на IL-18, IL-6, IL-8 и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) через 24 и 72 ч с использованием цитокинового анализа Luminex. Следуйте инструкциям производителя для проведения анализа16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Целостность сетчатки была сохранена в этой модели HORC. Целостность сетчатки была сохранена в культивированных сэндвич-эксплантах сетчатки, но была потеряна в сетчатке, культивированной без смежных структур. H&E проводили для изучения структурной целостности секционированных сэндвич-эксплантов сетчатки после 72 ч в культуре. Экспланты сетчатки сэндвича показали сохраненную целостность и отчетливую структуру ламелей от GCL до ONL с компактными ядрами в INL и ONL(рисунок 4A). Однако нарушенная целостность сетчатки была обнаружена на краях того же образца, где сетчатка отделилась от нижележащих RPE-сосудистой оболочки и склеры, показывая уменьшенную толщину сетчатки и резкую потерю ядер в INL и ONL(рисунок 4B).

Figure 4
Рисунок 4:H&E изображения эксплантов сетчатки, культивированных в среде в течение 72 ч. A)Структурная целостность, поддерживаемая в областях, прикрепленных к нижележащих RPE-сосудистой оболочке и склере, изображена отчетливым разделением каждого слоя сетчатки от GCL до ONL и компактных ядер в INL и ONL. B)Тяжелая потеря целостности сетчатки в областях, отделенных от RPE-сосудистой оболочки и склеры, о чем свидетельствует общее уменьшение толщины сетчатки и уменьшение числа ядер в INL и ONL. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Характеристика эксплантов сетчатки с использованием IHC продемонстрировала хорошо сохранившуюся целостность сетчатки даже после 72 ч в культуре. В экстраплантах сетчатки, культивируемых в базальных условиях, не было обнаружено ТУНЭЛ-положительных клеточных ядер, которые отмечают апоптоз, демонстрируя устойчивую жизнеспособность клеток даже через 72 ч(рисунок 5A-C). Экспрессия GFAP оставалась локализованной в GCL и IPL, как видно в нормальных тканях сетчатки17,18. Не было глиального фиброза, признака активации и пролиферации клеток Мюллера в ответ на воспаление сетчатки, которое в противном случае было бы идентифицировано как регулируемая экспрессия GFAP, которая распространяется на ONL10,11,12(рисунок 5D-F). Маркировка виментина (красный) была высоко экспрессирована от GCL до ONL, демонстрируя сохраненную целостность клеток Мюллера, как видно в нормальных тканях сетчатки(рисунок 5G-I).

Figure 5
Рисунок 5:IHC изображения эксплантов сетчатки после культивирования в базальных средах в течение 72 ч. Отсутствие TUNEL-положительного окрашивания (зеленого) говорит о том, что в слоях сетчатки от GCL до ONL(A-C)не произошло клеточного апоптоза. Маркировка GFAP (красный) была ограничена GCL и IPL без глиального фиброза, который был бы идентифицирован как расширенная экспрессия GFAP в ONL(D-F). Виментин (красный) был высоко экспрессирован от GCL до ONL, находя клетки Мюллера, которые охватывают эти слои сетчатки(G-I). Ядра клеток окрашивали DAPI (синим цветом). Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Модель DR была разработана путем культивирования сэндвич-эксплантов сетчатки в HG и Cyt. HG и Cyt, IL-1β и TNF-α, увеличивали секрецию IL-18, VEGF, IL-6 и IL-8 относительно исходных уровней. Анализ Luminex использовался для измерения цитокинов IL-18, VEGF, IL-6 и IL-8, секретируемых эксплантами сетчатки после культивирования в течение 24 и 72 ч в условиях HG + Cyt(рисунок 6). Чтобы свести к минимуму междофонские различия, уровни секретируемых цитокинов сравнивали с исходным уровнем (обозначенным пунктирной красной линией), представленным уровнями цитокинов, секретируемыми сэндвич-эксплантами от того же донора, но культивируемыми в базальной среде (приготовленной на этапе 1.4.1). Через 24 ч уровни секретируемого IL-18, VEGF, IL-6 и IL-8 значительно увеличились по сравнению с исходным уровнем. Через 72 ч только уровни IL-18 и VEGF оставались значительно повышенными, тогда как в уровнях IL-6 и IL-8 не было обнаружено существенной разницы по сравнению с исходным уровнем.

