Summary
In het volgende werk beschrijven we de opeenvolgende stappen die nodig zijn voor de oprichting van een grote biobank van colorectale en alvleesklierkanker.
Abstract
In het licht van de groeiende kennis over de inter-individuele eigenschappen en heterogeniteit van kankers, vereist het opkomende gebied van gepersonaliseerde geneeskunde een platform voor preklinisch onderzoek. In de afgelopen jaren hebben we een biobank van colorectale en pancreaskankers opgericht die bestaat uit primair tumorweefsel, normaal weefsel, sera, geïsoleerde perifere bloedlymfocyten (PBL), van patiënten afgeleide xenografts (PDX), evenals primaire en secundaire kankercellijnen. Aangezien het oorspronkelijke tumorweefsel beperkt is en de totstandbrengingssnelheid van primaire kankercellijnen nog steeds relatief laag is, staat PDX niet alleen het behoud en de uitbreiding van de biobank toe, maar ook de generatie van secundaire kankercellijnen. Bovendien is bewezen dat PDX-modellen het ideale in vivo model zijn voor preklinische geneesmiddelentests. Biobanking vereist echter een zorgvuldige voorbereiding, strikte richtlijnen en een goed afgestemde infrastructuur. Colectomy, duodenopancreatectomie of herverdoemde uitzaaiingen worden onmiddellijk na resectie verzameld en overgebracht naar de pathologieafdeling. Met inachtneming van de prioriteit van een onbevooroordeeld histopathologisch rapport, naar goeddunken van de behandelende patholoog die de dissecties uitvoert, worden kleine tumorstukken en niet-tumorweefsel geoogst.
Necrotische delen worden weggegooid en het resterende tumorweefsel wordt in kleine, identieke kubussen gesneden en cryopreserveerd voor later gebruik. Bovendien wordt een klein deel van de tumor gehakt en gespannen voor de primaire kankercelcultuur. Bovendien worden bloedmonsters van de patiënt vóór en na de operatie verwerkt om serum en PBL's te verkrijgen. Voor PDX-engraftment worden de cryopreserveerde exemplaren ontdooid en subcutaan in de flanken van immunodeficiënte muizen geïmplanteerd. De resulterende PDX vat de histologie van de "donor"-tumoren nauw samen en kan worden gebruikt voor latere xenografting of cryopreserveerd voor later gebruik. In het volgende werk beschrijven we de individuele stappen van creatie, onderhoud en toediening van een grote biobank van colorectale en alvleesklierkanker. Bovendien benadrukken we de cruciale details en kanttekeningen die gepaard gaan met biobanking.
Introduction
In de afgelopen jaren leidde de opgebouwde kennis van de morfologische, klinische en genetische eigenschappen van kanker tot de conceptie van kanker als een heterogene, individuele ziekte. Bijgevolg heeft mutatiekarakterisering van neoplasmata, naast klinische en pathologische kenmerken, belang gekregen voor klinische besluitvorming en zijn er veel gerichte therapieën ontwikkeld voor verschillende moleculaire veranderingen. De werkzaamheid van cetuximab bij de behandeling van colorectale kanker kan bijvoorbeeld worden voorspeld door de analyse van de KRAS- en PIK3CA-mutatiestatus 1. Precisiegeneeskunde streeft naar een op maat gemaakte aanpak om de hoogste behandelingsrespons bij elke patiënt te bieden en toxiciteit van inefficacious therapieën te voorkomen2. Biobanken bevatten weefsel, bloed en andere biologische materialen van kankerpatiënten, die zijn gekoppeld aan de klinische gegevens, en zijn dus een uitstekend hulpmiddel voor translationeel kankeronderzoek. Vanwege het grote aantal klinische monsters maken biobanken de detectie van zeldzame, maar mogelijk medicijngegeerbare mutaties mogelijk, wat nieuwe behandelingsmogelijkheden biedt voor de individuele patiënt3.
Om een zo breed mogelijk oncologisch onderzoeksspectrum te bestrijken, beperkten we onze activiteit op het oogsten van monsters niet alleen, maar richtten we ons op de oprichting van patiënt-afgeleide kankercellijnen en xenografts (PDX). Traditionele 2D-cellijnen blijven de hoeksteen van in vitro onderzoek en zijn de belangrijkste keuze voor grootschalige geneesmiddelenscreenings4,5. Bovendien is mobiele lijnanalyse vaak eenvoudiger, goedkoper en gemakkelijker beschikbaar. Aangezien patiënt-afgeleide perifere bloedlymfocyten (PBL) beschikbaar zijn, kan ook tumorimmunologie in vitroworden bestudeerd6. De meeste nieuw ontwikkelde geneesmiddelen met veelbelovende preklinische effectiviteit in in vitro of in vivo experimenten op celbasis hebben echter teleurstellende resultaten aangetoond in klinische studies7. Daarentegen hebben preklinische studies op basis van PDX in vivo studies de klinische activiteit van antineoplastische agentia veel getrouwer weerspiegeld8. Aangezien PDX-weefsel de histologische en moleculaire eigenschappen van de donortumor nauw weerspiegelt, zijn PDX-modellen een goede manier om de vaak zeer beperkte hoeveelheden levensvatbaar tumorweefsel te vermeerderen om de integriteit van een biobank te behouden en de uitwisseling van monsters tussen onderzoeksgroepen en instellingen mogelijk te maken. Bovendien kunnen kankercellijnen afgeleid van PDX-weefsel aanzienlijk gemakkelijker worden vastgesteld dan primaire kankercellijnen9. In de afgelopen jaren heeft onze werkgroep een uitgebreide geïntegreerde biobank voor colorectale en pancreaskanker opgericht door stapsgewijs de werkstroom voor alle biologische monsters in kwestie te standaardiseren en te optimaliseren(figuur 1).
Figuur 1: Workflow en organisatie van de biobank Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Protocol
De volgende studie is goedgekeurd door de instellingscommissie van het Universitair Medisch Centrum Rostock (II HV 43/2004, A 45/2007, A 2018-0054, A 2019-0187 en A 2019-0222). Bovendien zijn alle veterinair relevante procedures goedgekeurd door de Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern onder de registratienummers LALLF M-V/TSD/ 7221.3-2-020/17 en 7221.3-1-007/19.
1. Experimentele vereisten
- Voldoe aan een aantal belangrijke randvoorwaarden om een biobank op te richten en te onderhouden.
- Gebruik een kliniek met een chirurgische afdeling en voldoende oncologische resecties samen met een goed uitgerust lab en voldoende academisch personeel. Een goede infrastructuur en een stevige contacten met een samenwerkende pathologieafdeling zijn verdere voorwaarden.
