Summary
Questo è un metodo efficace per lo screening di soppressori o driver di metastasi del cancro. Le cellule, trasdotte con una libreria di espressione, vengono iniettate nella vascolarizzazione della membrana corioallantoica di pollo per formare colonie metastatiche. Le colonie con ridotta o aumentata invasività vengono asportato, espanse, reiniettate per confermare il loro fenotipo e, infine, analizzate utilizzando il sequenziamento ad alto rendimento.
Abstract
I recenti progressi nella ricerca sul cancro hanno illustrato la natura altamente complessa delle metastasi del cancro. È stato scoperto che più geni o reti di geni sono coinvolti nella regolazione differenziale dei geni a cascata metastatica del cancro e dei prodotti genici dipendenti dal tipo di cancro, dal tessuto e dalle caratteristiche individuali del paziente. Questi rappresentano obiettivi potenzialmente importanti per le terapie genetiche e gli approcci di medicina personalizzata. Lo sviluppo di piattaforme di screening rapido è essenziale per l'identificazione di questi bersagli genetici.
La membrana corioallantoica del pulcino (CAM) è una membrana altamente vascolarizzata e ricca di collagene situata sotto il guscio d'uovo che consente lo scambio di gas nell'embrione in via di sviluppo. A causa della posizione e della vascolarizzazione del CAM, lo abbiamo sviluppato come modello di metastasi del cancro umano intravitale che consente un robusto xenotrapianto delle cellule tumorali umane e l'imaging in tempo reale delle interazioni delle cellule tumorali con la matrice e la vascolarizzazione ricche di collagene.
Utilizzando questo modello, è stata progettata una piattaforma di screening quantitativo per l'identificazione di nuovi driver o soppressori delle metastasi del cancro. Abbiamo trasdotto un pool di cellule tumorali HEp3 della testa e del collo con una libreria completa di geni shRNA del genoma umano, quindi iniettato le cellule, a bassa densità, nella vascolarizzazione CAM. Le cellule proliferarono e formarono colonie di cellule tumorali singole. Le singole colonie che non erano in grado di invadere il tessuto CAM erano visibili come fenotipo di colonia compatta e asportate per l'identificazione dello shRNA trasdotto presente nelle cellule. Le immagini delle singole colonie sono state valutate per la loro invasività. Sono stati eseguiti più cicli di selezioni per ridurre il tasso di falsi positivi. Cloni di cellule tumorali individuali e isolati o cloni di nuova progettazione che esprimono geni di interesse sono stati sottoposti a test di formazione tumorale primaria o analisi di cooptazione vascolare delle cellule tumorali. In sintesi presentiamo una piattaforma di screening rapido che consente l'identificazione del bersaglio anti-metastatico e l'analisi intravitale di una cascata dinamica e complessa di eventi.
Introduction
Le metastasi sono la principale causa di morte del pazienteoncologico1,2,3. Le cellule tumorali metastatiche utilizzano percorsi di segnalazione distinti, a seconda del tipo di cancro, attraverso le cinque fasi della cascata metastatica: invasione locale, intravaso, sopravvivenza nella circolazione, stravaso ed espansione della colonia in siti metastatici distanti. L'attuale comprensione di questo processo metastatico suggerisce che ci sono due fasi di collo di bottiglia, una è l'invasione direzionale della cellula tumorale dal tumore primario, e la seconda è la creazione della lesione metastatica del sito distante4,5,6. Entrambi i passaggi richiedono alle cellule tumorali di interagire attivamente con il collagene e la vascolarizzazione nei siti di invasione iniziale o formazione di lesioni metastatiche a distanza. Pertanto, le cellule tumorali metastatiche devono essere in grado di attaccarsi alle cellule, rimodellare le fibre di collagene e invadere direzionalmente lungo le paretivascolari 7. I modelli di screening in grado di identificare rapidamente bersagli terapeutici antimetastatici per impedire alle cellule tumorali di completare questi passaggi sono della massima importanza. I modelli di screening in vitro esistenti non imitano completamente il complesso ambiente dei tessuti vivi. I modelli murini sono costosi e richiedono molto tempo. Pertanto, vi è un urgente bisogno di piattaforme di screening intravitale che forniscano ambienti di tessuti vivi complessi e una rapida identificazione dei bersagli.
Nell'ultimo decennio, l'embrione di pollo è stato stabilito come un modello robusto ed economico di metastasi del cancro umano8,9,10,11,12. Il tessuto della membrana corioallantoica del pulcino (CAM) è sottile e traslucido, il che lo rende ideale per l'imaging microscopico intravitale dei comportamenti cellulari e delle colonie nei siti tumorali primari e / o metastatici12. La crescita del tumore primario da più linee cellulari tumorali umane può essere avviata e metastatizzata in un arco di soli diversi giorni dopo la microiniezione nel tessuto CAM. Le cellule tumorali possono essere somministrate nel tessuto CAM in diversi modi, tra cui per via endovenosa, intra-CAM o come collagene onplants, questa flessibilità consente al ricercatore di concentrarsi su fasi specifiche della progressione del cancro, ad esempio la formazione di lesioni metastatiche, l'invasione dal tumore primario o l'angiogenesi.
