Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

الأيض الكمي من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي الترادفي

Published: January 5, 2021 doi: 10.3791/62061
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biology, Concordia University, 2Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Concordia University

Summary

نقدم بروتوكول لتحديد وكمية الفئات الرئيسية من الأيض للذوبان في الماء في الخميرة Saccharomyces cerevisiae. الطريقة الموصوفة متعددة الاستخدامات وقوية وحساسة. فإنه يسمح فصل ايزومرات الهيكلية وأشكال ستيريويسوميريك من الأيض للذوبان في الماء من بعضها البعض.

Abstract

الأيض هو منهجية تستخدم لتحديد وتحديد كمي من العديد من وسيطات الوزن الجزيئي المنخفض ومنتجات التمثيل الغذائي داخل الخلية أو الأنسجة أو الأعضاء أو السوائل البيولوجية أو الكائن الحي. يركز الميتابوميك تقليديا على الأيض القابل للذوبان في الماء. المستقلب القابل للذوبان في الماء هو المنتج النهائي لشبكة خلوية معقدة تدمج مختلف العوامل الجينومية، الجينومية، النسخية، البروتيومية، والبيئية. وبالتالي، فإن التحليل الأيضي يقيم مباشرة نتيجة العمل لجميع هذه العوامل في عدد كبير من العمليات البيولوجية داخل الكائنات الحية المختلفة. واحدة من هذه الكائنات الحية هي الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae، وهو eukaryote أحادي الخلية مع الجينوم تسلسل كامل. لأن S. cerevisiae قابلة للتحليلات الجزيئية الشاملة ، يتم استخدامه كنموذج لتشريح الآليات الكامنة وراء العديد من العمليات البيولوجية داخل الخلية eukaryotic. ومن شأن اتباع طريقة تحليلية متعددة الاستخدامات للتقييم الكمي القوي والحساس والدقيق للميبولوم القابل للذوبان في الماء أن يوفر المنهجية الأساسية لتشريح هذه الآليات. هنا نقدم بروتوكولا للظروف الأمثل من النشاط الأيضي في إرواء واستخراج المستقلب للذوبان في الماء من خلايا S. cerevisiae. ويصف البروتوكول أيضا استخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب (LC-MS/MS) للتحليل الكمي للميثابات المستخلصة القابلة للذوبان في الماء. طريقة LC-MS/MS من الأيض غير المستهدفة الموصوفة هنا متعددة الاستخدامات وقوية. وهو يتيح تحديد وتحديد كمي لأكثر من 370 المستقلبات القابلة للذوبان في الماء مع خصائص هيكلية ومادية وكيميائية متنوعة، بما في ذلك إيزومرات هيكلية مختلفة وأشكال ستيريويسوميريك من هذه الأيضات. وتشمل هذه الأيض جزيئات مختلفة الناقل الطاقة, النيوكليوتيدات, الأحماض الأمينية, السكريات الأحادية, وسيطة من انحلال الجليكوليسيس, ووسيطة دورة tricarboxylic. طريقة LC-MS/MS من الأيض غير المستهدفة حساسة وتسمح بتحديد وكمية بعض الأيضات القابلة للذوبان في الماء بتركيزات منخفضة يصل إلى 0.05 pmol/μL. وقد استخدمت هذه الطريقة بنجاح لتقييم الأيض للذوبان في الماء من خلايا الخميرة البرية من نوع ومتحولة المستزرعة في ظل ظروف مختلفة.

Introduction

الأيضات القابلة للذوبان في الماء هي وسيطة منخفضة الوزن الجزيئي ومنتجات التمثيل الغذائي التي تساهم في العمليات الخلوية الأساسية. وتشمل هذه العمليات المحفوظة تطوريا تحويل المواد الغذائية إلى طاقة قابلة للاستخدام، وتركيب الجزيئات الكبيرة، والنمو الخلوي والإشارات، والسيطرة على دورة الخلية، وتنظيم التعبير الجيني، والاستجابة للإجهاد، وتنظيم ما بعد الترجمة من التمثيل الغذائي، والحفاظ على وظائف الميتوكوندريا، والاتجار الخلوي المركبات، autophagy، الشيخوخة الخلوية، وتنظيم موت الخلية1،2،3.

وقد تم اكتشاف العديد من هذه الأدوار الأساسية من الأيض للذوبان في الماء من قبل الدراسات في الخميرة الناشئة S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. هذا eukaryote أحادي الخلية هو كائن نموذجي مفيد لتشريح الآليات التي من خلالها الأيض القابل للذوبان في الماء تساهم في العمليات الخلوية بسبب قابليتها للالمتقدمة البيوكيميائية والوراثية والجزيئية التحليلات البيولوجية23،24،25،26. على الرغم من أن أساليب LC-MS/MS من الأيض غير المستهدفة قد استخدمت لدراسة أدوار الأيض القابل للذوبان في الماء في الخميرة الناشئة3،18،22،27، يتطلب هذا النوع من التحليل تحسين براعة ، متانة ، حساسية ، والقدرة على التمييز بين مختلف الايزومرات الهيكلية والأشكال المجسمة لهذه الأيضات.

وتتميز السنوات الأخيرة من التقدم الكبير في تطبيق أساليب LC-MS/MS من الأيض غير المستهدفة إلى التنميط من الأيض للذوبان في الماء في الجسم الحي. ومع ذلك، لا تزال العديد من التحديات في استخدام هذه المنهجية2،28،29،30،31،32،33،34،35،36. وتشمل هذه التحديات ما يلي: أولا، تركيزات داخل الخلايا من العديد من الأيضات القابلة للذوبان في الماء هي أقل من عتبة الحساسية للطرق المستخدمة حاليا. ثانيا، كفاءة إرواء النشاط الأيضي منخفضة جدا، ومدى تسرب الخلايا المرتبطة بإرواء الأيض داخل الخلايا مرتفع جدا بالنسبة للطرق الحالية؛ وبالتالي، فإن الأساليب المستخدمة حاليا أقل تقدير تركيزات داخل الخلايا من الأيض للذوبان في الماء. ثالثا، لا يمكن للأساليب القائمة أن تميز بين الأيزومرات الهيكلية (أي الجزيئات ذات الصيغة الكيميائية نفسها ولكن الاتصال الذري المختلف) أو الجسيمات المجسمة (أي الجزيئات ذات الصيغة الكيميائية نفسها والاتصال الذري، ولكن مع الترتيب الذري المختلف في الفضاء) لمييضات محددة؛ وهذا يمنع التعليق التوضيحي الصحيح لبعض الأيضات بالطرق المستخدمة حاليا. رابعا، إن قواعد البيانات الطيفية الكتلية الموجودة على الإنترنت للتوابع الأصلية (MS1) والأيونات الثانوية (MS2) غير مكتملة؛ وهذا يؤثر على تحديد الصحيح والكمية من الأيض محددة باستخدام البيانات الخام LC-MS / MS المنتجة بمساعدة الأساليب الحالية. خامسا، لا يمكن استخدام الطرق القائمة نوع واحد من استخراج المستقلب لاسترداد جميع أو معظم فئات الأيض للذوبان في الماء. سادسا، لا يمكن استخدام الطرق الموجودة نوع واحد من العمود LC لفصل عن بعضها البعض جميع أو معظم فئات الأيض للذوبان في الماء.

هنا، ونحن الأمثل الظروف لإرواء النشاط الأيضي داخل خلايا S. cerevisiae، والحفاظ على معظم الأيض للذوبان في الماء داخل هذه الخلايا قبل الاستخراج، واستخراج معظم فئات الأيض للذوبان في الماء من خلايا الخميرة. طورنا طريقة متعددة الاستخدامات وقوية وحساسة لتحديد وتحديد كمية أكثر من 370 استقلاب قابل للذوبان في الماء مستخرج من خلايا S. cerevisiae. هذه الطريقة من الأيض غير المستهدفة تمكن من تقييم تركيزات داخل الخلايا من جزيئات الناقل الطاقة المختلفة, النيوكليوتيدات, الأحماض الأمينية, السكريات الأحادية, وسيطة من انحلال الجليكوليسيس, ووسيطة دورة tricarboxylic. تسمح طريقة LC-MS/MS المطورة بتحديد وتحديد كمي لمختلف الأيزومرات الهيكلية والأشكال المجسمة من الأيضات القابلة للذوبان في الماء ذات الخصائص الهيكلية والفيزيائية والكيميائية المتنوعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. صنع وتعقيم وسيلة لزراعة الخميرة

  1. جعل 180 مل من استخراج الخميرة كاملة مع bactopeptone (YP) المتوسطة. المتوسطة كاملة YP يحتوي على 1٪ (ث / الخامس) استخراج الخميرة و 2٪ (ث / الخامس) bactopeptone.
  2. توزيع 180 مل من المتوسط YP بالتساوي في أربع قوارير Erlenmeyer 250 مل. كل من هذه القوارير يحتوي على 45 مل من المتوسط YP.
  3. تعقيم قوارير مع المتوسطة YP عن طريق الالاستعباد التلقائي في 15 psi/121 °C لمدة 45 دقيقة.

