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Biochemistry

Estimación del contenido de lignina de biomasa vegetal utilizando ácido tioglicólico (TGA)

Published: July 24, 2021 doi: 10.3791/62055
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Plant and Soil Science, Texas Tech University, 2Fiber and Biopolymer Research Institute (FBRI), Department of Plant and Soil Science, Texas Tech University

Summary

Aquí, presentamos un método TGA modificado para la estimación del contenido de lignina en biomasa vegetal herbácea. Este método estima el contenido de lignina formando enlaces específicos de tioéter con lignina y presenta una ventaja sobre el método de Klason, ya que requiere una muestra relativamente pequeña para la estimación del contenido de lignina.

Abstract

La lignina es un polímero natural que es el segundo polímero más abundante en la Tierra después de la celulosa. La lignina se deposita principalmente en las paredes celulares secundarias de las plantas y es un heteropolímero aromático compuesto principalmente por tres monolignoles con una importancia industrial significativa. La lignina juega un papel importante en el crecimiento y desarrollo de las plantas, protege de las tensiones bióticas y abióticas, y en la calidad del forraje, la madera y los productos industriales de lignina. La estimación precisa del contenido de lignina es esencial tanto para la comprensión fundamental de la biosíntesis de lignina como para las aplicaciones industriales de la biomasa. El método del ácido tioglicólico (TGA) es un método altamente confiable de estimar el contenido total de lignina en la biomasa vegetal. Este método estima el contenido de lignina formando tioéteres con los grupos de alcohol bencílico de lignina, que son solubles en condiciones alcalinas e insolubles en condiciones ácidas. El contenido total de lignina se estima utilizando una curva estándar generada a partir de lignina de bambú comercial.

Introduction

La lignina es uno de los componentes de carga vitales de las paredes celulares de las plantas y el segundo polímero más abundante en la Tierra1. Químicamente, la lignina es un heteropolímero reticulado compuesto por compuestos fenólicos complejos de alto peso molecular que forman una fuente natural renovable de polímeros aromáticos y síntesis de biomateriales2,3. Este polímero natural juega un papel importante en el crecimiento de las plantas, el desarrollo, la supervivencia, el soporte mecánico, la rigidez de la pared celular, el transporte de agua, el transporte de minerales, la resistencia al alojamiento, el desarrollo de tejidos y órganos, la deposición de energía y la protección contra tensiones bióticas y abióticas4,5,6,7. La lignina se compone principalmente de tres monolignoles diferentes: alcoholes de coniferilo, sinapilo y p-coumaril que se derivan de la vía proanoide fenilo8,9. La cantidad de lignina y la composición de los monómeros varían según la especie vegetal, el tipo de tejido/órgano y las diferentes etapas del desarrollo de las plantas10. La lignina se clasifica ampliamente en lignina de madera blanda, madera dura y hierba en función de la fuente y la composición del monolignol. La madera blanda se compone principalmente de alcohol de coniferilo en un 95% con un 4% de p-coumaryl y un 1% de alcoholes sinapílicos. La madera dura tiene alcoholes de coniferilo y sinapilo en proporciones iguales, mientras que la lignina de hierba está compuesta por varias proporciones de alcoholes de coniferilo, sinapilo y p-coumarílico11,12. La composición de los monómeros es crítica, ya que determina la resistencia a la lignina, la descomposición y la degradación de la pared celular, así como la determinación de la estructura molecular, la ramificación y la reticulación con otros polisacáridos13,14.

