Summary
Nel seguente lavoro, descriviamo i passaggi consecutivi necessari per la creazione di una grande biobanca di cancro colorettale e pancreatico.
Abstract
Alla luce della crescente conoscenza delle proprietà inter-individuali e dell'eterogeneità dei tumori, il campo emergente della medicina personalizzata richiede una piattaforma per la ricerca preclinica. Negli ultimi anni, abbiamo istituito una biobanca di tumori colorettali e pancreatici che comprende tessuto tumorale primario, tessuto normale, sieri, linfociti del sangue periferici isolati (PBL), xenoinnesti derivati dal paziente (PDX), nonché linee cellulari tumorali primarie e secondarie. Poiché il tessuto tumorale originale è limitato e il tasso di determinazione delle linee cellulari primarie del cancro è ancora relativamente basso, il PDX consente non solo la conservazione e l'estensione della biobanca, ma anche la generazione di linee cellulari tumorali secondarie. Inoltre, i modelli PDX hanno dimostrato di essere il modello in vivo ideale per il test preclinico dei farmaci. Tuttavia, il biobanking richiede un'attenta preparazione, linee guida rigorose e un'infrastruttura ben sintonizzata. La colectomia, la duodenopancreatectomia o i campioni di metastasi resettati vengono raccolti immediatamente dopo la resezione e trasferiti al reparto di patologia. Rispettando la priorità di un rapporto istopatologico imparziale, a discrezione del patologo presente che effettua le dissezioni, vengono raccolti piccoli pezzi tumorali e tessuto non tumorale.
Le parti necrotiche vengono scartate e il tessuto tumorale rimanente viene tagliato in piccoli cubi identici e crioconservato per un uso successivo. Inoltre, una piccola parte del tumore viene macinata e tesa per la coltura primaria delle cellule tumorali. Inoltre, i campioni di sangue prelevati dal paziente in modo pre e postoperatorio, vengono elaborati per ottenere siero e PBL. Per l'innesto PDX, gli esemplari crioconservati vengono scongelati e impiantati per via sottocutanea nei fianchi di topi immunodifesa. Il PDX risultante ricapitola strettamente l'istologia dei tumori "donatori" e può essere utilizzato per successive xenointetizzazioni o crioconservati per un uso successivo. Nel seguente lavoro, descriviamo le singole fasi di creazione, manutenzione e somministrazione di una grande biobanca di cancro colorettale e pancreatico. Inoltre, evidenziamo i dettagli cruciali e gli avvertimenti associati al biobanking.
Introduction
Negli ultimi anni, la conoscenza accumulata delle proprietà morfologiche, cliniche e genetiche dei tumori ha portato alla concezione del cancro come malattia eterogenea e individuale. Di conseguenza, la caratterizzazione mutazionale delle neoplasie, oltre alle caratteristiche cliniche e patologiche, ha acquisito importanza per il processo decisionale clinico e sono state sviluppate molte terapie mirate per varie alterazioni molecolari. Ad esempio, l'efficacia del cetuximab nel trattamento del cancro delcolon-rettopuò essere prevista dall'analisi dello stato mutazionale KRAS e PIK3CA 1 . La medicina di precisione mira a un approccio su misura per fornire la massima risposta al trattamento in ogni paziente ed evitare la tossicità delle terapie inefficaci2. Le biobanche contengono tessuti, sangue e altri materiali biologici dei pazienti oncologici, che sono collegati ai dati clinici, e quindi sono uno strumento eccellente per la ricerca traslizionale sul cancro. A causa del gran numero di campioni clinici, le biobanche consentono il rilevamento di mutazioni rare, ma potenzialmente drogabili, che offrono nuove opportunità di trattamento per ilsingolo paziente 3.
Per coprire il più ampio possibile uno spettro di ricerca oncologica, non abbiamo limitato la nostra attività sulla raccolta dei campioni da soli, ma ci siamo concentrati sulla creazione di linee cellulari tumorali derivate dal paziente e xenografti (PDX). Le linee cellulari 2D tradizionali rimangono la pietra d'angolo della ricerca in vitro e sono la scelta principale per gli screening farmacologici su larga scala4,5. Inoltre, l'analisi della linea cellulare è spesso più semplice, più economica e più facilmente disponibile. Inoltre, poiché sono disponibili linfociti del sangue periferici derivati dal paziente (PBL), anche l'immunologia tumorale può essere studiata in vitro6. Tuttavia, la maggior parte dei farmaci di nuova sviluppo con promettente efficacia preclinica in esperimenti in vitro o in vivo a base cellulare, hanno mostrato risultati deludenti negli studi clinici7. Al contrario, studi preclinici basati su studi in vivo PDX hanno rispecchiato l'attività clinica degli agenti antineoplastici molto più fedelmente8. Poiché il tessuto PDX riflette da vicino le proprietà istologiche e molecolari del tumore donatore, i modelli PDX sono un buon modo per propagare le quantità spesso molto limitate di tessuto tumorale vitale per mantenere l'integrità di una biobanca e consentire lo scambio di campioni tra gruppi di ricerca e istituzioni. Inoltre, le linee cellulari tumorali derivate dal tessuto PDX possono essere stabilite in modo significativamente più semplice rispetto alle linee cellulari primariedel cancro 9. Negli ultimi anni, il nostro gruppo di lavoro ha istituito una biobanca integrata completa per il cancro del colon-retto e del pancreas, standardizzando e ottimizzando gradualmente il flusso di lavoro per tutti i campioni biologici in questione (Figura 1).
Figura 1: Flusso di lavoro e organizzazione della biobanca Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.
Protocol
Il seguente studio è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale dell'University Medical Center Rostock (II HV 43/2004, A 45/2007, A 2018-0054, A 2019-0187 e A 2019-0222). Inoltre, tutte le procedure veterinarie pertinenti sono state approvate dal Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern con i numeri di immatricolazione LALLF M-V/TSD/ 7221.3-2-020/17 e 7221.3-1-007/19.