2. سلالة الخميرة البرية من نوع

  1. استخدام BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) سلالة.

3. الخميرة المتنامية في المتوسط YP تحتوي على الجلوكوز 2٪

  1. تعقيم محلول مخزون 20٪ (ث / v) من الجلوكوز عن طريق الالاستعباد التلقائي في 15 psi/121 °C لمدة 45 دقيقة.
  2. إضافة 5 مل من محلول الأسهم autoclaved 20٪ (ث / v) من الجلوكوز إلى كل من قوارير Erlenmeyer اثنين مع 45 مل من المتوسط YP المعقمة. نسبة السكر في التركيز النهائي في متوسط YP هي 2٪ (ث/v).
  3. استخدام حلقة الميكروبيولوجية لتطعيم خلايا الخميرة في كل من قوارير Erlenmeyer اثنين مع المتوسط YP التي تحتوي على الجلوكوز 2٪.
  4. تنمو خلايا الخميرة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية في شاكر التناوب تعيين في 200 دورة في الدقيقة.
  5. اتخاذ aliquot من ثقافة الخميرة. تحديد العدد الإجمالي لخلايا الخميرة لكل مل من الثقافة. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم.

4. نقل الخلية إلى الخلية وينمو في المتوسط YP مع الجلوكوز 2٪

  1. إضافة 5 مل من محلول الأسهم المعقم 20٪ (ث / v) من الجلوكوز إلى كل من قوارير Erlenmeyer المتبقية مع وسيط YP المعقم. التركيز النهائي للجلوكوز هو 2٪ (ث / v).
  2. نقل حجم ثقافة الخميرة بين عشية وضحاها في المتوسط YP مع الجلوكوز 2٪ الذي يحتوي على العدد الإجمالي لل5.0 × 107 خلايا في كل من قوارير Erlenmeyer اثنين مع المتوسطة YP التي تحتوي على الجلوكوز 2٪. استخدام ماصة معقمة لنقل الخلية.
  3. تنمو خلايا الخميرة لمدة 24 ساعة على الأقل (أو أكثر، إذا كانت التجربة تتطلب) في 30 درجة مئوية في شاكر التناوب تعيين في 200 دورة في الدقيقة.

5. صنع الكواشف، وإعداد المختبرات، وإعداد معدات لإرواء الخلايا

  1. إعداد ما يلي: 1) محلول إخماد (60٪ عالية الجودة (>99.9٪) الميثانول في 155 mM الأمونيوم بيكربونات (ABC) العازلة، درجة الحموضة = 8.0)؛ 2) حل ABC الجليد الباردة (درجة الحموضة = 8.0)؛ 3) ميزان الحرارة الرقمية قادرة على قياس ما يصل إلى -20 درجة مئوية؛ 4) 500 مل زجاجات الطرد المركزي الكبيرة؛ 5) جهاز طرد مركزي عالي السرعة مبرد مسبقا مع دوار مبرد مسبقا وزجاجات طرد مركزي مبردة مسبقا سعة 500 مل لهذا الدوار ، كل ذلك عند -5 درجة مئوية ؛ 6) أنابيب استخراج المستقلب (15 مل أنابيب الطرد المركزي الزجاج عالية السرعة مع قبعات مبطنة البوليتيترافلوروإيثيلين); و 7) الجليد الجاف.

6. خلية التبريد

  1. استخدام مقياس الدم لتحديد عدد خلايا الخميرة لكل مل من YP مع 2٪ ثقافة الجلوكوز.
  2. نقل حجم الثقافة في المتوسط YP مع 2٪ الجلوكوز الذي يحتوي على العدد الإجمالي لل5.0 × 108 خلايا في زجاجات الطرد المركزي 500 مل المبردة مسبقا.
  3. ملء بسرعة زجاجة الطرد المركزي التي تحتوي على خلايا تصل إلى حجم 200 مل مع محلول التبريد المخزنة في -20 درجة مئوية.
  4. طرد مركزي الزجاجات في جهاز طرد مركزي عالي السرعة في 11,325 x g لمدة 3 دقائق في -5 درجة مئوية.
  5. بسرعة وبحنان استرداد زجاجة من الطرد المركزي؛ فك بلطف الغطاء وإزالة supernatant دون إزعاج بيليه.
  6. إعادة إنفاق بيليه الخلية بسرعة في 10 مل من الجليد الباردة ABC العازلة ونقل التعليق إلى أنبوب الطرد المركزي الزجاج عالية السرعة 15 مل مع غطاء مبطن البوليتيترافلوروإيثيلين لاستخراج المستقلب.
  7. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي سريري في 3000 x g لمدة 3 دقائق عند 0 درجة مئوية.
  8. إزالة بسرعة supernatant ووضع أنبوب على الجليد الجاف لبدء استخراج المستقلب أو تخزين الأنبوب في -80 درجة مئوية حتى استخراج.

7. إعداد الكواشف، ومختبرات ومعدات لاستخراج المستقلب

  1. إعداد ما يلي: 1) الكلوروفورم LC-MS الصف؛ 2) LC-MS الصف الميثانول؛ 3) LC الصف نانو نقية المياه؛ 4) درجة LC-MS (ACN)؛ 5) الخرز الزجاجي (حمض غسلها، 425-600 ميكرومتر)؛ 6) دوامة مع طقم حامل أنبوب رغوة مع التجنيب؛ 7) 15 مل أنابيب الطرد المركزي الزجاج عالية السرعة مع قبعات مبطنة البوليتيترافلوروإيثيلين؛ 8) قوارير MS؛ 9) الجليد الجاف؛ و 10) أنابيب 1.5 مل غسلها مرة واحدة مع الإيثانول، مرة واحدة مع ACN ومرة واحدة مع نانو نقية المياه.
    ملاحظة: استخدم فقط نصائح micropipette والأنابيب المصنوعة من البولي بروبلين المقاوم للمذيبات العضوية.

8. استخراج ميتابوليت

  1. إلى الأيض أبقى على الجليد الجاف أو المخزنة في أنبوب -80 درجة مئوية من الخطوة 6.7، إضافة ما يلي: 1) 2 مل من الكلوروفورم المخزنة في -20 درجة مئوية؛ 20 درجة مئوية؛ 20 درجة مئوية؛ 20 درجة مئوية؛ 20 درجة مئوية؛ 20 درجة مئوية؛ 20 درجة مئوية؛ 20 درجة مئوية؛ 20 درجة مئوية؛ 20 درجة مئوية؛ 2 مل من الكلوروفورم. 2) 1 مل من الميثانول المخزنة في -20 درجة مئوية؛ 3) 1 مل من الجليد الباردة نانو نقية المياه؛ و 4) 200 ميكرولتر من حبات الزجاج المغسولة بالأحماض 425-600 ميكرومتر.
  2. تغطية وإغلاق فم أنبوب مع رقائق الألومنيوم. ضع أنابيب في طقم حامل أنبوب رغوي مع التجنيب ودوامة لهم لمدة 30 دقيقة بسرعة متوسطة (أي في سرعة التي يتم تعيينها في 6، مع 12 كونها السرعة القصوى للدوامة) في 4 درجة مئوية لتسهيل استخراج المستقلب.
  3. احتضان أنبوب لمدة 15 دقيقة على الجليد (وليس الجليد الجاف!) لتعزيز هطول الأمطار البروتين وفصل المائية العليا من المرحلة العضوية السفلى.
  4. طرد مركزي الأنبوب في جهاز طرد مركزي سريري في 3000 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجة مئوية. تسمح خطوة الطرد المركزي هذه بفصل المرحلة المائية العليا (التي تحتوي على نواتج الأيض القابلة للذوبان في الماء) عن الطبقة الوسطى (التي تحتوي على حطام الخلايا والبروتينات) ومن المرحلة العضوية السفلية (التي تحتوي في الغالب على الدهون).
  5. استخدم ميكروباينيت لنقل المرحلة المائية العليا (400 ميكرولتر) إلى أنبوب مغسول ومسمي 1.5 مل يحتوي على 800 ميكرولتر من ACN تم تخزينه عند -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: سيكون هناك هطول الأمطار سحابة بيضاء بعد إضافة المرحلة المائية العليا إلى ACN أبقى في -20 درجة مئوية.
  6. طرد مركزي أنبوب مع العينة في جهاز الطرد المركزي الطاولة في 13400 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: سوف تختفي هطول الأمطار سحابة بيضاء بعد الطرد المركزي.
  7. نقل 800 ميكرولتر من الجزء العلوي من السائل في الأنبوب إلى قارورة MS المسماة. تخزين العينة عند 0 درجة مئوية حتى يتم تحليلها بواسطة LC-MS/MS.