Qui descriviamo una piattaforma di screening quantitativo che può essere utilizzata per misurare la capacità delle cellule tumorali di stabilire lesioni metastatiche invasive. Le cellule tumorali che sono state trasdotte con una libreria di espressioni vengono iniettate per via endovenosa nella vascolarizzazione CAM a bassa densità. Le colonie metastatiche si formano per 4-5 giorni, quindi viene valutata la capacità di invasione e l'interazione vascolare delle colonie risultanti. Le singole colonie che non riescono a invadere vengono asportate, propagate e il loro fenotipo viene confermato nella CAM mediante reiniezione e quantificazione della compattezza delle colonie e dei contatti cellula tumorale-vaso sanguigno. I costrutti della libreria di espressioni responsabili del fenotipo mutante della singola colonia metastatica sono identificati dal DNA genomico della colonia isolata tramite sequenziamento ad alto rendimento. La stessa piattaforma può essere ulteriormente utilizzata per convalidare il nesso causale tra un gene e il fenotipo osservato o per eseguire studi meccanicistici approfonditi sul fenotipo osservato.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con i regolamenti e le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università di Alberta. Gli embrioni aviari non sono considerati animali vivi da molti istituti di ricerca e non sono richiesti protocolli animali. Tuttavia, è opinione accettata che gli embrioni aviari possano provare dolore e, pertanto, debbano essere trattati nel modo più umano possibile. L'autorità locale per la ricerca sugli animali deve essere contattata prima dell'inizio di qualsiasi lavoro di ricerca per garantire che vengano seguite le normative appropriate.
1. Coltura di uova senza guscio
- Acquista uova di gallina fecondate dal fornitore locale. Questo esperimento utilizza la razza di pollo Livorno Bianca; tuttavia, possono essere utilizzate anche altre razze.
NOTA: Si raccomanda di acquisire il 10% in più di uova del necessario nel caso in cui alcuni degli embrioni siano danneggiati durante il cracking e non possano essere utilizzati in questo protocollo. - Trasferire il numero richiesto di uova in un incubatore a dondolo umidificato al 60%. Il resto delle uova può essere conservato fino a due settimane a 12 °C senza perdita di vitalità.
- Incubare le uova nell'incubatrice a dondolo umidificata per quattro giorni.
NOTA: Il giorno 1 è quando le uova vengono trasferite nell'incubatrice a dondolo. - Preparare i piatti di pesatura e i coperchi di plastica per la coltura delle uova senza guscio. Tagliare uno degli angoli di ciascuna delle stoviglie di pesatura per consentire un accesso efficiente dell'aria all'embrione (Figura 1A).
- Disporre i piatti di pesatura preparati in file nella cappa di flusso. (Figura 1B).
- In un piatto di pesatura separato preparare il 70% di etanolo per il risciacquo delle uova.
- Immergere brevemente l'uovo nel 70% di etanolo, quindi utilizzare lo strumento rotante elettrico per effettuare con cura quattro tagli di 2-3 mm paralleli al più grande diametro latitudinale dell'uovo (Figura 1C).
- Trasferire l'uovo tagliato in un piatto di pesatura e premere delicatamente l'uovo contro il fondo del piatto fino a formare una crepa nel guscio d'uovo (Figura 1D).
- Separare le metà del guscio d'uovo lasciando che l'embrione scivoli nel piatto di pesatura. Scartare il guscio d'uovo e coprire il piatto di pesatura con un coperchio.
- Trasferire gli embrioni in incubatrici umidificate non a dondolo (Figura 1E).
NOTA: Le stoviglie di pesatura contenenti gli embrioni vengono poste in contenitori di plastica separati (12 embrioni/contenitore). Ciò aumenta la vitalità dell'embrione e consente l'organizzazione dell'embrione specifica per l'esperimento. - Incubare gli embrioni per altri 6 giorni (fino a 10 giorni). Controllare quotidianamente la ricerca di embrioni morti o contaminati e rimuoverli dall'incubatrice.
NOTA: gli embrioni possono essere contaminati da spore di muffa trasportate dall'aria. La contaminazione da muffa si manifesta inizialmente come macchie bianche sulla superficie CAM dell'embrione. Rimuovere immediatamente gli embrioni contaminati e pulire l'incubatrice con il 70% di etanolo su base settimanale per prevenire la contaminazione. Nella nostra esperienza i livelli di contaminazione sono molto bassi ~ 1-3%. - Utilizzare questi embrioni per l'iniezione di cellule tumorali la mattina del giorno 10.
2. Preparazione delle cellule tumorali per l'iniezione
NOTA: La selezione delle colonie metastatiche si basa su un fenotipo stabilito da cellule tumorali fluorescenti, derivato da una libreria di espressioni o da un vettore etichettato con proteine fluorescenti come la proteina fluorescente verde o rossa (vedere l'intero flusso dello schermo nella Figura 2A). Non è raccomandato l'uso di cellule trasfettate transitoriamente con proteine fluorescenti o etichettate con coloranti fluorescenti permeabili alle cellule a causa del rapido sbiadimento del segnale causato dalla proliferazione delle cellule tumorali e dalla colorazione irregolare.
- Coltura di cellule tumorali al 60-70% di confluenza al momento dell'iniezione. L'uso di cellule tumorali a livelli più elevati di confluenza ridurrà la loro vitalità, con conseguente bassa efficienza della formazione di colonie metastatiche. Assicurarsi che le cellule tumorali utilizzate siano prive di micoplasma poiché la contaminazione da micoplasma può portare a una diminuzione della vitalità dell'embrione di pollo.
- Risciacquare le cellule due volte con 1x PBS pH 7,4. Rimuovere il PBS rimanente, quindi aggiungere lo 0,5% di tripsina-EDTA e incubare a 37 °C per 2-5 minuti fino a quando tutte le cellule non vengono sollevate dalla superficie del piatto di coltura.
- Trasferire la sospensione cellulare in tubo conico da 15 mL e centrifugare a temperatura ambiente a 200 x g per 5 min.
- Risospendare le cellule in 10 mL di PBS e centrifugare nuovamente le cellule come nel passaggio 2.3, per rimuovere la tripsina e altri componenti dei mezzi di coltura come gli antibiotici.