1. Prerequisiti sperimentali
- Soddisfa diverse importanti condizioni quadro per stabilire e mantenere una biobanca.
- Utilizzare una clinica con un reparto chirurgico e un numero sufficiente di resezioni oncologiche insieme a un laboratorio ben attrezzato e personale accademico sufficiente. Una buona infrastruttura e un solido collegamento con un reparto di patologia che collabora sono ulteriori prerequisiti.
- Per la ricerca in vivo, utilizzare una struttura animale con condizioni abitative adeguate ai topi immunodifesa.
- Ottenere l'autorizzazione su qualsiasi ricerca su materiale derivato dal paziente da un comitato etico sanitario. Ottenere l'approvazione di qualsiasi ricerca in vivo da parte dell'autorità competente secondo le normative di legge locali.
2. Raccolta dei campioni
- Il giorno prima dell'intervento
- Valutare tutti i pazienti con cancro colorettale o pancreatico riconsestabile e/o metastasi corrispondenti per l'idoneità al biobanking. Evitare di includere casi con pretrattamento neoadiuvante, tumori molto piccoli, tumori di incerta dignità o lesioni che sono stati parzialmente resected endoscopicamente prima.
- Ottenere l'approvazione scritta della partecipazione del paziente durante la discussione sul consenso informato sulla procedura chirurgica. Informare tempestivamente tutti i chirurghi coinvolti, il team di laboratorio e il patologo.
- Acquisizione di campioni
- Informare tutti gli operatori della sala operatoria (OR) sulla raccolta dei tessuti per la biobanca immediatamente prima dell'inizio della procedura chirurgica.
NOTA: È fondamentale che il tessuto non debba essere fissato in formalina. Se il tessuto è immerso nella formalina, diventa inadatto per il biobanking integrato. - Preleggio di 40 ml di sangue eparinato (siringa da 2 x 20 ml) e di un tubo siero standard da 7,5 ml immediatamente dopo l'induzione anestetica e trasferimento rapidamente in laboratorio per l'isolamento della PBL e la lavorazione del siero (vedere fase 3-4).
- Ottenere il campione reinsediato direttamente dal tavolo operatorio, posizionarlo in un contenitore appropriato e portarlo al reparto patologico. Annotare il punto di distacco dalla circolazione, dalla resezione e dall'arrivo in patologia.
NOTA: L'idoneità del campione per il bio banking deve essere valutata dal patologo cooperante che seziona una fetta di tumore e tessuto non maligno. Non asportate da soli parti del campione che possano compromettere la successiva relazione patologica. - Posizionare entrambi i pezzi di tessuto in un tubo di polipropilene separato da 15 a 50 ml con una soluzione di stoccaggio dei tessuti da 10 a 30 mL (o DPBS) sul ghiaccio. Annotare l'ora di ricezione e trasferire immediatamente i campioni in laboratorio.
NOTA: I seguenti passaggi del protocollo 3-6 devono essere condotti in un armadio a flusso laminare in condizioni sterili rigorose. Utilizzare tutti i liquidi a temperatura ambiente.
- Informare tutti gli operatori della sala operatoria (OR) sulla raccolta dei tessuti per la biobanca immediatamente prima dell'inizio della procedura chirurgica.
3. Lavorazione del siero
- Centrifugare il tubo del siero da 7,5 ml a 1128 x g e 4 °C per 15 minuti in una centrifuga pre-raffreddata.
- Aliquota 1 mL siero per tubo in criotubi pre-etichettati e congelamento in azoto liquido.
4. Isolamento della PBL per centrifugazione del gradiente di densità
NOTA: Lavorare in parallelo con ciascuna delle due siringhe da 20 ml.
- Riempire 20 ml di sangue eparinizzato in un tubo di polipropilene da 50 ml e aggiungere 15 ml di DPBS.
- Prendere 15 ml di Pancoll con una pipetta sierologica, inserire la pipetta con cura fino al fondo del tubo di polipropilene e rilasciare il Pancoll molto lentamente per formare uno strato sotto la colonna sangue / DBPS.
- Centrifuga a 375 x g per 15 minuti senza freno.
- Aspirare e trasferire lo strato di interfase opaco tra la colonna centrale e superiore di entrambi i campioni in un nuovo tubo di polipropilene da 50 ml e riempire con DPBS a 50 mL.
- Centrifuga a 270 x g per 15 min con freno.
- Aspirare e scartare il supernatante, rimescolare il pellet cellulare in 4,5 mL di mezzo congelatore.
- Aliquota 1,5 mL della sospensione per criotubo, chiudere saldamente i tubi e metterli in un contenitore di congelamento adatto al congelamento lento e conservare a -80 °C.
5. Lavorazione dei tessuti
NOTA: Iniziare con la generazione di campioni congelati a scatto di tumore e tessuto sano per mantenere l'integrità degli acidi nucleici.
- Campione di tessuto tumorale
- Trasferire il campione tumorale con diversi ml di soluzione di stoccaggio dei tessuti dal tubo di polipropilene a una piastra di Petri. Risciacquare con DPBS, se necessario. Evitare di toccare il campione e utilizzare due bisturi sterili per maneggiare il tessuto. Evitare l'essiccazione in qualsiasi momento.
- Pesare l'esemplare tumorale su una scala conveniente in un piatto separato e notare il peso del tessuto.
- Valutare le dimensioni, la forma e la qualità dei tessuti del tessuto tumorale prima del taglio. Mirare ad ottenere almeno un pezzo delle dimensioni di una pinhead per il congelamento a scatto e quattro cubi di circa 30 mm3 (lunghezza del bordo 3 x 3x 3 mm) ciascuno per la crioconservazione vitale. Genera il maggior numero possibile dicubi da 30 mm e 3 in quadrupli e genera un pezzo per il congelamento a scatto per 5 quadrupli. Prendi anche in considerazione che le porzioni necrotiche devono essere tagliate in modo che i cubi siano costituiti solo da tessuto vitale.