- Gebruik voor in vivo onderzoek een dierenfaciliteit met huisvestingsomstandigheden die geschikt zijn voor immunodeficiënte muizen.
- Krijg toestemming voor elk onderzoek naar van patiënten afgeleid materiaal van een ethische commissie voor de gezondheidszorg. Goedkeuring verkrijgen voor elk in vivo onderzoek van de bevoegde autoriteit volgens de lokale wettelijke voorschriften.
2. Monsterverzameling
- De dag voor de operatie
- Evalueer alle patiënten met reseceerbare colorectale of pancreaskanker en/of overeenkomstige uitzaaiingen om in aanmerking te komen voor biobanking. Vermijd het opnemen van gevallen met neoadjuvante voorbehandeling, zeer kleine tumoren, tumoren van onzekere waardigheid of laesies die eerder gedeeltelijk endoscopisch zijn gereseceerd.
- Krijg schriftelijke toestemming van de patiënt tijdens de discussie over geïnformeerde toestemming over de chirurgische procedure. Informeer tijdig alle betrokken chirurgen, het laboratoriumteam en de patholoog.
- Voorbeeldverwerving
- Informeer alle begeleiders in de operatiekamer (OR) direct voor aanvang van de chirurgische ingreep over de weefselafname voor de biobank.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat het weefsel niet in formaline mag worden bevestigd. Als het weefsel wordt ondergedompeld in formaline, wordt het ongeschikt voor geïntegreerde biobanking. - Teken 40 ml gehepariniseerd bloed (2 x 20 ml spuit) en een standaard serumbuis van 7,5 ml onmiddellijk na verdovingsinductie en breng snel over naar het lab voor PBL-isolatie en serumverwerking (zie stap 3-4).
- Haal het gereseceerde monster rechtstreeks uit de operatietafel, plaats het in een geschikte container en breng het naar de pathologische afdeling. Noteer het tijdstip van onthechting van de circulatie, resectie en aankomst bij pathologie.
OPMERKING: De geschiktheid van het monster voor biobankieren moet worden beoordeeld door de samenwerkende patholoog die een stukje tumor en niet-kwaadaardig weefsel ontleedt. Verwijder geen delen van het monster zelf die het daaropvolgende pathologische rapport in gevaar kunnen brengen. - Plaats beide weefselstukken in een aparte polypropyleenbuis van 15 tot 50 ml met 10 tot 30 ml weefselopslagoplossing (of DPBS) op ijs. Noteer het tijdstip van ontvangst en breng de monsters onmiddellijk naar het lab.
OPMERKING: De volgende protocolstappen 3-6 moeten onder strikte steriele omstandigheden in een lamineerstroomkast worden uitgevoerd. Gebruik alle vloeistoffen op kamertemperatuur.
- Informeer alle begeleiders in de operatiekamer (OR) direct voor aanvang van de chirurgische ingreep over de weefselafname voor de biobank.
3. Serumverwerking
- Centrifugeer de serumbuis van 7,5 ml bij 1128 x g en 4 °C gedurende 15 minuten in een voorgekoelde centrifuge.
- Aliquot 1 ml serum per tube in voorgelabelde cryotubes en invriezen in vloeibare stikstof.
4. Isolatie van PBL door dichtheid gradiëntcentrifugatie
OPMERKING: Werk parallel met elk van de twee spuiten van 20 ml.
- Vul 20 ml ge hepariniseerd bloed in een 50 ml polypropyleen buis en voeg 15 ml DPBS toe.
- Neem 15 ml Pancoll met een serologische pipet, plaats de pipet voorzichtig helemaal tot aan de bodem van de polypropyleenbuis en laat de Pancoll heel langzaam los om een laag onder de bloed/DBPS-kolom te vormen.
- Centrifugeren bij 375 x g gedurende 15 minuten zonder rem.
- Aspireer en breng de ondoorzichtige interfaselaag tussen de middelste en bovenste kolom van beide monsters over in een verse polypropyleenbuis van 50 ml en vul met DPBS tot 50 ml.
- Centrifugeren bij 270 x g gedurende 15 minuten met rem.
- Aspireer en gooi het supernatant weg, resuspendeer de celkorrel in 4,5 ml vriesmedium.
- Aliquot 1,5 ml van de suspensie per cryobuis, sluit de buizen goed en plaats ze in een vriesbak die geschikt is voor langzaam invriezen en bewaren bij -80 °C.
5. Weefselverwerking
OPMERKING: Begin met het genereren van snap bevroren monsters van tumor en gezond weefsel om de integriteit van nucleïnezuren te behouden.
- Het weefselexemplaar van de tumor
- Breng het tumormonster met verschillende ml weefselopslagoplossing over van de polypropyleenbuis naar een Petrischaal. Spoel indien nodig af met DPBS. Raak het monster niet aan en gebruik twee steriele scalpels om het weefsel te behandelen. Vermijd uitdroging op elk gewenst moment.
- Weeg het tumormonster op een handige schaal in een aparte schaal en noteer het weefselgewicht.
- Evalueer de grootte, vorm en weefselkwaliteit van het tumorweefsel voordat u gaat snijden. Streef ernaar om ten minste één stuk te verkrijgen ter grootte van een pinhead voor het invriezen van snap en vier kubussen van ongeveer 30 mm3 (randlengte 3 x 3x 3 mm) elk voor vitale cryopreservatie. Genereer zoveel mogelijk 30 mm3 -kubussen in viervoudige blokjes en genereer één stuk voor snap freezing per 5 viervoudige. Houd er ook rekening mee dat necrotische porties moeten worden afgesneden, zodat de kubussen alleen uit vitaal weefsel bestaan.
- Genereer plakjes met een dikte van 3 mm. Snijd necrotische porties af, te onderscheiden als gelachtige of vloeibare massa, en snijd de plakjes in blokjes van de twee gewenste maten.
OPMERKING: Gooi op dit moment geen weefsel weg. - Snap bevriezen
- Label cryotubes dienovereenkomstig (zie stap 7.7).
- Plaats een klein stukje weefsel per voorgelabelde cryobuis. Dompel de monsters onmiddellijk enkele minuten onder in vloeibare stikstof en bewaar ze vervolgens bij -80 °C.
- Cryopreservatie van vitaal weefsel
- Label cryotubes dienovereenkomstig (zie stap 7.7) en vul elk met 1,5 ml vriesmedium. Plaats de vriesbak naast de bank.