NOTA: La presenza di tripsina o componenti di colture cellulari come antibiotici nella sospensione delle cellule tumorali può comportare una diminuzione della vitalità dell'embrione di pollo. - Aspirare accuratamente le cellule surnatante e riconsoppiate con 1 mL di PBS ghiacciato.
- Contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro o qualsiasi altra apparecchiatura di conteggio delle cellule disponibile.
NOTA: Questo protocollo di screening richiede che ogni colonia metastatica sia iniziata da una singola cellula. Quando si contano le cellule assicurarsi che le cellule siano completamente tripsinizzate ed esistano come una sospensione a singola cellula (non sono presenti grumi cellulari). - Per iniezione endovenosa (IV) concentrare le cellule a 0,5 x10 da 6 a 1,0 x 106 cellule/ ml. Utilizzare 1x PBS ghiacciato per diluire e/o risospendare i concentrati cellulari. Aspettatevi che sarà necessario circa 1 mL di sospensione delle cellule per ogni dieci embrioni.
NOTA: La concentrazione necessaria di sospensione cellulare in sospensione è determinata principalmente dal livello di esperienza dello sperimentatore. Si prega di consultare la sezione successiva per maggiori dettagli.
3. Iniezione endovenosa di cellule tumorali per la formazione di colonie metastatiche
NOTA: Seguendo questo protocollo fino a un centinaio di embrioni possono essere iniettati entro un giorno. Generalmente ci vuole più tempo per isolare le colonie metastatiche (Step 5) quindi per iniettare le cellule tumorali e, pertanto, si consiglia di eseguire un esperimento iniziale per stimare il tempo necessario per completare tutti i passaggi. L'uso di etichette fluorescenti differenziali per cellule tumorali aiuta a ridurre il numero di animali e il tempo necessario per ogni esperimento. Ad esempio, le cellule di controllo possono essere etichettate con RFP (proteina fluorescente rossa) mentre le cellule tumorali mutanti possono essere alternativamente etichettate con GFP (proteina fluorescente verde). In questo caso, ogni esperimento ha un controllo integrato che corregge la variabilità interembriale.
- Assemblare l'apparecchio di iniezione come mostrato nella Figura 2B. Montare prima un ago sulla siringa e poi estendere l'ago della siringa con un tubo lungo 3-5 cm.
- Rompere la punta dell'ago borosilicato usando la pinna fine (~ 20-60 μL di larghezza).
- Caricare la siringa con la sospensione delle cellule tumorali (50-200 μL) e inserire l'ago borosilicato nel tubo (Figura 2B).
- Ispezionare l'ago borosilicato per l'intasamento delle cellule e le bolle d'aria. È fondamentale iniettare le cellule come una sospensione a singola cellula per garantire che ogni colonia metastatica sia avviata da una singola cellula.
NOTA: Le cellule tumorali tendono ad aggregarsi in PBS entro 1-2 ore dopo la tripsinizzazione e, pertanto, devono essere preparate immediatamente prima dell'iniezione. Se necessario, le cellule possono essere riconsosciate periodicamente utilizzando la siringa da 1 mL utilizzata per iniezioni (senza l'ago borosilicato). - Se si osserva un intasamento cellulare all'interno del capillare, rimuovere il capillare, sospendere nuovamente le cellule e sostituirlo con un nuovo capillare. Usa lo stantuffo per spingere fuori eventuali bolle. Se non si osservano intasamenti o bolle cellulari, procedere al passaggio successivo.
- Rimuovere il coperchio di copertura e trasferire l'embrione sotto lo stereoscopio. Identificare la vena appropriata da iniettare sulla superficie CAM. Vene e arterie formano l'intricata rete all'interno del tessuto CAM (Figura 2C). Le vene si distinguono per il colore rosso più brillante perché trasportano sangue ricco di ossigeno all'embrione.
NOTA: per la manipolazione generale degli embrioni, l'iniezione di cellule tumorali e l'escissione di colonie metastatiche, utilizzare uno stereomicroscopio fluorescente dotato di obiettivi 0,8x e 1,5x e oculari 10x per la visualizzazione. Il microscopio meno avanzato può anche essere utilizzato con successo per queste procedure, a seconda del livello di esperienza degli utenti. I lettori possono contattare gli autori per consigli più dettagliati. - Trova la vena ideale per iniettare le cellule che normalmente è solo leggermente più larga (10-20%) rispetto al diametro della punta dell'ago di borosilicato e situata a metà strada tra l'embrione e la parete del piatto di pesatura. È generalmente più facile iniettare nel punto immediatamente adiacente alla biforcazione venosa.
NOTA: L'iniezione in una vena più grande può sembrare più facile, ma porterà a sanguinamento eccessivo e diminuzione della sopravvivenza dell'embrione. - Premere la punta dell'ago contro la parete dei vasi sanguigni e applicare una leggera pressione nella stessa direzione del flusso sanguigno. Se necessario, utilizzare un batuffolo di cotone (tenuto in un'altra mano) per aiutare ad ancorare o stabilizzare la nave che viene iniettata.
- Premere delicatamente lo stantuffo della siringa. Si può visualizzare un'iniezione di successo osservando una "pulizia" del vaso sanguigno quando la sospensione delle cellule tumorali entra nel flusso sanguigno.
- Continuare a premere lo stantuffo della siringa per 2-10 s fino a quando il volume di sospensione desiderato viene iniettato nel flusso sanguigno della vena. Tutti insieme l'iniezione di un singolo embrione può richiedere 1-10 minuti a seconda del livello di esperienza dell'utente. Se nel sito di iniezione appare un sanguinamento eccessivo o un chiaro accumulo di liquidi, scartare l'embrione.
