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Cancer Research

निर्माण और एक जीवित बायोबैंक के रखरखाव-हम यह कैसे करते है

Published: April 10, 2021 doi: 10.3791/62065
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 2, 2
1Department of General, Visceral, Vascular and Transplantation Surgery, University Medical Center Rostock, University of Rostock, 2Molecular Oncology and Immunotherapy, Department of General, Visceral, Vascular and Transplantation Surgery, University Medical Center Rostock, 3Institute of Pathology, University Medical Center Rostock

Summary

निम्नलिखित कार्य में, हम कोलोरेक्टल और अग्नाशय के कैंसर के एक बड़े बायोबैंक की स्थापना के लिए आवश्यक लगातार कदमों का वर्णन करते हैं।

Abstract

अंतर-व्यक्तिगत गुणों और कैंसर की विषमता के बारे में बढ़ते ज्ञान के प्रकाश में, व्यक्तिगत चिकित्सा के उभरते क्षेत्र को प्रीक्लिनिकल अनुसंधान के लिए एक मंच की आवश्यकता होती है। हाल के वर्षों में, हमने प्राथमिक ट्यूमर ऊतक, सामान्य ऊतक, सेरा, अलग परिधीय रक्त लिम्फोसाइट्स (पीबीएल), रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोग्राफ्ट (पीडीएक्स), साथ ही प्राथमिक और माध्यमिक कैंसर सेल लाइनों को शामिल करते हुए कोलोरेक्टल और अग्नाशय के कैंसर का एक बायोबैंक स्थापित किया है। चूंकि मूल ट्यूमर ऊतक सीमित है और प्राथमिक कैंसर सेल लाइनों की स्थापना दर अभी भी अपेक्षाकृत कम है, पीडीएक्स न केवल बायोबैंक के संरक्षण और विस्तार की अनुमति देता है बल्कि माध्यमिक कैंसर सेल लाइनों की पीढ़ी को भी अनुमति देता है। इसके अलावा, पीडीएक्स-मॉडल प्रीक्लिनिकल दवा परीक्षण के लिए वीवो मॉडल में आदर्श साबित हुए हैं। हालांकि, बायोबैंकिंग के लिए सावधानीपूर्वक तैयारी, सख्त दिशानिर्देश और एक अच्छी तरह से अभ्यस्त बुनियादी ढांचे की आवश्यकता होती है। कोलेक्टॉमी, डुओडेनोपेनक्रिएटेक्टोमी या पुनः प्राप्त मेटास्टेस नमूनों को रीसेक्शन के तुरंत बाद एकत्र किया जाता है और पैथोलॉजी विभाग में स्थानांतरित कर दिया जाता है। एक निष्पक्ष हिस्टोपैथोलॉजिकल रिपोर्ट की प्राथमिकता का सम्मान करते हुए, उपस्थित पैथोलॉजिस्ट के विवेक पर, जो विच्छेदन करता है, छोटे ट्यूमर के टुकड़े और गैर-ट्यूमर ऊतक काटे जाते हैं।

परिगलित भागों को त्याग दिया जाता है और शेष ट्यूमर ऊतक को छोटे, समान क्यूब्स में काट दिया जाता है और बाद में उपयोग के लिए क्रायोप्रेयर किया जाता है। इसके अतिरिक्त, ट्यूमर का एक छोटा सा हिस्सा प्राथमिक कैंसर सेल संस्कृति के लिए कीमा बनाया हुआ और तनावपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, रोगी से पूर्व और पश्चात से तैयार किए गए रक्त नमूनों को सीरम और पीबीएल प्राप्त करने के लिए संसाधित किया जाता है। पीडीएक्स एनग्रेफ्टमेंट के लिए, क्रायोप्रीवित नमूनों को शौच की कमी वाले चूहों के पार्श्व में कम से कम प्रत्यारोपित किया जाता है। जिसके परिणामस्वरूप पीडीएक्स ने "दाता" ट्यूमर की हिस्टोलॉजी को बारीकी से पुनः बढ़ाया और बाद में उपयोग के लिए बाद में ज़ेनोबेड़ाइंग या क्रायोप्रेयरेक्ट के लिए उपयोग किया जा सकता है। निम्नलिखित कार्य में, हम कोलोरेक्टल और अग्नाशय के कैंसर के एक बड़े बायोबैंक के निर्माण, रखरखाव और प्रशासन के व्यक्तिगत चरणों का वर्णन करते हैं। इसके अलावा, हम बायोबैंकिंग से जुड़े महत्वपूर्ण विवरणों और चेतावनी को उजागर करते हैं।

Introduction

हाल के वर्षों में, कैंसर के रूप में आकृति, नैदानिक और आनुवंशिक गुणों के संचित ज्ञान के कारण कैंसर की अवधारणा को विषम, व्यक्तिगत रोग के रूप में जन्म दिया । नतीजतन, नैदानिक और रोग सुविधाओं के अलावा नियोप्लाज्म्स के उत्परिवर्तनीय लक्षण वर्णन ने नैदानिक निर्णय लेने के लिए महत्व प्राप्त किया है और विभिन्न आणविक परिवर्तनों के लिए कई लक्षित उपचार विकसित किए गए थे। उदाहरण के लिए, कोलोरेक्टल कैंसर के इलाज में सेटुक्सीमैब की प्रभावकारिता केआरएएस और PIK3CA उत्परिवर्तनीय स्थिति1के विश्लेषण से भविष्यवाणी की जा सकती है। सटीक दवा का उद्देश्य प्रत्येक रोगी में उच्चतम उपचार प्रतिक्रिया प्रदान करने और अप्रभावी उपचारों की विषाक्तता से बचने के लिए एक सिलवाया दृष्टिकोण का लक्ष्य है2. बायोबैंकों में कैंसर रोगियों के ऊतक, रक्त और अन्य जैविक सामग्री होती हैं, जो नैदानिक डेटा से जुड़ी होती हैं, और इस प्रकार ट्रांसलेशनल कैंसर अनुसंधान के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण हैं। नैदानिक नमूनों की बड़ी संख्या के कारण, बायोबैंक दुर्लभ, लेकिन संभावित नशा म्यूटेशन का पता लगाने में सक्षम होते हैं, जो व्यक्तिगत रोगी3के लिए नए उपचार के अवसर प्रदान करता है।

एक ऑन्कोलॉजिक अनुसंधान स्पेक्ट्रम के रूप में व्यापक रूप से कवर करने के लिए, हमने अकेले नमूना कटाई पर अपनी गतिविधि को नियंत्रित नहीं किया, बल्कि रोगी-व्युत्पन्न कैंसर सेल लाइनों और ज़ेनोग्राफ्ट्स (पीडीएक्स) की स्थापना पर ध्यान केंद्रित किया। पारंपरिक 2डी सेल लाइनें इन विट्रो अनुसंधान का कोना पत्थर बनी हुई हैं और बड़े पैमाने पर दवा स्क्रीनिंग4,5के लिए प्रमुख विकल्प हैं । इसके अलावा, सेल लाइन विश्लेषण अक्सर आसान, सस्ता और अधिक आसानी से उपलब्ध है। इसके अतिरिक्त, चूंकि रोगी-व्युत्पन्न परिधीय रक्त लिम्फोसाइट्स (पीबीएल) उपलब्ध हैं, इसलिए विट्रो6में ट्यूमर इम्यूनोलॉजी का भी अध्ययन किया जा सकता है। हालांकि, विट्रो में या वीवो प्रयोगों में आधारित कोशिका में आशाजनक प्रीक्लिनिकल प्रभावता के साथ नव विकसित दवाओं के बहुमत ने नैदानिक परीक्षणों में निराशाजनक परिणाम दिखाए हैं7। इसके विपरीत, वीवो अध्ययनों में पीडीएक्स पर आधारित प्रीक्लिनिकल अध्ययनों ने एंटीनोप्लास्टी एजेंटों की नैदानिक गतिविधि को अधिक ईमानदारी से8रूप से परिलक्षित किया है। चूंकि पीडीएक्स ऊतक दाता ट्यूमर के हिस्टोलॉजिकल और आणविक गुणों को बारीकी से दर्शाता है, इसलिए पीडीएक्स मॉडल बायोबैंक की अखंडता को बनाए रखने और अनुसंधान समूहों और संस्थानों के बीच नमूनों के आदान-प्रदान की अनुमति देने के लिए अक्सर बहुत सीमित ट्यूमर ऊतकों का प्रचार करने का एक अच्छा तरीका है। इसके अलावा, पीडीएक्स ऊतक से प्राप्त कैंसर सेल लाइनों को प्राथमिक कैंसर सेल लाइनों 9 की तुलना में काफी आसानस्थापितकिया जा सकता है। हाल के वर्षों में, हमारे कार्य समूह ने प्रश्न में सभी जैविक नमूनों के लिए कार्य प्रवाह को मापने और अनुकूलन करके एक व्यापक एकीकृत कोलोरेक्टल और अग्नाशय के कैंसर बायोबैंक की स्थापनाकी है (चित्र 1)।