OPMERKING: Volg de volgende stappen zo snel mogelijk. Aangezien de DMSO in het vriesmedium cytotoxische eigenschappen heeft, mag de tijd van het weefsel dat zonder de juiste koeling in het vriesmedium wordt ondergedompeld, niet langer zijn dan 2 minuten. - Schik de 30 mm3 blokjes in viervorupten. Duw necrotisch weefsel en andere overblijfselen naar de rand van de schaal, maar gooi ze niet weg.
- Schep de kubussen met het scalpelblad en breng 4 blokjes per cryobuis over. Zorg ervoor dat de tumorstukken volledig ondergedompeld zijn in het vriesmedium. Sluit de buizen goed en plaats ze in een vriesbak die geschikt is voor langzaam invriezen en bewaar ze in een vriezer van -80 °C.
- Breng cryotubes over in een geschikt opslagsysteem voor langdurige opslag bij -140 °C of lager. Documentatie in het laboratoriuminventarisbeheersysteem is verplicht.
- Label cryotubes dienovereenkomstig (zie stap 7.7) en vul elk met 1,5 ml vriesmedium. Plaats de vriesbak naast de bank.
- Gezond weefselmonster: Herhaal stap 5.1.1. tot 5.1.6.4 voor het gezonde weefselmonster.
6. Primaire celcultuur
- Desintegreer de overblijfselen van het tumorweefsel, inclusief het necrotische schroot, in de Petrischaal met de scalpels in stukken zo klein mogelijk.
- Plaats een steriele celzeef (100 μm poriegrootte) bovenop een polypropyleenbuis van 50 ml.
- Gebruik een serologische pipet om 5-10 ml DPBS aan de Petrischaal toe te voegen, drijf de weefselresten en pipet op en neer om een suspensie te genereren.
- Breng de suspensie met de pipet over op de celzeef.
- Herhaal stap 6.3-6.4 totdat alle weefselresten uit de Petrischaal zijn opgelost.
- Gebruik de zuiger van een eenrichtingsspuit van 20 ml om de cel- en weefselsuspensie door de celzeef te persen.
- Spoel af met 5-10 ml verse DPBS, gooi de celzeef weg en sluit de buis goed.
- Centrifugeer de suspensie gedurende 5-10 minuten op 180 x g.
- Bereid een collageen-I voorgecoat 6 goed plaat met 1,5 ml medium per put.
- Aspirateer en gooi het supernatant weg. Resuspend de pellet in 3 ml DPBS of medium en voeg 500 μL van de suspensie toe aan elke put. Plaats de plaat in de incubator (100% luchtvochtigheid, 5% CO2,37 °C)
- Controleer de plaat dagelijks op celgroei en verontreiniging.
OPMERKING: Verdere celcultus tot het punt van vestiging van een permanente cellijn wordt hier niet beschreven.
7. PDX-generatie
- Voer in vivo experimenten alleen uit door naar behoren gekwalificeerde personen die voldoen aan de vereisten van de bevoegde autoriteit van uw rechtsgebied.
- Huis immunodeficiënte muizen onder specifiek ziekteverwekkervrije (SPF) omstandigheden die voldoen aan de eisen van de gebruikte muizenstam. De hygiënische maatregelen omvatten individueel geventileerde kooien, autoclaved voedsel, water en nestmateriaal, evenals een veiligheidsluchtslot en het dragen van persoonlijke, beschermende apparatuur.
- Autoclaaf alle instrumenten van tevoren en gebruik slechts één set instrumenten voor elk tumorgeval om kruisbesmetting te voorkomen. Behandel het tumorweefsel zo aseptisch mogelijk. Alle hieronder genoemde plastic voorwerpen moeten steriel, voor eenmalig gebruik en na elke operatie worden weggegooid.
OPMERKING: Bepaald door de methode om vier tumorweefselstukken per cryobuis in te vriezen, vereist de PDX-generatie altijd twee muizen per monster, idealiter resulterend in vier PDX-tumoren. - Kies de gewenste primaire tumor voor engraftment via het laboratoriuminventarisbeheersysteem en breng het monster (vitaal bewaard tumorweefsel) over van de hoofdopslagtank naar een draagbare vloeibare stikstofcontainer (Tussentijdse opslag bij -80 °C op droogijs is ook handig).
- Trek persoonlijke beschermingsmiddelen aan voordat u de SPF-sectie betreedt (scrubs, klompen, schort, haarbedekking, chirurgisch masker en overschoenen), desinfecteer uw handen en alle apparatuur.
- Matrigel weken
- Verwijder de cryobuis uit de vloeibare stikstofcontainer en wacht op ontdooiing van het monster.
- Label een 50 ml polypropyleen buis en vul met 35 ml DPBS.
- Kantel de cryobuis op en neer en breng de inhoud onmiddellijk over naar de polypropyleenbuis zodra de weefsel-medium-slush kan worden verschoven. Spoel voorzichtig de stukjes tumorweefsel, gooi het hoofdvolume uit de buis in een apart vat, sluit het deksel en plaats de buis naast elkaar, zodat de vier weefselstukken zich in het deksel verzamelen.
- Plaats een Petrischaal op de koelaccumulator en plaats 100 μL Matrigel als een enkele druppel in het midden. Gebruik anatomische tang om de tumorstukken over te brengen naar de Matrigel. Zorg ervoor dat elk stuk volledig bedekt is met Matrigel. Incubeer gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Muizenanesthesie (2 muizen per monster, werk parallel)
- Bereid een 3:1- bouillon van een ketamine (100 mg/ml) en xylazine (20 mg/ml) verdovingsoplossing. De aanbevolen dosis is 90/6 mg/kg lichaamsgewicht.
- Weeg de muis af en stel de benodigde verdovingsoplossing op in een insulinespuit voor eenmalig gebruik.
- Plaats de muis op het rooster van de kooi, trek voorzichtig aan zijn staart met één hand om een voorwaartse beweging op te wekken en krab tegelijkertijd de nek met een knijpgreep van de andere hand. Til de muis van het raster op en draai de hand, zodat de rug van dat dier op je handpalm rust. Immobiliseer een van de achterpoten met je pink en injecteer de verdovende middelen intraperitoneaal. Leg de muis terug in zijn kooi en wacht op verdovende inductie.
- Plaats de verdoofde muis op de verwarmingsplaat en bedek de ogen met zalf om hoornvliesschade te voorkomen. Asses de diepte van anesthesie door zachtjes knijpen de achtervoet van de muis met chirurgische tang.
OPMERKING: Afwezigheid van beweging duidt op diepe narcosis. Elke vorm van beweging vereist meer tijd voor het bereiken van de gewenste verdovende diepte of een extra dosis verdovingsmiddelen.