9. إعداد الكواشف، ومختبرات، ومعدات لLC

  1. إعداد ما يلي: 1) دوامة؛ 1) دوامة؛ 1) دوامة؛ 1) دوامة؛ 1) دوامة؛ 1) دوامة؛ 1) دوامة 2) سونيكاتور بالموجات فوق الصوتية؛ 3) MS الزجاج قارورة؛ 4) نظام LC مجهزة مضخة ثنائية، ديجاسر، وautautsampler؛ 5) عمود كروماتوغرافيا المرحلة zwitterionic (5 ميكرومتر البوليمر، 150 × 2.1 ملم) اسمه في جدول المواد؛ 6) سخان العمود؛ و7) مراحل متنقلة، بما في ذلك المرحلة A (5:95 ACN: المياه (v/v) مع خلات الأمونيوم 20 mM، درجة الحموضة = 8.0) والمرحلة B (ACN 100٪).

10. فصل الأيض المستخرج من LC

  1. إخضاع محتوى قارورة MS إلى سونيكيشن بالموجات فوق الصوتية لمدة 15 دقيقة.
  2. دوامة قارورة MS 3x لمدة 10 ثوان في درجة حرارة الغرفة (RT).
  3. ضع قارورة التصلب المتعدد في لوحة البئر.
  4. أثناء التصوير اللوني، حافظ على العمود عند 45 درجة مئوية ومعدل تدفق 0.250 مل/دقيقة. احتفظ بالعينة في لوحة البئر عند 0 درجة مئوية. راجع الجدول 1 للتدرجات LC التي تحتاج إلى استخدام أثناء الكروماتوغرافيا.
    ملاحظة: يظهر في الشكل 1رسم لوني أيوني إجمالي تمثيلي للمثيلات القابلة للذوبان في الماء التي تم استخراجها من خلايا السلالة البرية BY4742. تم تحديد الأيضات التي فصلها LC وقياسها كميا من خلال التحليل الطيفي الكتلي الذي تم إجراؤه في وضع التأين الإيجابي [ESI (+)] ، كما هو موضح للخطوة 11.

11. التحليل الطيفي الشامل من الأيض مفصولة LC

  1. استخدم مطياف كتلة مجهز بتأين الرذاذ الكهربائي الساخن (HESI) لتحديد وكمية الأيضات القابلة للذوبان في الماء التي تم فصلها بواسطة LC. استخدم محلل مطياف الكتلة لأيونات MS1 وكاشف مطياف الكتلة لأيونات MS2. استخدم الإعدادات المتوفرة في الجدول 2 والجدول 3 للحصول على أيونات MS1 وMS2 المعتمدة على البيانات على التوالي.
  2. استخدم حجم عينة من 10 ميكرولتر للحقن في وضعي ESI (+) وESI (-).

12. تحديد وكمية من الأيض المختلفة عن طريق معالجة البيانات الخام من LC-MS/MS

  1. استخدام البرنامج المسمى في جدول المواد لإجراء تحديد وكمية من الأيضات القابلة للذوبان في الماء مختلفة من ملفات LC-MS/MS الخام. يستخدم هذا البرنامج MS1 لكمية المستقلب وMS2 لتحديد المستقلب. يستغل البرنامج مكتبة التجزئة الطيفية الطيفية الشاملة الأكثر تنسيقا لشرح المستقلبات باستخدام البيانات الخام LC-MS/MS من خلال مطابقة أطياف MS. يستخدم هذا البرنامج أيضا الكتلة الدقيقة ل MS1 ومطابقة نمط النظائر لشرح الأيض باستخدام قواعد البيانات عبر الإنترنت. انظر الشكل 2 للاطلاع على التفاصيل.
  2. استخدام مكتبة قواعد البيانات والأطياف، والتي تتوفر بحرية على الانترنت (https://www.mzcloud.org)، للبحث عن أطياف MS2 من البيانات الخام.

13. فحص سلامة الغشاء بواسطة البروبيديوم يوديد (PI) تلطيخ ومجهر مضان

  1. بعد إخماد الخلية تنفيذها كما هو موضح للخطوة 6، غسل الخلايا المروية جيدا مع 15 مل من العازلة ABC لإزالة محلول التبريد. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 3000 × غرام لمدة 5 دقائق في 0 درجة مئوية.
  2. Resuspend بيليه الخلية في 1 مل من العازلة ABC وإضافة 0.5 مل من الحل PI (0.5 ملغ / مل).
  3. دوامة أنبوب مع عينة 3x لمدة 10 ق واحتضانه لمدة 10 دقيقة في الظلام وعلى الجليد.
  4. طرد مركزي أنبوب مع العينة في جهاز الطرد المركزي الطاولة في 13400 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  5. إزالة supernatant وإعادة إنفاق بيليه في 1 مل من العازلة ABC.
  6. طرد مركزي أنبوب في 13400 س غ لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية وإزالة supernatant. كرر هذه الخطوة 2 مرات أخرى لإزالة PI منضم إلى سطح الخلية.
  7. Resuspend بيليه في 300 ميكرولتر من العازلة ABC. ضع 10 ميكرولتر من التعليق على سطح شريحة المجهر.
  8. التقط تباين التداخل التفاضلي (DIC) وصور المجهر الفلوري مع مجهر مضان. استخدم مرشح تم إعداده عند أطوال موجية من الإثارة والانبعاثات من 593 نانومتر و 636 نانومتر (على التوالي).
  9. استخدم برنامجا لحساب إجمالي عدد الخلايا (في وضع DIC) وعدد الخلايا الملونة الفلورية. أيضا، استخدم هذا البرنامج لتحديد كثافة تلطيخ للخلايا الفردية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لتحسين التقييم الكمي للنواتج الأيضية القابلة للذوبان في الماء داخل خلية الخميرة، قمنا بتحسين ظروف إخماد الخلايا للكشف عن المستقلب. خلية إرواء لهذا الغرض ينطوي على اعتقال سريع لجميع ردود الفعل الأنزيمية داخلالخلية 31،33،37،38. مثل هذا الاعتقال للنشاط الأيضي الخلوي هو خطوة أساسية لأي طريقة لكمية الأيضات القابلة للذوبان في الماء في الجسم الحي لأنه يمنع التقدير الناقص لتركيزاتها داخل الخلايا31،33،37،38. إخماد الخلايا لتقييم المستقلب يضعف دائما سلامة غشاء البلازما (PM) (وجدار الخلية (CW)، إذا كان موجودا)؛ وهذا يسبب تسرب المستقلب من الخلية31،33،37،38. تستخدم الطريقة ظروف إخماد الخلايا التي تقلل من هذا الضعف ، وبالتالي تقلل بشكل كبير من تسرب الخلايا المرتبطة بالتبريد من الأيض داخل الخلايا. والواقع أن معظم الطرق الحالية لإرواء الخلايا تنطوي على استخدام تركيز معين من الميثانول (أي، 40٪ (v/v)، 60٪ (v/v)، 80٪ (v/v)، أو 100٪ (v/v)) عند درجة حرارة محددة (أي -20 درجة مئوية، -40 درجة مئوية، أو -60 درجة مئوية)، مع أو بدون عازل31،33،37،38. قارنا كفاءة اضمحلال PM وCW لأحد أساليب إخماد الخلايا المستخدمة حاليا (أي، بواسطة معالجة الخلية مع 80٪ (v/v) الميثانول في -40 درجة مئوية في غياب العازلة38) إلى أن لطريقة إخماد الخلية المعدلة (أي عن طريق علاج الخلية مع 60٪ (v/v) الميثانول في -20 درجة مئوية في وجود محلول عازل متساوي التوتر من ABC في درجة الحموضة = 8.0). PI هو صبغة الفلورسنت التي هي غير منفذة للخلايا سليمة. فإنه يمكن أن تدخل الخلية إلا إذا كان سلامة رئيس الوزراء (والأسلحة الكيميائية، إذا كان موجودا) هو ضعف39. وعلاوة على ذلك، فإن كثافة انبعاثات الفلورية من قبل PI ترتفع بمقدار 30 ضعفا عندما يكون من المحتم أن الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي39. وهكذا، يمكن استخدام المقايسة تلطيخ PI لتقييم كفاءة تسرب الخلايا المرتبطة إرواء من الأيض داخل الخلايا لأن هذه الأيض يمكن أن تسرب إلى الفضاء خارج الخلية إلا إذا تضررت PM وCW من خلية الخميرة39. وجدنا أن طريقة إخماد الخلايا المعدلة تسبب ضررا أقل بكثير لرئيس الوزراء والأسلحة الكيميائية من طريقة إخماد عن طريق معالجة الخلايا مع غير المخزنة مؤقتا 80٪ (v/v) الميثانول في -40 درجة مئوية (الشكل 3). في الواقع، أظهرت جميع الخلايا تقريبا التي تعرضت لإرواء باستخدام الأسلوب انبعاث مضان أحمر، وهو سمة من سمات خلايا الخميرة التي PM و CW ليست معطوبة(الشكل 3). في المقابل، تقريبا جميع الخلايا التي تتعرض لإرواء باستخدام طريقة أخرى، عرض الانبعاثات الفلورية الخضراء مميزة للخلايا الخميرة التي PM و CW تضررت بشكل كبير(الشكل 3). تم تحويل الفلورية الحمراء الأكثر كثافة إلى مضان أخضر من خلال برنامج للتمييز بين الفلورسينس الأحمر القوي وانبعاثات الفلورية الحمراء الخفيفة.