Figure 6
Рисунок 6:Высвобождение цитокинов путем экстраплантов сетчатки сэндвича, культивированного в HG и Cyt, IL-1β и TNF-α, через 24 и 72 ч. Секретируемые уровни IL-18, VEGF, IL-6 и IL-8 значительно превышали исходный уровень через 24 ч (p < 0,05). Через 72 ч уровни IL-18 и VEGF оставались значительно повышенными (p < 0,05), но не было обнаружено существенной разницы в уровнях IL-6 и IL-8 по сравнению с исходным уровнем. Пунктирная красная линия указывает на исходный уровень, который представляет собой уровни цитокинов, секретируемые эксплантами от того же донора, но культивируемые в нормальной среде. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HORC в настоящее время является наиболее клинически переводимой моделью в доклинических исследованиях сетчатки. По сравнению с моделями культур клеток in vitro, HORC может лучше представлять анатомию сетчатки человека in situ, сохраняя динамические типы клеток сетчатки и их связи с нейронами, сосудами и внеклеточной средой19. По сравнению с животными моделями, HORC более выгоден в изучении патофизиологии и разработке фармацевтических методов лечения заболеваний сетчатки человека из-за межвидовых вариаций, таких как различные типы клеток сетчатки, а также различная плотность и пропорции фоторецепторов, что может способствовать неудачным клиническим испытаниям, несмотря на положительные результаты на животных моделях19. Однако в предыдущих протоколах HORC сетчатка была намеренно отделена от RPE-сосудистой оболочки и склеры. Без жесткой склеры хлипкой сетчаткой трудно справиться, и целостность сетчатки может быть нарушена, если ее напрямую обрабатывать щипцами6,7,8,9. Об этом свидетельствует тот факт, что предыдущие исследования с использованием изолированных сетчаток сообщали об увеличении активации клеток Мюллера и TUNEL-положительных ядер на 72 ч культуры. Это контрастирует с нашими выводами, предполагающими, что метод сэндвича лучше сохраняет целостность сетчатки. Во-вторых, повышенная дегенерация нейронов и глиальная пролиферация были обнаружены в животных моделях ORC в сетчатке, культивируемой без RPE, по сравнению с сетчаткой, культивируемой с RPE10,11,12.

Чтобы свести к минимуму вероятность нарушения целостности сетчатки, в этом новом протоколе HORC были использованы сэндвич-экспланты сетчатки. В отличие от предыдущих протоколов HORC, трефин прорезал не только сетчатку, но и RPE-стекловидное стекло и склеру, так что полученный эксплант «зажат» и стабилизировался между остаточным стекловидным стекловидом и нижележащими структурами. Остаточное стекловидное стекло утяжелит сетчатку, чтобы предотвратить сворачивание и отслоение от нижележащих структур, в то время как склера действует как каркас для поддержки архитектуры сетчатки, чтобы защитить сетчатку от травм, вызванных щипцами. Кроме того, культивирование сетчатки с помощью RPE может предотвратить дегенерацию сетчатки и глиальную пролиферацию в культуре10,11,12.