La investigación de la lignina está ganando importancia en forrajeo, industrias textiles, industrias papeleras, y para bioetanol, biocombustibles y bioproductos debido a su bajo costo y alta abundancia15,16. Se utilizaron varios métodos químicos (por ejemplo, bromuro de acetilo, detergentes ácidos, Klason y oxidación de permanganato) junto con métodos instrumentales (por ejemplo, espectroscopia de infrarrojo cercano (NIR), espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) y espectrofotometría ultravioleta (UV)) para la cuantificación de lignina9,17. Los métodos de análisis de lignina generalmente se clasifican en función de la radiación electromagnética, la gravimetría y la solubilidad. El principio detrás de la estimación de la lignina por radiación electromagnética se basó en la propiedad química de la lignina por la cual absorbe la luz en longitudes de onda específicas. Estos resultados fueron estimados basados en el principio que la lignina tiene una absorbancia ULTRAVIOLETA más fuerte que carbohidratos. En 1962, Bolker y Somerville utilizaron pellets de cloruro de potasio para estimar el contenido de lignina en la madera18. Sin embargo, este método tiene inconvenientes en la estimación del contenido de lignina a partir de muestras herbáceas debido a la presencia de compuestos fenólicos no lignina y la ausencia de un coeficiente de extinción adecuado. En 1970, Fergus y Goring encontraron que los máximos de absorción de los compuestos de guaiacyl y syringyl estaban en 280 nm y 270 nm, lo que corrigió el problema del coeficiente de extinción del método Bolker y Somerville19. Más tarde, la espectroscopia infrarroja, una técnica altamente sensible para caracterizar fenólicos, también se utilizó para la estimación de lignina con una pequeña cantidad de muestras de biomasa vegetal. Un ejemplo de esta tecnología fue la espectrofotometría de transformada de Fourier de reflectancia difusa. Este método, sin embargo, carece de un estándar adecuado similar al método UV20. Más tarde, el contenido de lignina fue estimado por NIRS (espectroscopia de infrarrojo cercano) y RMN (espectroscopia de resonancia magnética nuclear). Aunque, hay desventajas en estos métodos, no alteran la estructura química de la lignina, conservando su pureza20.

El método gravimétrico de Klason es un método analítico directo y más fiable para la estimación de lignina de tallos leñosos. La base para la estimación gravimétrica de la lignina es la hidrólisis/solubilización de compuestos no lignínicos y la recolección de lignina insoluble para gravimetría21. En este método, los hidratos de carbono se eliminan por hidrólisis de la biomasa con H2 CONCENTRADO2SO4 para extraer residuos de lignina20,22. El contenido de lignina estimado por este método se conoce como lignina insoluble en ácido o lignina Klason. La aplicación del método Klason depende de la especie de planta, el tipo de tejido y el tipo de pared celular. La presencia de cantidades variables de componentes no lignínicos como taninos, polisacáridos y proteínas, da lugar a diferencias proporcionales en la estimación del contenido de lignina insoluble/soluble en ácido. Por lo tanto, el método de Klason sólo se recomienda para la estimación de lignina de biomasa con alto contenido de lignina, como los tallos leñosos17,23. Los métodos de solubilidad como el bromuro de acetilo (AcBr), la lignina insoluble en ácido y el ácido tioglicólico (TGA) son los métodos más comúnmente utilizados para estimar el contenido de lignina de varias fuentes de biomasa vegetal. Kim et al. establecieron dos métodos para la extracción de lignina por solubilización. El primer método extrae lignina como residuo insoluble solubilizando celulosa y hemicelulosa, mientras que el segundo método separa la lignina en la fracción soluble, dejando la celulosa y la hemicelulosa como residuo insoluble24.

Métodos similares empleados en la estimación de la lignina basados en la solubilidad son los métodos del ácido tioglicólico (TGA) y del bromuro de acetilo (AcBr)25. Tanto los métodos de TGA como los de bromuro de acetilo estiman el contenido de lignina midiendo la absorbancia de la lignina solubilizada a 280 nm; sin embargo, el método AcBr degrada los xilanos durante el proceso de solubilización de lignina y muestra un falso aumento en el contenido de lignina26. El método del tioglicolato (TGA) es el método más confiable, ya que depende de la unión específica con los grupos de tioéter de los grupos de alcohol bencílico de lignina con TGA. La lignina unida a TGA se precipita en condiciones ácidas utilizando HCl, y el contenido de lignina se estima utilizando su absorbancia a 280 nm27. El método TGA tiene ventajas adicionales de menos modificaciones estructurales, una forma soluble de estimación de lignina, menos interferencia de componentes no lignina y una estimación precisa de lignina debido a la unión específica con TGA.