تسبب أسلوب إخماد الخلايا المعدلة تسرب أقل بكثير من الأيضات القابلة للذوبان في الماء من خلايا الخميرة من طريقة - الإرواء عن طريق معالجة الخلايا مع الميثانول غير المخزنة 80٪ (v/v) في -40 درجة مئوية. أخضعنا أعدادا متساوية من خلايا الخميرة للإرواء باستخدام إما الطريقة (أي عن طريق معالجة الخلايا مع 60٪ (v/v) الميثانول في -20 درجة مئوية في وجود محلول عازل متساوي التوتر من ABC عند درجة الحموضة = 8.0؛ الشكل 4) أو الطريقة الأخرى (أي عن طريق معالجة الخلايا مع غير المخزنة مؤقتا 80٪ (v/v) الميثانول في -40 درجة مئوية؛ الشكل 5). تم تقييم مدى تسرب الخلايا المرتبطة بالتبريد إلى المحلول خارج الخلية لمييضات محددة قابلة للذوبان في الماء بمساعدة LC-MS/MS. تم قياس تركيزات فئات الأحماض الأمينية المختلفة (أي الأحماض الحمضية الكبيرة والصغيرة والأساسية والمحايدة وغير القطبية والأحماض الأمينية القطبية المحايدة) في المحلول خارج الخلية قبل وبعد إخماد الخلايا. وجدنا أن طريقة إخماد الخلايا تسبب تسرب أقل بكثير من كل هذه الطبقات من الأحماض الأمينية في محلول خارج الخلية(الشكل 4)من الطريقة الأخرى(الشكل 5).

تستخدم طريقة LC-MS/MS لإجراء تقييم كمي للم المستقلبات القابلة للذوبان في الماء داخل خلية الخميرة نوعا واحدا من العمود لفصل الكروماتوغرافي لجميع فئات المستقلب القابلة للذوبان في الماء. هذا العمود هو العمود المرحلة zwitterionic المسمى في جدول المواد. وجدنا أن هذا العمود يوفر فصل أكثر كفاءة بكثير من فئات مختلفة من الأيض للذوبان في الماء من العمود عكس المرحلة المذكورة في جدول المواد (الجدول التكميلي 1). في الواقع، كانت قيم التحول وقت الاستبقاء (RT) لمعايير المستقلب القابلة للذوبان في الماء (أي NAD+، AMP، GMP، أرجينين، وحمض الجلوتاميك) أقل بكثير وكانت أشكال الذروة أكثر حدة بشكل كبير لعمود المرحلة الزويرتيريونية، بالمقارنة مع عمود المرحلة العكسية(الجدول التكميلي 1). يتم توفير شروط LC المستخدمة لفصل الكروماتوغرافية لجميع الأيض (أي القابلة للذوبان في الماء وغير قابلة للذوبان في الماء) لعمود المرحلة العكسية في الجدول التكميلي 2.

ميزة أخرى لطريقة LC-MS/MS تتكون من قدرة الفصل اللوني على عمود المرحلة الزويرتيريونية أعلاه على الانفصال بكفاءة عن بعضها البعض المستقلبات المختلفة القابلة للذوبان في الماء ذات الخصائص الهيكلية والفيزيائية والكيميائية المتنوعة. وتشمل هذه الأيضات القابلة للذوبان في الماء فئات المستقلب التالية: 1) الحمضية, أساسي, محايد القطبية, والأحماض الأمينية القطبية غير محايدة, بما في ذلك ايزومرات الهيكلية المختلفة (الشكل 6); 2) النيوكليوتيدات مستقرة وغير مستقرة واشتقاقاتها التي تؤدي وظائف حيوية داخل الخلية (الشكل 7)؛ و 3) مختلف أحادية الشاريدات، بما في ذلك أشكالها المجسمة المختلفة(الشكل 8).

والأهم من ذلك، كانت طريقة LC-MS/MS لإجراء تقييم كمي للم المستقلبات القابلة للذوبان في الماء داخل خلية الخميرة متعددة الاستخدامات وقوية. سمح لنا لتحديد وتحديد كميا 374 الأيض للذوبان في الماء مع الخصائص الهيكلية والمادية والكيميائية المتنوعة في S. cerevisiae الخلايا التي كانت مثقفة في المتوسط YP كاملة تحتوي في البداية على 2٪ الجلوكوز (الجدول التكميلي 3). تم الكشف عن 240 المستقلبات في وضع التأين الإيجابي وتم الكشف عن 134 المستقلبات في وضع التأين السلبي. تم تأكيد هويات جميع هذه الأيضات القابلة للذوبان في الماء من خلال مطابقة شظايا MS2 المعتمدة على البيانات (DDA) التي تم الحصول عليها في أوضاع التأين الإيجابية والسلبية إلى المكتبة الطيفية MS2 mzCloud. تتضمن هذه المكتبة عبر الإنترنت أطياف معايير المستقلب التي تختلف في معلمات MS1 و DDA MS2 الخاصة بها. لتعظيم مدى مطابقة أطياف MS2 للعينة مع المكتبة الطيفية عبر الإنترنت ، استخدمنا معلمات DDA MS2 مختلفة. وترد هذه المعلمات في الجدول التكميلي 4. تم الحصول على ما يقرب من 6000 ميزة (المستقلبات المفترضة) لنفس العينة بمساعدة طريقة تجزئة التصادم الناجم عن الطاقة العالية أو الفصام الناجم عن الاصطدام (HCD) أو الانفصال الناجم عن الاصطدام (CID) ، باستخدام أعلى 5 أحداث MS2 ، و 35 قيمة طاقة تصادم ، و 10 أوقات تنشيط مللي ثانية. بعد تصفية الملفات الناتجة مع > مطابقة MS2 95٪ > 90٪ معايير مطابقة النمط النظيري MS1، تم تحديد 162 مستقلبات فقط تحت حالة مجزأة من HCD و 142 مستقلبات تحت شرط مجزأة CID. 81 من أصل 162 المستقلبات كانت فريدة من نوعها لطريقة تجزئة HCD، في حين أن 42 من أصل 142 كانت فريدة من نوعها لطريقة تجزئة CID (انظر ورقة تسمى "T5_35E__10 ms_HCD مقابل CID" في الجدول التكميلي 4). لذلك، خلصنا إلى أن التعليق التوضيحي الصحيح من الأيضات القابلة للذوبان في الماء بمساعدة طريقة LC-MS/MS يتطلب استخدام العديد من معلمات DDA MS2 المختلفة.

أسلوب LC-MS/MS حساس للغاية أيضا. فهو يسمح بتحديد وكمية بعض الأيضات القابلة للذوبان في الماء بتركيزات منخفضة يصل إلى 0.05 pmol/μL (انظر بيانات الفينيلالانين في الجدول 4). ويختلف هذا الحد من الكمية ضمن مجموعة واسعة من التركيزات لمختلف فئات المستقلب(الجدول 4).

نظام التصلب المتعدد المستخدمة هنا لديها واسعة (على الأقل أمرين من حجم) مجموعة ديناميكية خطية لقياس تركيزات الأيض المختلفة(الجدول التكميلي 5).