Figure 1
चित्रा 1:कार्यप्रवाह और बायोबैंक के संगठन कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Protocol

निम्नलिखित अध्ययन विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र Rostock (द्वितीय HV 43/2004, एक 45/2007, एक 2018-0054, एक 2019-0187 और एक 2019-0222) के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया है । इसके अलावा, सभी पशु चिकित्सा प्रासंगिक प्रक्रियाओं को लैंडेसमैट फ्यूर लैंडवर्ट्सचैफ्ट, लेबेन्समिटेलसिचेर्चेट एंड फिशरेरी मेकेलेनबर्ग-वोर्पोमर्न द्वारा पंजीकरण संख्या के तहत अनुमोदित किया गया है।

1. प्रायोगिक आवश्यकताएं

  1. बायोबैंक स्थापित करने और बनाए रखने के लिए कई महत्वपूर्ण ढांचे की स्थितियों को पूरा करें।
    1. एक शल्य चिकित्सा विभाग और एक अच्छी तरह से सुसज्जित प्रयोगशाला और पर्याप्त अकादमिक कर्मचारियों के साथ एक साथ ऑन्कोलॉजिकल resections की पर्याप्त संख्या के साथ एक क्लिनिक का उपयोग करें । एक अच्छा बुनियादी ढांचा और एक सहयोग पैथोलॉजी विभाग के साथ एक दृढ़ संपर्क आगे की आवश्यकता है ।
    2. वीवो अनुसंधान में, इम्यूनोडिफिशिएंसी चूहों के लिए उपयुक्त आवास शर्तों के साथ एक पशु सुविधा का उपयोग करें।
    3. स्वास्थ्य देखभाल आचार समिति से रोगी-व्युत्पन्न सामग्री पर किसी भी शोध पर प्राधिकरण प्राप्त करें। स्थानीय सांविधिक विनियमों के अनुसार सक्षम प्राधिकारी से वीवो अनुसंधान में किसी पर अनुमोदन प्राप्त करें।

2. नमूना संग्रह

  1. सर्जरी से पहले दिन
    1. बायोबैंकिंग पात्रता के लिए पुन: प्राप्त कोलोरेक्टल या अग्नाशय के कैंसर और/या इसी मेटास्टेस के साथ सभी रोगियों का मूल्यांकन करें । नियोएडजुवेंट प्रीट्रीटमेंट, बहुत छोटे ट्यूमर, अनिश्चित गरिमा या घावों के ट्यूमर के साथ मामलों को शामिल करने से बचें जिन्हें आंशिक रूप से एंडोस्कोपिक रूप से पहले पुन: प्राप्त किया गया है।
    2. शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के बारे में सूचित सहमति चर्चा के दौरान रोगी से भागीदारी का लिखित अनुमोदन प्राप्त करें। समय पर सभी शामिल सर्जन, प्रयोगशाला टीम के साथ ही रोगविज्ञानी को सूचित करें।
  2. नमूना अधिग्रहण
    1. ऑपरेशन रूम (ओआर) में सभी अटेंडेंट्स को सर्जिकल प्रक्रिया शुरू होने से तुरंत पहले बायोबैंक के लिए ऊतक संग्रह के बारे में सूचित करें।
      नोट: यह महत्वपूर्ण है कि ऊतक को फॉर्मेलिन में तय नहीं किया जाना चाहिए। यदि ऊतक फॉर्मेलिन में डूबे हुए हैं, तो यह एकीकृत बायोबैंकिंग के लिए अनुपयुक्त हो जाता है।
    2. हेपरिनाइज्ड ब्लड (2 x 20 एमएल सिरिंज) के 40 एमएल ड्रा के साथ-साथ एनेस्थेटिक इंडक्शन के तुरंत बाद एक स्टैंडर्ड 7.5 एमएल सीरम ट्यूब और पीबीएल आइसोलेशन और सीरम प्रोसेसिंग के लिए लैब में जल्दी ट्रांसफर करें (स्टेप 3-4 देखें)।
    3. ऑपरेटिंग टेबल से सीधे पुनः प्राप्त नमूना प्राप्त करें, इसे एक उपयुक्त कंटेनर में रखें और इसे पैथोलॉजिकल विभाग में ले जाएं। संचलन, resection और विकृति पर आगमन से टुकड़ी के समय बिंदु लिखें।
      नोट: जैव बैंकिंग के लिए नमूने की उपयुक्तता का आकलन सहयोग करने वाले पैथोलॉजिस्ट द्वारा किया जाना चाहिए जो ट्यूमर और गैर-घातक ऊतकों का एक टुकड़ा विच्छेदित करता है। नमूने के किसी भी हिस्से को स्वयं द्वारा उत्पादित न करें जो बाद की पैथोलॉजिकल रिपोर्ट से समझौता कर सकता है।
    4. दोनों टिश्यू पीस को अलग-अलग 15 से 50 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में 10 से 30 एमएल टिश्यू स्टोरेज सॉल्यूशन (या डीपीबीएस) के साथ बर्फ पर रखें। रसीद का समय लिखें और नमूनों को तुरंत लैब में स्थानांतरित करें।
      नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल चरण 3-6 सख्त बाँझ परिस्थितियों में एक लेमिनार प्रवाह कैबिनेट में आयोजित किया जाना चाहिए। कमरे के तापमान पर सभी तरल पदार्थों का उपयोग करें।

3. सीरम प्रोसेसिंग

  1. सेंट्रलाइज 7.5 एमएल सीरम ट्यूब 1128 x g पर और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 15 मिनट के लिए एक पूर्व ठंडा अपकेंद्रित्र में।
  2. प्री-लेबल वाले क्रायोट्यूब में प्रति ट्यूब 1 एमएल सीरम और तरल नाइट्रोजन में फ्रीज करें।

4. घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र द्वारा पीबीएल का अलगाव

नोट: दो 20 मिली सीरिंज में से प्रत्येक के साथ समानांतर काम करते हैं ।

  1. 50 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में 20 एमएल हेपरिनाइज्ड ब्लड भरें और डीपीबीएस के 15 एमएल जोड़ें।
  2. एक सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ पैनकोल के 15 एमएल लें, पिपेट को पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब के नीचे तक ध्यान से डालें और रक्त/डीबीपीएस कॉलम के नीचे एक परत बनाने के लिए पैनकोल को बहुत धीरे-धीरे छोड़ें।
  3. ब्रेक के बिना 15 मिनट के लिए 375 x g पर सेंट्रलाइज।
  4. दोनों नमूनों के मध्य और शीर्ष स्तंभ के बीच अपारदर्शी इंटरफेज परत को एक ताजा 50 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में स्थानांतरित करें और डीपीबीएस से 50 एमएल तक भरें।
  5. ब्रेक के साथ 15 मिनट के लिए 270 x g पर सेंट्रलाइज।
  6. सुपरनेट को एस्पिरेट करें और त्यागें, फ्रीजर माध्यम के 4.5 एमएल में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें।
  7. एलिकोट प्रति क्रायोट्यूब निलंबन का 1.5 एमएल, ट्यूबों को कसकर बंद करें और उन्हें धीमी ठंड के लिए उपयुक्त फ्रीजिंग कंटेनर में रखें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

5. ऊतक प्रसंस्करण

नोट: न्यूक्लिक एसिड की अखंडता को बनाए रखने के लिए ट्यूमर और स्वस्थ ऊतकों के स्नैप जमे हुए नमूनों की पीढ़ी के साथ शुरू करें।