- Generare fette di spessore di 3 mm. Tagliare le porzioni necrotiche, distinguibili come massa gel-like o liquida, e tagliare le fette a cubetti delle due dimensioni desiderate.
NOTA: Non scartare alcun tessuto a questo punto. - Blocco a scatto
- Etichettare i criotubi di conseguenza (vedere il passaggio 7.7).
- Posizionare un piccolo pezzo di tessuto per criotubo pre-etichettato. Immergere immediatamente i campioni in azoto liquido per diversi minuti e conservare successivamente a -80 °C.
- Crioconservazione del tessuto vitale
- Etichettare i criotubi di conseguenza (vedere passaggio 7.7) e riempire ciascuno con 1,5 mL di mezzo congelatore. Posizionare il contenitore di congelamento accanto alla panchina.
NOTA: seguire i passaggi successivi il più rapidamente possibile. Poiché il DMSO nel mezzo congelatore ha proprietà citotossiche, il tempo in cui il tessuto viene immerso nel mezzo congelatore senza un adeguato raffreddamento non deve superare i 2 minuti. - Disporre i cubi da 30 mm3 in quadrupli. Spingere il tessuto necrotico e altri resti sul bordo del piatto, ma non scartarli.
- Raccogli i cubi con la lama bisturi e trasferisci 4 cubi per criotubo. Assicurarsi che i pezzi tumorali siano interamente immersi nel mezzo congelatore. Chiudere saldamente i tubi e metterli in un contenitore di congelamento adatto per il congelamento lento e conservare in un congelatore a -80 °C.
- Trasferire i criotubi in un sistema di stoccaggio adatto per la conservazione a lungo termine a -140 °C o inferiore. La documentazione nel sistema di gestione dell'inventario di laboratorio è obbligatoria.
- Etichettare i criotubi di conseguenza (vedere passaggio 7.7) e riempire ciascuno con 1,5 mL di mezzo congelatore. Posizionare il contenitore di congelamento accanto alla panchina.
- Campione di tessuto sano: Ripetere i passaggi 5.1.1. 5.1.6.4 per il campione di tessuto sano.
6. Coltura cellulare primaria
- Disintegrare i resti del tessuto tumorale, incluso il rottame necrotico, nella piastra di Petri con i bisturi a pezzi il più piccolo possibile.
- Posizionare un filtro cellulare sterile (dimensione del poro di 100 μm) sopra un tubo in polipropilene da 50 ml.
- Utilizzare una pipetta sierologica per aggiungere 5-10 mL di DPBS alla piastra di Petri, galleggiare i resti del tessuto e pipettare su e giù per generare una sospensione.
- Trasferire la sospensione con la pipetta al filtro cellulare.
- Ripetere i passaggi 6.3-6.4 fino a quando tutti i resti di tessuto non vengono risolti dalla piastra di Petri.
- Utilizzare lo stantuffo di una siringa uni-way da 20 ml per spremere la sospensione cellulare e tissutale attraverso il filtro cellulare.
- Risciacquare con 5-10 ml di DPBS fresco, scartare il filtro cellulare e chiudere correttamente il tubo.
- Centrifugare la sospensione a 180 x g per 5-10 minuti.
- Preparare un collagene-I prerivestito 6 piastra bene con 1,5 mL di mezzo per pozzo.
- Aspirare e scartare il supernatante. Resuspend il pellet in 3 mL di DPBS o mezzo e aggiungere 500 μL della sospensione ad ogni pozzo. Posizionare la piastra nell'incubatore (100% di umidità, 5% CO2, 37 °C)
- Monitorare quotidianamente la piastra per la crescita cellulare e la contaminazione.
NOTA: Un'ulteriore ristrutturazione cellulare fino al punto di istituzione di una linea cellulare permanente non è descritta qui.
7. Generazione PDX
- Condurre esperimentii n vivo solo da persone adeguatamente qualificate che soddisfa i requisiti dell'autorità competente della vostra giurisdizione.
- Ospitare topi immunodifesa in condizioni specifiche esenti da agenti patogeni (SPF) che soddisfano le esigenze del ceppo di topo usato. Le misure igieniche includono gabbie ventilate individualmente, alimenti autoclavati, acqua e materiale di nidificazione, nonché una serratura d'aria di sicurezza e l'uso di dispositivi di protezione personali.
- Autoclave tutti gli strumenti in anticipo e utilizzare un solo set di strumenti per ogni caso tumorale per evitare la contaminazione incrociata. Maneggiare il tessuto tumorale il più asettico possibile. Tutti gli articoli in plastica nominati di seguito devono essere sterili, monouso e scartati dopo ogni intervento chirurgico.
NOTA: Determinata con il metodo di congelamento di quattro pezzi di tessuto tumorale per criotubo, la generazione PDX richiede sempre due topi per campione, idealmente con conseguente quattro tumori PDX. - Scegli il tumore primario desiderato per l'innesto tramite il sistema di gestione dell'inventario di laboratorio e trasferisci il campione (tessuto tumorale preservato in modo vitale) dal serbatoio di stoccaggio principale a un contenitore portatile di azoto liquido (è conveniente anche lo stoccaggio intermedio a -80 °C sul ghiaccio secco).
- Indossare dispositivi di protezione individuale prima di entrare nella sezione SPF (scrub, zoccoli, grembiule, copricapelli, maschera chirurgica e soprasostruzioni), disinfettare le mani e tutte le attrezzature.
- Matrigel ammollo
- Rimuovere il criotubo dal contenitore di azoto liquido e attendere lo scongelamento del campione.
- Etichettare un tubo in polipropilene da 50 ml e riempire con 35 ml di DPBS.
- Inclinare il criotubo su e giù e trasferire immediatamente il contenuto sul tubo di polipropilene non appena il tessuto-medio-fango può essere spostato. Risciacquare delicatamente i pezzi di tessuto tumorale, scartare il volume principale dal tubo in un vaso separato, chiudere il coperchio e mettere il tubo su-lato verso il basso, in modo che i quattro pezzi di tessuto si riunistano nel coperchio.