Figure 1
الشكل 1:مجموع الكروماتوغرافيا الأيونية (TIC) من الكروماتوغرافيا السائلة / قياس الطيف الكتلي (LC-MS) بيانات الأيض القابل للذوبان في الماء التي تم استخراجها من خلايا سلالة البرية BY4742. تم فصل الأيض من قبل LC على العمود الكروماتوغرافيا المرحلة zwitterionic اسمه في جدول المواد. تم الكشف عن الأيض من قبل MS من الأيونات الأم (MS1) التي تم إنشاؤها باستخدام وضع تأين الرذاذ الكهربائي الإيجابي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2:سير عمل يستخدم لتحليل الأيضات القابلة للذوبان في الماء بمساعدة البرنامج المسمى في جدول المواد. تم تصحيح جميع المعلمات تلقائيا بواسطة البرنامج استنادا إلى البيانات الخام MS، باستثناء ما يلي: 1) علامة التبويب "الكشف عن المركبات": مجموعة دقيقة، ذروة كثافة 10،000؛ و 2) "البحث ChemSpider" علامة التبويب: تم اختيار 4 قواعد البيانات على الانترنت لتحديد الأيض, بما في ذلك BioCyc, قاعدة بيانات ميتابولوم الإنسان, KEGG, والخميرة ميتابولوم قاعدة البيانات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3:تباين التداخل التفاضلي (DIC؛ الصف العلوي) والصور الفلورية (الصف السفلي) المجهرية لخلايا الخميرة المروية إما بحاجز بيكربونات الأمونيوم (ABC) (الرقم الحموضة = 8.0؛ التحكم) أو بمحلول إخماد مختلف. بعد إخماد الخلايا ، تم احتضان أعداد متساوية من الخلايا مع محلول PI لمدة 10 دقائق في الظلام وعلى الجليد. تم تحويل الفلورية الحمراء الأكثر كثافة إلى مضان أخضر بواسطة برنامج للتمييز بين الفلورسينس الأحمر القوي وانبعاثات الفلورية الحمراء الخفيفة. تمت مقارنة كفاءة الضرر الذي لحق ب PM و CW لطريقة إخماد الخلايا (أي، بواسطة معالجة الخلية مع 60٪ (v/v) الميثانول في -20 درجة مئوية في وجود محلول عازل متساوي التوتر من ABC عند درجة الحموضة = 8.0) وواحدة من الطرق المستخدمة حاليا (أي عن طريق معالجة الخلية مع 80٪ (v/v) الميثانول في -40 درجة مئوية في غياب عازل). يظهر شريط مقياس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4:تعرضت نسبة تسرب فئات الأحماض الأمينية المختلفة لطريقة إخماد الخلايا. تم تقييم نسبة التسرب من فئات الأحماض الأمينية المختلفة باستخدام LC-MS/MS لقياس تركيزاتها في المحلول خارج الخلية قبل وبعد إخماد. يتم عرض متوسط القيم ± SD ونقاط البيانات الفردية (n = 3). * ص < 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5:تعرضت نسبة تسرب فئات الأحماض الأمينية المختلفة لإحدى طرق إخماد الخلايا المستخدمة حاليا. تم تقييم نسبة التسرب من فئات الأحماض الأمينية المختلفة باستخدام LC-MS/MS لقياس تركيزاتها في المحلول خارج الخلية قبل وبعد إخماد. يتم عرض متوسط القيم ± SD ونقاط البيانات الفردية (n = 3). * ص < 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6:فصل لوني فعال لفئات الأحماض الحمضية والأساسية والمحايدة والأحماض الأمينية القطبية غير المحايدة، بما في ذلك اثنين من الأيزومرات الهيكلية (أي الليوسين والإيزولوسين)، على عمود المرحلة الزويرتيريونية المسمى في جدول المواد. تم الكشف عن جميع هذه الأحماض الأمينية من قبل MS / MS في وضع التأين الإيجابي [ESI (+)]. شروط LC على العمود الكروماتوغرافي المرحلة zwitterionic موصوفة في الجدول 1. يتم وصف شروط MS/MS في الجدول 2 والجدول 3. يتم شراء جميع معايير الأحماض الأمينية تجاريا (على سبيل المثال، سيغما). التحولات الزمنية الاحتفاظ بين 3 أشواط الكروماتوغرافيا المستقلة هي أقل من ± 10 ثانية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7:الفصل الكروماتوغرافي الفعال لفئات مختلفة من النيوكليوتيدات، بما في ذلك النيوكليوتيدات غير المستقرة بنشاط (أحادي الفوسفات أحادي النيوكليوسيد، ثنائي فوسفات النيوكليوسيد، وثلاثي الفوسفات النووي) وجزيئات حاملة الإلكترون (NADH و NAD+)، على عمود المرحلة الزويديةالمسمى في جدول المواد. تم الكشف عن جميع هذه النيوكليوتيدات بواسطة MS/MS في وضع التأين الإيجابي [ESI (+)]. شروط LC على العمود الكروماتوغرافي المرحلة zwitterionic موصوفة في الجدول 1. يتم وصف شروط MS/MS في الجدول 2 والجدول 3. يتم شراء جميع معايير النيوكليوتيدات تجاريا (على سبيل المثال، سيغما). التحولات الزمنية الاحتفاظ بين 3 أشواط الكروماتوغرافيا المستقلة هي أقل من ± 10 ثانية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8:الفصل الكروماتوغرافي الفعال لفئات مختلفة من السكريات الأحادية، بما في ذلك الأيزومرات الهيكلية والأشكال المجسمة للaldo- وketohexoses (الفركتوز والمانوس والجالاكتوز)، والaldopentoses (الريبوز والأرابينوز)، على عمود المرحلة الزويديةالمسمى في جدول المواد. تم الكشف عن كل هذه السكريات الأحادية بواسطة MS/MS في وضع التأين الإيجابي [ESI (+)]. شروط LC على العمود الكروماتوغرافي المرحلة zwitterionic موصوفة في الجدول 1. يتم وصف شروط MS/MS في الجدول 2 والجدول 3. يتم شراء جميع معايير الشاريد الأحادي تجاريا (على سبيل المثال، سيغما). التحولات الزمنية الاحتفاظ بين 3 أشواط الكروماتوغرافيا المستقلة هي أقل من ± 10 ثانية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

نوع العمود SeQuant ZIC-pHILIC 5μm بوليمر 150 × 2.1 ملم
المذيبات A LC-MS الصف H2O: ACN (95:5، v/v) خلات الأمونيوم 20 mM
المذيب B LC-MS الصف أسيتونيتريل (ACN)
حد الضغط الحد الأقصى = 300 شريط الحد الأدنى = 0
برنامج تدرج HPLC
الوقت (دقائق) معدل التدفق (0.25 مل/دقيقة) التراكيب
A% B%
0.5 0.25 5 95
26 0.25 40 60
30 0.25 70 30
31 0.25 70 30
31.1 0.4 5 95
43.9 0.4 5 95
44 0.25 5 95
45 0.25 5 95

الجدول 1: حالة LC المستخدمة لفصل الأيضات القابلة للذوبان في الماء بمساعدة عمود المرحلة zwitterionicالمسمى في جدولالمواد. وقد استخدمت هذه الشروط في جميع التجارب الموصوفة هنا.

مجموعة كتلة المسح الكامل (دالتون) 70-900
FTMS (محلل أوربيراب) دقة المسح الكامل 6.0 × 104
FTMS (محلل المركبة المدارية) دقة HCD 7500
FTMS المسح الكامل هدف AGC 1.0 × 106
هدف FTMS MSn AGC 5.0 × 104
أيون فخ (LTQ) MSn AGC الهدف 1.0 × 104
نوع مصدر الأيونات تأين الرذاذ الكهربائي الساخن
درجة حرارة الشعرية (°C) 275
درجة حرارة سخان المصدر (°C) 250
غمد تدفق الغاز 10
تدفق غاز أوكس 5

الجدول 2: إعدادات مطياف الكتلة المستخدمة لتحليل الأيضات التي تم فصلها بواسطة LC. وقد استخدمت هذه الشروط لتحليل الأيض في جميع التجارب الموصوفة هنا. الاختصارات: FTMS = تحويل فورييه (FTMS)؛ HCD = التفكك الناجم عن الاصطدام الناجم عن الطاقة العالية؛ LTQ = فخ خطي رباعي; AGC = التحكم التلقائي في الكسب، قيمة مجموعة أيونات ل MS و MS/MS.

قطبية الصك موجب/سالب
نوع التنشيط CID/HCD
الحد الأدنى للإشارة المطلوبة 5000
عرض العزل 2
تطبيع طاقات التصادم ل CID 35, 60
تطبيع الطاقات الاصطدام لHCD 35, 45, 55
حالة الشحن الافتراضية 1
وقت التنشيط ل CID (ms) 10, 30
وقت التنشيط ل HCD (ms) 10
عدد أحداث MS/MS في CID أعلى 3، أعلى 5، أعلى 10
عدد أحداث MS/MS في HCD أفضل 5
عدد عمليات المسح المجهري المستخدمة في كل من HCD و CID 1

الجدول 3: إعدادات مطياف الكتلة المستخدمة للكشف عن الأيونات الثانوية (MS2). المختصرات: HCD = التفكك الناجم عن الاصطدام الناجم عن الطاقة العالية؛ CID = التفكك الناجم عن الاصطدام؛ مللي ثانية = ms.