Помните следующие моменты при извлечении сэндвича эксплантов сетчатки. При разрезании вдоль лимбуса хрусталик будет утяжелять радужную оболочку, но не будет попадать внутрь глазной чашки, поскольку она прикреплена через зональные волокна к цилиарному телу. Нанесите щипцы на склеру и избегайте прикосновения к сетчатке, чтобы предотвратить нарушение целостности сетчатки. Заполните культивные колодцы средой перед размещением эксплантата сетчатки внутри скважин. Добавление среды после размещения эксплантов сетчатки внутри колодцев увеличивает риск смещения сетчатки из RPE-сосудистой оболочки и склеры или переворачивания всей эксплант вверх ногами. Делая глубокие разрезы в четырех квадрантах, имейте в виду, что периферическая сетчатка может отсоединиться из-за того, что стекловидное стекло вытекает из глазной чашки. Чтобы предотвратить отслоение или складчатку сетчатки, удалите стекловидное стекло в области, которая тянет сетчатку. Хотя предыдущий пункт советует удалить стекловидное потягивание на сетчатке, оставьте достаточное остаточное стекловидное стекло, чтобы взвесить сетчатку поверх RPE-сосудистой оболочки и склеры, чтобы повысить стабильность сэндвич-эксплантов сетчатки. При разрезании жесткой, волокнистой склеры трефин может легко стать тупым. В результате может потребоваться чрезмерная сила или склера может быть не полностью проникнута. Используйте новый трефин на каждые 1-2 экстрагированных эксплантата сетчатки, чтобы избежать неполного проникновения через склеру. Опыт бережного обращения имеет решающее значение для защиты сетчатки; поэтому рекомендуется тренировать глаза свиней, которые похожи по размеру и структуре на человеческий глаз, перед использованием ограниченных донорских склеральных глазных глаз.

Целостность сетчатки сохранялась в эксплантатах, зажатых между остаточным стекловидным стекловидным и нижележащих RPE-сосудистой оболочкой и склерами. Окрашивание H & E показало лучшую структурную целостность, когда культивируемая эксплант сетчатки был прикреплен к RPE-сосудистой оболочке и склере, по сравнению с культивированием одной только сетчатки. Подтверждая этот вывод, отсутствие TUNEL-положительных клеточных ядер предполагало отсутствие апоптоза во всех слоях сетчатки, демонстрируя сохраненную клеточную жизнеспособность даже через 72 ч. Кроме того, маркировка виментина подтвердила целостность клеток Мюллера и ограниченную экспрессию GFAP в GCL и INL, обнаруженную в нормальной сетчатке, снова подтвердили отсутствие воспалительных или стрессовых сигналов в сетчатке.

Модель HORC, характерная в этом исследовании, привела к сохранению структуры сетчатки и целостности клеток Мюллера, предотвращая воспаление сетчатки и клеточный апоптоз. Кроме того, он может быть использован для моделирования заболеваний сетчатки, что особенно полезно для выявления путей заболевания и фармацевтических механизмов. Предыдущие исследования на животных и in vitro показали, что воспаление ДР может быть вызвано, когда сетчатка или клетки животных подвергаются воздействию HG иCyt 13,14,15. В этом исследовании HORC, при применении HG и Cyt к сэндвич-эксплантам в течение 24 ч в культуре, секреция IL-18, VEGF, IL-6 и IL-8 была значительно повышена выше исходного уровня. Хорошо известно, что эти цитокины увеличивают стекловидное стекло и сыворотку крови пациентов с ДР по сравнению с контрольной точки зрения, недиабетическими, что подтверждает, что эта модель ДР клинически трансликулируется20,21,22,23,24,25. Хотя это исследование характеризовало DR только с использованием анализа Magnetic Luminex, другие методы, такие как вестерн-блоттинг, IHC и полимеризованная цепная реакция (ПЦР), также могут быть выполнены26.