- Mettere una piastra di Petri sull'accumulatore di raffreddamento e posizionare 100 μL di Matrigel come una singola goccia al centro. Utilizzare le forcette anatomiche per trasferire i pezzi tumorali nel Matrigel. Assicurarsi che ogni pezzo sia completamente coperto con Matrigel. Incubare per 10 minuti a 4 °C.
- Anestesia del topo (2 topi per campione, lavorare in parallelo)
- Preparare uno stock di 3:1- di una soluzione anestetica di ketamina (100 mg/mL) e xiazina (20 mg/mL). La dose raccomandata è di 90/6 mg/kg di peso corporeo.
- Pesare il topo e redigere la soluzione anestetica necessaria in una siringa per insulina monouso.
- Posizionare il mouse sulla griglia della gabbia, tirare delicatamente la coda con una mano per indurre un movimento in avanti e contemporaneamente granchiare il collo con una presa di pizzico dell'altra mano. Solleva il mouse della griglia e gira la mano, in modo che la schiena dell'animale poggia sul palmo della mano. Immobilizzare una delle zampe posteriori con il mignolo e iniettare i narcotici intraperitonealmente. Rimettere il topo nella sua gabbia e attendere l'induzione narcotica.
- Posizionare il topo anestetizzato sulla piastra riscaldante e coprire gli occhi con unguento per evitare danni corneali. Assale la profondità dell'anestesia pizzicando delicatamente il piede posteriore del topo con forcep chirurgiche.
NOTA: L'assenza di movimento indica narcosi profonda. Qualsiasi tipo di movimento richiede più tempo per raggiungere la profondità narcotica desiderata o una dose aggiuntiva di anestetici.
- Procedura chirurgica
- Formare una piega della pelle pizzicando il collo del mouse e iniettare il microchip per via sottocutanea con l'applicatore (Vedere il passaggio 9 per i dettagli di programmazione)
- Radere i fianchi del topo se necessario (i topi NMRInu/nu non richiedono la rasatura), applicare povidone-iodio con un batuffolo di cotone e utilizzare drappeggio chirurgico per creare un campo sterile.
- Sollevare la pelle del fianco con forcep chirurgiche, fare una piccola incisione di circa 4 mm e formare una piccola tasca sottocutanea con preparazione smussata con forbici.
- Metti un pezzo tumorale in ogni tasca e posizionalo all'estremità posteriore.
- Ritagliare l'estremità di una punta di pipetta da 100 μL e aspirare il Matrigel rimanente dalla piastra di Petri e applicarlo equamente in ogni tasca della pelle.
- Chiudere le ferite con semplici suture interrotte e applicare la medicazione spray.
- Scansiona il microchip e controlla la validità del mouse e dell'ID tumorale.
- Prepara una nuova gabbia con biancheria da letto fresca e materiale di nidificazione, oltre a un bastone rosicchiato. Piegare un "cuscino" con gli asciugamani di carta e posare il mouse con la testa sopraelevata sotto una lampada termica a infrarossi.
- Mescolare 0,25 ml di trimetopolrim/sulfamethoxazolo (400 mg/80 mg) con 100 ml di acqua potabile e somministrare tramite la bottiglia da bere. Si consideri che un topo consuma circa 150 mL per kg di peso corporeo al giorno.
NOTA: Poiché il modello PDX sottocutaneo non è associato al dolore postoperatorio, né durante il processo di guarigione delle ferite, né durante la crescita del tumore, non è richiesta l'analgesia postoperatoria. Si prega di notare che le linee guida per il benessere degli animali della vostra istituzione / autorità potrebbero differire. - Monitoraggio degli animali da esperimento
- Monitorare quotidianamente i topi alla ricerca di segni di angoscia. Questo può essere delegato a custodi animali qualificati.
- Mantenere il trattamento antibiotico postoperatorio con il suddetto dosaggio per 4 settimane. Sostituire la miscela antibiotica due volte a settimana.
- Misurare la dimensione del tumore almeno una volta alla settimana, idealmente quotidianamente, con una pinza (volume tumorale = 0,52 x lunghezza x larghezza x altezza [mm3]) e registrare nel database.
8. Raccolta e lavorazione PDX
- Raccogliere ed elaborare il tumore PDX, quando:
La dimensione del tumore raggiunge il volume target di 1.500 mm3.
L'animale che porta il tumore mostra segni di angoscia e / o malattia e il trattamento è inutile.
Il tumore diventa ulcerato o penetra nella pelle del topo. - Leggere il microchip per identificare il PDX corretto.
- Eutanasia del topo con un metodo legale (a seconda delle linee guida nazionali) come ad esempio l'asfissiazione di CO2o l'iniezione di chetamina/xiazina seguita da lussazione cervicale.
- Sollevare la pelle con forcende chirurgiche ai fianchi e incise con forbici Metzenbaum a pochi millimetri di distanza dal tumore.
- Staccare la pelle sopra il tumore con una preparazione smussata, quindi afferrare attentamente il tumore con le forcelle anatomiche e staccare il tumore dalla fascia superficiale del corpo.
- Risciacquare il tumore con DPBS, metterlo in una piastra di Petri e rimuovere il tessuto connettivo adiacente.
- A questo punto, eseguire una delle operazioni seguenti:
- Tagliare cubi da30 mm 3 e creare un nuovo PDX (procedere con il protocollo al punto 7.7.4).
- Tagliare il tumore a fette, che vengono poi trasferite in cassette istografiche e conservate in formaldeide al 4% per l'incorporamento successivo della paraffina.
- Conservare il tumore in un tubo con soluzione di stoccaggio dei tessuti per aggiungerlo alla biobanca (procedere con il protocollo al passaggio 3.) e/o creare linee cellulari derivate da PDX (procedere con il protocollo al passaggio 4).
9. Biobanca e gestione dei dati
- Assegnare un ID interno a ciascun caso tumorale secondo la tabella 1.
| Posizione/nome del laboratorio | entità tumorali | numero di caso consecutivo | specificazione | numero consecutivo |
| C=colon-retto | _Met=Metastasi | |||
| P=pancreatico | _Tu=Tumore | |||
| Esempio: HROC389_Met2 = Rostock, cancro del colon-retto, caso 389, seconda metastasi | ||||
Tabella 1: Definizione dell'ID campione.
- Conservare il consenso del paziente in forma elettronica e cartacea insieme all'ID tumorale.
- Raccogli quanti più dati clinici possibili e memorizzali in modo anonimo e separato.
- Utilizzare un software di gestione dei dati (ad esempio Freezerworks) o altro e creare un'interfaccia con un software di stampa di etichette per generare etichette di codici a barre autoaderente resistenti alla temperatura.
- Aggiungere un nuovo campione aprendo il software di gestione dei dati, definire il tipo di campione e registrare le seguenti informazioni: ID tumorale, tipo di tessuto, metodo di congelamento, data, dipendente responsabile, numero di passaggio, ID mouse e affaticamento del mouse.
- Assegnare i campioni a posizioni specifiche nel serbatoio di stoccaggio.
- Tracciamento e monitoraggio di PDX (si applica al passaggio 7-8)
- Utilizzare una base di dati MS Access (o un sistema simile) su un dispositivo portatile abilitato bluetooth (laptop o tablet) per registrare l'ID tumorale, la data di impianto, la data di eutanasia, l'età e lo sforzo del mouse, nonché la crescita del tumore nel tempo.
- Collegare il lettore di microchip al dispositivo e leggere il microchip prima dell'impianto.
- Assegnare un ID specifico a ogni mouse; si utilizza il seguente schema: (cfr. tabella 2)
- Dopo l'impianto, registrare l'ID insieme alle caratteristiche del mouse nella base di dati.
- Riletto il microchip e controlla, se le specifiche del microchip, della base di dati e dell'etichetta del criotubo sono coerenti.
- Creare di conseguenza un'etichetta per ogni gabbia per topi.
NOTA: per creare un backup fisico, attaccare le etichette del criotubo con le etichette dei microchip corrispondenti in un libretto e notare la data e la tensione del mouse. - Per monitorare la crescita tumorale del singolo PDX, scansionare il microchip del mouse con il lettore collegato al dispositivo della base dati per l'identificazione e registrare la dimensione tumorale misurata dalla pinza ogni settimana.
- Pianificare il punto di tempo ideale della raccolta del PDX analizzando la curva di crescita del tumore.
| ID tumorale | Conservazione preventiva in N2 (=f) | Numero passaggio (=T) | numero di mouse consecutivo (=M) |
| Esempio: HROP12 fT0 M1 = Rostock, cancro al pancreas, caso 12, generato da tessuto primario congelato, primo passaggio, topo 1. | |||
Tabella 2: Definizione dell'ID PDX.
Representative Results
Nelle nostre mani, il tasso di stabilimento delle colture cellulari primarie (Figura 2A & B) è stato del 12,9% in una grande serie9. La maggior parte dei tentativi di isolare le cellule tumorali espandibili da nuovi campioni chirurgici reinsediati è fallita a causa della mancanza di crescita o contaminazione precoce. Lo stabilimento della linea cellulare è stato considerato un successo dopo 3 passaggi con una crescita costante in condizioni di coltura standard (DMEM, FCS al 10%, vaso di coltura standard) e convalida della differenziazione epiteliale tramite l'analisi FACS10. Le linee cellulari derivate da tumori PDX (Figura 2C & D) hanno mostrato un tasso di stabilimento più elevato del 23,6%, dovuto anche alla possibilità di tentativi ripetitivi in contrasto con i tumori primari resected9. Tuttavia, alcune colture miste (figura 2E) non possono essere liberate dalla crescita fibroblastica o addirittura perse a causa della crescita troppo fibroblastica (Figura 2F).
Figura 2: Coltura cellulare. Linee cellulari tumorali primarie, derivate da una metastasi del caso di cancro del colon HROC313, passaggio 21 (A) e caso di cancro al pancreas HROP88, passaggio 5 (B). Linee cellulari tumorali derivate da PDX del colon PDX HROC285 T0 M2 (D) e pancreatico PDX HROP10 T5 M2, passaggio 4 (E). Coltura mista di fibroblasti e cellule tumorali da tumore al pancreas HROP75, passaggio 8 (C) e crescita troppo fibroblastica (F). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Considerando i cambiamenti nel protocollo di generazione PDX, i ceppi di topi utilizzati e anche gli sperimentatori nel corso di diversi anni, nonché grandi differenze nella quantità di tessuto tumorale disponibile per l'innesto, non è banale dare il tasso di successo complessivo della generazione PDX. In una serie molto recente di esperimenti di generazione PDX eseguiti da due ricercatori (S.M. e F.B.), sono stati osservati tassi di crescita primaria del 63% per il PDX colorettale (un'istologia esemplare può essere rappresentata dalla figura 3A)e del 48% per il PDX pancreatico(Figura 3B). La crescita dei linfomi murini o umani nel sito di impianto è relativamente rara, ma può imitare la crescita pdx di successo (Figura 3C). Oltre all'esame istopatologico, la concordanza tra i modelli PDX e i loro pazienti donatori è stata regolarmente confermata da una breve analisi di ripetizione tandem (STR) (Figura 3D). Ad oggi la biobanca comprende >50 colon-retto primario e >50 secondario, 3 linee cellulari tumorali pancreatiche primarie e 6 secondarie, nonché modelli >150 colorettali e 19 pdx pancreatici.