ستيد ميتابوليتس م. و. (ز/ الخلد) [م+ح]+1 [م-ه]-1 وضع الكشف أقل تركيز تم اكتشافه (pmol/μL)
غليسين 75.03203 76.03931 74.02475 P 7.43E +00
تريبتوفان 204.08988 205.09716 203.0826 P 5.56E-02
فينيل ألانين 165.07898 166.08626 164.0717 P 5.14E-02
أرجينين 174.11168 175.11896 173.1044 P 7.14E-02
ثريونين* 119.05824 120.06552 118.05096 P
سيرين 105.04259 106.04987 104.03531 P 4.66E+00
الغلوتامات 147.05316 148.06044 146.04588 P 4.20E-01
ميثيونين 149.05105 150.05833 148.04377 P 1.96E+00
أسبارتات 133.03751 134.04479 132.03023 P 3.75E +00
فالين 117.07898 118.08626 116.0717 P 1.49E+00
اليسولوسين 131.09463 132.10191 130.08735 P 1.84E +00
لوسين 131.09463 132.10191 130.08735 P 2.26E +00
هيستيدين 155.06948 156.07676 154.0622 P 2.53E +00
التيروزين 181.07389 182.08117 180.06661 P 8.72E-02
ليسين 146.10553 147.11281 145.09825 P 1.43E-01
ألانين 89.04768 90.05496 88.0404 P 1.12E+00
برولين 115.06333 116.07061 114.05605 P 1.05E +00
السيستين 121.01975 122.02703 120.01247 P 8.22E-01
أسباراجين 132.05349 133.06077 131.04621 P 1.08E +00
الجلوتامين 146.06914 147.07642 145.06186 P 1.92E+00
جوانين 151.04941 152.05669 150.04213 P 5.47E +00
جوانوسين 283.09167 284.09895 282.08439 P 3.67E-01
GMP 363.058 364.06528 362.05072 P 7.17E-01
الناتج المحلي الاجمالي 443.02434 444.03162 442.01706 P 2.57E+00
GTP 522.99067 523.99795 521.98339 P 2.27E+00
امبير 347.06309 348.07037 346.05581 P 5.25E-01
شرطة أبوظبي 427.02942 428.0367 426.02214 P 1.32E +00
ATP 506.99575 508.00303 505.98847 P 1.77E +00
ناده 665.12478 666.13206 664.1175 P 1.47E +00
NAD+ 663.10912 664.1164 662.10184 P 3.03E +00
الجلوكوز** 180.06339 181.07067 179.05611
فركتوز*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 5.67E-01
مانوز*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 1.05E +00
غالاكتوز*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 9.00E-01
ريبوز*** 150.05283 151.06011 149.04555 N 1.10E+00
أرابينوس*** 150.05283 151.06011 149.04555 N 1.23E +00
الفركتوز-6-فوسفات*** 260.02972 261.037 259.02244 N 6.60E+00
الجلوكوز-6-فوسفات*** 260.02972 261.037 259.02244 N 4.27E +00
حمض الستريك 192.12 غرام 193.034279 191.019726 N 9.33E-01
حمض ماليك 134.09 135.0288 133.014247 N 1.23E +00
حمض بيروفيك 88.06 89.02332 87.008768 N 2.77E +00

الجدول 4:أدنى تركيزات مختلف معايير المستقلب القابلة للذوبان في الماء التي يمكن أن تحددها طريقة LC-MS/MS وكمية. تم استخدام منطقة الذروة MS1 من كل معيار المستقلب لتقدير أدنى تركيز قابل للقياس الكمي لهذا المستقلب. يتم عرض القيم المتوسطة من تجربتين مستقلتين. وأجريت ثلاث نسخ متماثلة تقنية لكل تجربة من التجربتين المستقلتين. ملاحظة: يمكن الكشف عن ثريونين * ولكن لا يمكن قياسها كميا بسبب الإلتواء المشترك مع الهوموسيرين ، وهو ايزومر كيميائي من الثريونين. الجلوكوز ** لا يمكن تحديدها لأنها تخلق قمم الكروماتوغرافيا متعددة. معايير الأيض *** يمكن تحديدها وكميتها فقط في عينات فردية, ولكن ليس في خليط من معايير المستقلب أو خليط بيولوجي من الأيض.

الجدول التكميلي 1: قيم التحول لوقت الاستبقاء (RT) لنفس المجموعة من الأيضات لأعمدة المرحلة الزويرتيريونية والطور العكسي (انظر جدول المواد) بعد توازن العمود. يقارن الجدول إمكانية إعادة إنتاج الاحتفاظ بأعمدة المرحلة الزويرتيرية والطور العكسي لمجموعة متميزة من الأيض تختلف عن بعضها البعض في الزهرية المائية ورهاب الماء. تم تحديد هذه الأيضات بمساعدة LC-MS/MS. لاحظ أن قيم تحول RT من الأيض المائي (أي NAD +، AMP، GMP، أرجينين، وحمض الجلوتاميك) أقل بكثير وأشكال الذروة أكثر حدة بكثير لعمود المرحلة zwitterionic، بالمقارنة مع عمود المرحلة العكسية. وعلى النقيض من ذلك، فإن قيم التحول RT من الأيض الكاره للماء (أي حمض الستيريك وحمض اللوريك وحمض ديكانويك) أقل بكثير والأشكال الذروة أكثر حدة بشكل كبير لعمود المرحلة العكسية، بالمقارنة مع عمود المرحلة zwitterionic. وترد تفاصيل شروط الفصل الكروماتوغرافي للم المستقلبات بمساعدة أعمدة المرحلة الزويرتيريونية وأعمدة المرحلة العكسية في الجدول 1 والجدول التكميلي 2على التوالي. تستند قيم التحول RT المبلغ عنها هنا إلى قياس 20 عينة مختلفة مأخوذة من قوارير مختلفة. تم تحليل العينات بعد توازن العمود. تم استخراج الأيض في كل عينة من 5.0 × 108 خلايا الخميرة. قيم التحول RT هي وسيلة من 20 عينات مختلفة (ن = 20). تم استخدام قيم p المشتقة من اختبار t غير المدفوع لمقارنة العمودين بالتباين المتساوي بين كلا النوعين من العينات. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول التكميلي 2: شروط LC لعمود المرحلة العكسية 8 المسمى في جدول المواد ويستخدم لفصل المستقلبات المختلفة في هذه الدراسة. خصائص العمود كانت كما يلي: 150 × 2.1 مم، 5 ميكرومتر بوليمر. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول التكميلي 3: قائمة بجميع الأيضات القابلة للذوبان في الماء البالغ عددها 374 التي تم استردادها والتعليق عليها باستخدام طريقة LC-MS/MS. تم استرداد جميع الأيضات من نفس تشغيل التدرج LC، تخضع لاقتناء البيانات تعتمد (DDA) خوارزمية التجزئة الموصوفة في الجدول التكميلي 4،وشروح باستخدام البرنامج المسمى في جدول المواد. كانت أشكال الذروة MS1 من 211 المستقلبات (التي يشار إلى حالتها في الجدول على أنها فارغة) مناسبة لاستخدامها في القياس الكمي ، وكان لأطياف MS2 الخاصة بها تطابقات كاملة مع المكتبة الطيفية mzCloud. وكان الأطياف MS2 من 38 الأيض (الذي يشار إلى حالته في الجدول ك د) مباريات كاملة مع المكتبة الطيفية على الانترنت. ومع ذلك ، فإن أشكال الذروة MS1 لم تكن مناسبة لاستخدامها في القياس الكمي. لم يكن لأطياف MS2 من 125 مستقلبات (يشار إلى حالتها في الجدول على أنها n) تطابقات كاملة مع المكتبة الطيفية عبر الإنترنت. وقد تم شرح هذه الأيضات على النحو التالي: 1) باستخدام "عقدة تكوين التنبؤ" (التي توضح الأيض على أساس المطابقة الدقيقة لقيم MS1، وعدد النظائر المتطابقة والمفتقدة، وكثافة النظائر المئوية المتطابقة مع تلك الخاصة بالمعايير المرجعية النظرية)؛ 2) باستخدام "عقدة ChemSpider" (التي توضح الأيض استنادا إلى المطابقة الدقيقة لقيم MS1 ودرجة تطابق تشابه أطياف MS2 مع المكتبة الطيفية عبر الإنترنت)؛ و 3) باستخدام الوقت الاحتفاظ (RT) التحول قيم الأيض (هذه القيم تعتمد على التركيب الفيزيائي والخصائص الكيميائية من الأيض). تم العثور على الأيض المدرجة في الجدول في جميع النسخ المتماثلة البيولوجية 3 القيام بها، مع قيم التحول RT من < 0.2 دقيقة. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول التكميلي 4: خوارزمية تجزئة اقتناء تعتمد على البيانات (DDA) تم استخدامها هنا للتعليق التوضيحي للم المستقلبات القابلة للذوبان في الماء بمساعدة البرنامج المسمى في جدول المواد.