Este método de TGA se modifica en función del tipo de muestra de biomasa vegetal utilizada para la estimación del contenido de lignina. Aquí, modificamos y adaptamos el método rápido de TGA de pajitas de arroz27 a los tejidos de algodón para estimar el contenido de lignina. Brevemente, las muestras de plantas en polvo secas se sometieron a tampón de solubilización de proteínas y extracción de metanol para eliminar las proteínas y la fracción soluble en alcohol. El residuo insoluble del alcohol fue tratado con TGA y la lignina precipitada bajo condiciones ácidas. Se generó una curva estándar de lignina utilizando lignina de bambú comercial y se obtuvo una línea de regresión (y = mx+c). El valor "x" utiliza valores de absorbancia promedio de lignina a 280 nm, mientras que los valores "m" y "c" se ingresaron desde la línea de regresión para calcular la concentración desconocida de lignina en muestras de biomasa de plantas de algodón. Este método se divide en cinco fases: 1) preparación de muestras de plantas; 2) lavar las muestras con agua y metanol; 3) tratamiento del pellet con TGA y ácido para precipitar lignina; 4) precipitación de lignina; y 5) la preparación de la curva estándar y la estimación del contenido de lignina de la muestra. Las dos primeras fases se centran principalmente en la preparación del material vegetal, seguida de las extracciones de agua, PSB (tampón de solubilización de proteínas) y metanol para obtener el material insoluble en alcohol. Luego, se trató con TGA (ácido tioglicólico) y HCl para formar un complejo con lignina en la tercera fase. Al final, se utilizó HCl para precipitar lignina, que se disolvió en hidróxido de sodio para medir su absorbancia a 280 nm28.

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Protocol

1. Preparación de muestras de plantas

  1. Recoger plantas de algodón de dos meses de edad del invernadero (Figura 1A).
  2. Voltee las macetas de las plantas suavemente para separar el suelo y las raíces con raíces laterales intactas aflojando el suelo alrededor de la planta (Figura 1B).
  3. Lavar bien las plantas recolectadas en bandejas llenas de agua para eliminar toda la suciedad (para muestras de raíces) (Figura 1C).
  4. Use toallas de papel para secar los tejidos separados de raíces, tallos y hojas, y etiquételos (Figura 1D). Secar al aire durante 2 días a temperatura ambiente para evitar cualquier contaminación fúngica (Figura 1E).
  5. Transfiera los tejidos de la muestra a recipientes etiquetados/papeles de aluminio e incube en una incubadora de temperatura controlada a 49 °C durante 7 a 10 días (Figura 1F).
    NOTA: Las temperaturas más altas pueden alterar la estructura de la lignina. Alternativamente, se puede usar un liofilizador para secar muestras durante 1 a 2 días sin causar ningún cambio químico en la biomasa de la planta.
  6. Utilice una cuchilla para cortar el tejido seco de la incubadora en piezas de tamaño de 5 mm o, alternativamente, emplee una amoladora de biomasa para moler los tejidos de la planta(Figura 1G, Figura 1H).
    NOTA: La amoladora/cuchilla de biomasa debe limpiarse después de que cada muestra haya sido cortada/molida.
  7. Transferir el tejido cortado /material vegetal conectado a tierra de biomasa en viales de molienda y moler en polvo fino de tamaño de 1 mm utilizando un molino congelador o amoladora criogénica con líquido N2.
  8. Moler muestras durante tres ciclos a razón de 10 CPS (cada ciclo de 2 min) en un polvo uniforme(Figura 1I,1J, 1K).
    NOTA: El experimento se puede pausar en este punto y las muestras se pueden almacenar a temperatura ambiente en contenedores herméticos para su almacenamiento a largo plazo.