Несмотря на явные преимущества, описанные выше, эта новая модель HORC также имеет некоторые ограничения. Основным ограничением этого протокола является низкое снабжение тканей. Донорские глазные чашки, которые имеют все глазные структуры, но роговица обычно удаляется для трансплантации, редко доступны для исследований из-за большого спроса на склеру в хирургических процедурах, таких как шунты глаукомы, орбитальные имплантаты, восстановление повреждений при отслоении сетчатки и покрытие открытых швов. Чтобы свести к минимуму это ограничение, мы предлагаем, чтобы все экспериментальные группы были собраны у одного и того же донора. Это устраняет необходимость учитывать меж донорские вариации, такие как возраст, продолжительность заболевания, исходные уровни цитокинов и другие факторы, которые могут способствовать путанице переменных при сравнении между различными пациентами. Кроме того, большинство донорских тканей получены от пожилых людей, так как сложнее получить образцы из младших возрастных групп, и даже при наличии причина смерти молодых доноров часто имеет травматический характер, что приводит к повреждению тканей, которые непригодны для культивирование. Тем не менее, учитывая, что большинство хронических заболеваний сетчатки встречаются у пожилых пациентов, эта модель по-прежнему сохраняет полезность при изучении возрастных хронических заболеваний сетчатки, таких как ДР и возрастная макулярная дегенерация.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить щедрых доноров тканей глаза и команду из Национального банка глаз Новой Зеландии за их поддержку. Эта работа была финансово поддержана грантами проекта от Фонда Мориса и Филлис Пайкель и Оклендского фонда медицинских исследований (1117015). Директорство IDR поддерживается Благотворительным фондом Бьюкенена. Стипендия CK предоставляется Новозеландским образовательным и исследовательским фондом Ассоциации оптометристов (CC36812), а стипендия HHL предоставляется Благотворительным фондом Бьюкенена.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposable Biopsy Punches (5 mm) Integra York PA Inc., USA 21909-142 Referred as surgical trephines
in this article
Human Recombinant IL-1β Peprotech, USA 200-01B Working concentration: 10 ng/mL
Human Recombinant  TNF-a Peprotech, USA 300-01A Working concentration: 10 ng/mL
DAPI (1 µg/mL) Sigma Aldrich, Germany #D9542 Nuclear stain. Working dilution 1:1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA 10565018 Dulbecco’s Modified Eagle Medium nutrient mixture F-12 containing a 1× antibiotics and antimycotics mixture (AA, 100× stock)
Fine Scissors - Sharp-Blunt Fine Science Tools (F.S.T) 14028-10 Tips: Sharp-Blunt, Cutting Edge: 27mm, Length: 10cm, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight
Graefe Forceps Fine Science Tools (F.S.T) 11050-10 Length:10cm, Tip shape: Straight, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8mm, Tip Dimensions:0.8 x 0.7mm, Alloy/Materials: Stainless Steel
Mouse monoclonal GFAP-Cy3 Sigma Aldrich, Germany #C9205 Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:1000.
Mouse monoclonal Vimentin-Cy3 Sigma Aldrich, Germany #C9080 Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:50.
Rabbit polyclonal TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein) Sigma Aldrich, Germany #11684795910 Primary antibody conjugated to Fluorescein-dUTP. Working dilution 1:10 with enzyme-buffer solution.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. Facts and Figures Concerning the Human Retina. Webvision-The Organization of the Retina and Visual System. , Internet (2005).
  2. Gemenetzi, M., De Salvo, G., Lotery, A. Central serous chorioretinopathy: an update on pathogenesis and treatment. Eye. 24 (12), 1743-1756 (2010).
  3. Buschini, E., Piras, A., Nuzzi, R., Vercelli, A. Age related macular degeneration and drusen: neuroinflammation in the retina. Progress in Neurobiology. 95 (1), 14-25 (2011).
  4. Chen, S. -Y., et al. Current concepts regarding developmental mechanisms in diabetic retinopathy in Taiwan. Biomedicine. 6 (2), (2016).
  5. Kaaja, R., Loukovaara, S. Progression of retinopathy in type 1 diabetic women during pregnancy. Current Diabetes Reviews. 3 (2), 85-93 (2007).
  6. Azizzadeh Pormehr, L., et al. Human organotypic retinal flat-mount culture (HORFC) as a model for retinitis pigmentosa11. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (8), 6775-6783 (2018).
  7. Fernandez-Bueno, I., et al. Time course modifications in organotypic culture of human neuroretina. Experimental Eye Research. 104, 26-38 (2012).