  1. ट्यूमर ऊतक नमूना
    1. ट्यूमर के नमूने को पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब से टिश्यू स्टोरेज सॉल्यूशन के कई एमएल के साथ पेट्री डिश में ट्रांसफर करें। यदि आवश्यक हो तो डीपीबीएस के साथ कुल्ला। नमूना छूने से बचें और ऊतक को संभालने के लिए दो बाँझ स्केलपेल का उपयोग करें। किसी भी समय ह्रास से बचें।
    2. ट्यूमर के नमूने को एक अलग डिश में सुविधाजनक पैमाने पर तौलें और टिश्यू वजन पर ध्यान दें।
    3. काटने से पहले ट्यूमर ऊतक के आकार, आकार और ऊतक की गुणवत्ता का मूल्यांकन करें। स्नैप फ्रीजिंग के लिए पिनहेड के आकार के बारे में कम से कम एक टुकड़ा प्राप्त करने का लक्ष्य रखें और महत्वपूर्ण क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए लगभग30 मिमी 3 (एज लेंथ 3 x 3x 3 मिमी) प्रत्येक के चार क्यूब्स। जितना संभव हो चौगुनी में30 मिमी 3 -क्यूब्स उत्पन्न करें और प्रति 5 चौगुनी तस्वीर ठंड के लिए एक टुकड़ा उत्पन्न करें। यह भी ध्यान रखें कि परिगलित भागों को काट दिया जाना चाहिए ताकि क्यूब्स में केवल महत्वपूर्ण ऊतक शामिल हों।
    4. 3 मिमी मोटाई के स्लाइस उत्पन्न करें। नेक्रोटिक भागों को काटें, जेल की तरह या तरल द्रव्यमान के रूप में अलग करें, और स्लाइस को दो वांछित आकारों के क्यूब्स में काट लें।
      नोट: इस बिंदु पर किसी भी ऊतक को न त्यागें।
    5. स्नैप फ्रीजिंग
      1. तदनुसार क्रायोट्यूब लेबल करें (चरण 7.7 देखें)।
      2. एक छोटे ऊतक टुकड़ा प्रति पूर्व लेबल क्रायोट्यूब रखें। नमूनों को तुरंत तरल नाइट्रोजन में कई मिनट के लिए जलमग्न करें और बाद में -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    6. महत्वपूर्ण ऊतकों का क्रायोप्रिजर्वेशन
      1. तदनुसार क्रायोट्यूब लेबल करें (चरण 7.7 देखें) और प्रत्येक को फ्रीजर माध्यम के 1.5 एमएल से भरें। बेंच के बगल में फ्रीजिंग कंटेनर रखें।
        नोट: जितनी जल्दी हो सके अगले चरणों का पालन करें । चूंकि फ्रीजर माध्यम में डीएमएसओ में साइटोटॉक्सिक गुण होते हैं, इसलिए उचित शीतलन के बिना फ्रीजर माध्यम में ऊतक के जलमग्न होने का समय 2 मिनट से अधिक नहीं होना चाहिए।
      2. चौगुनी में 30मिमी 3 क्यूब्स की व्यवस्था करें। फेंकना परिगलित ऊतक और अन्य अवशेष पकवान के किनारे पर रहते हैं, लेकिन उन्हें त्यागें नहीं।
      3. स्केलपेल ब्लेड के साथ क्यूब्स स्कूप करें और क्रायोट्यूब प्रति 4 क्यूब्स ट्रांसफर करें। सुनिश्चित करें कि ट्यूमर के टुकड़े पूरी तरह से फ्रीजर माध्यम में डूबे हुए हैं। ट्यूबों को कसकर बंद करें और उन्हें धीमी ठंड के लिए उपयुक्त फ्रीजिंग कंटेनर में रखें और -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें।
      4. -140 डिग्री सेल्सियस या उससे कम पर दीर्घकालिक भंडारण के लिए क्रायोट्यूब को एक अनुकूल भंडारण प्रणाली में स्थानांतरित करें। प्रयोगशाला सूची प्रबंधन प्रणाली में प्रलेखन अनिवार्य है।
  2. स्वस्थ ऊतक नमूना: दोहराएं कदम 5.1.1. स्वस्थ ऊतक नमूने के लिए 5.1.6.4 करने के लिए।

6. प्राथमिक सेल संस्कृति

  1. ट्यूमर ऊतक के अवशेषों को विघटित करें, जिसमें परिगलित स्क्रैप शामिल है, पेट्री डिश में स्केलपेल के साथ जितना संभव हो उतना छोटे टुकड़ों में।
  2. 50 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब के शीर्ष पर एक बाँझ सेल छींटे (100 माइक्रोन पोर आकार) रखें।
  3. पेट्री डिश में डीपीबीएस के 5-10 एमएल जोड़ने के लिए एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें, ऊतक अवशेषों को फ्लोट करें और निलंबन उत्पन्न करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें।
  4. पिपेट के साथ निलंबन को सेल छन्नी में स्थानांतरित करें।
  5. जब तक सभी ऊतकों को पेट्री डिश से हल नहीं किया जाता तब तक चरण 6.3-6.4 दोहराएं।
  6. सेल छलनी के माध्यम से सेल और ऊतक निलंबन निचोड़ करने के लिए एक 20 एमएल एक तरह से सिरिंज के प्लंजर का प्रयोग करें।
  7. ताजा डीपीबीएस के 5-10 एमएल के साथ कुल्ला, सेल छन्नी त्यागें और ट्यूब को ठीक से बंद करें।
  8. 5-10 मिनट के लिए 180 x g पर निलंबन अपकेंद्रित्र।
  9. एक कोलेजन-1 प्रीकोटेड 6 अच्छी तरह से प्लेट तैयार करें जिसमें 1.5 एमएल मध्यम प्रति अच्छी तरह से है।
  10. अधिष्ठाता को त्यागें और त्यागें। डीपीबीएस या माध्यम के 3 एमएल में गोली को फिर से रखें और प्रत्येक कुएं में निलंबन के 500 माइक्रोन जोड़ें। प्लेट को इनक्यूबेटर में रखें (100% आर्द्रता, 5% सीओ2,37 डिग्री सेल्सियस)
  11. सेल विकास और प्रदूषण के लिए प्रतिदिन प्लेट की निगरानी करें।
    नोट: एक स्थायी सेल लाइन की स्थापना के बिंदु तक आगे सेल खेती यहां वर्णित नहीं है ।