2. Lavar muestras con agua, PSB y metanol

  1. Mida y registre el peso de todos los tubos de microfuge vacíos de 2 mL utilizados para la estimación del contenido de lignina en el cuaderno de laboratorio.
  2. Transfiera 20 mg del polvo de la muestra molida al tubo prepesado. Pesar el tubo con tejido y polvo de tejido y registrar estos pesos en el cuaderno de laboratorio.
  3. Incubar los tubos de microfugio de 2 mL (con tapas abiertas) con 20 mg de polvo de tejido en un bloque de calor u horno a 60 °C durante 1 hora.
  4. Después de la incubación, enfríe las muestras durante 10 min a temperatura ambiente (RT).
  5. Añadir 1,8 mL de agua a cada tubo de microfugio y mezclar por vórtice. A continuación, centrífuga a 25.200 x g (15.000 rpm) durante 10 min a RT y desechar el sobrenadante (Figura 2).
  6. Añadir 1,8 mL de tampón de solubilización de proteínas (PSB)(Tabla 1)a cada pellet retenido y mezclar por vórtice. Centrífuga a 25.200 x g (15.000 rpm) durante 10 min en RT y desecha el sobrenadante.
  7. Repita el paso 2.6 de nuevo para cada muestra.
  8. Añadir 1,8 mL de agua a cada pellet, mezclar por vórtice, y centrífuga a 25.200 x g (15.000 rpm) durante 10 min. Después de la centrifugación, guarde el pellet y deseche el sobrenadante.
  9. Al pellet retenido, añadir 1,8 mL de metanol e incubar en un bloque de calor de 60 °C durante 20 min. Luego, centrífuga a 25.200 x g (15.000 rpm) durante 10 min en RT. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y conserve el pellet (Figura 2).
  10. Repita el paso 2.9 de nuevo para cada muestra.
  11. Seque al aire el pellet en RT o proceda inmediatamente por secado al vacío. Seque al vacío usando secador al vacío a 30 °C durante 2 a 3 horas o hasta que el pellet esté completamente seco.
    NOTA: El experimento se puede pausar en este punto por secado al aire durante la noche o continuar por secado al vacío.
  12. Después del secado, pese los tubos de muestra con el pellet seco y registre el peso junto al peso del tubo vacío respectivo en el cuaderno de laboratorio. Estime el peso del pellet restando los dos valores. Estos pesos se utilizarán para la estimación de lignina al final del proceso de extracción de lignina.
  13. En este punto de extracción de lignina, se incluye la lignina de bambú comercial para la generación de la curva estándar de lignina. Mida la lignina de bambú comercial en tubos separados que van desde 0,5 mg a 5 mg en incrementos de 0,5 mg (0,5 mg, 1,5 mg, 1,5 mg, 2 mg, 3 mg, 3,5 mg, 4 mg, 4,5 mg y 5,0 mg). Mida cada concentración tres veces para tres réplicas técnicas.
    NOTA: A partir de aquí, los estándares medidos en el paso anterior se procesaron de la misma manera que las muestras que se secaron.