- Chirurgische ingreep
- Vorm een huidplooi door de nek van de muis te knijpen en injecteer de microchip subcutaan met de applicator (Zie stap 9 voor programmeerdetails)
- Scheer indien nodig de flanken van de muis (NMRInu/nu muizen hoeven niet te worden geschaafd), breng povidone-jodium aan met een wattenstaafje en gebruik chirurgisch doek om een steriel veld te creëren.
- Til de huid van de flank op met chirurgische tang, maak een kleine incisie van ongeveer 4 mm en vorm een kleine onderhuidse zak door stompe voorbereiding met een schaar.
- Stop één tumorstuk in elke zak en plaats het aan de achterkant.
- Knip het uiteinde van een pipettip van 100 μL en aspirateer de resterende Matrigel uit de Petrischaal en breng deze gelijkmatig aan in elke huidzak.
- Sluit de wonden met eenvoudige onderbroken hechtingen en breng spuitverband aan.
- Scan de microchip en controleer de validiteit van muis- en tumor-ID.
- Bereid een nieuwe kooi voor met vers beddengoed en nestmateriaal, evenals een knaagstok. Vouw een "kussen" uit papieren handdoeken en leg de muis neer met een verhoogde kop onder een infrarood warmtelamp.
- Meng 0,25 ml trimethoprim/sulfamethoxazol (400 mg/80 mg) met 100 ml drinkwater en dien het toe via de drinkfles. Houd er rekening mee dat één muis dagelijks ongeveer 150 ml per kg lichaamsgewicht verbruikt.
OPMERKING: Aangezien het subcutane PDX-model niet geassocieerd is met postoperatieve pijn, noch tijdens het wondgenezingsproces, noch tijdens de uitgroei van de tumor, is postoperatieve analgesie niet vereist. Houd er rekening mee dat de richtlijnen voor dierenwelzijn van uw instelling/autoriteit kunnen verschillen. - Monitoring van proefdieren
- Controleer de muizen dagelijks op tekenen van nood. Dit kan worden gedelegeerd aan gekwalificeerde dierenverzorgers.
- Houd de postoperatieve antibioticabehandeling met de bovengenoemde dosering gedurende 4 weken. Vervang het antibioticummengsel twee keer per week.
- Meet de tumorgrootte minstens één keer per week, idealiter dagelijks, met een remklauw (tumorvolume = 0,52 x lengte x breedte x hoogte [mm3]) en noteer in de database.
8. PDX oogsten en verwerken
- Oogst en verwerk de PDX tumor, wanneer:
De tumorgrootte bereikt het doelvolume van 1.500 mm3.
Het tumordragende dier vertoont tekenen van nood en/of ziekte en de behandeling is zinloos.
De tumor wordt zwerend of dringt de huid van de muis binnen. - Lees de microchip uit om de juiste PDX te identificeren.
- Euthanaseer de muis volgens een wettelijke methode (afhankelijkvan de nationale richtlijnen) zoals bijvoorbeeld CO 2-asphyxatie of ketamine/xylazine-injectie gevolgd door cervicale dislocatie.
- Til de huid op met chirurgische tangen aan de flanken en inciseer met een metzenbaum schaar een paar millimeter ver van de tumor.
- Maak de huid boven de tumor los door middel van een stompe voorbereiding, pak de tumor vervolgens voorzichtig vast met anatomische tang en maak de tumor los van de oppervlakkige fascia van het lichaam.
- Spoel de tumor af met DPBS, doe deze in een Petrischaal en verwijder aangrenzend bindweefsel.
- Voer op dit moment een van de volgende stellingen uit:
- Snijd 30 mm3 kubussen en maak nieuwe PDX (Ga verder met protocol in punt 7.7.4).
- Snijd de tumor in plakjes, die vervolgens worden overgebracht naar histologiecassettes en bewaard in 4% formaldehyde voor latere paraffine-inbedding.
- Behoud de tumor in een buis met weefselopslagoplossing om deze toe te voegen aan de biobank (Ga verder met het protocol in stap 3.) en/of maak PDX-afgeleide cellijnen (Ga verder met het protocol in stap 4.)
9. Biobank en datamanagement
- Wijs een interne ID toe aan elke tumorgeval volgens tabel 1.
| Laboratoriumlocatie/naam | kanker entiteit | aaneengesloten zaaknummer | Specificatie | opeenvolgend nummer |
| C=colorectaal | _Met=Uitzaaiingen | |||
| P=pancreas | _Tu=Tumor | |||
| Voorbeeld: HROC389_Met2 = Rostock, colorectale kanker, geval 389, tweede uitzaaiingen | ||||
Tabel 1: Definitie van de voorbeeld-ID.
- Bewaar de toestemming van de patiënt in elektronische en papieren vorm samen met de tumor-ID.
- Verzamel zoveel mogelijk klinische gegevens en sla ze geanonimiseerd en afzonderlijk op.
- Gebruik een datamanagementsoftware (bijv. Freezerworks) of andere en maak een interface met een labelprintsoftware om temperatuurbestendige, zelfklevende streepjescodelabels te genereren.
- Voeg een nieuw monster toe door de gegevensbeheersoftware te openen, definieer het monstertype en noteer de volgende informatie: tumor-ID, weefseltype, bevriezingsmethode, datum, verantwoordelijke werknemer, passagenummer, muis-ID en muisstam.
- Wijs de monsters toe aan specifieke posities in de opslagtank.
- Tracing en monitoring van PDX (Geldt voor stap 7-8)
- Gebruik een MS Access-databank (of een vergelijkbaar systeem) op een draagbaar, Bluetooth-apparaat (laptop of tablet) om tumor-ID, datum van implantatie, datum van euthanasie, muisleeftijd en -stam en tumorgroei in de loop van de tijd vast te leggen.
- Sluit de microchiplezer aan op het apparaat en lees de microchip uit voordat u deze implanteert.
- Wijs een specifieke ID toe aan elke muis; we gebruiken de volgende regeling: (zie tabel 2 hieronder)
- Noteer na implantatie de ID samen met de muiskenmerken in de database.
- Lees de microchip opnieuw en controleer of de specificaties van de microchip, de databank en het cryotube-label consistent zijn.
- Maak dienovereenkomstig een label voor elke muizenkooi.
OPMERKING: Om een fysieke back-up te maken, plakt u de cryotube-labels met de bijbehorende microchiplabels in een boekje en noteer datum en muisspanning. - Om de tumorgroei van de individuele PDX te volgen, scant u de microchip van de muis met de lezer verbonden met het databaseapparaat voor identificatie en registreert u elke week de tumorgrootte gemeten per remklauw.