NOTA: È facile "iniettare troppo" un embrione. La considerazione generale che dovrebbe essere tenuta a mente è che le colonie metastatiche non dovrebbero toccarsi dopo un periodo di crescita di 4-5 giorni. Idealmente ~ 5-10% dei capillari venosi CAM terminali dovrebbe avere cellule immobilizzate in essi dopo un'iniezione di successo (Figura 2D, E). Come accennato nel passaggio 2, è possibile utilizzare un intervallo di concentrazione cellulare (0,5 x10 6 - 1,0 x 106 celle / mL). Concentrazioni più basse richiederanno tempi di iniezione più lunghi, ma ridurranno l'intasamento dell'ago. Concentrazioni più elevate richiederanno tempi di iniezione più brevi, ma aumenteranno l'intasamento dell'ago. Si consiglia di provare diverse concentrazioni per trovare quella più comoda per un operatore. Generalmente, si preferisce una concentrazione più elevata (1,0 x10 6 cellule/ml) per ridurre il tempo di iniezione. - Rimuovere l'ago dal CAM e tamponare delicatamente il sito di iniezione con un batuffolo di cotone per rimuovere il sangue o le cellule tumorali in eccesso.
- Coprire l'embrione nella pesata con un coperchio e riportare l'embrione di pollo iniettato nell'incubatrice.
- Ripetere la procedura con l'embrione successivo fino a quando tutti gli embrioni vengono iniettati.
4. Mantenimento dell'embrione durante la crescita della colonia metastatica
- Ispezionare visivamente gli embrioni. Se ce ne sono alcuni morti e / o contaminati da batteri o muffe rimuoverli dall'incubatore, quindi autoclave e scartarli secondo le procedure di smaltimento di laboratorio.
NOTA: Si raccomanda di ispezionare gli embrioni a giorni alterni (giorni 1, 3, 5 dopo l'iniezione di cellule tumorali) per la crescita delle colonie metastatiche. Evitare di spostare gli embrioni iniettati inutilmente poiché potrebbe causare danni all'embrione e/o morte. - Se le cellule mostrano una crescita eccessiva (le colonie metastatiche si sovrappongono tra loro) o una distribuzione irregolare all'interno del tessuto CAM (colonie metastatiche situate in una piccola sottoarea della superficie CAM) rimuovere quell'embrione dall'esperimento. Eutanasia degli embrioni scartati mediante congelamento a -20 °C (o altro metodo approvato) immediatamente dopo la rimozione dall'esperimento. Il numero di cellule metastatiche vitali all'interno del tessuto CAM diminuirà inizialmente (giorni 1-2) e poi aumenterà (giorni 2-5).
NOTA: Alcuni embrioni possono "rifiutare" le cellule tumorali, cioè tutte le cellule tumorali scompariranno dal tessuto CAM. Questi embrioni dovrebbero essere rimossi dall'esperimento. Normalmente, le colonie di cellule tumorali possono essere viste attraverso il coperchio trasparente sotto lo stereomicroscopio fluorescente senza aprire la parabola di pesatura. - Assicurarsi che le colonie metastatiche appaiano di forma uniforme (primi 1-3 giorni dopo l'iniezione). Identificare colonie metastatiche invasive o non invasive ai giorni 4-5 dopo l'iniezione (vedere paragrafo 5 per maggiori dettagli).
5. Isolamento delle colonie metastatiche
- Al giorno 5 dopo l'iniezione rimuovere gli embrioni dall'incubatrice e ispezionare i CAR embrionali per la distribuzione delle colonie metastatiche. Identificare gli embrioni con distribuzione uniforme delle colonie in cui sono presenti colonie compatte (o eccessivamente invasive).
NOTA: Il processo di coltura degli embrioni di pollo non è sterile, pertanto tutte le fasi di screening devono essere eseguite in condizioni altamente pulite per evitare future contaminazioni da coltura tissutale. La contaminazione è piuttosto rara e può essere facilmente evitata indossando guanti e una maschera e utilizzando solo strumenti sterili durante le procedure di iniezione cellulare e isolamento delle colonie. Si raccomanda di ispezionare gli embrioni uno per uno per ridurne l'esposizione alla temperatura ambiente di laboratorio e per prevenire la contaminazione. - Individua la colonia metastatica di interesse. Una colonia compatta può essere descritta come una con la maggior parte delle cellule tumorali situate all'interno di un'area limitata nel tessuto CAM (le cellule appaiono "raggruppate insieme"). Una colonia invasiva può essere descritta come colonia in cui le cellule tumorali "si disperdono" nel tessuto CAM (Figura 3A,B).
NOTA: La "compattezza" della colonia metastatica può essere spiegata sia dall'inibizione dell'invasione delle cellule tumorali, dall'inibizione della proliferazione delle cellule tumorali, sia da entrambe. Si dovrebbe prestare attenzione a tutti gli scenari e le colonie di contatto dovrebbero essere isolate (Figura 3A,B). Un semplice stereomicroscopio fluorescente può essere utilizzato per discriminare tra fenotipi di colonie metastatiche compatte e invasive. - Sotto il microscopio di dissezione tirare delicatamente verso l'alto il tessuto CAM che contiene la colonia metastatica di interesse usando una pinza fine (Figura 3C).
- Tagliare il tessuto CAM che contiene la colonia metastatica usando forbici chirurgiche.
- Trasferire il tessuto CAM che contiene la colonia metastatica in un tubo vuoto e sterile da 1,5 ml (su ghiaccio) e chiudere il coperchio del tubo.