  8. Niyadurupola, N., Sidaway, P., Osborne, A., Broadway, D. C., Sanderson, J. The development of human organotypic retinal cultures (HORCs) to study retinal neurodegeneration. British Journal of Ophthalmology. 95 (5), 720-726 (2011).
  9. Osborne, A., Hopes, M., Wright, P., Broadway, D. C., Sanderson, J. Human organotypic retinal cultures (HORCs) as a chronic experimental model for investigation of retinal ganglion cell degeneration. Experimental Eye Research. 143, 28-38 (2016).
  10. Caffe, A., Visser, H., Jansen, H., Sanyal, S. Histotypic differentiation of neonatal mouse retina in organ culture. Current Eye Research. 8 (10), 1083-1092 (1989).
  11. Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. K., Thumann, G. Novel organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with retinal pigment epithelium. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 47-58 (2008).
  12. Liu, L., Cheng, S. -H., Jiang, L. -Z., Hansmann, G., Layer, P. G. The pigmented epithelium sustains cell growth and tissue differentiation of chicken retinal explants in vitro. Experimental Eye Research. 46 (5), 801-812 (1988).
  13. Kuo, C., Green, C. R., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. Connexin43 hemichannel block protects against retinal pigment epithelial cell barrier breakdown. Acta Diabetologica. 57 (1), 13-22 (2020).
  14. Mugisho, O. O., et al. The inflammasome pathway is amplified and perpetuated in an autocrine manner through connexin43 hemichannel mediated ATP release. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1862 (3), 385-393 (2018).
  15. Mugisho, O. O., et al. Intravitreal pro-inflammatory cytokines in non-obese diabetic mice: Modelling signs of diabetic retinopathy. PLoS ONE. 13 (8), 0202156 (2018).
  16. R&D Systems, I. , Available from: https://www.rndsystems.com/protocol-types/luminex (2020).
  17. Nakazawa, T., et al. Attenuated glial reactions and photoreceptor degeneration after retinal detachment in mice deficient in glial fibrillary acidic protein and vimentin. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (6), 2760-2768 (2007).
  18. Okada, M., Matsumura, M., Ogino, N., Honda, Y. Müller cells in detached human retina express glial fibrillary acidic protein and vimentin. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 228 (5), 467-474 (1990).
  19. Murali, A., Ramlogan-Steel, C. A., Andrzejewski, S., Steel, J. C., Layton, C. J. Retinal explant culture: A platform to investigate human neuro-retina. Clinical & Experimental Ophthalmology. 47 (2), 274-285 (2019).
  20. Koleva-Georgieva, D. N., Sivkova, N. P., Terzieva, D. Serum inflammatory cytokines IL-1beta, IL-6, TNF-alpha and VEGF have influence on the development of diabetic retinopathy. Folia Medica (Plovdiv). 53 (2), 44-50 (2011).
  21. Lee, J. -H., et al. Cytokine profile of peripheral blood in type 2 diabetes mellitus patients with diabetic retinopathy. Annals of Clinical & Laboratory Science. 38 (4), 361-367 (2008).
  22. Chorostowska-Wynimko, J., et al. In vitro angiomodulatory activity of sera from type 2 diabetic patients with background retinopathy. Journal of Physiology and Pharmacology: An Official Journal of the Polish Physiological Society. 56, 65-70 (2005).
  23. Khalifa, R. A., Khalef, N., Moemen, L. A., Labib, H. M. The role interleukin 12 (IL-12), interferon-inducible protein 10 (IP-10) and Interleukin 18 (IL-18) in the angiogenic activity of diabetic retinopathy. Research Journal of Medicine and Medical Sciences. 4, 510-514 (2009).
  24. Zhou, J., Wang, S., Xia, X. Role of intravitreal inflammatory cytokines and angiogenic factors in proliferative diabetic retinopathy. Current Eye Research. 37 (5), 416-420 (2012).
  25. Song, Z., et al. Increased intravitreous interleukin-18 correlated to vascular endothelial growth factor in patients with active proliferative diabetic retinopathy. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 252 (8), 1229-1234 (2014).
  26. Louie, H. H., Shome, A., Kuo, C. Y. J., Rupenthal, I. D., Green, C. R., Mugisho, O. O. Connexin43 hemichannel block inhibits NLRP3 inflammasome activation in a human retinal explant model of diabetic retinopathy. Experimental Eye Research. , (2020).

Tags

Медицина выпуск 172 Человек Сетчатка Органотипический Культура Разработка модели Модель болезни
Характеристика новой техники органотипической культуры сетчатки человека
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuo, C. Y. J., Louie, H. H.,… More

Kuo, C. Y. J., Louie, H. H., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique. J. Vis. Exp. (172), e62046, doi:10.3791/62046 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter