Summary
Denna studie syftar till att utveckla en ny human organotypisk retinalkultur (HORC) modell som förhindrar att kompromissa retinal integritet under explant hantering. Detta uppnås genom att odla näthinnan med den överliggande glaskroppen och det underliggande retinalpigmentet epitel-choroid (RPE-choroid) och sclera.
Abstract
Tidigare mänskliga organotypiska retinal kultur (HORC) modeller har använt fristående näthinnan. Men utan det strukturella stöd som ges av näthinnepigment epitel-choroid (RPE-choroid) och sclera, kan integriteten hos den bräckliga näthinnan lätt äventyras. Syftet med denna studie var att utveckla en ny HORC-modell som innehåller näthinnan, RPE-choroid och sclera för att upprätthålla näthinnans integritet vid odling av näthinneexplanter.
Efter att ha skurit omkrets längs limbus för att ta bort iris och lins, gjordes fyra djupa snitt för att platta ögonkoppen. I motsats till tidigare HORC-protokoll användes en trephine för att skära igenom inte bara näthinnan utan också RPE-choroid och sclera. De resulterande trippelskiktade explanterna odlades i 72 h. Hematoxylin och Eosin färgning (H&E) användes för att bedöma anatomiska strukturer och retinal explanter präglades ytterligare av immunohistokemi (IHC) för apoptos, Müller cell integritet och retinal inflammation. För att bekräfta möjligheten till sjukdomsinduktion utsattes explanter för hög glukos (HG) och proinflammatoriska cytokiner (Cyt), för att efterlikna diabetes retinopati (DR). Luminex magnetiska pärlanalys användes för att mäta DR-relaterade cytokiner som släpptes ut i odlingsmediet.
H&E färgning visade distinkt retinal lamellae och kompakt atomkärnor i retinal explanter med underliggande RPE-choroid och sclera, medan näthinnor utan de underliggande strukturerna uppvisade minskad tjocklek och allvarliga atomkärnor förlust. IHC resultat anges avsaknad av apoptos och retinal inflammation samt bevarade Müller cell integritet. Luminex-analyserna visade signifikant ökad utsöndring av DR-associerade proinflammatoriska cytokiner i retinala explanter som exponerades för HG + Cyt i förhållande till utgångsnivåerna vid 24 h.
Vi framgångsrikt utvecklat och karakteriserat ett nytt HORC protokoll där retinal integritet bevarades utan apoptos eller näthinneinflammation. Dessutom föreslår den inducerade utsöndring av DR-associerade proinflammatoriska biomarkörer när retinal explanter exponeras för HG + Cyt att denna modell kan användas för kliniskt översättbara retinal sjukdom studier.
Introduction
Näthinnan är en högspecialiserad okulär struktur som ansvarar för att omvandla inkommande ljusenergi till elektriska signaler, som sedan bearbetas av hjärnan för visuell uppfattning. Den mänskliga näthinnan innehåller ett dynamiskt område av celltyper, mycket organiserade i en unik lamellstruktur bestående av två synaptiska och tre atomkärnor1 (figur 1). Retinal homeostas upprätthålls av de invecklade kopplingarna mellan neuroretinal celler, blodkärl, nerver, bindväv och RPE1. På grund av den sofistikerade näthinnans anatomi och fysiologi förblir mekanismerna för många näthinnesjukdomar fortfarande dåligtförstådda 2,3,4,5. För att bättre studera näthinnesjukdomar har HORC-modeller utvecklats6,7,8,9. Jämfört med djurstudier och in vitro-kulturer är HORC-modeller fördelaktiga eftersom de behåller den dynamiska cellulära miljön och komplexa neurovaskulära interaktioner på plats, vilket ger en bra modell för klinisk översättning.
Figur 1: Bakre okulära strukturer i det mänskliga ögat. Främre till bakre, näthinnan lager är: nerv fiber lager (NFL), ganglion cell lager (GCL), inre plexiform lager (IPL), inre nukleära lager (INL), yttre plexiform skikt (OPL), yttre nukleära lager (ONL), photoreceptor inre segment (IS) och photoreceptor yttre lager (OS). Celler i näthinnan inkluderar ganglionceller (blå), amacrinceller (gula), bipolära celler (röda), horisontella celler (lila), stavfotoreceptorer (rosa) och konfotoreceptorer (gröna). Glaskroppen ligger främre till näthinnan. RPE, Bruchs membran, choroid och sclera ligger posterior till näthinnan. Observera att bilden som visas endast är en schematisk representation av näthinnan och förhållandet mellan celler/näthinneanslutning inom varje lager kanske inte tyder på in vivo-inställningen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Tidigare karakteriserade HORC protokoll6,7,8,9 har involverat att separera näthinnan från den underliggande RPE-choroid och sclera med hjälp av en kirurgisk trephine. Men utan stöd från dessa underliggande strukturer blir den genomskinliga näthinnan tunn, svår att hantera och verktyg som tång kan lätt störa dess integritet. Dessutom har isolerande näthinnan i kulturen utan RPE visat sig orsaka ganglion cell apoptos och fotoreceptor degeneration10,11,12. Således skulle ett alternativt HORC-protokoll som minimerar förlusten av näthinneintegritet och bättre efterliknar in vivo-miljön vara användbart. Detta är särskilt viktigt när man studerar retinal sjukdom mekanismer, som fysisk skada under explant hantering kan införa artefakter. Syftet med denna studie var därför att utveckla en ny HORC-modell som inkluderar RPE-choroid och sclera för att skydda näthinnans integritet under explanthantering och odling.
För att uppnå detta mål extraherades retinal explanter "sandwiched" mellan den återstående glaskroppen och den underliggande RPE-choroid och sclera. I smörgåsexplanterna tynger glaskroppen näthinnan för att förhindra näthinneavlossning och vikning, medan den tuffa, fibrösa skleran fungerar som både en ställning för strukturellt stöd och en kontaktpunkt för tång. Dessutom har djurmodeller visat att bibehållande av RPE i kultur kan förhindra retinal degeneration och gliaproliferation, ett svar från Müller-celler på risksignaler som hypoxi och inflammation10,11,12.
För att karakterisera modellen färgades smörgås retinal explanter med Hematoxylin och Eosin (H&E) för att bedöma anatomiska strukturer och immunohistokemi (IHC) utfördes, Märkning explanter med terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL, en apoptotisk cell markör), gliafibrillary surt protein (GFAP, en retinal inflammation och Müller cell aktivering markör) och vimentin, en markör för Müller cell integritet. För att avgöra om denna modell kan induceras för att utveckla molekylära sjukdomstecken, explanterna utsattes för hög glukos (HG) med proinflammatoriska cytokiner (Cyt), interleukin-1β (IL-1β) och tumörnekrosfaktor-α (TNF-α), en odlingsmiljö som har visat sig efterlikna diabetes retinopati (DR) i både cell- och djursjukdomsmodellerna13,14,15. Luminex analyser användes i DR-modellen för att mäta cytokiner som släpptes ut i odlingsmediet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mänskliga donator ögonkoppar erhölls från Nya Zeeland National Eye Bank efter hornhinnans excision för transplantation och som godkänts av Northern B Health and Disability Ethics Committee (NTX/06/19/CPD/AM07).
OBS: Kulturen bör göras i ett biosäkerhetsskåp av klass II för att säkerställa sterila vävnadskulturförhållanden. Vävnaderna måste odlas inom 24 timmar efter slakt för att undvika betydande retinal integritet förlust.
Bild 2:Bilder som visar proceduren för insamling av smörgås retinal explanter. För explantpreparat, använd dissekerande sax med en skarp spets och en trubbig ände, med den trubbiga änden vänd mot insidan av världen för att minska vävnadsskador under snitt. Använd även tång med trubbiga ändar för att undvika att repa de intraokulära vävnaderna under hanteringen. Använd kirurgisk sax, med den trubbiga änden vänd mot insidan, skär längs limbus för att ta bort iris och linsen (A-C). ONH kan placeras om man tittar rakt in i den öppnade ögonkoppen (D). Använd tång med trubbiga spetsar, håll sclera för att stabilisera jordgloben (E). Dela upp jordgloben vertikalt i två halvor genom att göra två djupa snitt mot ONH men skär inte igenom ONH. Upprepa detta längs den horisontella meridianen (G). Applicera trubbiga tång vid sclera och öppna försiktigt jordgloben till en klöverform (H-K). Använd tång för att försiktigt manipulera glaskroppen för att jämna ut den vikta näthinnan, som glaskroppstuggorna på näthinnan, men rör inte näthinnan direkt (I). Ta bort glaskroppen om den orsakar näthinneavlossning eller vikning (visas inte i figur 2 eftersom den genomskinliga glaskroppen inte är väl fångad på foton). Leta reda på områden där näthinnan är platt och extrahera retinal explanter med hjälp av en kirurgisk trephine (L). Applicera tång vid skleran, överför försiktigt retinal explanterna till det förberedda odlingsmediet(M,N). Hela smörgåsexplantan bör sjunka till botten av brunnen på grund av dess vikt, därför är varje explant nedsänkt i mediet (O). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
1. Extraktion av smörgås retinal explanter från ögonkoppen
- Ta bort iris och linsen.
- Placera ögonkoppen i en petriskål, med iris och linsen vänd uppåt och det optiska nervhuvudet (ONH) som kommer i kontakt med Petri-skålen (Figur 2A).
- Håll ögonkoppen stadigt vid limbusen med tång (Figur 2B).
- Lossa iris och linsen genom att göra små snitt omkrets längs limbusens ytterkant (figur 2A).
- Ta försiktigt bort iris och linsen. Undvik att störa näthinnan under manipulering (figur 2C).
OBS: Linsen kommer inte att falla i ögonkoppen eftersom den är fastsatt, via zonulefibrer, på ciliarykroppen.
- Platta till ögonkoppen.
- När ögonkoppen fortfarande sitter upprätt, identifiera ONH. Detta är enklare med en ljus vit ljuskälla (Bild 2D).
- Inklusera vid de fyra kvadranterna mot ONH(figur 2E). Petriskålen kan roteras för enklare hantering. Klipp INTE av ONH.
- Sprid och platta till ögonkoppen försiktigt (Bild 2E).
- Applicera tången på sclera istället för näthinnan för att undvika att störa näthinnans integritet.
OBS: Perifer näthinneavlossning och vikning är oundviklig, eftersom vikten på den överfyllda glaskroppen kommer att dra på näthinnan. I dessa områden, ta bort glaskroppen för att förhindra ytterligare näthinnevikning. Kom ihåg att lämna kvarvarande glaskropp för att stabilisera näthinnan ovanpå RPE-choroid och sclera.
- Samla smörgås retinal explanter.
- Placera en kirurgisk trefin på näthinnan i en region utan näthinneveck (figur 2F).
- Tryck hårt för att penetrera sclera, vilket bör generera ett sprakande ljud.
- Vrid trefinen med 180° för att säkerställa att sclera har trängts in helt så att näthinnans explant nu är separerad från den återstående vävnaden.
- Applicera tången på sclera och överför smörgåsretinal explanten till odlingsmediet (Figur 2G-I).
- Få 2-3 sandwich retinal explanter från perifera näthinnan i varje kvadrant.
OBS: Smörgåsretinal explantan kan ibland fångas i trefinens öppning. Använd tång, reta försiktigt ut en liten del av scleras botten. Detta inträffar oftare när bladet är trubbigt och kan orsaka förlust av näthinnan (Figur 3A-C). - Använd en ny trephine efter att ha skurit ut 1-2 näthinneexplanter eftersom bladet lätt blir trubbigt (Bild 3C
Bild 3: Felsökning. Under extraktionsprocessen kan näthinnan explant fångas vid öppningen av den kirurgiska trefinen (A). Reta försiktigt ut vävnaden från scleras botten utan att röra näthinnan (B). Detta kan hända oftare om den kirurgiska trefinen används för att extrahera mer än två retinal explanter, eftersom bladet lätt kan bli trubbigt (C). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
- Kultur retinal explanterna.
- Förbered odlingsmediet som innehåller Dulbeccos modifierade eagle medium näringsblandning F-12 (DMEM-F12) och en 1x antibiotika- och antimykotikablandning (AA, 100x lager).
- Före explant extraktion, placera 500 μL medium i brunnarna på en 24-brunnsplatta och jämvikt i inkubatorn. Detta är viktigt eftersom tillsats av mediet efteråt kan rubba näthinnan.
- Kultur smörgås retinal explanterna vid 37 °C i upp till 72 timmar i en fuktad 5% CO2 inkubator i medium beredd i steg 1.4.2.
- För att inducera DR-liknande förändringar, odling retinal explanter i medium som innehåller DMEM-F12 med en kombination av 32,5 mM HG med Cyt, TNF-α (10 ng/mL) och IL-1β (10 ng/mL).
2. Paraffin-inbäddning av smörgås retinal explanter
- Fixa smörgås retinal explanterna.
- Sänk ner smörgåsretinal explanterna i 10% formalin i minst 24 timmar.
- Ta bort formalinlösningen och överför smörgåsretinal explanterna försiktigt till vävnadskuddar och kassetter.
- Blötlägg smörgåsretinal explanterna i 70% etanol i minst 24 timmar.
- Paraffin-inbäddning retinal explanter i block.
- Skär paraffinininbäddade näthinnevävnader i 5 μm tjocka sektioner med hjälp av en mikrotom och montera på glasrutschbanor. Förvaras i rumstemperatur tills avbildningen.
- Avparaffinisera avsnitt.
- Sänk ner sektionerna i 70% xylen i 5 min.
- Sänk ner sektionerna i 100% xylen i 5 min.
- Återfukta sektionerna i 70% etanol i 5 min.
- Återfukta sektionerna i 100% etanol i 5 min.
- Tvätta sektionerna under rinnande kranvatten i 10 minuter.
3. Karakterisering med H&E, IHC och en magnetisk Luminex-analys
- H&E-färgningsprotokoll
- Avparaffinisera avsnitten med steg 2.2.
- Hydrera sektionerna i kranvatten i 5 minuter.
- Färga sektionerna i Gills 2 hematoxylinlösning i 5 min.
- Tvätta sektionerna noggrant under rinnande kranvatten för att avlägsna överflödig fläck.
- Differentiera genom att doppa sektionerna två gånger i 1% sur alkohol.
- Tvätta sektionerna snabbt under rinnande kranvatten.
- Färga sektionerna blått genom att doppa sex gånger i 1% litiumkarbonat (10 mg/ml).
- Tvätta sektionerna noggrant under rinnande kranvatten i 5 minuter för att ta bort överflödig blå fläck.
- Doppa sektionerna i 1% eosin 10 gånger.
- Tvätta sektionerna snabbt under kranvatten för att ta bort överflödig fläck.
- Torka av sektionerna genom att doppa dem 10 gånger i 100% etanol. Gör det här två gånger.
- Doppa sektionerna i 70% xylen 10 gånger.
- Doppa sektionerna i 100% xylen 10 gånger.
- Montera med ett täckglas med dibutylfentalatpolystyren xylen (DPX) monteringsmedium.
- Ta bilder med ett ljusmikroskop.
- IHC-märkningsprotokoll"
- Avparaffinisera avsnitten med steg 2.2.
- Placera diabilderna i en lösning som innehåller 10 mM natriumcitratbuffert med 0,05% interpolering 20 vid pH 6,0 och kör en antigenhämtning i en tryckkokare automatiserad vid 121 °C i 2 min.
- Tvätta sektioner i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i 5 minuter. Gör det här tre gånger.
- Blockera sektionerna med PBS som innehåller 0,1% Triton X-100 och 10% normalt getserum i 1 timme vid rumstemperatur.
- Inkubera sektioner över natten vid 4 °C med primära antikroppar konjugerade till sekundära antikroppar (Materialförteckning).
- Tvätta sektionerna i PBS i 5 minuter. Gör det här tre gånger.
- Fläckkärnor med 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) i 2 min.
- Tvätta och montera sektioner med hjälp av ett anti-fade reagens.
- Försegla täcken med nagellack.
- Ta bilder med ett konfokalt laserskanningsmikroskop.
- Magnetisk Luminex-analys
- Överför 75 μL media från varje brunn till en 96-brunn-u-bottenplatta vid 24 och 72 timmar.
- Analysera cellens supernatant för IL-18, IL-6, IL-8 och Vaskulär endotel tillväxtfaktor (VEGF) efter 24 och 72 h med Luminex cytokin analys. Följ tillverkarens instruktioner för att genomföra analysen16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Näthinneintegritet bevarades i denna HORC-modell. Retinal integritet bevarades i de odlade smörgås retinal explants men förlorades i näthinnan odlas utan angränsande strukturer. H&E genomfördes för att undersöka den strukturella integriteten hos sektionerade smörgås retinal explanter efter 72 h i kultur. Smörgås retinal explanterna visade bevarad integritet och en distinkt lamellstruktur från GCL till ONL med kompakta atomkärnor i INL och ONL (Figur 4A). Störd näthinneintegritet hittades dock vid kanterna på samma prov, där näthinnan hade lossnat från den underliggande RPE-choroid och sclera, vilket visade minskad näthinnetjocklek och sever förlust av atomkärnor i INL och ONL (Figur 4B).
Figur 4: H&E-bilder av näthinneexplanter odlade på medium i 72 timmar. A) Strukturell integritet upprätthålls i områden som är knutna till den underliggande RPE-choroid och sclera, avbildad av distinkt separation av varje retinal skikt från GCL till ONL och kompakta atomkärnor i INL och ONL. B) Allvarlig förlust av näthinneintegritet i regioner som är fristående från RPE-choroid och sclera, vilket framgår av den totala retinaltjockleksreduktionen och det minskade antalet atomkärnor i INL och ONL. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Karakterisering av retinal explanter med hjälp av IHC visat välbevarade näthinnan integritet även efter 72 h i kultur. Inga TUNEL-positiva cellkärnor, som markerar apoptos, hittades i retinala explanter odlade under basala förhållanden, vilket visar ihållande cell livskraft även efter 72 h (Figur 5A-C). GFAP uttryck förblev lokaliserade i GCL och IPL, sett i normala näthinnanvävnader 17,18. Det fanns ingen stödjeceller fibros, ett tecken på Müller cell aktivering och spridning som svar på retinal inflammation, som annars skulle identifieras som uppreglerade GFAP uttryck som sträcker sig in i ONL10,11,12( Figur5D-F). Vimentinmärkning (röd) uttrycktes starkt från GCL till ONL, som visade bevarad Müller-cellintegritet, vilket ses i normala näthinnevävnader (figur 5G-I).
Figur 5: IHC-bilder av näthinneexplanter efter odling i basala medier i 72 timmar. Bristen på TUNEL-positiv färgning (grön) tyder på att ingen cellulär apoptos har inträffat i retinalskikten från GCL till ONL (A-C). GFAP-märkning (röd) begränsades till GCL och IPL utan gliafibros, vilket skulle identifieras som ett utvidgat uttryck för GFAP i ONL (D-F). Vimentin (röd) uttrycktes starkt från GCL till ONL och lokaliserar Müller-cellerna som sträcker sig genom dessa näthinneskikt (G-I). Cellkärnor var färgade med DAPI (blå). Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
En DR-modell utvecklades av odling av smörgås retinal explanter i HG och Cyt. HG och Cyt, IL-1β och TNF-α, ökade utsöndring av IL-18, VEGF, IL-6 och IL-8 i förhållande till utgångsnivåerna. En Luminex-analys användes för att mäta cytokinerna IL-18, VEGF, IL-6 och IL-8 som utsöndrades av retinala explanter efter odling i 24 och 72 h under HG + Cyt-förhållanden (figur 6). För att minimera skillnader mellan givare jämfördes utsöndrade cytokinnivåer med baslinjen (indikerad av den prickade röda linjen), representerad av cytokinnivåer som utsöndras av sandwichexplanterna från samma donator men odlas i basalt medium (beredd i steg 1.4.1). Efter 24 h ökade utsöndrade IL-18, VEGF, IL-6 och IL-8 nivåer avsevärt i förhållande till baslinjen. Efter 72 h förblev endast IL- 18- och VEGF- nivåerna signifikant förhöjda, medan ingen signifikant skillnad hittades i IL- 6- och IL- 8- nivåer jämfört med utgångsvärdet.
Figur 6:Cytokiner som frigörs av smörgåsretinal explanterna odlade i HG och Cyt, IL-1β och TNF-α, efter 24 och 72 timmar. De utsöndrade nivåerna IL-18, VEGF, IL-6 och IL-8 ökade betydligt över utgångsvärdet efter 24 timmar (p < 0,05). Efter 72 h, IL-18 och VEGF nivåer förblev betydligt ökade (p < 0,05), men ingen betydande skillnad hittades i IL-6 och IL-8 nivåer, jämfört med baslinjen. Den prickade röda linjen anger baslinjenivån, som representerar cytokinnivåer som utsöndras av explanterna från samma givare men odlas i normalt medium. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HORC är för närvarande den mest kliniskt översättbara modellen inom preklinisk näthinneforskning. Jämfört med in vitro-cellkulturmodeller kan HORC bättre representera anatomin hos den mänskliga näthinnan på plats, genom att behålla de dynamiska näthinnecelltyperna och deras kopplingar till nervceller, vaskulaturer och den extracellulära miljön19. Jämfört med djurmodeller är HORC mer fördelaktiga när det gäller att studera patofysiologin hos och utforma läkemedelsbehandlingar för mänskliga näthinnesjukdomar på grund av variationer mellan arter, såsom olika näthinnecelltyper samt varierande fotoreceptortäthet och proportioner, vilket kan bidra till misslyckade kliniska prövningar trots positiva resultat i djurmodeller19. I tidigare HORC protokoll, näthinnan var dock avsiktligt fristående från RPE-choroid och sclera. Utan den tuffa skleran är den bräckliga näthinnan svår att hantera och näthinneintegriteten kan äventyras om den hanteras direkt medtång 6,7,8,9. Detta framgår av det faktum att tidigare studier med isolerade näthinnor har rapporterat ökad Müller cell aktivering och TUNEL-positiva atomkärnor med 72 h kultur. Detta står i kontrast till våra resultat, vilket tyder på att smörgåsmetoden bättre bevarar näthinnans integritet. För det andra hittades ökad neuronal degeneration och gliaproliferation i djur ORC-modeller i näthinnan odlad utan RPE, jämfört med näthinnan odlad med RPE10,11,12.
För att minimera chanserna att äventyra näthinnans integritet användes smörgås retinal explanter i detta nya HORC-protokoll. I motsats till tidigare HORC-protokoll skär trephinen genom inte bara näthinnan, utan även RPE-glaskroppen och skleran, så att den resulterande explanten "sandwiched" och stabiliseras mellan rest glaskroppen och de underliggande strukturerna. Den återstående glaskroppen väger näthinnan nedåt för att förhindra vikning och lossning från de underliggande strukturerna medan sclera fungerar som en byggnadsställning för att stödja näthinnans arkitektur för att skydda näthinnan från tånginducerad skada. Dessutom kan odling näthinnan med RPE förhindra retinal degeneration och glia spridning i kultur10,11,12.
Kom ihåg följande punkter när du extraherar smörgås retinal explanter. Vid skärning längs limbusen kommer linsen att tynga ner iris men kommer inte att falla inuti ögonkoppen eftersom den är fastsatt, via zonulefibrer, på ciliarykroppen. Applicera tången på sclera och undvik att vidröra näthinnan för att förhindra störande näthinneintegritet. Fyll odlingsbrunnarna med medium innan du placerar retinalexplantan inuti brunnarna. Att tillsätta mediet efter att näthinnan placerats i brunnarna ökar risken för att näthinnan lossas från RPE-choroiden och sclera eller att hela explantan vänds upp och ner. När du gör djupa snitt vid de fyra kvadranterna, var uppmärksam på att perifera näthinnan kan lossna på grund av att glaskroppen läcker ut ur ögonkoppen. För att förhindra lossning eller vikning av näthinnan, ta bort glaskroppen i det område som drar i näthinnan. Även om föregående punkt rekommenderar att du tar bort glaskroppen som drar på näthinnan, lämna tillräckligt med rest glaskropp för att väga näthinnan ovanpå RPE-choroid och sclera för att öka stabiliteten hos sandwich retinal explants. När man skär igenom den tuffa, fibrösa skleran kan trephinen lätt bli trubbig. Som ett resultat kan överdriven kraft krävas eller sclera får inte penetreras helt. Använd en ny trephine för varje 1-2 extraherade retinal explanter för att undvika ofullständig penetration genom sclera. Erfarenhet av noggrann hantering är avgörande för att skydda näthinnan; Därför är träning med svinögon, som liknar i storlek och struktur till det mänskliga ögat, lämpligt innan du använder de begränsade donatorsklerala ögonkopparna som finns tillgängliga.
Retinal integritet bevarades i explanter sandwiched mellan rest glaskropp och underliggande RPE-choroid och sclera. H&E färgning visade bättre strukturell integritet när den odlade retinal explant var fäst vid RPE-choroid och sclera, jämfört med kultivering näthinnan ensam. Stödja detta konstaterande, bristen på TUNEL-positiva cellkärnor föreslog en avsaknad av apoptos inom alla retinal lager, visar bevarad cellulär livskraft även efter 72 h. Vimentinmärkning bekräftade dessutom Müllers cellintegritet och det begränsade GFAP-uttrycket i GCL och INL, som finns i normal näthinnan, kontrollerade återigen bristen på inflammatoriska signaler eller stresssignaler i näthinnan.
HORC-modellen som karakteriserades i denna studie resulterade i bevarad näthinnestruktur och Müller cellintegritet samtidigt som retinal inflammation och cellulär apoptos förhindras. Dessutom kan det användas för att modellera näthinnesjukdomar, vilket är särskilt användbart för att identifiera sjukdomsvägar och farmaceutiska mekanismer. Tidigare djur- och in vitro-studier har visat att DR-inflammation kan induceras när djurhinnan eller cellerna utsätts för HG och Cyt13,14,15. I denna HORC-studie, genom att applicera HG och Cyt på smörgås explanterna för 24 h i kultur, utsöndring av IL-18, VEGF, IL-6 och IL-8 var betydligt förhöjd över baslinjen. Dessa cytokiner är välkända för att öka i glaskroppen och serum hos patienter med DR jämfört med icke-diabetiker kontroller, validerar att denna DR-modell är kliniskt översättbar20,21,22,23,24,25. Även om denna studie endast har kännetecknat DR med magnetic luminex-analys, kan andra tekniker som Western Blotting, IHC och polymeriserad kedjereaktion (PCR) också utföras26.