NOTA: Le colonie isolate possono essere mantenute sul ghiaccio per un massimo di 3 ore senza perdita di vitalità. - Ripetere la procedura di escissione fino a quando tutte le colonie di interesse sono raccolte in tubi separati. Per evitare sofferenze animali, non asportare più di 2-3 colonie da un embrione. Eutanasia degli embrioni mediante congelamento a -20 °C (o altro metodo approvato) immediatamente dopo l'escissione della colonia.
- Tritare delicatamente il tessuto CAM in un tubo microcentrifuga utilizzando un ago sterile calibro 18. Utilizzare un ago separato per ogni colonia.
- Aggiungere 100 μL di 1x soluzione di collagenasi e incubare per 30 minuti a 37 °C.
- Ruotare le cellule e il tessuto CAM a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aspirare la soluzione di collagenasi e risospendare le cellule in mezzi completi utilizzati per la linea cellulare di interesse.
NOTA: Normalmente il tessuto CAM non è completamente dissociato dopo il trattamento con collagenasi e le cellule tumorali proliferano prima all'interno dei pezzi di tessuto CAM e solo successivamente migrano sul piatto di coltura tissutale. - Ruotare nuovamente le cellule e il tessuto CAM a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Risuspendare le cellule e i pezzi di tessuto CAM in 1 mL di supporto completo più fattore di selezione (se presente), quindi trasferire in un singolo piatto di coltura tissutale a 12 pozzi.
NOTA: I fibroblasti CAM di pollo possono persistere nella coltura tissutale per passaggi multipli inibendo l'espansione clonale. La capacità di espandere le colonie metastatiche in presenza di fattore di selezione (cioè, se un vettore che è stato usato per rendere fluorescenti le cellule tumorali codifica anche un gene di resistenza agli antibiotici dei mammiferi) può accelerare notevolmente l'espansione clonale. Un esperimento di curva di uccisione deve essere eseguito prima dello screening per garantire che venga utilizzata una corretta concentrazione di antibiotico. - Per le prossime 1-3 settimane monitorare le cellule tumorali ogni giorno per la crescita e la contaminazione.
- Quando le cellule raggiungono il 70-80% della confluenza trasferiscono le cellule in un piatto di coltura di volume più grande.
NOTA: Si raccomanda di espandere le cellule fino a quando almeno due flaconcini criogenici di ciascun clone possano essere congelati. Mantenere grandi quantità di coltura tissutale può essere laborioso e non necessario. - Procedere al sequenziamento o al prossimo ciclo di selezione non appena viene raggiunto un numero sufficiente di cellule tumorali. Generalmente, 1 x 106 di cellule tumorali sono sufficienti per le moderne tecniche di sequenziamento ad alto rendimento.
- Procedere alla reiniezione del clone e all'imaging e alla quantificazione della compattezza della colonia o del contatto cellula tumorale-vaso sanguigno (Figura 2A). In alternativa, procedere al sequenziamento ad alto rendimento o ripetere la selezione della colonia.
NOTA: per ridurre il numero di falsi positivi si consigliano almeno due cicli di selezione. Due approcci sono stati impiegati con successo. 1) Espandere ogni clone e reiniettare individualmente per confermare il fenotipo della colonia. 2) Mescolare tutti i cloni espansi in un rapporto 1:1 ciascuno, reiniettare come miscela e ripetere il ciclo di selezione.
6. Iniezione di lectine marcate fluorescentemente nella vascolarizzazione CAM.
- Identificare la vena da iniettare. È più facile utilizzare lo stesso sito di iniezione per la lectina che è stato utilizzato per l'iniezione di cellule tumorali.
- Diluire la soluzione stock di lectina fluorescente (5 mg/ml) 50-100x con 1x PBS e caricarla nello stesso apparato di iniezione utilizzato per l'iniezione di cellule tumorali.
NOTA: La quantità di lectina che deve essere iniettata (normalmente 20-100 μL) per la visualizzazione dei vasi sanguigni dipende dalla sensibilità del microscopio e deve essere determinata sperimentalmente prima dello screening. - Iniettare lectina usando la stessa tecnica dell'iniezione di cellule tumorali (vedere i passaggi 3.6.-3.10.).
- Dopo l'iniezione di lectina, mettere l'embrione nell'incubatrice per recuperare per 5 minuti. Iniettare solo un embrione alla volta e immediatamente prima di immaginare l'embrione.
NOTA. Gli embrioni di età pari o superiore a 12 giorni generalmente guariscono bene dalle iniezioni di lectina e possono essere reiniettati di nuovo con lectina il giorno successivo per l'imaging sequenziale. Gli embrioni più giovani sono più sensibili e possono mostrare coagulazione del sangue.
7. Visualizzazione dei contatti cellula tumorale-vasi sanguigni
- Impostare l'involucro del microscopio a temperatura regolata a 37 °C circa 6 ore prima dell'imaging. Ciò stabilizzerà la temperatura del microscopio e contribuirà a ridurre al minimo la deriva XYZ durante l'imaging.
NOTA. Per questo esperimento è stata utilizzata una camera di imaging specializzata per embrioni di pollo9,10,11, 12,13. Un semplice microscopio a dissezione fluorescente può essere utilizzato per tutte le fasi a partire dall'iniezione di cellule tumorali alla selezione del clone e alla reiniezione del clone e alla valutazione della compattezza della colonia. Un microscopio confocale dotato di una camera di imaging è necessario per l'imaging e la quantificazione dei contatti cellula tumorale-vaso sanguigno. Non è necessario alcun riscaldamento per un massimo di 1 ora e generalmente gli embrioni sopravvivono ad almeno due sessioni di imaging sequenziale senza alcun impatto sulla loro vitalità. - Assicurarsi che sia stata installata la lente dell'obiettivo necessaria (si consiglia una lente ad immersione in acqua 20x o 25x).