7. पीडीएक्स जनरेशन

  1. केवल उचित रूप से योग्य व्यक्तियों द्वारा अपने अधिकार क्षेत्र के सक्षम अधिकारी की आवश्यकताओं को पूरा करके आईएन वीवो प्रयोगों का संचालन करें।
  2. विशिष्ट रोगजनक मुक्त (एसपीएफ) स्थितियों के तहत घर इम्यूनोडिफिशिएंसी चूहों का उपयोग माउस तनाव की मांगों को संतुष्ट करता है। स्वच्छ उपायों में व्यक्तिगत रूप से हवादार पिंजरे, ऑटोक्लेव भोजन, पानी और घोंसले की सामग्री के साथ-साथ एक सुरक्षा एयर लॉक और व्यक्तिगत, सुरक्षात्मक उपकरण पहनना शामिल है।
  3. ऑटोक्लेव सभी उपकरणों को पहले से ही और पार संदूषण से बचने के लिए प्रत्येक ट्यूमर मामले के लिए उपकरणों का केवल एक सेट का उपयोग करें। ट्यूमर के ऊतकों को यथासंभव एसेप्टिक के रूप में संभालें। नीचे नामित सभी प्लास्टिक आइटम बाँझ, एकल उपयोग और प्रत्येक सर्जरी के बाद त्याग दिया जाना चाहिए ।
    नोट: क्रायोट्यूब प्रति चार ट्यूमर ऊतक टुकड़े ठंड की विधि से निर्धारित, PDX पीढ़ी हमेशा नमूना प्रति दो चूहों की आवश्यकता है, आदर्श चार PDX ट्यूमर में जिसके परिणामस्वरूप ।
  4. प्रयोगशाला इन्वेंट्री प्रबंधन प्रणाली के माध्यम से एनग्रफ्टमेंट के लिए वांछित प्राथमिक ट्यूमर चुनें और नमूना (महत्वपूर्ण रूप से संरक्षित ट्यूमर ऊतक) को मुख्य भंडारण टैंक से पोर्टेबल तरल नाइट्रोजन कंटेनर में स्थानांतरित करें (सूखी बर्फ पर -80 डिग्री सेल्सियस पर मध्यवर्ती भंडारण भी सुविधाजनक है)।
  5. एसपीएफ-सेक्शन (स्क्रब्स, मोज़री, एप्रन, हेयर कवर, सर्जिकल मास्क और ओवरशूज) में प्रवेश करने से पहले व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों पर रखें, अपने हाथों और सभी उपकरणों को कीटाणुरहित करें।
  6. मातृगील भिगोने
    1. क्रायोट्यूब को तरल नाइट्रोजन कंटेनर के रूप में निकालें और नमूने के विगलन का इंतजार करें।
    2. 50 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब को लेबल करें और डीपीबीएस के 35 एमएल से भरें।
    3. क्रायोट्यूब को ऊपर और नीचे झुकाएं और जैसे ही टिश्यू-मीडियम-स्लश को शिफ्ट किया जा सकता है, तुरंत कंटेंट को पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में ट्रांसफर कर दें । धीरे से ट्यूमर ऊतक टुकड़े कुल्ला, एक अलग पोत में ट्यूब से मुख्य मात्रा त्यागने, ढक्कन बंद करो और ट्यूब ऊपर की ओर नीचे डाल दिया, ताकि चार ऊतक टुकड़े ढक्कन में इकट्ठा ।
    4. ठंडा संचायक पर एक पेट्री डिश रखो और बीच में एक बूंद के रूप में Matrigel के १०० μL जगह है । ट्यूमर के टुकड़ों को मैट्रिगेल में स्थानांतरित करने के लिए शारीरिक संदंश का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक टुकड़ा पूरी तरह से मातृगेल के साथ कवर किया गया है। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  7. माउस संज्ञाहरण (प्रति नमूना 2 चूहों, समानांतर में काम करते हैं)
    1. एक 3:1-एक केटामाइन (१०० मिलीग्राम/एमएल) और जाइलाज़ीन (20 मिलीग्राम/एमएल) संवेदनाहारी समाधान का स्टॉक तैयार करें । अनुशंसित खुराक 90/6 मिलीग्राम/किलो शरीर का वजन है।
    2. माउस का वजन करें और आवश्यक एनेस्थेटिक समाधान को एक ही उपयोग इंसुलिन सिरिंज में खींचें।
    3. पिंजरे के ग्रिड पर माउस रखें, एक हाथ से अपनी पूंछ धीरे खींचने के लिए एक आगे आंदोलन प्रेरित और एक साथ दूसरे हाथ की एक चुटकी पकड़ के साथ गर्दन केकड़ा । ग्रिड के माउस को उठाएं और होल्डिंग हाथ को चालू करें, ताकि जानवर की पीठ आपकी हथेली पर टिकी रहे। अपनी पिंकी के साथ पिछले पैरों में से एक को स्थिर करें और मादक पदार्थों को इंट्रापेरिटी रूप से इंजेक्ट करें। माउस को अपने पिंजरे में वापस रखो और मादक प्रेरण का इंतजार करें।
    4. हीटिंग प्लेट पर एनेस्थेटाइज्ड माउस रखें और कॉर्नियल नुकसान से बचने के लिए आंखों को मरहम से ढक दें। सर्जिकल संदंश के साथ माउस के पीछे पैर धीरे चुटकी द्वारा संज्ञाहरण की गहराई गधे।
      नोट: आंदोलन की अनुपस्थिति गहरी नार्कोसिस इंगित करता है। किसी भी प्रकार के आंदोलन को वांछित मादक गहराई तक पहुंचने के लिए अधिक समय या एनेस्थेटिक्स की अतिरिक्त खुराक की आवश्यकता होती है।
  8. सर्जिकल प्रक्रिया
    1. माउस की गर्दन को चुटकी देकर त्वचा को फोल्ड करें और माइक्रोचिप को एप्लिकेटर के साथ संक्षेप में इंजेक्ट करें (प्रोग्रामिंग विवरण के लिए चरण 9 देखें)
    2. यदि आवश्यक हो तो माउस के फ्लैंक को शेव करें (एनएमआरआईनू/नू चूहों को शेविंग की आवश्यकता नहीं है), कपास झाड़ू के साथ पोविडोन-आयोडीन लागू करें और एक बाँझ क्षेत्र बनाने के लिए सर्जिकल ड्रेप का उपयोग करें।
    3. शल्य चिकित्सा संदंश के साथ पार्श्व की त्वचा लिफ्ट, लगभग 4 मिमी का एक छोटा सा चीरा बनाने के लिए और कैंची के साथ कुंद तैयारी के द्वारा एक छोटे से चमड़े के नीचे जेब फार्म।
    4. प्रत्येक जेब में एक ट्यूमर टुकड़ा रखो और यह पीछे के अंत में जगह है।
    5. एक 100 माइक्रोल पिपेट टिप के अंत को क्लिप करें और पेट्री डिश से शेष मैट्रिक्स को एस्पिरेट करें और इसे प्रत्येक त्वचा की जेब में समान रूप से लागू करें।
    6. घावों को सरल बाधित टांके के साथ बंद करें और स्प्रे ड्रेसिंग लागू करें।
  9. माइक्रोचिप को स्कैन करें और माउस और ट्यूमर-आईडी की वैधता की जांच करें।
  10. ताजा बिस्तर और घोंसले की सामग्री के साथ एक नया पिंजरे तैयार करें, साथ ही एक पीसने वाली छड़ी भी। कागज तौलिए से बाहर एक "तकिया" गुना और एक अवरक्त गर्मी दीपक के नीचे ऊंचा सिर के साथ माउस नीचे रखना ।
  11. 100 मिली लीटर पीने के पानी के साथ ट्राइमेटहोरिम/सल्फेमेथोक्साजोल (400 मिलीग्राम/80 मिलीग्राम) का 0.25 एमएल मिलाएं और पीने की बोतल के माध्यम से प्रशासित करें। गौर करें कि एक माउस प्रतिदिन लगभग 150 एमएल प्रति किलोग्राम शरीर के वजन का उपभोग करता है।
    नोट: चूंकि चमड़े के नीचे पीडीएक्स-मॉडल पश्चात दर्द से जुड़ा नहीं है, न तो घाव भरने की प्रक्रिया के दौरान, न ही ट्यूमर आउटग्रोथ के दौरान, पश्चात एनाल्जेसिया की आवश्यकता नहीं है। कृपया ध्यान दें कि आपकी संस्था/प्राधिकरण के पशु कल्याण दिशानिर्देश भिन्न हो सकते हैं।
  12. प्रायोगिक पशुओं की निगरानी
    1. संकट के संकेतों के लिए चूहों की दैनिक निगरानी करें। यह योग्य पशु देखभाल करने वालों को प्रत्यायोजित किया जा सकता है।
    2. 4 सप्ताह के लिए उपरोक्त खुराक के साथ पश्चात एंटीबायोटिक उपचार रखें। प्रति सप्ताह दो बार एंटीबायोटिक मिश्रण को बदलें।
    3. ट्यूमर के आकार को प्रति सप्ताह कम से कम एक बार मापें, आदर्श रूप से दैनिक, एक कैलिपर (ट्यूमर की मात्रा = 0.52 x लंबाई एक्स चौड़ाई एक्स ऊंचाई[मिमी 3])और डेटाबेस में रिकॉर्ड के साथ।