- Plan het ideale tijdspunt van PDX-oogst door de groeicurve van de tumor te analyseren.
| Tumor-ID | Voorafgaande opslag in N2 (=f) | Passagenummer (=T) | opeenvolgende muisnummer (=M) |
| Voorbeeld: HROP12 fT0 M1 = Rostock, alvleesklierkanker, geval 12, gegenereerd uit bevroren primair weefsel, eerste passage, muis 1. | |||
Tabel 2: Definitie van de PDX-ID.
Representative Results
In onze handen was het vestigingspercentage van primaire celculturen (figuur 2A & B) 12,9% in een grote serie9. De meeste pogingen om uitbreidbare tumorcellen te isoleren van verse chirurgische gereseceerde exemplaren mislukten vanwege een gebrek aan uitgroei of vroege besmetting. De vestiging van de cellijn werd als succesvol beschouwd na 3 passages met een gestage groei onder standaardcultuuromstandigheden (DMEM, 10% FCS, standaard kweekvat) en validatie van epitheeldifferentiatie via FACS-analyse10. Cellijnen afgeleid vanPDX-tumoren ( figuur 2C & D) vertoonden een hoger vestigingspercentage van 23,6% wat ook te wijten is aan de mogelijkheid van herhaalde pogingen in tegenstelling tot primaire gereseceerdetumoren 9. Sommige gemengde culturen (figuur 2E) kunnen echter niet vrij zijn van fibroblastische groei of gaan zelfs verloren als gevolg van fibroblastische overgroei (figuur 2F).
Figuur 2: Celcultuur. Primaire kankercellijnen, afgeleid van een uitzaaiing van darmkankergeval HROC313, passage 21 (A) en alvleesklierkankergeval HROP88, passage 5 (B). PDX-afgeleide kankercellijnen van colon PDX HROC285 T0 M2 (D) en pancreas PDX HROP10 T5 M2, passage 4 (E). Gemengde cultuur van fibroblasten en kankercellen uit alvleesklierkanker HROP75, passage 8 (C) en fibroblastische overgroei (F). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Gezien veranderingen in het PDX-generatieprotocol, gebruikte muisstammen en ook experimenten gedurende meerdere jaren, evenals grote verschillen in de hoeveelheid tumorweefsel die beschikbaar is voor engraftment, is het niet triviaal om het algehele slagingspercentage van pdx-generatie te geven. In een zeer recente reeks PDX-generatie-experimenten uitgevoerd door twee onderzoekers (S.M. en F.B.), werden primaire uitgroeisnelheden van 63% voor colorectale PDX (een voorbeeldige histologie kan worden weergegeven uit figuur 3A)en 48% voor pancreas PDX (figuur 3B) waargenomen. De uitgroei van murine of menselijke lymfomen op de implantatieplaats is relatief zeldzaam, maar kan succesvolle PDX-uitgroei nabootsen (figuur 3C). Afgezien van histopathologisch onderzoek werd de concordantie tussen PDX-modellen en hun donorpatiënten regelmatig bevestigd door een korte tandemherhalingsanalyse (STR) (figuur 3D). Tot op de dag van vandaag bestaat de biobank uit >50 primaire en >50 secundaire colorectale, 3 primaire en 6 secundaire alvleesklierkankercellijnen, evenals > 150 colorectale en 19 pancreas PDX-modellen.
Figuur 3: Representatieve histologische vergelijking van colorectaal (A) en pancreas PDX (B). Humaan lymfoom op de implantatieplaats dat PDX-uitgroei (C) nabootst. Genetische identiteitstesten van een PDX-model (HROC430 T1 M2) aan het oorspronkelijke tumorweefsel van de patiënt (HROC430Tu) door korte tandemherhaling (STR) analyse. Vergelijking van de negen STR loci, vWA, THO1, TPOX, CSF1 PO (FAM-kleurstof) en D5S818, D13S317, D7S820, D16S539 (HEX-kleurstof) met behulp van multiplex PCR met fluorescerende primers na capillaire elektroforese bevestigde genetische concordantie van de PDX en donortumor (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
De generatie van een levende biobank veronderstelt, afgezien van het voldoen aan de wettelijke voorschriften van privacy, medisch recht en dierenwelzijn, een goede infrastructuur en een goed gecoördineerd team. Het is voordelig gebleken om een deel van het chirurgisch personeel direct te betrekken bij de onderzoeksprocedures, omdat ze heel goed de geschiktheid van de individuele patiënt voor weefseldonatie kunnen beoordelen. Bovendien hebben patiënten de neiging om vaker in te stemmen met biobanking, wanneer hun schriftelijke goedkeuring wordt verkregen in de loop van de chirurgische geïnformeerde toestemmingsdiscussie. Om tijd en middelen te besparen, mogen gevallen die vermoedelijk onvoldoende hoeveelheden tumorweefsel opleveren, niet worden geselecteerd voor biobanking. Als het gaat om specimenverwerving, is de stelregel "communicatie is de sleutel" een eenvoudige, maar vaak over het hoofd geziene waarheid. Er is slechts één ongeïnformeerde theaterverpleegkundige of chirurgische collega nodig om het exemplaar in het begin te ruïneren door gewoon door te gaan en formaldehyde aan het resectiemonster toe te voegen. Daarom is het absoluut cruciaal dat elk lid van het betrokken personeel kennis maakt met de SOP voor biobanking. Chirurgen moeten de dag ervoor en direct aan het begin van de procedure worden opgemerkt over geplande weefselverzameling. Bovendien moeten gevallen die voor biobanking zijn geselecteerd, in het elektronische OR-plan worden benadrukt. Weefseloogst van het chirurgische monster moet worden uitgevoerd door een patholoog. Ten eerste zal dit ervoor zorgen dat de weefseloogst het definitieve pathologische rapport niet verstoort. Ten tweede verhoogt dit de kans op het ontvangen van weefsel met voldoende hoeveelheden levensvatbaar kankerweefsel. Vooral bij alvleesklierkankers met een uitgesproken desmoplastische reactie en frequente necrotische gebieden zijn levensvatbare delen moeilijk macroscopisch te identificeren voor het ongetrainde oog. Als uitzondering op deze regel kunnen weefselblokken van grote lever- of longmetastasen soms door de chirurg "back-table" worden verwijderd, als chirurgische marges macroscopisch kunnen worden gedefinieerd. Rectale kanker die door totale mesorectale excisie (TME) wordt gereseceerd, is mogelijk niet geschikt voor biobanking, omdat weefseloogst uit het gereseceerde monster voorafgaand aan paraffine-inbedding de TME-kwaliteitsbeoordeling kan verstoren. Als alternatief kan weefsel voor biobanking worden verkregen door transanale biopsie van rectale kanker.