الجدول التكميلي 5: نطاق ديناميكي خطي نموذجي لاحظناه عندما قمنا بقياس تركيزات الأحماض الأمينية المختلفة بمساعدة نظام التصلب المتعدد المسمى في جدول المواد. نظام التصلب المتعدد المستخدمة هنا لديها واسعة (على الأقل أمرين من حجم) مجموعة ديناميكية خطية لقياس تركيزات الأيض المختلفة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لاستخدام البروتوكول الموضح هنا بنجاح، اتبع التدابير الوقائية الموضحة أدناه. الكلوروفورم والميثانول استخراج مواد مختلفة من البلاستيك المختبري. لذلك، التعامل معها بحذر. تجنب استخدام البلاستيك في الخطوات التي تنطوي على الاتصال مع أي من هذه المذيبات العضوية اثنين. استخدام ماصة الزجاج borosilicate لهذه الخطوات. ارتفاع هذه المواسير مع الكلوروفورم والميثانول قبل الاستخدام. استخدام نصائح micropipette فقط والأنابيب المصنوعة من البولي بروبلين التي تقاوم المذيبات العضوية. أثناء إعداد العينة ل LC-MS/MS، قم بإزالة جميع فقاعات الهواء في قوارير الزجاج قبل إدخالها في لوحة بئر.

يتطلب عمود المرحلة zwitterionic المستخدم هنا إعادة تكييف واسعة النطاق بعد كل تشغيل لتقليل إزاحة RT. لإعادة تكييف العمود، نوصي باستخدام وحدة تخزين حل إعادة تكييف حوالي 20 وحدة تخزين العمود. يجب إعادة تكييف العمود مع المرحلة الأولى من التنقل لمدة 15 دقيقة بمعدل تدفق متزايد قدره 0.4 مل / دقيقة. لتجنب أي ضرر للعمود أثناء إعادة تكييفه، حافظ على ضغط العمود تحت الحد الأعلى للضغط الذي أوصت به الشركة المصنعة.

وتجدر الإشارة إلى أن بعض الأعمدة الكروماتوغرافية المختلطة الفصل التي تعمل في وضع المرحلة العكسية تسمح بحل الأيض المشحون40و41. تستند هذه الأعمدة المختلطة الفصل على العمود عكس المرحلة المستخدمة هنا (انظر جدول المواد)وتحتوي على مجموعات مدمجة القطبية التي يمكن فصل الأيض على أساستهمة 40،41.

هنا، وصفنا طريقة LC-MS/MS المستندة إلى الأيض غير المستهدف للتحليل الكمي للعديد من الأيضات القابلة للذوبان في الماء المستخرجة من خلايا الخميرة. توفر هذه الطريقة العديد من المزايا على أساليب LC-MS/MS لعلم الأيض غير المستهدف المستخدم حاليا لهذا الغرض. وتشمل هذه المزايا ما يلي. أولا، الطريقة حساسة وتسمح بتحديد وكمية بعض الأيضات القابلة للذوبان في الماء بتركيزات منخفضة يصل إلى 0.05 pmol/μL. الحساسية المبلغ عنها من أساليب LC-MS/MS الموجودة هي أقلمن 3و22و27و42. ثانيا، يستخدم الأسلوب إجراء إخماد الخلايا التي تثير تسرب أقل بكثير من الأيض داخل الخلايا من الخلية من تلك المبلغ عنها للإجراءات المستخدمة حاليا31،33،38. وبالتالي، فإن الإجراء الذي قمنا بتطويره لإرواء الخلايا يقلل من مدى تقليل الإجراءات المستخدمة حاليا من تقدير التركيزات داخل الخلايا من الأيضات القابلة للذوبان في الماء. ثالثا، على عكس أساليب LC-MS/MS الموجودة2و31و33،تميز الطريقة بين الأيزومرات الهيكلية المختلفة والأشكال المجسمة للعديد من الأيضات. وتشمل هذه الأيض جزيئات مختلفة الناقل الطاقة, النيوكليوتيدات, الأحماض الأمينية, السكريات الأحادية, وسيطة من انحلال الجليكوليسيس, ووسيطة دورة tricarboxylic. رابعا، استخدمنا هذه الطريقة لإنشاء قاعدة بيانات طيفية واسعة النطاق للكتلة MS1 و MS2 لتحديد وكمية مجموعة واسعة من الأيضات المحددة باستخدام بيانات LC-MS/MS الخام. في المقابل، قواعد البيانات الطيفية الكتلية الموجودة على الإنترنت من MS1 و MS2 غير مكتملة43،44،45. خامسا، تستخدم الطريقة نوعا واحدا من استخراج المستقلب لاستعادة الأيضات القابلة للذوبان في الماء ذات الخصائص الهيكلية والفيزيائية والكيميائية المتنوعة. هذه الأيض 'التنوع يتجاوز بكثير من الطرق البديلة لاستخراج خطوة واحدة من الأيض للذوبان في الماء من خلايا الخميرة3,22,27,46. ستة، على عكس أساليب LC-MS/MS الموجودة3،22،47،48، تستخدم الطريقة نوعا واحدا من عمود LC للفصل عن بعضها البعض مختلف الطبقات الهيكلية والوظيفية من الأيض القابل للذوبان في الماء. سبعة, هذه الطريقة تمكن من تحديد وتكميم أكثر من 370 الأيض للذوبان في الماء المستخرجة من خلايا الخميرة. هذا العدد من الأيض يمكن تحديدها وقابلة للقياس الكمي يتجاوز عدد الأيض ذكرت لطرق أخرى من الأيض غير المستهدفة في الخميرة3,22,27,49,50.

الأسلوب له عدة قيود. هذه القيود هي كما يلي. يتطلب عمود المرحلة zwitterionic المستخدم لفصل المستقلب بواسطة LC إعادة تكييف واسعة النطاق بعد كل شوط. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة فعالة فقط لنواتج الأيض غير المستهدفة من الأيض المائي القابل للذوبان في الماء. وعلاوة على ذلك، لا يمكن قياس أشكال مختلفة من الكربوهيدرات (بما في ذلك إيزومرات الفركتوز والجلوكوز والجالاكتوز) بمساعدة الطريقة. وذلك لأن العمود المرحلة zwitterionic المستخدمة في الأسلوب لا يمكن فصل هذه الأيزومرات الكربوهيدرات من بعضها البعض عندما تكون موجودة في خليط مع الأيض الأخرى. الى جانب ذلك، لا يمكن استغلال هذه الطريقة لتحديد الجلوكوز لأن هذه الكربوهيدرات يخلق قمم متعددة خلال الكروماتوغرافيا على العمود المرحلة zwitterionic المستخدمة في هذه الطريقة. وأخيرا، لا يمكن قياس الثريونين بمساعدة الطريقة بسبب الإلصاق المشترك لهذا الحمض الأميني مع هوموسرين الايزومر أثناء فصل المستقلب عن طريق الكروماتوغرافيا.