- Applicare un sottile strato di grasso sottovuoto sul lato inferiore del coperchio della camera di imaging per creare una tenuta sicura con il coperchio.
- Posizionare delicatamente una coverlip nel coperchio e asciugare il grasso sottovuoto in eccesso.
- Togliere l'embrione iniettato di lectina dall'incubatrice e tagliare i bordi della pesata, se necessario.
- Posizionare l'embrione nella camera di imaging con il coverslip abbassato direttamente sull'area del CAM in cui si trovano le colonie metastatiche di interesse. Abbassare lentamente il coperchio sull'embrione fino a quando il coverslip non contatta il CAM. Stringere le viti per fissare il coperchio in posizione, assicurarsi che il coperchio sia livellato e che il coperchio non eserciti alcuna pressione verso il basso sul CAM.
- Acquisire immagini di colonie multiple e casuali da gruppi di controllo e sperimentali (10-20) da diversi (5-10) embrioni.
NOTA. Si consiglia di acquisire stack 3D casuali (1-5um Z-steps; 50-100um range; 25x) da ciascun campo. - Utilizzare l'opzione di cucitura sul campo nel software di acquisizione del microscopio, se disponibile. Poiché le immagini utilizzate per la quantificazione non saranno di qualità di pubblicazione, utilizzare modalità di acquisizione rapida come la scansione risonante, se disponibile. Utilizzare 25x obiettivo e 3 x 3 cuciture con 5-10 μm Z-step, 100 μm gamma totale. Immagine di almeno 100 cellule (~ 20 colonie) per condizione.
8. Quantificazione dei contatti dei vasi sanguigni delle cellule tumorali
- Aprire il file 3D come Z-stack utilizzando il software necessario.
NOTA. Un software specializzato deve essere utilizzato per acquisire e analizzare immagini ad alta risoluzione al fine di quantificare il contatto cellula tumorale-vaso sanguigno. Sono disponibili diversi pacchetti software in grado di analisi di immagini 3D. Si prega di consultare la Tabella dei materiali per maggiori dettagli. - Se durante l'acquisizione dell'immagine si è verificato un movimento XY significativo, allineare lo Z-stack utilizzando il plug-in ImageJ StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg).
- Individuare la cella o le celle di interesse.
- Scorrere l'immagine XYZ nella direzione Z e identificare la sezione ottica che contiene la lunghezza massima del contatto del vaso sanguigno della cellula tumorale per la cellula di interesse (Figura 2E).
- Misurare il contatto cellula-vaso sanguigno del cancro utilizzando la "funzione di misurazione manuale della lunghezza".
- Immettere le misurazioni nel pacchetto software di dati utilizzato per l'analisi statistica.
NOTA: La capacità delle cellule tumorali di attaccarsi ai vasi sanguigni può essere misurata come la lunghezza dei contatti cellula tumorale-vaso sanguigno o la percentuale della cellula in contatto con la vascolarizzazione per particolari cloni di cellule tumorali (o entrambi). - Passare alla cella di interesse successiva.
- Analizza i dati per la significatività statistica confrontando i cloni mutanti e i set di dati di controllo.
9. Quantificazione della compattezza delle colonie
- Reiniettare le celle del clone espanso utilizzando la stessa tecnica del passaggio 2.
- Cinque giorni dopo l'iniezione acquisire immagini di 10-50 colonie metastatiche casuali per ogni clone.
NOTA: non sono necessarie immagini di alta qualità per la quantificazione della compattezza delle colonie metastatiche. Sono sufficienti immagini monocromatiche al microscopio stereo (ingrandimento 10x). Si dovrebbe prestare attenzione alla luminosità dell'immagine (la maggior parte delle cellule all'interno della colonia dovrebbe essere vista) e al contrasto (differenza tra una o due cellule). - Isolare digitalmente l'immagine della colonia (vedere Figura 2C,D)e procedere alla quantificazione della compattezza della colonia utilizzando il modulo di quantificazione della compattezza della colonia stand-alone o il punteggiocieco 13.
- Procedi verso la prossima colonia di interesse.
- Analizza i dati per la significatività statistica confrontando i set di dati di clone mutanti e di controllo (ad esempio scramble shRNA).
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Representative Results
L'iniezione di cellule tumorali è considerata di successo se la maggior parte delle cellule che si depositano nei capillari sono singole e situate a una differenza significativa l'una dall'altra (~ 0,05-0,1 cm) in modo che le colonie non si sovrappongano dopo 5-6 giorni di periodo di incubazione (Figura 3A). L'iniezione non ha avuto successo se si può vedere un accumulo di cellule tumorali nella maggior parte dei capillari, gli embrioni che lo mostrano devono essere scartati (Figura 2E). Un numero significativo di cellule tumorali iniettate perisce entro 24 ore dall'iniezione, facendo sembrare che alcuni embrioni rifiutino tutte le cellule tumorali. La sopravvivenza delle cellule tumorali varia a seconda del fornitore locale di uova (cioè la quantità di cellule da iniettare può variare) e raccomandiamo vivamente di determinare le condizioni ottimali di iniezione (concentrazione di cellule tumorali rispetto alla durata dell'iniezione) prima di procedere con l'esperimento. Si consiglia una concentrazione cellulare compresa tra 0,5 x 106 e 1,0 x 106 celle/m. Quando si raggiunge la concentrazione cellulare ottimale e la durata dell'iniezione, le cellule trasdotte dopo l'iniezione del giorno 5 dovrebbero produrre un'ampia varietà di fenotipi di colonie con la maggior parte delle colonie che appaiono invasive come determinato dalle cellule tumorali che appaiono sparse nel tessuto CAM (Figura 3A). Bisogna prestare attenzione alle colonie metastatiche che appaiono "compatte" e si trovano abbastanza lontane dalle colonie vicine da poter essere asportate con pinza e forbici in un unico pezzo di tessuto CAM (Figura 3C). Uno schermo positivo isolato (cioè una colonia compatta) dovrebbe visualizzare il fenotipo della colonia compatta al momento della reiniezione (Figura 3B). Si può osservare anche una diminuzione della sopravvivenza cellulare (o del tasso di proliferazione cellulare all'interno della colonia). Pertanto, è possibile che sia necessario iniettare numeri di cellule più elevati per alcuni dei risultati positivi dello schermo per ottenere un numero sufficiente di colonie. Per la misurazione dei contatti cellula-vaso sanguigno del cancro si dovrebbe prestare attenzione alla luminosità della macchia della parete vascolare (lectina fluorescente; Figura 3D,E)e la quantità appropriata di lectina devono essere iniettate per il segnale luminoso / contrasto della parete vascolare. Qualsiasi software di analisi delle immagini disponibile può essere utilizzato durante le fasi di quantificazione dopo l'esecuzione della calibrazione del software del microscopio.
Figura 1: Panoramica della coltura senza guscio di embrione di pollo. (A) Piatto di pesatura con coperchio preparato per la coltura senza guscio. La freccia punta all'angolo tagliato. (B) Pesare le stoviglie disposte in file nella cappa di flusso. (C) Tagliare un guscio d'uovo con un utensile rotante elettrico. (D) Rompere un uovo in un piatto di pesatura. (E) Embrioni coltivati nell'incubatrice umidificata. Barre della scala = 1 cm (A-D) o 5 cm (E). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Cenni sull'iniezione di cellule tumorali e sull'isolamento delle colonie metastatiche. (A) Diagramma di flusso che delinea le fasi della piattaforma di screening dell'embrione di pollo. (B) Iniezione di cellule tumorali impostata sullo stadio del microscopio stereo fluorescente. (C) Iniezione delle cellule tumorali nella vascolarizzazione CAM. (D) Immagine che mostra l'iniezione di cellule tumorali riuscita (densità accettabile delle cellule tumorali), presa immediatamente dopo l'iniezione. (E) Immagine che mostra una scarsa iniezione di cellule tumorali, vista come un embrione sovra-iniettato. Nota l'accumulo di cellule tumorali nei capillari sanguigni (frecce bianche). Barre della scala = 1 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Risultati rappresentativi per le diverse fasi del protocollo di screening. (A) Colonie metastatiche formate da cellule HEp3 eterogenee (linea cellulare tumorale trasdotta in libreria), 5 giorni dopo l'iniezione. La freccia rossa mostra una colonia compatta (potenziale colpo positivo) che dovrebbe essere eliminata. (B) Colonie metastatiche formate da uno dei colpi isolati dello schermo (KIF3B) dopo la reiniezione, 5 giorni dopo l'iniezione. Gli inserti mostrano immagini di colonie metastatiche ritagliate digitalmente dai quadrati tratteggiati. Questa è una qualità dell'immagine accettabile per la quantificazione C.I. Viene mostrato il valore medio di C.I. per la reiniezione di hit (KIF3B). (C) Isolamento della colonia metastatica di interesse dal tessuto CAM. Sezioni ottiche rappresentative di (D) una colonia di controllo e (E) una colonia di sovraespressione di shRNA KIF3B, entrambe mostrano misurazioni del contatto cellula tumorale-vaso sanguigno. La vascolarizzazione CAM è etichettata con lectina fluorescente-649. Barre della scala = 1 cm (A-C) o 50 μm (D, E). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui descriviamo un protocollo di screening intravitale basato sulla microscopia a fluorescenza rapida che può essere utilizzato per applicazioni importanti come gli screening genetici o dei farmaci candidati. Le cellule tumorali che sono state trasdotte con una libreria genetica di interesse o trasfettate con costrutti di espressione individuale possono essere rapidamente vasate e quantificate in base al fenotipo di interesse utilizzando questo modello CAM di pulcino. Poiché i protocolli di trasduzione o trasfezione variano in modo significativo, a seconda del tipo di libreria, non sono inclusi in questa procedura. Le colonie metastatiche fenotipicamente rilevanti vengono asportate dal CAM, espanse e il DNA isolato per il sequenziamento ad alto rendimento per identificare il costrutto di espressione di interesse. Generalmente, ogni libreria genetica è dotata di sequenze di primer e metodi raccomandati di purificazione del DNA genomico. Si consiglia di utilizzare le linee guida della struttura locale per i migliori risultati di sequenziamento ad alta produttività.
Si raccomanda di determinare la molteplicità ottimale dell'infezione (M.O.I.) per una libreria e una linea cellulare prima dello screening. Idealmente ogni cellula (e quindi futura colonia metastatica) dovrebbe contenere un solo costrutto di espressione genica, tuttavia nella nostra esperienza ciò non è sempre realizzabile. Si consiglia di seguire il protocollo del produttore della libreria e testare una vasta gamma di M.O.I. (0,01-5) per ottenere il più vicino possibile a 1. La presenza di più costrutti di espressione della libreria all'interno di ciascuna colonia metastatica può complicare significativamente l'analisi del fenotipo della colonia. Raccomandiamo inoltre di utilizzare il controllo negativo fornito dal produttore della libreria nei tuoi esperimenti (ad esempio scramble shRNA che esprime un vettore che è etichettato in modo fluorescente).
Il nostro protocollo di screening si basa sulla selezione di colonie fluorescenti non invasive; è fondamentale garantire che tutte le linee cellulari utilizzate negli esperimenti abbiano un'intensità di fluorescenza simile. L'intensità di fluorescenza irregolare tra le cellule (e le colonie metastatiche) può comportare una selezione distorta delle colonie a causa della luminosità della cellula o della colonia anziché dell'invasività.