De vestigingspercentages voor primaire celculturen afgeleid van de oorspronkelijke tumor zijn over het algemeen laag. PDX-afgeleide, secundaire celculturen kunnen waarschijnlijk met succes worden vastgesteld. We raden aan om voor elk geval verschillende media te testen en antibioticasupplementen te gebruiken voor de eerste passages om besmetting tot een minimum te beperken, omdat het geoogste weefsel zelden steriel is. Na succesvolle vermeerdering moet elke afzonderlijke cellijn worden bevestigd als een kankercellijn door middel van FACS-analyse en regelmatig worden getest op mycoplasmabesmetting. Om kruisbesmetting uit te sluiten, is regelmatige STR-analyse raadzaam. Opgemerkt moet worden dat het vestigingsprotocol voor primaire en secundaire cellijnen voortdurend wordt onderworpen aan optimalisatie. Details over de samenstelling en het succespercentage van de afzonderlijke media vallen duidelijk buiten het toepassingsgebied van dit werk en zullen afzonderlijk worden gepubliceerd.
Voor PDX-engraftment kan tumorweefsel direct na resectie worden geïmplanteerd of cryopreserveerd in foetaal kalverenserum met 10% DMSO of vergelijkbare bevriezingsmedia voor vertraagde implantatie. Implantatie onmiddellijk na het oogsten van tumorweefsel legt een druk op logistiek en laboratoriumpersoneel, en xenografting resultaten na cryopreservatie zijn helemaal niet inferieur 10. Bovendien verhoogt incubatie van het weefsel in Matrigel voorafgaand aan tumorimplantatie de engraftmentsnelheden aanzienlijk12. We raden vertraagde engraftment aan na definitieve pathologische bevinding en onmiddellijke verwijdering van ten onrechte verzamelde weefselmonsters. Omdat het slagingspercentage van primaire engraftment toeneemt met immunodeficiëntie van de ontvangende muis, hebben we de neiging om NSG-muizen te gebruiken voor de allereerste PDX-passage. Na de eerste succesvolle PDX-engraftment kunnen en moeten NMRInu/nu-muizen worden gebruikt voor latere passages en weefseluitbreiding. Deze soort is robuuster, goedkoper en gemakkelijker te kweken in vergelijking met NSG of vergelijkbare immunodeficiënte stammen, maar vertoont nog steeds redelijke engraftmentpercentages. Bovendien vergemakkelijkt de naaktheid implantatie en tumorgroeimonitoring. Om de engraftmentsnelheden in volgende passages te verhogen, raden we directe overdracht van vers geoogste PDX-weefsels aan om muizen waar mogelijk te ontvangen, vooral voor langzaam groeiende PDX en gevallen met een laag primair succespercentage. Collins en Lang hebben onlangs 14 studies van colorectale PDX-vestiging beoordeeld en gerapporteerde engraftmentpercentages variërend van 14 tot 100% met een mediaan PDX-vestigingspercentage van 68%, de laatste is consistent met onze bevindingen13. In overeenstemming met de literatuur, zagen we lagere vestigingspercentages van pancreas in vergelijking met colorectale kanker PDX14. Ongeacht de gastheermuisstam en tumorentiteit vormt de uitgroei van menselijke, Epstein-Barr Virus (EBV)-geassocieerde B-cellymfomen en murinelymfomen aan de implantatiezijde een belangrijke valkuil15,16. Indien niet herkend, kunnen dergelijke tumoren latere passages "besmetten" en zo opeenvolgende resultaten verwarren. Ongebruikelijke snelle PDX-groei en zwelling van cervicale, oksel- en lieslymfeklieren zijn sterke indicatoren voor de groei van murinelymfoom, maar regelmatig histologisch onderzoek van PDX is niettemin raadzaam. Bovendien moet de genetische concordantie tussen PDX en de overeenkomstige donorpatiënt regelmatig worden getest door middel van STR-analyse. Idealiter moet de biobank worden gekoppeld aan een klinische database met patiëntenkenmerken (algemene informatie, overleving, terugvalvrije overleving, therapie, secundaire neoplasie enz.). Vanwege wettelijke voorschriften voor privacybescherming en het ontbreken van een dergelijke geanonimiseerde database, wordt onze klinische dataset regelmatig handmatig beheerd en bijgewerkt door de samenwerkende artsen.
Hoewel conventionele biobanken beperkt zijn tot observatoriumonderzoek, biedt een levende biobank de mogelijkheid voor in vitro en in vivo interventies. Van patiënten afgeleide cellijnen zijn een belangrijk instrument voor fundamenteel onderzoek, geneesmiddelenscreenings met hoge doorvoer en beoordeling van nieuwe farmaceutische agentia4. Overeenkomstige PDX-modellen zijn echter van toenemend belang, omdat ze de histologie van de oorspronkelijke tumor17,18 nauw samenvatten en een hoge genetische stabiliteit vertonen over verschillende passages19,20. Onze PDX biobank heeft zich bewezen als een uitstekend platform voor preklinisch en fundamenteel onderzoek6,21. Aangezien grote PDX-collecties de interpersoonlijke heterogeniteit van de patiëntenpopulatie adequaat weerspiegelen, is de PDX clinical trial (PCT)-benadering (één dier per model per behandeling) van belang geworden voor de ontwikkeling van geneesmiddelen, omdat hiermee de getrouwe voorspelling van de klinische respons op nieuwe geneesmiddelen en het combinatorische regime mogelijk is8. We evalueren momenteel ook nieuwe experimentele geneesmiddelen in kleine PCT-proeven.
Ondanks deze veelbelovende resultaten belemmert de mediane vestigingsduur van 12,2 maand de klinische toepasbaarheid van PDX-modellen als "avatarmuizen" voor het testen van behandelingsopties tegen kanker, althans voor patiënten die onmiddellijke adjuvante of zelfs neoadjuvante behandeling nodig hebben22. Een bijkomend nadeel van standaard PDX-modellen is het gebrek aan bruikbaarheid voor immunotherapietests als gevolg van de immunodeficiëntie van gastheermuizen. Om deze beperkingen te overwinnen, zijn verschillende "gemensiseerde" muisstammen ontwikkeld. Deze muizen zijn zwaar immuungecompromitteerd, maar kunnen worden gereconstitueerd met verschillende soorten menselijke beenmerg-afgeleide cellen of CD34+ hematopoietische stamcellen na PDX-uitgroei23, waardoor de evaluatie van lymfocytengemedieerde cytotoxiciteit en van therapierespons op immuun checkpoint inhibitor behandeling24,25.