Figura 3: Confronto istologico rappresentativo del colon-retto (A) e del PDX pancreatico (B). Linfoma umano nel sito di impianto che imita la crescita del PDX (C). Test di identità genetica di un modello PDX (HROC430 T1 M2) al tessuto tumorale del paziente originale (HROC430Tu) mediante breve analisi di ripetizione tandem (STR). Il confronto dei nove LOCI STR, vWA, THO1, TPOX, CSF1 PO (colorante FAM) e D5S818, D13S317, D7S820, D16S539 (colorante HEX) utilizzando PCR multiplex con primer con etichetta fluorescente a seguito dell'elettroforesi capillare ha confermato la concordanza genetica del PDX e del tumore del donatore (D). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
La generazione di una biobanca vivente presuppone, oltre a rispettare le norme giuridiche in materia di privacy, diritto medico e benessere degli animali, una buona infrastruttura e un team ben coordinato. Si è dimostrato vantaggioso coinvolgere direttamente una parte del personale chirurgico nelle procedure di ricerca, poiché possono valutare molto bene l'idoneità del singolo paziente alla donazione di tessuti. Inoltre, i pazienti tendono a acconsentire con il biobanking più frequentemente, quando la loro approvazione scritta viene ottenuta nel corso della discussione sul consenso informato chirurgico. Per risparmiare tempo e risorse, i casi che presumibilmente produrranno quantità insufficienti di tessuto tumorale non dovrebbero essere selezionati per il biobanking. Quando si tratta di acquisizione di campioni, la massima "la comunicazione è la chiave" è una verità semplice, ma spesso trascurata. Ci vuole solo un singolo infermiere teatrale disinformato o un collega chirurgico per rovinare l'esemplare fin dall'inizio procedendo come al solito e aggiungendo formaldeide al campione di resezione. Pertanto, è assolutamente fondamentale che ogni singolo membro del personale coinvolto faccia conoscenza della SOP per il biobanking. I chirurghi dovrebbero essere notati il giorno prima e proprio all'inizio della procedura sulla raccolta programmata dei tessuti. Inoltre, i casi selezionati per il biobanking dovrebbero essere evidenziati nel piano or elettronico. La raccolta dei tessuti dal campione chirurgico deve essere eseguita da un patologo. In primo luogo, ciò garantirà che la raccolta dei tessuti non interferisca con la relazione patologica finale. In secondo luogo, ciò aumenta la probabilità di ricevere tessuti con quantità adeguate di tessuto tumorale vitale. Soprattutto nei tumori pancreatici con una pronunciata reazione desmoplastica e frequenti aree necrotiche, le parti vitali sono difficili da identificare macroscopicamente per l'occhio non addestrato. Come eccezione a questa regola, i blocchi di tessuto da grandi metastasi epatiche o polmonari, possono a volte essere asportati "back-table" dal chirurgo, se i margini chirurgici possono essere definiti macroscopicamente. Il cancro rettale resected per escissione mesorettale totale (TME), potrebbe non essere adatto per il biobanking, poiché la raccolta dei tessuti dal campione reinsediato prima dell'incorporamento della paraffina potrebbe interferire con la valutazione della qualità TME. In alternativa, i tessuti per il biobanking possono essere acquisiti mediante biopsia transanale del cancro rettale.
I tassi di stabilimento per le colture cellulari primarie derivate dal tumore originale sono generalmente bassi. È più probabile che le colture di cellule secondarie derivate da PDX vengano stabilite con successo. Si consiglia di testare diversi supporti per ogni caso e l'uso di integratori antibiotici per i primi passaggi per ridurre al minimo la contaminazione poiché il tessuto raccolto è raramente sterile. Dopo una propagazione riuscita, ogni singola linea cellulare deve essere confermata come linea cellulare tumorale dall'analisi FACS e regolarmente testata per la contaminazione da micoplasma. Per escludere la contaminazione incrociata, è consigliabile un'analisi STR regolare. Va notato che il protocollo di stabilimento per le linee cellulari primarie e secondarie è costantemente soggetto a ottimizzazione. I dettagli relativi alla composizione e ai tassi di successo dei singoli mezzi di comunicazione esulano chiaramente dall'ambito di questo lavoro e saranno pubblicati separatamente.
Per l'innesto PDX, il tessuto tumorale può essere impiantato direttamente dopo la resezione o crioconservato nel siero fetale del calvo con DMSO al 10% o mezzi di congelamento simili per l'impianto ritardato. L'impianto immediatamente dopo la raccolta dei tessuti tumorali mette a dura prova la logistica e il personale di laboratorio e i risultati di xenografting dopo la crioconservazione non sono affatto inferiori a 10. Inoltre, l'incubazione del tessuto in Matrigel prima dell'impianto tumorale, aumenta significativamente i tassi di innesto12. Si consiglia l'innesto ritardato a seguito di una definitiva scoperta patologica e dello smaltimento immediato di campioni di tessuto raccolti erroneamente. Poiché il tasso di successo dell'innesto primario aumenta con l'immunodeficienza del topo ricevente, tendiamo a utilizzare topi NSG per il primo passaggio PDX. Dopo il primo accinnesto PDX di successo, i topi NMRInu/nu possono e devono essere utilizzati per passaggi successivi ed espansione dei tessuti. Questo ceppo è più robusto, più economico e più facile da allevare rispetto all'NSG o a ceppi immunodifesa simili, ma mostra ancora tassi di innesto ragionevoli. Inoltre, la sua nudità facilita l'impianto e il monitoraggio della crescita tumorale. Per aumentare i tassi di innesto nei passaggi successivi, si consiglia il trasferimento diretto di tessuti PDX appena raccolti per ospitare topi quando possibile, specialmente per pdx a crescita lenta e casi con un basso tasso di successo dell'innesto primario. Collins e Lang hanno recentemente esaminato 14 studi sull'istituzione del PDX colorettale e hanno riportato tassi di innesto che variano dal 14 al 100% con un tasso medio di stabilimento PDX del 68%, quest'ultimo coerente con i nostririsultati 13. In linea con la letteratura, abbiamo osservato tassi di stabilimento più bassi di pancreas rispetto al cancro del colon-retto PDX14. Indipendentemente dal ceppo del topo ospite e dall'entità tumorale, la crescita dei linfomi delle cellule B associati al virus Epstein-Barr (EBV) umani e dei linfomi murini sul lato dell'impianto pone un'insidiaimportante 15,16. Se non riconosciuti, tali tumori possono "contaminare" i passaggi successivi e quindi confondere risultati consecutivi. Insolita crescita rapida del PDX e gonfiore dei linfonodi cervicali, ascellari e inguinali sono forti indicatori della crescita del linfoma murino, ma è comunque consigliabile un esame istologico regolare della PDX. Inoltre, la concordanza genetica tra pdx e il corrispondente paziente donatore deve essere testata regolarmente mediante analisi STR. Idealmente, la biobanca dovrebbe essere collegata a una banca dati clinica che comprenda le caratteristiche dei pazienti (informazioni generali, sopravvivenza, sopravvivenza libera recidiva, terapia, neoplasia secondaria, ecc.). A causa delle normative legali sulla protezione della privacy e della mancanza di una base di dati così anonima, il nostro set di dati clinici viene regolarmente amministrato e aggiornato manualmente dai medici che collaborano.