Trots de tydliga fördelarna som beskrivs ovan har denna nya HORC-modell också vissa begränsningar. En stor begränsning av detta protokoll är den låga tillgången på vävnad. Donator ögonkoppar, som har alla okulär strukturer men hornhinnan i allmänhet bort för transplantation, är sällan tillgängliga för forskning på grund av den stora efterfrågan på sclera i kirurgiska ingrepp såsom glaukom shunts, orbital implantat, skada reparation i näthinneavlossning och täckning av exponerade suturer. För att minimera denna begränsning föreslår vi att alla experimentella grupper samlas in från samma givare. Detta tar bort behovet av att ta hänsyn till inter-donor-variabilities, såsom ålder, sjukdomslängd, cytokinnivåer vid baslinjen och andra faktorer som kan bidra till förvirrande variabler om man jämför mellan olika patienter. Dessutom kommer de flesta donatorvävnader från äldre människor eftersom det är svårare att få prover från yngre åldersgrupper, och även när det är tillgängligt är dödsorsaken för unga givare ofta traumatisk till sin natur som leder till skadade vävnader som är olämpliga för kultur. Med tanke på att de flesta kroniska näthinnesjukdomar förekommer hos äldre patienter, behåller denna modell dock fortfarande användbarhet vid studier av åldersrelaterade kroniska retinala sjukdomar som DR och åldersrelaterad makuladegeneration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka de generösa donatorerna av ögonvävnader och teamet från New Zealand National Eye Bank för deras stöd. Detta arbete stöddes ekonomiskt av projektbidrag från Maurice och Phyllis Paykel Trust och Auckland Medical Research Foundation (1117015). IDR:s styrelseuppdrag stöds av Buchanan Charitable Foundation. CK:s stipendium ges av New Zealand Association of Optometrists Education and Research Fund (CC36812) och HHL:s stipendium ges av Buchanan Charitable Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposable Biopsy Punches (5 mm) | Integra York PA Inc., USA | 21909-142 | Referred as surgical trephines in this article |
| Human Recombinant IL-1β | Peprotech, USA | 200-01B | Working concentration: 10 ng/mL |
| Human Recombinant TNF-a | Peprotech, USA | 300-01A | Working concentration: 10 ng/mL |
| DAPI (1 µg/mL) | Sigma Aldrich, Germany | #D9542 | Nuclear stain. Working dilution 1:1000 |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA | 10565018 | Dulbecco’s Modified Eagle Medium nutrient mixture F-12 containing a 1× antibiotics and antimycotics mixture (AA, 100× stock) |
| Fine Scissors - Sharp-Blunt | Fine Science Tools (F.S.T) | 14028-10 | Tips: Sharp-Blunt, Cutting Edge: 27mm, Length: 10cm, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools (F.S.T) | 11050-10 | Length:10cm, Tip shape: Straight, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8mm, Tip Dimensions:0.8 x 0.7mm, Alloy/Materials: Stainless Steel |
| Mouse monoclonal GFAP-Cy3 | Sigma Aldrich, Germany | #C9205 | Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:1000. |
| Mouse monoclonal Vimentin-Cy3 | Sigma Aldrich, Germany | #C9080 | Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:50. |
| Rabbit polyclonal TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein) | Sigma Aldrich, Germany | #11684795910 | Primary antibody conjugated to Fluorescein-dUTP. Working dilution 1:10 with enzyme-buffer solution. |
References
- Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. Facts and Figures Concerning the Human Retina. Webvision-The Organization of the Retina and Visual System. , Internet (2005).
- Gemenetzi, M., De Salvo, G., Lotery, A. Central serous chorioretinopathy: an update on pathogenesis and treatment. Eye. 24 (12), 1743-1756 (2010).
- Buschini, E., Piras, A., Nuzzi, R., Vercelli, A. Age related macular degeneration and drusen: neuroinflammation in the retina. Progress in Neurobiology. 95 (1), 14-25 (2011).
- Chen, S. -Y., et al. Current concepts regarding developmental mechanisms in diabetic retinopathy in Taiwan. Biomedicine. 6 (2), (2016).
- Kaaja, R., Loukovaara, S. Progression of retinopathy in type 1 diabetic women during pregnancy. Current Diabetes Reviews. 3 (2), 85-93 (2007).