In de afgelopen jaren kwamen patiënt-afgeleide organoïden (BOB) naar voren als belangrijke kankermodellen die concurreren met PDX. Afgeleid van intacte tumorstukken en gekweekt in een extracellulaire matrixsteiger, weerspiegelen deze driedimensionale structuren nauw de histologische en genetische eigenschappen van de oorspronkelijke tumor. De mogelijkheid van langdurige uitbreiding en cryopreservatie maakt BOB een ideaal supplement van een levende biobank26,27. Naast een relatief hoog vestigingspercentage is voor BOB van verschillende tumorentiteiten een betrouwbare voorspelling van de respons op geneesmiddelen gerapporteerd28. Bovendien zijn BOB 's zelfs gegenereerd uit circulerende tumorcellen en is ook de gelijktijdige vaststelling van organoïden uit overeenkomstig gezond weefsel mogelijk , waardoor de therapiegerelateerde toxiciteit op patiënt-individuele basis kan worden beoordeeld29,30. In vergelijking met conventionele 2D-celculturen is organoïde cultuur echter tijdrovend en kunnen kunstmatige extracellulaire matrixverbindingen bepaalde analytische procedures verstoren31. Bovendien zijn kankerorganoïden vatbaar voor overgroei door sneller groeiende, niet-kwaadaardige organoïden afkomstig van gezond epitheel30. Vanwege een gebrek aan stroma, bloedvaten en immuuncellen zijn BOB's meestal niet toepasbaar voor het testen van antiangiogene immunotherapeutische middelen. Toch maken nieuwe cultiveringsmethoden het mogelijk om tumormicromilieu in vitrote modelleren , waardoor BOB 's een echte kanshebber zijn voor PDX-modellen32. In de nabije toekomst zullen patiënt-individuele tumormodellen, gecombineerd met krachtige genetische hulpmiddelen zoals sequencing van de volgende generatie, hopelijk de weg effenen naar echte precisiegeneeskunde en op maat gemaakte behandelingsbenaderingen.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
We erkennen Jenny Burmeister, onze grafische assistent, vriendelijk voor het opnemen en bewerken van de video. Verder danken wij onze collega's van de chirurgische en pathologische afdeling voor de jarenlange samenwerking. We willen ook Marcus Müller, productiemanager van het IT- en Mediacentrum van de Universiteit van Rostock, bedanken voor het leveren van de audio-opnameapparatuur en het verfijnen van de geluidskwaliteit.
FINANCIERING: De Duitse Stichting voor Kankerhulp (DKH e.V.), subsidienummer 108446 en subsidienummer TBI-V-1-241-VBW-084 van de deelstaat Mecklenburg-Vorpommern financierden dit onderzoek deels.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacillol® AF; 1L | Bode, Hartmann | REF 973380 | desinfection |
| PP centrifuge tube, 15ml; sterile | Greiner Bio One | GBO Cat. No.:188271 | centrifuge tube |
| PP centrifuge tube, 50ml, sterile | Sarstedt | Order number: 62.547.254 | centrifuge tube |
| BD DiscarditTM II Syringe 20ml | BD | REF 300296 | blood collection |
| Serum 7,5ml Sarstedt Monovette | Sarstedt | Item number: 01.1601 | blood collection |
| serological Pipette 10ml | Sarstedt | REF 86.1254.001 | liquid transfer |
| Pipetboy ratiolab® accupetta | Ratiolab | Item number: RL3200300 | liquid transfer |
| PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | VWR Cat.No: 613-4438 | liquid transfer |
| DPBS; w/o Ca & Mg | Pan Biotech | Cat. No.: P04-36500 | washing |
| Pancoll human | Pan Biotech | Cat. No.: P04-60500 | density gradient centrifugation |
| DMEM/F12 (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | PAN Biotech | Cat. No.: P04-41500 | cell cultivation |
| FBS Good Forte (Filtrated Bovine Serum) | PAN Biotech | Cat. No.: P40-47500 | cell cultivation |
| L-Glutamine 200mM | PAN Biotech | Cat. No.: P04-80100 | cell cultivation |
| Trypsin / EDTA | PAN Biotech | Cat. No.: P10-023100 | cell cultivation |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxid for cell culture) | PanReac AppliChem | VWR Cat.No: A3672.0250 | cell freezing |
| Freezer Medium (FCS with 10% DMSO) | selfmade | --- | cell freezing |
| cryotube- CryoPure 2ml | Sarstedt | 72380 | cell freezing |
| 6-Well cell culture plate; steril; with lid | Greiner bio-one | Cat.-No.: 657 160 | cell cultivation |
| Petri dish 92 x 16 mm, PS, without cams | Sarstedt | Cat. No.: 82.1472.001 | tissue preparation |
| sterile surgical blades | B.Braun (Aesculap) | REF BB510 | tissue preparation |
| BD DiscarditTM II Syringe 10ml | BD | REF 309110 | tissue preparation |
| cell strainer; yellow; 100µm | Falcon | REF 352360 | tissue preparation |
| CoolCell | biocision | Item number: 210004 | cooling container with -1°C/min |
| Dewar transport vessel type 27 B, 2 l, 138 mm | KGW | Cat. No.: HT39.1 | transport system |
| Pipette tip 200µl | Sarstedt | REF 70.760.002 | liquid transfer |
| Filter tip 1000µl | Sarstedt | REF 70.762.411 | liquid transfer |
| Pipette 200µl, yellow | Eppendorf | Cat. No.: 3121 000.082 | liquid transfer |
| Pipette 1000µl, blue | Eppendorf | Cat. No.: 3121 000.120 | liquid transfer |
| incubator BB 6220 CU | Heraeus | Cat.-No.: 51012839 | cell cultivation |
| heating plate PRÄZITHERM | Harry Gestigkeit GmbH | --- | heating |
| Microscope Zeiss Primo Vert | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | Serial number. 3842000839 | imaging cell cultures |
| Sterile bench Safe flow 1.8 nunc | nunc GmbH & Co. KG | --- | sterile working bench |
| freezer -80°C | Kryotec-Kryosafe GmbH | --- | sample storage |
| Electronic balance MP-300 | Chyo | --- | Scale |
| BD Micro-fine, U100 insulin syringe | BD | REF 324826 | injection anesthetic |
| Rompun 2%; 25ml | Bayer | approval number: 6293841.00.00 | anesthesia |
| Ketamin 100 mg/ml, 25ml | CP-Pharma GmbH | approval number: 401650.00.00 | anesthesia |
| GES3S Reader | Datamars | not available | RFID reader |
| ISO-Transponder FDX-B (1,4x8mm) | Peddymark | --- | RFID chip |
| Cotrim-ratiopharm® Ampullen SF 480 mg/5 ml | Ratiopharm | PZN-03928197 | antibiotic drinking water |
| Heating plate #FM-20 42x28cm | Dragon | --- | heating |
| Heating lamp | Electric Petra, Burgau | --- | heating |