8. पीडीएक्स कटाई और प्रसंस्करण

  1. फसल और पीडीएक्स ट्यूमर की प्रक्रिया, जब:
    ट्यूमर का आकार 1.500 मिमी3के लक्ष्य की मात्रा तक पहुंचता है।
    ट्यूमर असर जानवर संकट और/या रोग और उपचार के लक्षण दिखाता है व्यर्थ है ।
    ट्यूमर अल्सर हो जाता है या माउस की त्वचा में प्रवेश करता है।
  2. सही पीडीएक्स की पहचान करने के लिए माइक्रोचिप पढ़ें।
  3. उदाहरण के लिए सीओ2-एस्फिक्सेशन या केटामाइन/जाइलाज़ीन इंजेक्शन के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद एक कानूनी विधि (राष्ट्रीय दिशा-निर्देशों के आधार पर) द्वारा माउस को इच्छामृत्यु दें।
  4. फ्लैंक पर सर्जिकल संदंश के साथ त्वचा को उठाएं और ट्यूमर से कुछ मिलीमीटर दूर मेटज़ेनबॉम कैंची के साथ चीरा दें।
  5. कुंद तैयारी द्वारा ट्यूमर के ऊपर त्वचा को अलग करें, फिर ध्यान से ट्यूमर को शारीरिक संदंश के साथ समझें और शरीर के सतही प्रावरणी से ट्यूमर को अलग करें।
  6. डीपीबीएस के साथ ट्यूमर कुल्ला, यह एक पेट्री डिश में डाल दिया और आसन्न संयोजी ऊतक को दूर।
  7. इस बिंदु पर, निम्नलिखित में से एक प्रदर्शन करें:
    1. 30 मिमी3 क्यूब्स काटें और नए पीडीएक्स बनाएं (बिंदु 7.7.4 पर प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ें)।
    2. ट्यूमर को स्लाइस में काटें, जिन्हें फिर हिस्ट्रोलॉजी कैसेट में स्थानांतरित किया जाता है और बाद में पैराफिन एम्बेडिंग के लिए 4% फॉर्मलडिहाइड में संरक्षित किया जाता है।
    3. ऊतक भंडारण समाधान के साथ एक ट्यूब में ट्यूमर की रक्षा के लिए यह बायोबैंक में जोड़ने के लिए (3 कदम पर प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ें.) और/या PDX-व्युत्पन्न सेल लाइनों बनाने (4 कदम पर प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ें.)

9. बायोबैंक और डेटा प्रबंधन

  1. तालिका 1के अनुसार प्रत्येक ट्यूमर मामले के लिए एक आंतरिक आईडी असाइन करें ।
प्रयोगशाला स्थान/नाम कैंसर इकाई लगातार केस नंबर विस्‍तृत जानकारी लगातार संख्या
सी=कोलोरेक्टल _Met = मेटास्टेसिस
पी = अग्नाशय _Tu = ट्यूमर
उदाहरण: HROC389_Met2 = रोस्टॉक, कोलोरेक्टल कैंसर, केस 389, दूसरा मेटास्टेसिस

तालिका 1: नमूना आईडी की परिभाषा।

  1. ट्यूमर-आईडी के साथ इलेक्ट्रॉनिक और पेपर फॉर्म में मरीज की सहमति स्टोर करें।
  2. जितना संभव हो उतना नैदानिक डेटा इकट्ठा करें और उन्हें अनाम और अलग से स्टोर करें।
  3. डेटा प्रबंधन सॉफ्टवेयर (जैसे, फ्रीजरवर्क्स) या अन्य का उपयोग करें और तापमान प्रतिरोधी, स्वयं-चिपके हुए बार कोड लेबल उत्पन्न करने के लिए लेबल प्रिंटिंग सॉफ्टवेयर के साथ एक इंटरफ़ेस बनाएं।
  4. डेटा प्रबंधन सॉफ्टवेयर खोलकर एक नया नमूना जोड़ें, नमूना प्रकार को परिभाषित करें और निम्नलिखित जानकारी रिकॉर्ड करें: ट्यूमर आईडी, ऊतक प्रकार, फ्रीजिंग विधि, तिथि, जिम्मेदार कर्मचारी, पैसेज नंबर, माउस आईडी और माउस तनाव।
  5. भंडारण टैंक में विशिष्ट पदों के लिए नमूनों को असाइन करें।
  6. पीडीएक्स का ट्रेसिंग और मॉनिटरिंग (7-8 चरण पर लागू होता है)
    1. ट्यूमर आईडी, प्रत्यारोपण की तारीख, इच्छामृत्यु की तारीख, माउस उम्र और तनाव के साथ-साथ समय के साथ ट्यूमर वृद्धि रिकॉर्ड करने के लिए पोर्टेबल, ब्लूटूथ-सक्षम डिवाइस (लैपटॉप या टैबलेट) पर एमएस एक्सेस डेटा बेस (या इसी तरह की प्रणाली) का उपयोग करें।
    2. माइक्रोचिप रीडर को डिवाइस से कनेक्ट करें और प्रत्यारोपण से पहले माइक्रोचिप को पढ़ें।
    3. प्रत्येक माउस को एक विशिष्ट आईडी असाइन करें; हम निम्नलिखित योजना का उपयोगकरते हैं: (नीचे तालिका 2 देखें)
    4. प्रत्यारोपण के बाद, डेटा बेस में माउस विशेषताओं के साथ आईडी रिकॉर्ड करें।
    5. माइक्रोचिप को फिर से पढ़ें और चेक करें, अगर माइक्रोचिप के स्पेसिफिकेशन, डेटा बेस और क्रायोट्यूब लेबल लगातार हैं ।
    6. तदनुसार प्रत्येक माउस पिंजरे के लिए एक लेबल बनाएं।
      नोट: एक भौतिक बैक अप बनाने के लिए, इसी माइक्रोचिप लेबल के साथ क्रायोट्यूब लेबल को एक पुस्तिका और नोट तिथि और माउस तनाव में चिपकाएं।
    7. व्यक्तिगत PDX के ट्यूमर विकास की निगरानी करने के लिए, पहचान के लिए डेटा बेस डिवाइस से जुड़े पाठक के साथ माउस के माइक्रोचिप स्कैन और ट्यूमर प्रत्येक सप्ताह कैलिपर द्वारा मापा आकार रिकॉर्ड ।
    8. ट्यूमर के विकास वक्र का विश्लेषण करके पीडीएक्स कटाई के आदर्श समय बिंदु की योजना बनाएं।
ट्यूमर आईडी एन2 में पूर्व भंडारण (=f) मार्ग (=T) संख्या लगातार माउस (=M) संख्या
उदाहरण: HROP12 fT0 M1 = Rostock, अग्नाशय के कैंसर, केस 12, जमे हुए प्राथमिक ऊतक, पहला मार्ग, माउस 1 से उत्पन्न।

तालिका 2: पीडीएक्स आईडी की परिभाषा।

Representative Results

हमारे हाथ में, प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों की स्थापना दर(चित्रा 2 ए और बी)एक बड़ी श्रृंखला 9 में१२.९%थी । ताजा सर्जिकल पुनः प्राप्त नमूनों से विस्तारयोग्य ट्यूमर कोशिकाओं को अलग करने के प्रयासों के बहुमत वृद्धि या जल्दी संदूषण की कमी के कारण विफल रहा । मानक संस्कृति स्थितियों (डीएमईएम, 10% एफसीएस, मानक संस्कृति पोत) और FACS-विश्लेषण10के माध्यम से एपिथेलियल भेदभाव के सत्यापन के साथ 3 मार्ग के बाद सेल लाइन स्थापना को सफल माना गया था। पीडीएक्स ट्यूमर(चित्रा 2 सी और डी)से प्राप्त सेल लाइनों में 23.6% की उच्च स्थापना दर दिखाई गई जो प्राथमिक पुनः प्राप्त ट्यूमर9के विपरीत दोहराव वाले प्रयासों की संभावना के कारण भी है। हालांकि, कुछ मिश्रित संस्कृतियों(चित्रा 2E)फाइब्रोब्लास्टिक विकास से मुक्त नहीं किया जा सकता है या यहां तक कि फाइब्रोब्लास्टिक ओवरग्रोथ(चित्रा 2F) केकारण खो जाते हैं।

Figure 2
चित्रा 2:सेल संस्कृति। प्राथमिक कैंसर सेल लाइनों, पेट के कैंसर के मामले HROC313, मार्ग 21 (ए) और अग्नाशय के कैंसर के मामले HROP88, मार्ग 5 (बी) के एक मेटास्टेसिस से व्युत्पन्न । पीडीएक्स-व्युत्पन्न कैंसर सेल लाइनें कोलन पीडीएक्स एचआरओसी285 टी0 एम 2 (डी) और अग्नाशय पीडीएक्स एचआरओपी10 टी 5 एम 2, पैसेज 4 (ई)। अग्नाशय के कैंसर HROP75, मार्ग 8 (सी) और फाइब्रोब्लास्टिक ओवरग्रोथ (एफ) से फाइब्रोब्लास्ट और कैंसर कोशिकाओं की मिश्रित संस्कृति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