Mentre le biobanche convenzionali sono limitate alla ricerca degli osservatorio, una biobanca vivente offre l'opportunità di interventi in vitro e in vivo. Le linee cellulari derivate dal paziente sono uno strumento importante per la ricerca fondamentale, gli screening dei farmaci ad alta produttività e la valutazione di nuovi agentifarmaceutici 4. I corrispondenti modelli PDX, tuttavia, sono sempre più importanti, poiché ricapitolano da vicino l'istologia del tumore originale17,18 e mostrano un'elevata stabilità genetica su diversipassaggi 19,20. La nostra biobanca PDX si è dimostrata un'ottima piattaforma per la ricercapreclinica e fondamentale 6,21. Inoltre, poiché le grandi collezioni PDX riflettono adeguatamente l'eterogeneità inter-individuale della popolazione del paziente, l'approccio dello studio clinico PDX (PCT) (un animale per modello per trattamento) ha acquisito importanza per lo sviluppo del farmaco poiché consente la previsione fedele della risposta clinica a nuovi farmaci e al regime combinatorio8. Attualmente stiamo anche valutando nuovi farmaci sperimentali in piccoli studi PCT.
Nonostante questi risultati promettenti, la durata mediana dello stabilimento di 12,2 mesi, impedisce l'applicabilità clinica dei modelli PDX come "topi avatar" per testare le opzioni di trattamento antitumorale, almeno per quei pazienti che hanno bisogno di un trattamento adiuvante immediato o addirittura neoadiuvante22. Un ulteriore svantaggio dei modelli PDX standard è la mancanza di usabilità per i test di immunoterapia a causa dell'immunodeficienza dei topi ospiti. Per superare questi limiti, sono stati sviluppati diversi ceppi di topi "umanizzati". Questi topi sono fortemente immunocompromessi, ma possono essere ricostituiti con vari tipi di cellule derivate dal midollo osseo umano o cellule staminali ematopoietiche cd34+ successive alla crescita del PDX23,consentendo la valutazione della citotossicità mediata dai linfociti e della risposta terapeutica al trattamento inibitore del checkpoint immunitario24,25.
Negli ultimi anni, gli organoidi derivati dal paziente (DOP) sono emersi come importanti modelli di cancro in competizione con la PDX. Derivate da pezzi tumorali intatti e coltivate in un'impalcatura a matrice extracellulare, queste strutture tridimensionali riflettono da vicino le proprietà istologiche e genetiche del tumore originale. La possibilità di espansione e crioconservazione a lungo termine rende dop un integratore ideale di una biobancavivente 26,27. Oltre a un tasso di stabilimento relativamente elevato, è stata segnalata una previsione affidabile della risposta ai farmaci per la DOP di diverse entitàtumorali 28. Inoltre, le DOP sono state persino generate da cellule tumorali circolanti ed è anche possibile la creazione simultanea di organoidi dal tessuto sano corrispondente, consentendo la valutazione della tossicità correlata alla terapia su basepaziente-individuale 29,30. Tuttavia, rispetto alle colture cellulari 2D convenzionali, la coltura organoide richiede tempo e risorse e i composti artificiali della matrice extracellulare possono interferire con alcune procedure analitiche31. Inoltre, gli organoidi del cancro sono suscettibili alla crescita troppo da organoidi a crescita più rapida e non maligni derivati da epitelio sano30. A causa della mancanza di stroma, vasi sanguigni e cellule immunitarie, le DOP sono per lo più inapplicabili per il test di agenti immunoterapici antiangiogenetici. Tuttavia, i nuovi metodi di coltivazione consentono la modellazione del microambiente tumorale in vitro,rendendo le DOP un vero concorrente per i modelli PDX32. Nel prossimo futuro, i modelli tumorali pazienti-individuali, combinati con potenti strumenti genetici come il sequenziamento di nuova generazione, si spera aprano la strada a una vera medicina di precisione e approcci di trattamento su misura.
Disclosures
nessuno.
Acknowledgments
Prendiamo gentilmente atto di Jenny Burmeister, la nostra assistente grafica, per la registrazione e l'editing del video. Inoltre, ringraziamo i nostri colleghi del reparto chirurgico e patologico per la collaborazione di lunga data. Ringraziamo anche Marcus Müller, responsabile della produzione dell'IT and Media Centre dell'Università di Rostock, per aver fornito le apparecchiature di registrazione audio e perfezionato la qualità del suono.