- Azizzadeh Pormehr, L., et al. Human organotypic retinal flat-mount culture (HORFC) as a model for retinitis pigmentosa11. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (8), 6775-6783 (2018).
- Fernandez-Bueno, I., et al. Time course modifications in organotypic culture of human neuroretina. Experimental Eye Research. 104, 26-38 (2012).
- Niyadurupola, N., Sidaway, P., Osborne, A., Broadway, D. C., Sanderson, J. The development of human organotypic retinal cultures (HORCs) to study retinal neurodegeneration. British Journal of Ophthalmology. 95 (5), 720-726 (2011).
- Osborne, A., Hopes, M., Wright, P., Broadway, D. C., Sanderson, J. Human organotypic retinal cultures (HORCs) as a chronic experimental model for investigation of retinal ganglion cell degeneration. Experimental Eye Research. 143, 28-38 (2016).
- Caffe, A., Visser, H., Jansen, H., Sanyal, S. Histotypic differentiation of neonatal mouse retina in organ culture. Current Eye Research. 8 (10), 1083-1092 (1989).
- Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. K., Thumann, G. Novel organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with retinal pigment epithelium. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 47-58 (2008).
- Liu, L., Cheng, S. -H., Jiang, L. -Z., Hansmann, G., Layer, P. G. The pigmented epithelium sustains cell growth and tissue differentiation of chicken retinal explants in vitro. Experimental Eye Research. 46 (5), 801-812 (1988).
- Kuo, C., Green, C. R., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. Connexin43 hemichannel block protects against retinal pigment epithelial cell barrier breakdown. Acta Diabetologica. 57 (1), 13-22 (2020).
- Mugisho, O. O., et al. The inflammasome pathway is amplified and perpetuated in an autocrine manner through connexin43 hemichannel mediated ATP release. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1862 (3), 385-393 (2018).
- Mugisho, O. O., et al. Intravitreal pro-inflammatory cytokines in non-obese diabetic mice: Modelling signs of diabetic retinopathy. PLoS ONE. 13 (8), 0202156 (2018).
- R&D Systems, I. , Available from: https://www.rndsystems.com/protocol-types/luminex (2020).
- Nakazawa, T., et al. Attenuated glial reactions and photoreceptor degeneration after retinal detachment in mice deficient in glial fibrillary acidic protein and vimentin. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (6), 2760-2768 (2007).
- Okada, M., Matsumura, M., Ogino, N., Honda, Y. Müller cells in detached human retina express glial fibrillary acidic protein and vimentin. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 228 (5), 467-474 (1990).
- Murali, A., Ramlogan-Steel, C. A., Andrzejewski, S., Steel, J. C., Layton, C. J. Retinal explant culture: A platform to investigate human neuro-retina. Clinical & Experimental Ophthalmology. 47 (2), 274-285 (2019).
- Koleva-Georgieva, D. N., Sivkova, N. P., Terzieva, D. Serum inflammatory cytokines IL-1beta, IL-6, TNF-alpha and VEGF have influence on the development of diabetic retinopathy. Folia Medica (Plovdiv). 53 (2), 44-50 (2011).
- Lee, J. -H., et al. Cytokine profile of peripheral blood in type 2 diabetes mellitus patients with diabetic retinopathy. Annals of Clinical & Laboratory Science. 38 (4), 361-367 (2008).
- Chorostowska-Wynimko, J., et al. In vitro angiomodulatory activity of sera from type 2 diabetic patients with background retinopathy. Journal of Physiology and Pharmacology: An Official Journal of the Polish Physiological Society. 56, 65-70 (2005).
- Khalifa, R. A., Khalef, N., Moemen, L. A., Labib, H. M. The role interleukin 12 (IL-12), interferon-inducible protein 10 (IP-10) and Interleukin 18 (IL-18) in the angiogenic activity of diabetic retinopathy. Research Journal of Medicine and Medical Sciences. 4, 510-514 (2009).
- Zhou, J., Wang, S., Xia, X. Role of intravitreal inflammatory cytokines and angiogenic factors in proliferative diabetic retinopathy. Current Eye Research. 37 (5), 416-420 (2012).
- Song, Z., et al. Increased intravitreous interleukin-18 correlated to vascular endothelial growth factor in patients with active proliferative diabetic retinopathy. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 252 (8), 1229-1234 (2014).
- Louie, H. H., Shome, A., Kuo, C. Y. J., Rupenthal, I. D., Green, C. R., Mugisho, O. O. Connexin43 hemichannel block inhibits NLRP3 inflammasome activation in a human retinal explant model of diabetic retinopathy. Experimental Eye Research. , (2020).