| Ointment for the eyes and nose (5% Dexpanthenol) Bepanthen | Bayer | PZN-01578675 | Eye protection |
| anatomical tweezer | B.Braun Aesculap | BD21 OR | surgical instruments |
| surgical tweezer | B.Braun Aesculap | BD50 1 R | surgical instruments |
| scissors | B.Braun Aesculap | BC05 6R | surgical instruments |
| needle holder | B.Braun Aesculap | BH1 1 OR | surgical instruments |
| Prolene 5-0 | Ethicon | XN8870.P32 | surgical suture material |
| Opsite moisture vapour permable spray dressing | Smith&Nephew | REF 66004978, PZN- 02063507 | surgical suture material |
| Adhesive aperture drape | Barrier | REF 904622 | sterile OP tissue |
| gauze swap Gazin®; steril; 10x10 cm | Lohmann&Rauscher | REF 18506 | sterile OP tissue |
| Raucotupf cotton tipped applicators | Lohmann&Rauscher | REF 11969 | applicator |
| Corning® Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | Cat.-No.: 354234 | Basement Membrane Matrix |
| iodine solution Braunol (7,5g povidone iodine) | B.Braun Melsungen AG | Item number: 18839 | desinfection |
| MACS® Tissue Storage Solution | Miltenyi Biotec GmbH | Order No.:130-100-008 | storage solution |
| Formafix 4% | Grimm med. Logistik GmbH | Item number: F10010G | fixation solution |
| Software FreezerworksBasic | Dataworks Development, Inc | --- | sample organization |
| Zebra TLP 2844 printer | Zebra | --- | label printer |
References
- Sartore-Bianchi, A., et al. PIK3CA mutations in colorectal cancer are associated with clinical resistance to EGFR-targeted monoclonal antibodies. Cancer research. 69 (5), 1851-1857 (2009).
- Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Lipson, D., et al. Identification of new ALK and RET gene fusions from colorectal and lung cancer biopsies. Nature medicine. 18 (3), 382-384 (2012).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer research. 74 (9), 2377-2384 (2014).
- Mouradov, D., et al. Colorectal cancer cell lines are representative models of the main molecular subtypes of primary cancer. Cancer research. 74 (12), 3238-3247 (2014).
- Klier, U., Maletzki, C., Kreikemeyer, B., Klar, E., Linnebacher, M. Combining bacterial-immunotherapy with therapeutic antibodies: a novel therapeutic concept. Vaccine. 30 (17), 2786-2794 (2012).
- DiMasi, J. A., Reichert, J. M., Feldman, L., Malins, A. Clinical approval success rates for investigational cancer drugs. Clinical pharmacology and therapeutics. 94 (3), 329-335 (2013).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- Mullins, C. S., et al. Integrated Biobanking and Tumor Model Establishment of Human Colorectal Carcinoma Provides Excellent Tools for Preclinical Research. Cancers. 11 (10), (2019).
- Kuehn, F., et al. Establishment and characterization of HROC69 - a Crohn's related colonic carcinoma cell line and its matched patient-derived xenograft. Scientific reports. 6, 24671 (2016).
- Dangles-Marie, V., et al. Establishment of human colon cancer cell lines from fresh tumors versus xenografts: comparison of success rate and cell line features. Cancer research. 67 (1), 398-407 (2007).
- Gock, M., et al. Tumor Take Rate Optimization for Colorectal Carcinoma Patient-Derived Xenograft Models. BioMed research international. 2016, 11715053 (2016).
- Collins, A. T., Lang, S. H. A systematic review of the validity of patient derived xenograft (PDX) models: the implications for translational research and personalised medicine. PeerJ. 6, 5981 (2018).
- Brown, K. M., et al. Patient-derived xenograft models of colorectal cancer in pre-clinical research: a systematic review. Oncotarget. 7 (40), 66212-66225 (2016).
- Zhang, L., et al. The extent of inflammatory infiltration in primary cancer tissues is associated with lymphomagenesis in immunodeficient mice. Scientific reports. 5, (2015).
- Moyer, A. M., et al. Spontaneous murine tumors in the development of patient-derived xenografts: a potential pitfall. Oncotarget. 10 (39), 3924-3930 (2019).
- Prall, F., Maletzki, C., Hühns, M., Krohn, M., Linnebacher, M. Colorectal carcinoma tumour budding and podia formation in the xenograft microenvironment. PloS one. 12 (10), 0186271 (2017).
- Guenot, D., et al. Primary tumour genetic alterations and intra-tumoral heterogeneity are maintained in xenografts of human colon cancers showing chromosome instability. The Journal of pathology. 208 (5), 643-652 (2006).
- Mattie, M., et al. Molecular characterization of patient-derived human pancreatic tumor xenograft models for preclinical and translational development of cancer therapeutics. Neoplasia. 15 (10), New York, N.Y. 1138-1150 (2013).
- Cho, Y. B., et al. Colorectal cancer patient-derived xenografted tumors maintain characteristic features of the original tumors. The Journal of surgical research. 187 (2), 502-509 (2014).
- Maletzki, C., et al. Functional Characterization and Drug Response of Freshly Established Patient-Derived Tumor Models with CpG Island Methylator Phenotype. PloS one. 10 (11), 0143194 (2015).
- Katsiampoura, A., et al. Modeling of Patient-Derived Xenografts in Colorectal Cancer. Molecular cancer therapeutics. 16 (7), 1435-1442 (2017).
- Wege, A. K., et al. Humanized tumor mice--a new model to study and manipulate the immune response in advanced cancer therapy. International journal of cancer. 129 (9), 2194-2206 (2011).
- Herndler-Brandstetter, D., et al. Humanized mouse model supports development, function, and tissue residency of human natural killer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 9626-9634 (2017).
- Capasso, A., et al. Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts. Journal for immunotherapy of cancer. 7 (1), 37 (2019).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), New York, N.Y. 920-926 (2018).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature reviews. Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Abe, Y., et al. Improved phosphoproteomic analysis for phosphosignaling and active-kinome profiling in Matrigel-embedded spheroids and patient-derived organoids. Scientific reports. 8 (1), 11401 (2018).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