Rispetto ai metodi esistenti il nostro protocollo offre diversi vantaggi unici come velocità, basso costo e capacità di completare il ciclo dello schermo intravitale senza bisogno di sofisticate apparecchiature di imaging12,13,14. Inoltre, l'intero ciclo di screening può essere completato tra 3 e 6 settimane dall'iniezione cellulare alla fase di sequenziamento. Non è necessario alcun microscopio ad alta risoluzione per l'iniezione di cellule tumorali o l'isolamento delle colonie metastatiche in quanto questi passaggi possono essere eseguiti utilizzando lo stereomicroscopio fluorescente di base disponibile per la maggior parte dei ricercatori. Infine, poiché la coltura di embrioni senza guscio è completamente autosufficiente, non c'è bisogno di complicati programmi di stabulazione o alimentazione degli animali da ricerca. La maggior parte degli istituti di ricerca non considera gli embrioni di pollo come animali vivi, il che riduce significativamente il costo e l'onere della documentazione associati a questo modello.
Tuttavia, ci sono alcune limitazioni associate al modello embrionale senza guscio. In primo luogo, non tutte le linee cellulari tumorali funzionano in questo modello in modo efficiente. Nel nostro laboratorio utilizziamo abitualmente diverse linee cellulari tumorali, come HT1080 (fibrosarcoma umano), HEp3 (testa e collo) e melanoma b16 di topo e linee cellulari di cancro al seno 4T1, che formano in modo robusto colonie metastatiche quando iniettate nella vascolarizzazione CAM di pollo. Altre linee cellulari con diversi tipi di cancro come il seno (MDA468), il cervello (U87 e U118) o l'ovaio (A2780s) formano facilmente colonie metastatiche quando iniettate nel CAM e quindi possono essere utilizzate in questo protocollo di screening anche12,14,15. Tuttavia, nella nostra esperienza, le linee cellulari tumorali comunemente usate come LnCaP e PC3 non funzionano bene in questo modello (osservazioni non pubblicate). Un'altra limitazione è che un microscopio confocale con un intervallo di imaging da 100 a 200 μm è necessario per l'imaging ad alta risoluzione, come la visualizzazione dei contatti dei vasi sanguigni delle cellule tumorali, questa apparecchiatura potrebbe non essere disponibile per molti ricercatori.
Complessivamente, questo protocollo descrive una piattaforma di screening intravitale rapido che può essere utilizzata per la scoperta di soppressori e driver delle metastasi tumorali. Crediamo fermamente che la robustezza e la facilità d'uso di questo modello lo renderanno un modello di screening essenziale per molti ricercatori.
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Disclosures
Niente da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione del Canadian Cancer Society Research Institute #702849 a JDL e KS. Il Dr. Lewis detiene la cattedra Frank e Carla Sojonky nella ricerca sul cancro alla prostata supportata dalla Alberta Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL disposable syringes | BD | BD309659 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes. | Corning | CLS430791-500EA | |
| 18 gauge x 1 1/2 BD precision needle | BD | BD305196 | we use 1.2mm x 40mm, it is possible to use shorter needles if preferred |
| 2.5% Trypsin solution | many sources are available | ||
| 4T1 mouse breast cancer | ATCC | CRL-2539 | |
| B16F10 mouse melanoma cell line | ATCC | CRL-6475 | |
| Benchtop centrifuge. | many sources are available | Any TC compatible centrifuge that can be used to spin down the cells is suitable | |
| Circular coverslips, 22 mm. | Fisher Scientific | 12-545-101 | |
| Collagenase | Sigma | C0130-100MG | |
| Confocal microscope | We use Nikon A1r | ||
| cotton swabs | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Culture media appropriate for the cell lines used | many sources are available | We grow HT1080, HEp3 and b16 cell lines in DMEM, 10% FBS media | |
| Egg incubator | many sources are available | An exact model that is necessary depends on the scale of the screen. Available sources are MGF Company Inc., Savannah, GA, or Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA | |
| eppendor tubes , 1.5ml | Sigma | T4816-250EA | |
| Fertilized White Leghorn eggs | any local supplyer | ||
| fine forceps | many sources are available | must be sterilized begfore use | |
| Hemocytometer | Millipore-Sigma | MDH-4N1-50PK | |
| HT1080 human fibrosarcoma cell line | ATCC | CCL-121 | |
| Image analysis software | We use Nikon Elements | ||
| Lectin Lens Culinary Agglutinin (LCA) conjugated with Fluorescein or Rhodamine | Vector Laboratories | RL-1042, FL-1041 | Dilute stock (5mg/ml) 50-100x depending on the microscope sensetivity. Must be a different color from the color of cell line used for screening |
| MDA-MB-468 human breast cancer | ATCC | HTB-132 | |
| PBS (1x) | many sources are available | ||
| Plastic weighting dishes | Simport | CA11006-614 | dimensions are 78x78x25mm; many other sources are available |
| small surgical scissors | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Sodium borosilicate glass capillary tubes, outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.58 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-58-10 | |
| Square petri dishes (used as lids for the weighting dishes). | VWR | CA25378-115 | dimensions are 100x100x15mm; many other sources are available |
| Stereo fluorescent microscope | We use Zeiss Lumar v12 | ||
| Tygon R-3603 laboratory tubing | Cole-Parmer | AAC00001 | 1/32 in inner diameter, 3/32 in. outer diameter, 1/32 in. wall thickness |
| U-118 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-15 | |
| U-87 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-14 | |
| Vertical pipette puller | many sources are available | we use David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Model 720 |
References
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