3. Tratamiento de pellets con TGA y ácido para precipitar lignina

  1. Someta las muestras procesadas del paso anterior, junto con los estándares medidos, al tratamiento de TGA (ácido tioglicólico).
  2. Añadir 1 mL de 3 N HCl (Tabla 1) y 100 μL de TGA a cada pellet.
  3. Vórtice e incubar en un bloque de calor precalentado a 80 °C durante 3 horas en una campana extractora de humos (Figura 2).
    NOTA: El paso de calentamiento a 80 °C debe ser monitoreado. La acumulación de alta presión puede abrir las tapas y puede conducir a derrames químicos. Se recomiendan los tubos de tapón de rosca, pero los tubos de 2 mL se pueden tapar libremente durante este paso como una alternativa para evitar tales derrames.
  4. Después de la incubación, enfríe los tubos en RT durante 10-15 min y la centrífuga a 25.200 x g (15.000 rpm) durante 10 min a RT.
    NOTA: Los residuos generados a partir de disolventes ácidos y orgánicos deben separarse y almacenarse en recipientes de vidrio con tapas ventiladas. Utilice recipientes de vidrio separados para la recolección de residuos de ácido TGA y residuos ácidos.
  5. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y conserve el pellet. Añadir 1 mL de agua, mezclar por vórtice, y centrífuga a 25.200 x g (15.000 rpm) durante 10 min en RT.
  6. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y mezcle el pellet en NaOH 1 N durante 24 h a 37 °C coctelera/mezclador térmico a baja velocidad (Figura 2).
    NOTA: Este tiempo de incubación se puede reducir a 1 hora7.
  7. Después de la incubación, centrífuga los tubos de microfubra de 2 mL a 25.200 x g (15.000 rpm) durante 10 min en RT. Conserve el sobrenadante para el siguiente paso.
    NOTA: El procedimiento implica el uso de ácidos fuertes y otros productos químicos que son corrosivos en la naturaleza. Por lo tanto, se recomienda usar epp adecuado durante todo el proceso de estimación de lignina. TGA tiene un fuerte olor desagradable y es corrosivo en la naturaleza. Por lo tanto, se recomienda usar solo en la campana extractora de humos.

4. Precipitación de lignina

  1. Transferir el sobrenadante a un tubo de microfugio fresco de 2 mL y añadir 200 μL de HCl concentrado. Incubar a 4 °C durante 4 horas o durante la noche (Figura 2).
    NOTA: El proceso de extracción se puede pausar en este punto extendiendo el paso de refrigeración a la noche.
  2. Centrífuga a 25.200 x g (15.000 rpm) durante 10 min a RT y disuelva el pellet en 1 mL de 1 N NaOH.
  3. Incubar en la coctelera en RT durante 10 min para suspender el pellet completamente en NaOH.
  4. Finalmente, mida la absorbancia de muestras a 280 nm usando un espectrofotómetro y compárese con la curva de lignina estándar.
  5. Mida la concentración desconocida de lignina utilizando los valores de la línea de regresión de la curva de calibración y las absorbancias de las muestras extraídas a 280 nm.

5. Preparación de la curva estándar y estimación de lignina en la muestra

  1. Procese los estándares de lignina de la misma manera que las muestras experimentales del tratamiento con TGA.
  2. Mida los estándares comerciales de lignina de bambú en incrementos de 0.5 mg a partir de 0.5 mg, 1 mg, 1.5 mg, 2 mg, 2.5 mg, 3.0 mg, 3.5 mg, 4.0 mg, 4.5 mg y 5 mg. A continuación, el proceso por TGA, HCl, se disuelve en 1 N NaOH seguido de la medición de la absorbancia a 280 nm(Figura 3A).
  3. Utilice valores de concentración de lignina y lecturas de absorbancia para generar una gráfica dispersa de la curva de lignina estándar (Figura 3B).
  4. Utilice la línea de regresión, y = mx+c generada en la gráfica dispersa, para la estimación del contenido desconocido de lignina de muestras preparadas utilizando valores "x" de absorbancias promedio de muestras extraídas a 280 nm y valores "m" y "c" de la línea de regresión de la curva estándar de lignina.
  5. Divida el contenido de lignina en el valor y resultante por el peso total de la muestra de biomasa vegetal secada al vacío/aire después de la extracción de metanol en mg (aproximadamente 15 mg) para obtener la concentración de lignina por mg. Luego, multiplique este valor por 100 para calcular el porcentaje de lignina por mg.