FINANZIAMENTO: La Fondazione tedesca per l'aiuto al cancro (DKH e.V.), la sovvenzione numero 108446 e il numero di sovvenzione TBI-V-1-241-VBW-084 dello stato Meclemburgo-Pomerania Anteriore hanno parzialmente finanziato questa ricerca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacillol® AF; 1L | Bode, Hartmann | REF 973380 | desinfection |
| PP centrifuge tube, 15ml; sterile | Greiner Bio One | GBO Cat. No.:188271 | centrifuge tube |
| PP centrifuge tube, 50ml, sterile | Sarstedt | Order number: 62.547.254 | centrifuge tube |
| BD DiscarditTM II Syringe 20ml | BD | REF 300296 | blood collection |
| Serum 7,5ml Sarstedt Monovette | Sarstedt | Item number: 01.1601 | blood collection |
| serological Pipette 10ml | Sarstedt | REF 86.1254.001 | liquid transfer |
| Pipetboy ratiolab® accupetta | Ratiolab | Item number: RL3200300 | liquid transfer |
| PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | VWR Cat.No: 613-4438 | liquid transfer |
| DPBS; w/o Ca & Mg | Pan Biotech | Cat. No.: P04-36500 | washing |
| Pancoll human | Pan Biotech | Cat. No.: P04-60500 | density gradient centrifugation |
| DMEM/F12 (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | PAN Biotech | Cat. No.: P04-41500 | cell cultivation |
| FBS Good Forte (Filtrated Bovine Serum) | PAN Biotech | Cat. No.: P40-47500 | cell cultivation |
| L-Glutamine 200mM | PAN Biotech | Cat. No.: P04-80100 | cell cultivation |
| Trypsin / EDTA | PAN Biotech | Cat. No.: P10-023100 | cell cultivation |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxid for cell culture) | PanReac AppliChem | VWR Cat.No: A3672.0250 | cell freezing |
| Freezer Medium (FCS with 10% DMSO) | selfmade | --- | cell freezing |
| cryotube- CryoPure 2ml | Sarstedt | 72380 | cell freezing |
| 6-Well cell culture plate; steril; with lid | Greiner bio-one | Cat.-No.: 657 160 | cell cultivation |
| Petri dish 92 x 16 mm, PS, without cams | Sarstedt | Cat. No.: 82.1472.001 | tissue preparation |
| sterile surgical blades | B.Braun (Aesculap) | REF BB510 | tissue preparation |
| BD DiscarditTM II Syringe 10ml | BD | REF 309110 | tissue preparation |
| cell strainer; yellow; 100µm | Falcon | REF 352360 | tissue preparation |
| CoolCell | biocision | Item number: 210004 | cooling container with -1°C/min |
| Dewar transport vessel type 27 B, 2 l, 138 mm | KGW | Cat. No.: HT39.1 | transport system |
| Pipette tip 200µl | Sarstedt | REF 70.760.002 | liquid transfer |
| Filter tip 1000µl | Sarstedt | REF 70.762.411 | liquid transfer |
| Pipette 200µl, yellow | Eppendorf | Cat. No.: 3121 000.082 | liquid transfer |
| Pipette 1000µl, blue | Eppendorf | Cat. No.: 3121 000.120 | liquid transfer |
| incubator BB 6220 CU | Heraeus | Cat.-No.: 51012839 | cell cultivation |
| heating plate PRÄZITHERM | Harry Gestigkeit GmbH | --- | heating |
| Microscope Zeiss Primo Vert | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | Serial number. 3842000839 | imaging cell cultures |
| Sterile bench Safe flow 1.8 nunc | nunc GmbH & Co. KG | --- | sterile working bench |
| freezer -80°C | Kryotec-Kryosafe GmbH | --- | sample storage |
| Electronic balance MP-300 | Chyo | --- | Scale |
| BD Micro-fine, U100 insulin syringe | BD | REF 324826 | injection anesthetic |
| Rompun 2%; 25ml | Bayer | approval number: 6293841.00.00 | anesthesia |
| Ketamin 100 mg/ml, 25ml | CP-Pharma GmbH | approval number: 401650.00.00 | anesthesia |
| GES3S Reader | Datamars | not available | RFID reader |
| ISO-Transponder FDX-B (1,4x8mm) | Peddymark | --- | RFID chip |
| Cotrim-ratiopharm® Ampullen SF 480 mg/5 ml | Ratiopharm | PZN-03928197 | antibiotic drinking water |
| Heating plate #FM-20 42x28cm | Dragon | --- | heating |
| Heating lamp | Electric Petra, Burgau | --- | heating |
| Ointment for the eyes and nose (5% Dexpanthenol) Bepanthen | Bayer | PZN-01578675 | Eye protection |
| anatomical tweezer | B.Braun Aesculap | BD21 OR | surgical instruments |
| surgical tweezer | B.Braun Aesculap | BD50 1 R | surgical instruments |
| scissors | B.Braun Aesculap | BC05 6R | surgical instruments |
| needle holder | B.Braun Aesculap | BH1 1 OR | surgical instruments |
| Prolene 5-0 | Ethicon | XN8870.P32 | surgical suture material |
| Opsite moisture vapour permable spray dressing | Smith&Nephew | REF 66004978, PZN- 02063507 | surgical suture material |
| Adhesive aperture drape | Barrier | REF 904622 | sterile OP tissue |
| gauze swap Gazin®; steril; 10x10 cm | Lohmann&Rauscher | REF 18506 | sterile OP tissue |
| Raucotupf cotton tipped applicators | Lohmann&Rauscher | REF 11969 | applicator |
| Corning® Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | Cat.-No.: 354234 | Basement Membrane Matrix |
| iodine solution Braunol (7,5g povidone iodine) | B.Braun Melsungen AG | Item number: 18839 | desinfection |
| MACS® Tissue Storage Solution | Miltenyi Biotec GmbH | Order No.:130-100-008 | storage solution |
| Formafix 4% | Grimm med. Logistik GmbH | Item number: F10010G | fixation solution |
| Software FreezerworksBasic | Dataworks Development, Inc | --- | sample organization |
| Zebra TLP 2844 printer | Zebra | --- | label printer |
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