PDX पीढ़ी प्रोटोकॉल में परिवर्तन को ध्यान में रखते हुए, माउस उपभेदों का इस्तेमाल किया और भी कई वर्षों में प्रयोग, साथ ही ट्यूमर ऊतक की मात्रा में बड़े अंतर engraftment के लिए उपलब्ध है, यह PDX पीढ़ी की समग्र सफलता दर देने के लिए तुच्छ नहीं है । दो शोधकर्ताओं (एस.M और एफ.B द्वारा किए गए पीडीएक्स पीढ़ी के प्रयोगों की एक बहुत ही हालिया श्रृंखला में, कोलोरेक्टल पीडीएक्स के लिए 63% की प्राथमिक वृद्धि दर (चित्रा 3 एसे एक अनुकरणीय हिस्टोरोलॉजी चित्रित किया जा सकता है) और अग्नाशय पीडीएक्स(चित्रा 3 बी)के लिए 48% देखा गया। प्रत्यारोपण स्थल पर मुरीन या मानव लिंफोमा की वृद्धि अपेक्षाकृत दुर्लभ है, लेकिन सफल पीडीएक्स आउटग्रोथ(चित्रा 3C) की नकल कर सकते हैं। हिस्टोपैथोलॉजिकल परीक्षा के अलावा, पीडीएक्स मॉडल और उनके दाता रोगियों के बीच सामंजस्य की नियमित रूप से शॉर्ट टैंडेम रिपीट (एसटीआर) विश्लेषण(चित्रा 3 डी)द्वारा पुष्टि की गई थी। वर्तमान दिन के लिए बायोबैंक में >50 प्राथमिक और >50 माध्यमिक कोलोरेक्टल, 3 प्राथमिक और 6 माध्यमिक अग्नाशय के कैंसर सेल लाइनों के साथ-साथ >150 कोलोरेक्टल और 19 अग्नाशय पीडीएक्स मॉडल शामिल हैं।

Figure 3
चित्र 3:कोलोरेक्टल (ए) और अग्नाशय पीडीएक्स (बी) की प्रतिनिधि हिस्टोलॉजिकल तुलना। प्रत्यारोपण स्थल पर मानव लिंफोमा पीडीएक्स आउटग्रोथ (सी) की नकल करते हुए । शॉर्ट टैंडेम रिपीट (एसटीआर) विश्लेषण द्वारा मूल रोगी ट्यूमर ऊतक (HROC430Tu) के लिए एक पीडीएक्स मॉडल (HROC430 T1 M2) का आनुवंशिक पहचान परीक्षण। केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस के बाद फ्लोरोसेंट लेबल वाले प्राइमर के साथ मल्टीप्लेक्स पीसीआर का उपयोग करके नौ एसटीआर लोकी, वीडब्ल्यूए, THO1, TPOX, CSF1 पीओ (FAM डाई) और D5S818, D13S317, D7S820, D16S539 (HEX डाई) की तुलना में पीडीएक्स और दाता ट्यूमर (डी) के आनुवंशिक प्रवेश की पुष्टि की । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

एक जीवित बायोबैंक की पीढ़ी, गोपनीयता, चिकित्सा कानून और पशु कल्याण, एक अच्छा बुनियादी ढांचा और एक अच्छी तरह से समन्वित टीम के कानूनी नियमों का पालन करने के अलावा, पूर्वमान । यह सीधे अनुसंधान प्रक्रियाओं में शल्य चिकित्सा कर्मचारियों का एक हिस्सा शामिल करने के लिए लाभप्रद साबित कर दिया है, क्योंकि वे बहुत अच्छी तरह से ऊतक दान के लिए व्यक्तिगत रोगी की उपयुक्तता का आकलन कर सकते हैं । इसके अलावा, रोगियों को अधिक बार बायोबैंकिंग के साथ सहमति है, जब उनके लिखित अनुमोदन शल्य चिकित्सा सूचित सहमति चर्चा के दौरान प्राप्त किया जाता है करते हैं । समय और संसाधनों को बचाने के लिए, मामलों है कि संभवतः ट्यूमर ऊतक की अपर्याप्त मात्रा में उपज होगा बायोबैंकिंग के लिए नहीं चुना जाना चाहिए । जब नमूना अधिग्रहण की बात आती है, तो कहावत "संचार कुंजी है" एक सरल है, लेकिन अक्सर सत्य की अनदेखी करता है। यह केवल हमेशा की तरह आगे बढ़ने और resection नमूने के लिए फॉर्मलडिहाइड जोड़ने के द्वारा शुरू में नमूना सही बर्बाद करने के लिए एक भी बेख़त थिएटर नर्स या शल्य चिकित्सा सहयोगी लेता है । इसलिए, यह अत्यंत महत्वपूर्ण है कि इसमें शामिल कर्मचारियों का हर एक सदस्य बायोबैंकिंग के लिए एसओपी से परिचित हो जाए । सर्जन अनुसूचित ऊतक संग्रह के बारे में प्रक्रिया के शुरू में दिन पहले और सही देखा जाना चाहिए । इसके अलावा, बायोबैंकिंग के लिए चयनित मामलों को इलेक्ट्रॉनिक या योजना में हाइलाइट किया जाना चाहिए। सर्जिकल नमूने से ऊतक संचयन एक रोगविज्ञानी द्वारा किया जाना चाहिए। सबसे पहले, यह सुनिश्चित करेगा कि ऊतक संचयन अंतिम रोग रिपोर्ट में हस्तक्षेप नहीं करता है। दूसरा, यह व्यवहार्य कैंसर ऊतक की पर्याप्त मात्रा के साथ ऊतक प्राप्त करने की संभावना बढ़ जाती है । विशेष रूप से एक स्पष्ट डेस्मोप्लास्टिक प्रतिक्रिया और लगातार परिगलित क्षेत्रों के साथ अग्नाशय के कैंसर में, व्यवहार्य भागों को अप्रशिक्षित आंखों के लिए स्थूल की पहचान करना मुश्किल है। इस नियम के अपवाद के रूप में, बड़े हेपेटिक या पल्मोनल मेटास्टेस से ऊतक ब्लॉक, कभी-कभी सर्जन द्वारा "बैक-टेबल" उत्पादित किया जा सकता है, अगर सर्जिकल मार्जिन को मैक्रोस्कोपिक रूप से परिभाषित किया जा सकता है। कुल मेसोरेक्टल उत्तेजना (टीएमई) द्वारा पुनः प्राप्त होने वाला गुदा कैंसर, बायोबैंकिंग के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है, क्योंकि पैराफिन एम्बेडिंग से पहले पुनः प्राप्त नमूने से ऊतक संचयन टीएमई गुणवत्ता मूल्यांकन में हस्तक्षेप कर सकता है। वैकल्पिक रूप से, बायोबैंकिंग के लिए ऊतक गुदा कैंसर के ट्रांसनल बायोप्सी द्वारा प्राप्त किया जा सकता है।

मूल ट्यूमर से प्राप्त प्राथमिक सेल संस्कृतियों के लिए स्थापना दर आम तौर पर कम होती है। पीडीएक्स-व्युत्पन्न, माध्यमिक सेल संस्कृतियों को सफलतापूर्वक स्थापित किए जाने की संभावना है। हम प्रत्येक मामले के लिए विभिन्न मीडिया के परीक्षण और पहले मार्ग के लिए एंटीबायोटिक की खुराक के उपयोग के लिए एक ंयूनतम करने के लिए संदूषण को कम करने के बाद से काटा ऊतक शायद ही कभी बाँझ है की सलाह देते हैं । सफल प्रचार के बाद, प्रत्येक व्यक्ति सेल लाइन को FACS विश्लेषण द्वारा कैंसर सेल लाइन के रूप में पुष्टि की जानी चाहिए और नियमित रूप से माइकोप्लाज्मा संदूषण के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए। क्रॉस-संदूषण को बाहर करने के लिए, नियमित एसटीआर विश्लेषण की सलाह दी जाती है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए, कि प्राथमिक और माध्यमिक सेल लाइनों के लिए स्थापना प्रोटोकॉल लगातार अनुकूलन के अधीन है। एकल मीडिया की संरचना और सफलता दरों से संबंधित विवरण स्पष्ट रूप से इस काम के दायरे से बाहर हैं और अलग से प्रकाशित किए जाएंगे ।

पीडीएक्स एनग्रेफ्टमेंट के लिए, ट्यूमर ऊतक को या तो रिसेक्शन के बाद सीधे प्रत्यारोपित किया जा सकता है या भ्रूण बछड़े सीरम में 10% DMSO या देरी प्रत्यारोपण के लिए इसी तरह की ठंड मीडिया के साथ क्रायोप्रेयर्ड किया जा सकता है। ट्यूमर ऊतक कटाई पर तुरंत प्रत्यारोपण रसद और प्रयोगशाला के कर्मचारियों पर एक तनाव डालता है, और क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद xenografting परिणाम सभी 10में अवर नहीं हैं । इसके अलावा, ट्यूमर प्रत्यारोपण से पहले मैट्रिक्सेल में ऊतक के इनक्यूबेशन, काफी वृद्धि की दर12। हम निश्चित रोग खोज और गलती से एकत्र ऊतक नमूनों के तत्काल निपटान के बाद देरी engraftment की सलाह देते हैं । चूंकि प्राप्तकर्ता माउस की इम्यूनोडेफिशिएंसी के साथ प्राथमिक एनग्रेफ्टमेंट की सफलता दर बढ़ जाती है, इसलिए हम पहले पीडीएक्स मार्ग के लिए एनएसजी चूहों का उपयोग करते हैं। पहले सफल PDX engraftment के बाद, NMRInu/nu चूहों कर सकते है और बाद के मार्ग और ऊतक विस्तार के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । यह तनाव एनएसजी या इसी तरह की इम्यूनोडिफिशिएंसी उपभेदों की तुलना में नस्ल के लिए अधिक मजबूत, सस्ता और आसान है, लेकिन अभी भी उचित एनग्रेफ्टमेंट दरों को दर्शाता है । इसके अलावा, इसकी नग्नता प्रत्यारोपण और ट्यूमर विकास की निगरानी की सुविधा प्रदान करती है। बाद के मार्गों में एनग्रफ्टमेंट दरों को बढ़ाने के लिए, हम जब भी संभव हो चूहों की मेजबानी के लिए ताजा काटे गए पीडीएक्स ऊतकों के सीधे हस्तांतरण की सलाह देते हैं, विशेष रूप से धीमी गति से बढ़ते पीडीएक्स और कम प्राथमिक एनग्रेफ्टमेंट सफलता दर वाले मामलों के लिए। कोलिंस और लैंग ने हाल ही में कोलोरेक्टल पीडीएक्स स्थापना के 14 अध्ययनों की समीक्षा की और 68% की औसत पीडीएक्स स्थापना दर के साथ 14 से 100% तक भिन्न एनग्रफ्टमेंट दरों की सूचना दी, बाद में हमारे निष्कर्षों के अनुरूप13। साहित्य के अनुरूप, हमने कोलोरेक्टल कैंसर पीडीएक्स14की तुलना में अग्नाशय की कम स्थापना दरों का अवलोकन किया। मेजबान माउस तनाव और ट्यूमर इकाई के बावजूद, मानव, एपस्टीन-बर्र वायरस (ईबीवी) से जुड़े बी-सेल लिंफोमा और प्रत्यारोपण पक्ष में मुरीन लिंफोमास की वृद्धि एक महत्वपूर्ण नुकसान15,16बन गया है । यदि अपरिचित, इस तरह के ट्यूमर "दूषित" बाद के मार्ग कर सकते है और इस तरह लगातार परिणाम चकित । असामान्य तेजी से पीडीएक्स वृद्धि और गर्भाशय ग्रीवा, एक्सिलर और इंजिनियल लिम्फ नोड्स की सूजन मुरीन लिंफोमा वृद्धि के मजबूत संकेतक हैं, लेकिन पीडीएक्स की नियमित हिस्टोलॉजिकल परीक्षा फिर भी उचित है। इसके अलावा, पीडीएक्स और संबंधित दाता रोगी के बीच आनुवंशिक सामंजस्य एसटीआर-विश्लेषण द्वारा नियमित रूप से परीक्षण किया जाना चाहिए। आदर्श रूप से, बायोबैंक को एक नैदानिक डेटाबेस से जोड़ा जाना चाहिए जिसमें रोगियों की विशेषताएं (सामान्य जानकारी, अस्तित्व, रिलेप्स मुक्त अस्तित्व, चिकित्सा, माध्यमिक नियोप्लासिया आदि) शामिल हैं। गोपनीयता संरक्षण के कानूनी नियमों और इस तरह के एक अनाम डेटा आधार की कमी के कारण, हमारे नैदानिक डेटा सेट नियमित रूप से प्रशासनीकृत और सहयोग चिकित्सकों द्वारा मैन्युअल रूप से अद्यतन किया जाता है ।

जबकि पारंपरिक बायोबैंक वेधशाला अनुसंधान तक सीमित हैं, एक जीवित बायोबैंक इन विट्रो और वीवो हस्तक्षेपों के लिए अवसर प्रदान करता है। रोगी-व्युत्पन्न सेल लाइनें मौलिक अनुसंधान, उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग और नए दवा एजेंटों के मूल्यांकन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हैं4। इसी PDX मॉडल, हालांकि, बढ़ते महत्व के हैं, क्योंकि वे मूल ट्यूमर17, 18के हिस्टोलॉजी को बारीकी से पुन: रीकैपिटल करते हैं और कई मार्ग19, 20से अधिक उच्च आनुवंशिकस्थिरतादिखाते हैं। हमारे पीडीएक्स बायोबैंक ने खुद को प्रीक्लिनिकल और मौलिक अनुसंधान6,21के लिए एक उत्कृष्ट मंच के रूप में साबित किया है । इसके अलावा, चूंकि बड़े पीडीएक्स संग्रह रोगी आबादी की अंतर-व्यक्तिगत विषमता को पर्याप्त रूप से प्रतिबिंबित करते हैं, इसलिए पीडीएक्स नैदानिक परीक्षण (पीसीटी) दृष्टिकोण (प्रति मॉडल प्रति मॉडल एक जानवर) ने दवा विकास के लिए महत्व प्राप्त किया है क्योंकि यह नई दवाओं और संयोजन आहार8के लिए नैदानिक प्रतिक्रिया की वफादार भविष्यवाणी की अनुमति देता है। हम भी वर्तमान में छोटे पीसीटी परीक्षणों में नई प्रयोगात्मक दवाओं का मूल्यांकन कर रहे हैं ।

इन आशाजनक परिणामों के बावजूद, 12.2 महीने की औसत स्थापना अवधि, एंटीकैंसर उपचार विकल्पों के परीक्षण के लिए "अवतार चूहों" के रूप में पीडीएक्स मॉडल की नैदानिक प्रयोज्यता में बाधा डालती है, कम से कम उन रोगियों के लिए तत्काल न्यायवंत या यहां तक कि नियोडजूवेंट उपचार22की आवश्यकता होती है। मानक पीडीएक्स मॉडल का एक अतिरिक्त नुकसान मेजबान चूहों की इम्यूनोडेफिशिएंसी के कारण इम्यूनोथेरेपी परीक्षण के लिए उपयोगिता की कमी है। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, कई "मानवीकृत" माउस उपभेदों को विकसित किया गया है। इन चूहों को भारी इम्यूनोसमझौता है, लेकिन विभिन्न प्रकार के मानव अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न कोशिकाओं या सीडी 34+ हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं के साथ पीडीएक्स आउटग्रोथ23के बाद पुनर्गठित किया जा सकता है, जिससे लिम्फोसिट-मध्यस्थता साइटोक्सिसिटी के मूल्यांकन और प्रतिरक्षा चेकपॉइंट अवरोधक उपचार24,25के लिए चिकित्सा प्रतिक्रिया की अनुमति दी गई।

हाल के वर्षों में, रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड (पीडीओ) पीडीएक्स के साथ प्रतिस्पर्धा करने वाले महत्वपूर्ण कैंसर मॉडल के रूप में उभरा। बरकरार ट्यूमर टुकड़ों से व्युत्पन्न और एक बाह्रात्म मैट्रिक्स पाड़ में सुसंस्कृत, इन तीन आयामी संरचनाओं बारीकी से मूल ट्यूमर के हिस्टोलॉजिक और आनुवंशिक गुणों को प्रतिबिंबित । दीर्घकालिक विस्तार और क्रायोप्रिजर्वेशन की संभावना पीडो को एक जीवित बायोबैंक26, 27का एक आदर्श पूरक प्रदान करती है। अपेक्षाकृत उच्च स्थापना दर के अलावा, कई ट्यूमर संस्थाओं के पीडो के लिए विश्वसनीय दवा प्रतिक्रिया भविष्यवाणी की सूचना दी गई है28। इसके अलावा, पीडीओ भी ट्यूमर कोशिकाओं परिसंचारी से उत्पन्न किया गया है और इसी स्वस्थ ऊतक से ऑर्गेनॉइड की एक साथ स्थापना भी संभव है, एक रोगी-व्यक्तिगत आधार29,30पर चिकित्सा से संबंधित विषाक्तता के आकलन की अनुमति। हालांकि, पारंपरिक 2D सेल संस्कृतियों की तुलना में, ऑर्गेनॉइड संस्कृति समय और संसाधन लेने वाली है और कृत्रिम बाह्राश मैट्रिक्स यौगिक कुछ विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं31में हस्तक्षेप कर सकते हैं। इसके अलावा, कैंसर ऑर्गेनॉइड स्वस्थ एपिथेलियम30से प्राप्त तेजी से बढ़ते, गैर-घातक ऑर्गेनॉइड द्वारा अधिक वृद्धि के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। स्ट्रोमा, रक्त वाहिकाओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की कमी के कारण, पीडीओ ज्यादातर एंटींगियोजेनिक इम्यूनोथेरपी एजेंटों के परीक्षण के लिए लागू नहीं होते हैं। फिर भी, नई खेती के तरीके विट्रो मेंट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट के मॉडलिंग की अनुमति देते हैं, जो पीडीओ को पीडीएक्स मॉडल32के लिए एक सच्चे दावेदार प्रदान करते हैं। निकट भविष्य में, रोगी-व्यक्तिगत ट्यूमर मॉडल, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण जैसे शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरणों के साथ संयुक्त, उम्मीद है कि सच्ची सटीक दवा और अनुरूप उपचार दृष्टिकोण के लिए मार्ग प्रशस्त होगा।

Disclosures

कोई नहीं।

Acknowledgments

हम कृपया जेनी बर्मीस्टर, हमारे चित्रमय सहायक, रिकॉर्डिंग और वीडियो के संपादन के लिए स्वीकार करते हैं । इसके अलावा, हम शल्य चिकित्सा और रोग विभाग के अपने सहयोगियों को पुराने सहयोग के लिए धन्यवाद देते हैं । हम ऑडियो रिकॉर्डिंग उपकरण की आपूर्ति और ध्वनि की गुणवत्ता को परिष्कृत करने के लिए आईटी और मीडिया सेंटर, रोस्टॉक विश्वविद्यालय के उत्पादन प्रबंधक मार्कस मुलर को भी धन्यवाद देना चाहते हैं।

फंडिंग: जर्मन कैंसर सहायता फाउंडेशन (DKH e.V.), अनुदान संख्या १०८४४६, और अनुदान संख्या टीबीआई-V-1-241-VBW-084 राज्य Mecklenburg-Vorpommern से आंशिक रूप से इस शोध वित्त पोषित ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacillol® AF; 1L Bode, Hartmann REF 973380 desinfection
PP centrifuge tube, 15ml; sterile Greiner Bio One GBO Cat. No.:188271 centrifuge tube
PP centrifuge tube, 50ml, sterile Sarstedt Order number: 62.547.254 centrifuge tube
BD DiscarditTM II Syringe 20ml BD REF 300296 blood collection
Serum 7,5ml Sarstedt Monovette Sarstedt Item number: 01.1601 blood collection
serological Pipette 10ml Sarstedt REF 86.1254.001 liquid transfer
Pipetboy ratiolab® accupetta Ratiolab Item number: RL3200300 liquid transfer
PIPETBOY acu 2 Integra Biosciences VWR Cat.No: 613-4438 liquid transfer
DPBS; w/o Ca & Mg Pan Biotech Cat. No.: P04-36500 washing
Pancoll human Pan Biotech Cat. No.: P04-60500 density gradient centrifugation
DMEM/F12 (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) PAN Biotech Cat. No.: P04-41500 cell cultivation
FBS Good Forte (Filtrated Bovine Serum) PAN Biotech Cat. No.: P40-47500 cell cultivation
L-Glutamine 200mM PAN Biotech Cat. No.: P04-80100 cell cultivation
Trypsin / EDTA PAN Biotech Cat. No.: P10-023100 cell cultivation
DMSO (Dimethyl Sulfoxid for cell culture) PanReac AppliChem VWR Cat.No: A3672.0250 cell freezing
Freezer Medium (FCS with 10% DMSO) selfmade --- cell freezing
cryotube- CryoPure 2ml Sarstedt 72380 cell freezing
6-Well cell culture plate; steril; with lid Greiner bio-one Cat.-No.: 657 160 cell cultivation
Petri dish 92 x 16 mm, PS, without cams Sarstedt Cat. No.: 82.1472.001 tissue preparation
sterile surgical blades B.Braun (Aesculap) REF BB510 tissue preparation
BD DiscarditTM II Syringe 10ml BD REF 309110 tissue preparation
cell strainer; yellow; 100µm Falcon REF 352360 tissue preparation
CoolCell biocision Item number: 210004 cooling container with -1°C/min
Dewar transport vessel type 27 B, 2 l, 138 mm KGW Cat. No.: HT39.1 transport system
Pipette tip 200µl Sarstedt REF 70.760.002 liquid transfer
Filter tip 1000µl Sarstedt REF 70.762.411 liquid transfer
Pipette 200µl, yellow Eppendorf Cat. No.: 3121 000.082 liquid transfer
Pipette 1000µl, blue Eppendorf Cat. No.: 3121 000.120 liquid transfer
incubator  BB 6220 CU Heraeus Cat.-No.: 51012839 cell cultivation
heating plate PRÄZITHERM Harry Gestigkeit GmbH --- heating
Microscope Zeiss Primo Vert Carl Zeiss MicroImaging GmbH Serial number. 3842000839 imaging cell cultures
Sterile bench Safe flow 1.8 nunc nunc GmbH & Co. KG --- sterile working bench
freezer -80°C Kryotec-Kryosafe GmbH --- sample storage
Electronic balance MP-300 Chyo --- Scale
BD Micro-fine, U100 insulin syringe BD REF 324826 injection anesthetic
Rompun 2%; 25ml Bayer approval number: 6293841.00.00 anesthesia
Ketamin 100 mg/ml, 25ml CP-Pharma GmbH approval number: 401650.00.00 anesthesia
GES3S Reader Datamars not available RFID reader
ISO-Transponder FDX-B (1,4x8mm) Peddymark --- RFID chip
Cotrim-ratiopharm® Ampullen SF 480 mg/5 ml Ratiopharm PZN-03928197 antibiotic drinking water
Heating plate #FM-20 42x28cm Dragon --- heating
Heating lamp Electric Petra, Burgau --- heating
Ointment for the eyes and nose (5% Dexpanthenol) Bepanthen Bayer PZN-01578675 Eye protection
anatomical tweezer B.Braun Aesculap BD21 OR surgical instruments
surgical tweezer B.Braun Aesculap BD50 1 R surgical instruments
scissors B.Braun Aesculap BC05 6R surgical instruments
needle holder B.Braun Aesculap BH1 1 OR surgical instruments
Prolene 5-0 Ethicon XN8870.P32 surgical suture material
Opsite moisture vapour permable spray dressing Smith&Nephew REF 66004978, PZN- 02063507 surgical suture material
Adhesive aperture drape Barrier REF 904622 sterile OP tissue
gauze swap Gazin®; steril; 10x10 cm Lohmann&Rauscher REF 18506 sterile OP tissue
Raucotupf cotton tipped applicators Lohmann&Rauscher REF 11969 applicator
Corning® Matrigel Basement Membrane Matrix Corning Cat.-No.: 354234 Basement Membrane Matrix
iodine solution Braunol (7,5g povidone iodine) B.Braun Melsungen AG Item number: 18839 desinfection
MACS® Tissue Storage Solution Miltenyi Biotec GmbH Order No.:130-100-008 storage solution
Formafix 4% Grimm med. Logistik GmbH Item number: F10010G fixation solution
Software FreezerworksBasic Dataworks Development, Inc --- sample organization
Zebra TLP 2844 printer Zebra --- label printer

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References

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