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Representative Results

Se compararon dos líneas experimentales de algodón diferentes para las diferencias en su contenido de lignina en diferentes tejidos. El contenido de lignina extraído de cada muestra se midió a 280 nm y registró sus respectivos valores de absorbancia. Los valores medios de absorbancia de cada réplica biológica se compararon con la línea de regresión de la curva estándar de lignina(Tabla 2, Figura 3C). La línea de regresión, y = mx + c, se utiliza para calcular el contenido desconocido de lignina de las líneas experimentales extraídas, muestra 1 y muestra 2. Los resultados de los valores medios de OD se sustituyeron en "x" mientras que los valores "m" y "c" se taparon a partir de la línea de regresión de la curva estándar de lignina para obtener la concentración de lignina "y" en mg (Tabla 3, Figura 3B). En el siguiente paso, para calcular por 1 mg de contenido de lignina, divida el valor "y" por el peso de la muestra (15 mg) después de la extracción de metanol. En el siguiente paso, para calcular por gramo (= 1.000 mg) el valor y/15 se multiplicó por 1.000. Para obtener % de lignina dividimos el valor de y/15 entre 1.000 y multiplicamos por 100. El promedio de lignina % para tres réplicas biológicas (de cada línea, muestra 1 y muestra 2) se comparó entre las dos líneas experimentales de la muestra 1 (11,7%) y muestra 2 (10,3%). Los valores de lignina fueron consistentes entre las réplicas biológicas, lo que sugiere que el método TGA es un método confiable y altamente específico para medir el contenido de lignina. También se realizaron estudios de comparación entre diferentes tipos de tejidos (raíz, tallo y hojas) de dos líneas experimentales de algodón, y ambas líneas mostraron un contenido relativamente menor de lignina en las hojas (3,4%) en comparación con los tallos (9,4% a 9,9%) y raíces (9,4% a 9,2%) (Tabla 4, Figura 4).

Figure 1
Figura 1: Preparación de la muestra de biomasa vegetal.  (A) Material vegetal de algodón recolectado de la casa verde. (B) Macetas suavemente volteadas para separar las raíces. (C) Lavado a fondo en agua para eliminar toda la suciedad. (D) Tejidos separados de raíces, tallos y hojas. (E)Tejido secado al aire durante 2 días después de separar el tejido. (F) El tejido secado al aire se transfiere a la incubadora a 49 °C durante 10 días. (G)Se utilizó una amoladora de biomasa para moler muestras de biomasa vegetal. (H) Muestras de biomasa de plantas de tierra de raíz, tallo y hoja. (I)Las muestras de tierra se cargan en los viales de molienda, se colocan en la cámara del molino congelador, se ponen a tierra en el molino congelador a una velocidad de 10 CPS durante 3 ciclos. (J) Viales triturados que muestren polvo de tejido finamente molido después de la molienda en el molino congelador. (K) Polvo de tejido finamente molido de raíz, tallo y hoja después de utilizar el molino congelador para la molienda. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 2
Figura 2:Pasos críticos involucrados en la extracción de lignina mediada por TGA. Diagrama de flujo de los pasos críticos involucrados en la extracción de lignina de la biomasa vegetal a la estimación del contenido de lignina utilizando el método TGA: 1. Preparación de muestras de plantas mediante secado y molienda suficientes en polvo fino utilizando el molino congelador; 2. 20 mg de polvo tisular se sometieron a PSB, metanol y lavados con agua, secó y se extrajo material insoluble en alcohol; 3. Usando TGA y ácido, la lignina fue precipitada; 4. Preparación de la curva estándar de lignina utilizando lignina de bambú comercial; 5. Estimación del contenido de lignina. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 3
Figura 3:Preparación de la curva estándar y estimación dela lignina en la muestra. (A) Tabla que muestra las diferentes concentraciones de lignina de bambú comercial utilizada para generar la curva estándar de lignina a partir de lecturas de absorbancia a 280 nm. (B)Gráfica dispersa generada con el programa Excel utilizando los valores de la tabla A.(C)Gráficas de barras que representan el contenido estimado de lignina del tejido radicular de las muestras 1 y 2. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

solución Existencias necesarias preparación
Tampón de solubilización de proteínas (PSB) 1 M Tris HCl pH 8,8 y 0,5 M EDTA pH 8,0 Para preparar 100 mL de solución de trabajo de PSB con concentración final de 50 mM Tris, 0,5 mM de EDTA y 10 % de SDS, añadir 5 mL de 1 M Tris, 1 mL de EDTA y 10 g de SDS a 80 mL de agua estéril, mezclar, disolver y hacer el volumen final hasta 100 mL con agua estéril. Autoclave a 121 °C, 15 psi de presión, durante 30 min.
1 M Tris HCl Para preparar 100 mL de 1 M Tris, añadir 12,1 g de Tris HCl (peso molecular = 121,14 g) en 80 mL de agua. Mezclar Tris HCl agitando sobre un agitador magnético, ajustar el pH con NaOH a 8,8 y componer el volumen a 100 mL con agua estéril y autoclave a 121 °C, 15 psi de presión, durante 30 min.
0,5 M EDTA (Etilendiamina tetraaceticacid) Para preparar 100 mL de 0,5 M EDTA añadir 18,6 g de EDTA en 70 mL de agua. Ajuste el pH a 8.0 (EDTA se disuelve completamente a pH 8.0) usando pellets de hidróxido de sodio y ensaje el volumen a 100 mL. Autoclave la solución a 121 °C, 15 psi de presión, durante 30 min.
3 N Ácido clorhídrico (HCL) Para preparar 100 mL de 3 N HCl, añadir 26 mL de HCL concentrado a 74 mL de agua estéril.
Hidróxido de sodio del 4% (NaOH) Preparar 1 N solución de hidróxido de sodio, añadir 4 g de hidróxido de sodio en 90 mL de agua estéril, disolver, componer el volumen a 100 mL y autoclave a 121 °C, 15 psi de presión, durante 30 min.

Tabla 1: Preparación de las soluciones utilizadas en el protocolo. Tabla que muestra la preparación de las diferentes soluciones utilizadas en el protocolo.

Tabla 2: Curva estándar de lignina preparada de 0,5 mg a 3,5 mg de lignina de bambú industrial. Gráfico disperso con línea de regresión que muestra los valores m y c. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Plantilla de lignina utilizada para el cálculo del contenido desconocido de lignina utilizando lecturas de absorbancia de muestras a 280 nm (como x) y valores de línea de regresión de curva estándar 'm' y 'c' de la curva estándar. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 4: Contenido de lignina de diferentes tejidos (raíz, tallo y hojas) de la planta de algodón en la etapa posterior a la floración. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

La lignina desempeña un papel importante en el crecimiento y desarrollo de las plantas y recientemente ha sido ampliamente estudiada para aplicaciones de biocombustibles, bioenergía y bioproductos. La lignina es rica en compuestos aromáticos que se almacenan en todas las paredes celulares secundarias de las plantas vasculares. Tiene varias aplicaciones industriales como productos de paneles de madera, biodisponantes, floculantes, espumas de poliuretano y en resinas de placas de circuitos29,30,31. La mayor parte de la lignina generada a partir de las industrias del papel y la celulosa se libera como residuo o se quema para la producción de calor. Por lo tanto, si se procesa de manera eficiente, la lignina puede utilizarse como alternativa tanto a los productos a base de combustibles fósiles32,33 como a la producción de bioelectricidad34. Por lo tanto, la estimación precisa del contenido y la composición de lignina son fundamentales para aplicaciones industriales, ya que la composición varía según la especie vegetal, así como el tipo de órgano de la planta. La principal limitación para la estimación de lignina es la diferencia derivada del método seleccionado para la estimación del contenido de lignina35. Las diferencias de estimación entre los diferentes métodos se deben principalmente a la contaminación con otros componentes no lignínicos, la variación en la solubilidad, la adición de nuevos grupos a la lignina, la degradación/contaminación del xilano, los cambios estructurales nativos y la pérdida de alguna fracción de lignina durante la eliminación de otros componentes. Además, la mayoría de los protocolos de lignina se desarrollan originalmente sobre la base de la química de la madera27. Por lo tanto, existe una necesidad crítica de establecer protocolos de lignina para muestras herbáceas a medida que más especies de cultivos / plantas son el objetivo de biocombustibles y bioproductos. El método TGA estima el contenido de lignina pura basándose en la unión específica con TGA. Por lo tanto, la estimación de lignina por TGA produce un menor contenido de lignina en comparación con los métodos de Klason y bromuro deacetilo 35,36. Esto se debe a la unión específica de lignina con TGA, así como a la pérdida de cierto contenido de lignina durante la precipitación de lignina (parte insoluble).

El contenido de lignina estimado mediante el método TGA es reproducible y consistente. Los resultados obtenidos en este estudio fueron consistentes entre las réplicas biológicas y mostraron una diferencia significativa entre dos líneas, sugiriendo la fiabilidad del método TGA para la estimación de lignina. Para la reproducibilidad de los datos y la estimación precisa del contenido de lignina, es importante seguir los pasos y tomar las siguientes precauciones. La inclusión de controles positivos en diferentes concentraciones, que van desde 0,5 mg a 5 mg en tres réplicas, y su procesamiento junto con muestras de la etapa TGA evitará errores experimentales y dará lugar a una estimación precisa del contenido de lignina. La curva estándar debe generarse para cada conjunto de muestras y el estadístico de línea de regresiónR2 debe caer en el rango de 97% a 99%. El peso exacto del tubo vacío y del tejido extraído de metanol seco es fundamental para la estimación exacta del contenido de lignina. Además, diversos factores como la etapa específica de las plantas, las condiciones de crecimiento, los genotipos, el tipo de tejido y la edad de la planta afectarán el contenido de lignina30,37,38. Por lo tanto, es importante cultivar todas las líneas experimentales en el mismo ambiente y cosechar el mismo tipo de tejidos al mismo tiempo. Los resultados del estudio actual mostraron una tendencia esperada de menor contenido de lignina en las hojas, mayor contenido de lignina en tallos y raíces, y demostraron la aplicabilidad de este método a varios tejidos vegetales. Además, menos variación entre las réplicas biológicas sugirió que TGA puede estimar el contenido de lignina reproducible en todos los tejidos de las plantas.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

Acknowledgments

Agradecemos al Departamento de Plant &Soil Science y Cotton Inc. por su apoyo parcial a este estudio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioSpectrophotometer kinetic Eppendorf kinetic 6136000010 For measuring absorbance at 280 nm
Centrifuge Eppendorf 5424 For centrifuging  samples
Commercial bamboo lignin Aldrich 1002171289 Used in the preparation of the standard curve
Distilled water Fischer Scientific 16690382 Used in the protocol
Falcon tubes VWR 734-0448 Containers for solutions
Freezer mill Spex Sample Prep 68-701-15 For fine grinding of plant tissue samples
Heat block/ Thermal mixer Eppendorf 13527550 For temperature controlled steps during lignin extraction
Hotplate stirrer Walter WP1007-HS Used for preparation of solutions
Hydrochloric acid (HCL) Sigma 221677 Used in the protocol
Incubator Fisherbrand 150152633 For thorough drying of plant tissue samples
Measuring scale Mettler toledo 30243386 For measuring plant tissue weight, standards and microfuge tubes
Methanol (100 %) Fischer Scientific 67-56-1 Used in the protocol
Microfuge tubes (2 mL) Microcentrifuge Z628034-500EA Containers for extraction of lignin
Plant biomass gerinder Hanchen Amazon Used for crushing dried samples
pH meter Fisher Scientific AE150 Measuring pH for solutions prepared for lignin extraction
Temperature controlled incubator/oven Fisher Scientific 15-015-2633 Used in the protocol
Thioglycolic acid (TGA) Sigma Aldrich 68-11-1 Used in the protocol
Vacuum dryer Eppendorf 22820001 Used for drying samples
Vortex mixer Eppendorf 3340001 For proper mixing of samples

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Bioquímica Número 173 Lignina monolignoles Ácido tioglicólico
Estimación del contenido de lignina de biomasa vegetal utilizando ácido tioglicólico (TGA)
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Dampanaboina, L., Yuan, N., Mendu, V. Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA). J. Vis. Exp. (173), e62055, doi:10.3791/62055 (2021).

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