نحن نستخدم هذه الطريقة LC-MS / MS لدراسة التغيرات المرتبطة بالشيخوخة في المستقلب القابل للذوبان في الماء من الخميرة الناشئة S. cerevisiae. كما نستخدم هذه الطريقة للتحقيق في عدد التدخلات الوراثية والغذائية والصيدلانية التي تؤخر الشيخوخة التي تؤثر على المستقلب القابل للذوبان في الماء لخلايا الخميرة خلال شيخوختها الزمنية. بسبب براعة، متانة، وحساسية، يمكن استخدام طريقة LC-MS/MS بنجاح للتقييم الكمي للميبولومات القابلة للذوبان في الماء في الكائنات الحية eukaryotic البعيدة تطوريا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

ونحن ممتنون للأعضاء الحاليين والسابقين في مختبر تيتورينكو على المناقشات. ونعترف بمركز التطبيقات البيولوجية لقياس الطيف الكتلي، ومركز الجينوم الهيكلي والوظيفي، ومركز الفحص المجهري والتصوير الخلوي (وكلها في جامعة كونكورديا) للخدمات المتميزة. وقد دعمت هذه الدراسة بمنح من مجلس بحوث العلوم الطبيعية والهندسة الكندي (RGPIN 2014-04482 وCRDPJ 515900 - 17). حصل ك.M على دعم زمالة أرشامبولت بجامعة كونكورديا وجائزة عميد الآداب والعلوم في جامعة كونكورديا للتميز.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acetonitrile Fisher Scientific A9554
Ammonium acetate Fisher Scientific A11450
Ammonium bicarbonate Sigma 9830
Bactopeptone Fisher Scientific BP1420-2
Chloroform Fisher Scientific C297-4
Glucose Fisher Scientific D16-10
L-histidine Sigma H8125
L-leucine Sigma L8912
L-lysine Sigma L5501
Methanol Fisher Scientific A4564
Methanol Fisher Scientific A4564
Propidium iodide Thermo Scientific R37108
Uracil Sigma U0750
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Hardware equipment
500 ml centrifuge bottles Beckman 355664
Agilent 1100 series LC system Agilent Technologies G1312A
Beckman Coulter Centrifuge Beckman 6254249
Beckman Coulter Centrifuge Rotor Beckman JA-10
Centra CL2 clinical centrifuge Thermo Scientific 004260F
Digital thermometer Omega HH509
Foam Tube Holder Kit with Retainer Thermo Scientific 02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm) Sigma Milipore 150460
Thermo Orbitrap Velos MS Fisher Scientific ETD-10600
Ultrasonic sonicator Fisher Scientific 15337416
Vortex Fisher Scientific 2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm Agilent Technologies 883725-901
Laboratory materials
2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps Fisher Scientific 60180A-SV9-1P
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm) Sigma-Aldrich G8772
Hemacytometer Fisher Scientific 267110
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps PYREX 05-550
Software
Compound Discoverer 3.1 Fisher Scientific V3.1
Yeast strain
Yeast strain BY4742 Dharmacon YSC1049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hackett, S. R., et al. Systems-level analysis of mechanisms regulating yeast metabolic flux. Science. 354 (6311), aaf2786 (2016).
  2. Johnson, C. H., Ivanisevic, J., Siuzdak, G. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (7), 451-459 (2016).
  3. Mülleder, M., et al. Functional metabolomics describes the yeast biosynthetic regulome. Cell. 167 (2), 553-565 (2016).
  4. López-Otín, C., Galluzzi, L., Freije, J., Madeo, F., Kroemer, G. Metabolic control of longevity. Cell. 166 (4), 802-821 (2016).
  5. Krishnaiah, S. Y., et al. Clock regulation of metabolites reveals coupling between transcription and metabolism. Cell Metabolism. 25 (4), 961-974 (2017).
  6. Lee, H. J. Proteomic and metabolomic characterization of a mammalian cellular transition from quiescence to proliferation. Cell Reports. 20 (3), 721-736 (2017).
  7. Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
  8. Babst, M. Eisosomes at the intersection of TORC1 and TORC2 regulation. Traffic. 20 (8), 543-551 (2019).
  9. Pedro, J., Sica, V., Madeo, F., Kroemer, G. Acyl-CoA-binding protein (ACBP): the elusive 'hunger factor' linking autophagy to food intake. Cell Stress. 3 (10), 312-318 (2019).
  10. Rahmani, S., Defferrari, M. S., Wakarchuk, W. W., Antonescu, C. N. Energetic adaptations: Metabolic control of endocytic membrane traffic. Traffic. 20 (12), 912-931 (2019).
  11. Viltard, M., et al. The metabolomic signature of extreme longevity: naked mole rats versus mice. Aging. 11 (14), 4783-4800 (2019).
  12. Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (7), 436-450 (2019).
  13. Morrison, A. J. Chromatin-remodeling links metabolic signaling to gene expression. Molecular Metabolism. 38, 100973 (2020).
  14. Bitterman, K. J., Medvedik, O., Sinclair, D. A. Longevity regulation in Saccharomyces cerevisiae: linking metabolism, genome stability, and heterochromatin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 376-399 (2003).
  15. Carmona-Gutierrez, D. Apoptosis in yeast: triggers, pathways, subroutines. Cell Death and Differentiation. 17 (5), 763-773 (2010).
  16. Minois, N., Carmona-Gutierrez, D., Madeo, F. Polyamines in aging and disease. Aging. 3 (8), 716-732 (2011).
  17. Ring, J., et al. The metabolism beyond programmed cell death in yeast. Experimental Cell Research. 318 (11), 1193-1200 (2012).
  18. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  19. Pietrocola, F., et al. Acetyl coenzyme A: a central metabolite and second messenger. Cell Metabolism. 21 (6), 805-821 (2015).
  20. Carmona-Gutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
  21. Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), foy020 (2018).
  22. Leupold, S., et al. Saccharomyces cerevisiae goes through distinct metabolic phases during its replicative lifespan. eLife. 8, e41046 (2019).
  23. Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , Academic Press. Burlington. (2010).
  24. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  25. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
  26. Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
  27. Boer, V. M., et al. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular Biology of the Cell. 21 (1), 198-211 (2010).
  28. Clish, C. B. Metabolomics: an emerging but powerful tool for precision medicine. Cold Spring Harbor Molecular Case Studies. 1 (1), a000588 (2015).
  29. Fuhrer, T., Zamboni, N. High-throughput discovery metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 31, 73-78 (2015).
  30. Liu, X., Locasale, J. W. Metabolomics: A primer. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 274-284 (2017).
  31. Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  32. Riekeberg, E., Powers, R. New frontiers in metabolomics: from measurement to insight. F1000 Reseach. 6, 1148 (2017).
  33. Gertsman, I., Barshop, B. A. Promises and pitfalls of untargeted metabolomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. 41 (3), 355-366 (2018).
  34. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  35. Ivanisevic, J., Want, E. J. From samples to insights into metabolism: Uncovering biologically relevant information in LC-HRMS metabolomics data. Metabolites. 9 (12), 308 (2019).
  36. Srivastava, S. Emerging insights into the metabolic alterations in aging using metabolomics. Metabolites. 9 (12), 301 (2019).
  37. Chetwynd, A. J., Dunn, W. B., Rodriguez-Blanco, G. Collection and preparation of clinical samples for metabolomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 19-44 (2017).
  38. Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), (2017).
  39. Zhang, N., et al. Cell permeability and nuclear DNA staining by propidium iodide in basidiomycetous yeasts. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 4183-4191 (2018).
  40. Tu, B. P., et al. Cyclic changes in metabolic state during the life of a yeast cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16886-16891 (2007).
  41. Walvekar, A., Rashida, Z., Maddali, H., Laxman, S. A versatile LC-MS/MS approach for comprehensive, quantitative analysis of central metabolic pathways. Wellcome Open Research. 3, 122 (2018).
  42. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
  43. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  44. Oberacher, H., et al. Annotating nontargeted LC-HRMS/MS data with two complementary tandem mass spectral libraries. Metabolites. 9 (1), 3 (2018).
  45. Tada, I., et al. Creating a reliable mass spectral-retention time library for all ion fragmentation-based metabolomics. Metabolites. 9 (11), 251 (2019).
  46. Villas-Bôas, S. G., et al. Global metabolite analysis of yeast: evaluation of sample preparation methods. Yeast. 22 (14), 1155-1169 (2005).
  47. Crutchfield, C. A., Lu, W., Melamud, E., Rabinowitz, J. D. Mass spectrometry-based metabolomics of yeast. Methods in Enzymology. 470, 393-426 (2010).
  48. Zhang, T., Creek, D. J., Barrett, M. P., Blackburn, G., Watson, D. G. Evaluation of coupling reversed phase, aqueous normal phase, and hydrophilic interaction liquid chromatography with Orbitrap mass spectrometry for metabolomic studies of human urine. Analytical Chemistry. 84 (4), 1994-2001 (2012).
  49. Villas-Bôas, S. G., Moxley, J. F., Akesson, M., Stephanopoulos, G., Nielsen, J. High-throughput metabolic state analysis: the missing link in integrated functional genomics of yeasts. Biochemical Journal. 388 (Pt 2), 669-677 (2005).
  50. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 167، الأيضات القابلة للذوبان في الماء، التنميط الأيضي، إخماد النشاط الأيضي، تلطيخ يوديد البروبيديوم، المجهر الفلوري، استخراج الأيض، جزيئات ناقل الطاقة، النيوكليوتيدات، الأحماض الأمينية، السكريات الأحادية، الكروماتوغرافيا السائلة، قياس الطيف الكتلي
الأيض الكمي من <em>Saccharomyces Cerevisiae</em> باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي الترادفي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mohammad, K., Jiang, H., Titorenko,… More

Mohammad, K., Jiang, H., Titorenko, V. I. Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (167), e62061, doi:10.3791/62061 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter